CN105372213B - 一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法，用于小麦及其制品等中赭曲霉毒素A(OTA)含量的检测。通过将上转换发光材料(NaYF4:Yb0.286,Er0.0286)与赭曲霉毒素A核酸适配体连接形成能量供体探针，再通过碱基互补配对原则与适配体互补寡核苷酸单链修饰的金纳米棒(纵横比为2.5左右)能量受体探针形成纳米复合物，发生发光共振能量转移现象(LRET)，达到上转换发光淬灭的目的。当检测体系中存在OTA时，OTA与OTA适配体特异性结合，从而使双链解链，通过监控657nm处的上转换发光信号强度，能够定量检测OTA，线性范围为0.05‑100ng/mL，检出限为0.027ng/mL。本发明用于OTA检测具有灵敏度高、快速简便的优点。并应用于啤酒、小麦样品的检测，结果准确可靠。
Description
技术领域
一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法，涉及纳米材料和分析化学技术领域，用于对食品中赭曲霉毒素A进行检测。
背景技术
赭曲霉毒素(Ochratoxins，OT)是由曲霉属和青霉属中的某些菌种产生的有毒代谢物，是异香豆素联结L-苯丙氨酸在分子结构上类似的一族化合物。赭曲霉毒素(OT)主要包括赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、赭曲霉毒素C(OTC)、赭曲霉毒素D(OTD)等七种，其中以OTA为主，OTA的毒性最强、污染最为严重、分布最为广泛。OTA主要由纯绿青霉(Penicillium Verrucosum)、赭曲霉(Aspergillus achraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)三种真菌产生。主要危及人和动物的肾脏，动物实验表明：OTA是一种具有强烈肾脏毒性和肝脏毒性的真菌毒素，并具有致癌、致畸、致突变、神经毒性和免疫抑制等毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。OTA在自然界分布广泛，主要存在于粮谷类食品、咖啡、牛奶、啤酒、茶叶等中。因此，建立准确、灵敏、快速的OTA检测技术对于食品安全具有重大意义。
目前检测OTA的主要方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质联用法(LC-MS/MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析分析法(GICA)等。ELISA主要用于OTA现场快速检测和大批量样品筛选，它与GICA一样都是基于抗原抗体亲和反应，一抗体作为识别分子。但抗体易受外界条件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经过动物或者细胞实验，繁琐费时，成本较高，相应的检测成本也偏高。所以开发一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的新型检测方法是很有必要的。
核酸适配体(Aptamer)通过指数富集配体系统进化(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)技术从体外筛选得到的，能与相应配体专一性紧密结合的一类单链寡核苷酸序列。这种寡核苷酸序列形成的高级结构能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相比，适配体的靶分子范围广，体外筛选，易人工合成和修饰，分子较小，稳定性好，对温度不敏感，容易保存，而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食品安全中得到广泛应用。
近年来纳米材料与分析化学两者的结合越来越紧密，新型纳米材料在分析检测中的发展前景也越来越广大，并涌现出了很多具有优秀特性的纳米材料。其中上转换发光纳米材料和金纳米棒具备独特的功能被人们所熟知。
