CN106770163B - 一种凝血酶的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种凝血酶的检测方法及检测凝血酶的组合物。本发明所述组合物包括标记有核酸适配子的银纳米三角片和标记有核酸适配子的上转换纳米粒子；所述银纳米三角片上标记的核酸适配子和上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为与凝血酶特异性结合的核苷酸序列。本发明所述检测方法将标记有核酸适配子的银纳米三角片溶液与标记有核酸适配子的上转换纳米粒子溶液混合均匀，得检测体系；在所述检测体系中加入待检测样品，进行拉曼光谱检测。本发明所述检测方法具有检测灵敏度高，成本低，背景荧光干扰小，方法简单，便于操作等优点。

Description

一种凝血酶的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种凝血酶的检测方法及检测凝血酶的组合物。
背景技术
凝血酶是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白质水解酶，具有催化纤维蛋白原变成纤维蛋白、促进血液凝固和调控凝血等作用，在揭示肿瘤的发生机制及作为早期诊断、疗效及愈后判断依据等方面有着非常重大的意义。由于血液中凝血酶的浓度达10nmol/L，建立简单、快速、高灵敏度检测凝血酶的方法具有非常重要的意义。
目前国内外凝血酶的检测方法包括电化学方法、荧光检测方法、局域表面等离子体共振(LSPR)探测等。其中电化学方面通常较复杂，检测灵敏度在百纳摩尔水平已是极限。荧光检测通常在可见光范围激发，容易激发生物体内有机分子，产生强背景干扰，无法进行在体检测。而LSPR检测相对较简便，例如基于贵金属金银纳米粒子的LSPR探测可以实现裸眼检测，但裸眼检测仅在大浓度范围有效，灵敏度仍在1.6nM以上水平。
上转换纳米粒子发光检测具有高灵敏度、无光漂白、低荧光背景等特性，在生物/化学检测领域有重要应用。例如韩国Kim教授利用上转换纳米粒子实现对血红蛋白的检测(Anal.Chem.2016,88,2742-2746)。而利用上转换纳米粒子检测凝血酶的方法通常采用有机分子、碳纳米点、金纳米粒子等作为发光受主实现