上转换发光纳米材料(Upconversion Nanoparticles)的发光机理是基于双光子或者多光子机制将长波长的激发光转换成短波长的发射光的过程，是一种将红外光转变成可见光的有效途径。相对于传统的有机荧光染料和其他荧光纳米材料，上转换发光纳米材料作为完全惰性的无机发光材料具有很大的优势，光化学稳定，检测背景低，穿透性强，可以选择不同的基质材料和掺杂离子来调节上转换发光，真正实现单激发多发射，有利于生物体系中多组分同时检测。鉴于上述优点，上转换发光纳米材料已成为一种优秀的生物标记材料。金纳米棒在紫外-可见-近红外(UV-Vis-NIR)波段具有独特的可调节表面等离子体共振(SPR)光学性质，其良好的稳定性、低生物毒性、亮丽的色彩和在催化、生物医药、分析化学、食品安全等领域广阔的应用前景受到了广泛关注。
本发明首先通过调节金纳米棒的纵向表面等离子体共振吸收峰的位置，合成了能够与上转换发光纳米材料的发光光谱实现有效重叠的金纳米棒，纵向等离子体共振吸收峰峰为660nm左右，并分别在上转换纳米材料上修饰OTA适配体和在金纳米棒上修饰互补寡核苷酸链，分别组成能量供体探针和能量受体探针，基于两者碱基互补配对原则，使得能量供体探针和能量受体探针之间的距离拉近，发生发光共振能量转移，实现上转换发光信号的淬灭。当加入不同数量的OTA时，OTA与适配体进行特异性结合，使得双链结构解离，上转换发光纳米材料与金纳米棒之间的距离变大，上转换发光信号得以恢复，以980nm激光作为激发光源记录上转换发光检测信号，通过对不同浓度赭曲霉毒素A标准品的检测，建立标准曲线，达到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的。该发明可以用于啤酒、玉米、谷物、饲料及其制品等样品中赭曲霉毒素A含量的检测。
发明内容：
一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法：分别制备得到NaYF4:Yb0.286，Er0.0286上转换发光纳米材料和金纳米棒(纵横比为2.5)，对上转换发光纳米材料进行表面功能化修饰并与亲和素(Avidin)偶联，随后金纳米棒利用Au-S键的作用与巯基化适配体互补寡核苷酸链结合成为能量受体探针，上转换发光纳米材料通过亲和素(Avidin)与生物素(Biotin)之间的作用与生物素(Biotin)修饰的适配体DNA特异性结合称为能量供体探针。将两者经过一段时间的孵育，通过DNA互补杂交使得两者组装成为复合纳米材料，发生发光共振能量转移，实现上转换发光信号的淬灭，利用980nm激光激发，此时的发光信号为最小值。当加入目标分析物赭曲霉毒素A时，适配体DNA的空间构象发生改变，与赭曲霉毒素A发生特异性结合，使得适配体DNA与互补单链DNA解链，从而导致上转换发光纳米材料与金纳米棒分离，此时再对此溶液进行检测，得到发光信号增大。在一定范围内赭曲霉毒素A的含量与发光信号的增大的数值相关，基于此对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对实际样品中赭曲霉毒素A进行定量检测的目的；步骤为：
(1)通过高温热解法技术，制备NaYF4:Yb0.286，Er0.0286上转换发光颗粒，并对其做表面修饰。称取一定量的YCl3·6H2O，YbCl3·6H2O，ErCl3(Ln:68.54mol％Y3+，28.6mol％Yb3+，2.86mol％Tm3+；总共1mmol)于三口烧瓶中，加入6mL油酸以及15mL 1-十八烯。磁力搅拌条件下，逐渐升高温度至160℃，待混合液形成均一的溶液后，自然冷却至室温。准确称取0.1g氢氧化钠和0.1482g氟化铵，溶于10mL甲醇溶液混合均匀。将上述溶液缓慢加入到三口烧瓶中，磁力搅拌30min后，缓慢蒸发甲醇，脱气后，将混合液加热至300℃，并且持续1h。反应结束后，自然冷却至室温，离心收集材料，用环己烷和乙醇清洗三次，储存备用。
(2)利用配体交换法对上转换发光纳米颗粒进行表面羧基化修饰。取30mL二甘醇，300mg聚丙烯酸(Mw＝2000)加入到三口烧瓶中，加热至110℃，形成澄清透明溶液后，缓慢加入100mg油酸包被的上转换纳米材料甲苯溶液，在氩气保护下，110℃持续1h，升温至240℃持续2h，带溶液冷却至室温后，加入乙醇沉淀材料，离心收集材料用乙醇和水清洗三遍。
(3)采用两步种子法制备金纳米棒。金纳米棒的制备分为两步，第一步为金种子溶液的制备，首先向7.5mL0.05M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液中加入0.122mL 0.0237M氯金酸溶液，摇匀后成深黄色，迅速向其中加入新鲜冰水配制的0.6mL 0.01M硼氢化钠溶液，剧烈振荡2min，溶液成浅棕色，反应过程中有气体跑出，注意放气，最后将种子置于40℃水浴中静置2h后使用。第二步是金纳米棒的生长，向试管中加入30mL 0.05M十六烷基三甲基溴化铵溶液，然后加入70μL 0.01M硝酸银溶液和0.735mL 0.0237M氯金酸溶液，摇匀后，溶液呈亮黄色，再向其中加入0.24mL 0.1M抗坏血酸溶液，轻轻摇匀，溶液由亮黄色变为无色，此为生长溶液。最后加入0.3mL用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)稳定的金种子溶液，轻轻振荡1min，静置3h完成生长，得到长径比为2.5左右的金纳米棒，横向和纵向等离子共振吸收峰分别为515nm和660nm左右，将制备好的金纳米棒离心收集，用超纯水清洗三次，于4℃冰箱保存。
(4)利用EDC/NHS法将羧基化上转换发光纳米材料与亲和素(Avidin)偶联。称取5mg聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料分散于5mL MES(pH5.6)缓冲液中，超声15min，加入0.6mL 2mg/mL EDC溶液和0.2mL 2mg/mL NHS溶液，37℃摇床中活化2h。离心收集材料，用10mM磷酸缓冲液清洗三次。然后分散于磷酸缓冲液中，加入1mL 0.5mg/mL亲和素溶液，在37℃摇床中反应12h。反应结束后清洗数次，弃上清。
(5)利用通过亲和素(Avidin)与生物素(Biotin)之间的特异性结合将表面修饰亲和素(Avidin)的上转换发光纳米颗粒与生物素(Biotin)修饰的赭曲霉毒素A适配体DNA单链连接。具体方法为：将亲和素修饰的上转换纳米材料分散于5mL磷酸缓冲液中，加入一定量的生物素化赭曲霉毒素A适配体，在37℃摇床中孵育12h，离心收集材料和上清，用磷酸缓冲液清洗三次，分散于BB缓冲液(10mM Tris，pH8.5，120mM NaCl，5mM KCl和20mM CaCl2)中。
(6)利用Au-S键的作用将金纳米棒与巯基化赭曲霉毒素A适配体互补寡核苷酸链连接。取1mL金纳米棒溶液，加入一定量的巯基化OTA适配体寡核苷酸链，25℃摇床下孵育16h，离心收集材料和上清，用BB缓冲液清洗三次，分散于BB缓冲液中，4℃储存备用。
(7)通过赭曲霉毒素A适配体DNA与其互补DNA单链的杂交，将上转换发光纳米颗粒与金纳米棒连接起来构成一个纳米复合物，发生发光共振能量转移，实现上转换发光信号的淬灭。具体方法为：取0.5mg mL-1OTA适配体标记的上转换发光纳米颗粒溶液与60pM OTA适配体寡核苷酸单链功能化的金纳米棒混合，在BB缓冲液体系中37℃反应70min，形成上转换纳米颗粒与金纳米棒纳米复合物。
(8)对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线。配制不同浓度的赭曲霉毒素A标准品加入到纳米复合物体系中，37℃孵育80min，在980nm激光激发下得到657nm处的上转换发光信号，空白组检测得到的淬灭发光信号(I0)最小，随着赭曲霉毒素A浓度的增加发光信号(I)逐步增加。根据发光差值(△I＝I-I0)与对应的赭曲霉毒素A标准品浓度建立标准曲线，实验结果在0.05-100ng/mL区间内得到良好线性关系。
(9)对赭曲霉毒素A样品进行检测：对样品做简单的处理，随后直接加入到上述纳米复合物体系中37℃孵育80min后，直接在980nm激光下激发得到657nm处的上转换发光信号，从标准曲线中求得对应的赭曲霉毒素A的浓度。
本发明的优点是：
(1)利用适配体对被检测物质实现特异性捕获，有效提高了检测的稳定性和准确性。
(2)利用适配体与抗体相比较，具有可人工合成，不依赖动物和细胞，周期短、成本低、批次间差异小，便于化学修饰，稳定性也好，可长期保存。
(3)利用激光诱导上转换发光，检测背景低大大提高了检测的灵敏度。
(4)利用可调控纵向表面等离子体共振吸收峰的金纳米棒对上转换发光纳米材料实现发光共振能量转移，可以应用于不同发光光谱的上转换纳米材料，而且分析检测过程不需要进行分离，属于均相检测，大大简化了分析检测过程。
附图说明
图1：基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的实验原理图
图2：NaYF4:Yb0.286，Er0.0286上转换发光纳米材料电镜图(a)；聚丙烯酸修饰NaYF4:Yb0.286，Er0.0286上转换发光纳米材料电镜图(b)
图3：金纳米棒电镜图
图4：金纳米棒紫外吸收图(a)；NaYF4:Yb0.2，Er0.0286上转换发光纳米颗粒发光光谱(b)
图5：上转换发光强度随赭曲霉毒素A变化叠加图(a)；赭曲霉毒素A检测标准曲线图(b)，浓度范围在0.05-100ng/mL。
图6：本发明和ELISA方法检测同样的实际样品得到的相关性曲线。
具体实施方式
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或者局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
实施例1：啤酒实际样品中赭曲霉毒素A检测标准曲线建立及检测样品预处理：啤酒样品置于4℃冰箱冷藏30min，超声脱气。取脱气后啤酒样品20g，置于25mL容量瓶中，加2％碳酸氢钠和15％氯化钠混合提取液至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至澄清，收集滤液备用。
从本地超市购买5中不同类别的啤酒，利用本发明方法和酶联免疫方法分别测定其中赭曲霉毒素A的含量，结果见表一。两种方法检测结果一致，无明显差异。
表一：啤酒实际样品检测，本发明方法与Elisa方法对比
注：ND为未检出
实施例2：啤酒实际样品中赭曲霉毒素A的检测及加标回收率实验样品预处理同实施例1。
以实施例1得到的5组赭曲霉毒素A浓度数据为本底值，分别向其中加入五种不同浓度的OTA标准品，同样利用本发明方法再次检测其中OTA的含量，得到检测值。回收率％＝(检测值-本底值)/添加量X100％。从表二数据可以看到回收率在93.4％～119％，说明本发明稳定，灵敏，准确，适用于啤酒实际样品中OTA的检测。
表二：啤酒实际样品中赭曲霉毒素A的检测及加标回收率
实施例3:小麦实际样品中赭曲霉毒素A检测标准曲线建立及检测样品预处理
将小麦研磨，硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过1mm孔径试验筛，不要磨成粉末。称取20g(精确到0.01g)磨碎的小麦试样于100mL容量瓶中，加入5g氯化钠，加80％甲醇提取液至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。
从本地超市购买9种不同种类的小麦，利用本发明方法和酶联免疫方法分别测定其中赭曲霉毒素A的含量，结果见表三。两种方法检测结果一致，无明显差异。可用于小麦实际样品赭曲霉毒素A检测。
表三：小麦实际样品检测，本发明方法与Elisa方法对比
Claims (1)
1.一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：将赭曲霉毒素A适配体与高温热分解法制备得到的NaYF4:Yb0.2,Er0.0286上转换发光纳米材料偶联形成能量供体探针，同时将巯基化修饰的赭曲霉毒素A适配体的互补寡核苷酸单链与纵横比为2.5左右的金纳米棒连接形成能量受体探针，通过双链杂交形成上转换-金纳米棒纳米复合物，使得能量供体探针与能量受体探针两者之间的距离拉近，发生发光共振能量转移现象，实现发光信号淬灭；利用980nm激光激发纳米复合物，记录此时的发光发射峰强度；在检测体系中加入赭曲霉毒素A，由于赭曲霉毒素A会优先与对应的适配体结合并改变适配体的空间构象导致互补链与适配体解离，从而使一部分上转换-纳米棒纳米复合物分解，利用980nm激发收集此时的上转换发光信号；在0.05-100ng/mL范围内，赭曲霉毒素A的数量与恢复的上转换发光信号呈正相关，对照657nm的发光峰发光信号恢复强度建立标准曲线，以达到对赭曲霉毒素A定量检测的目的。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |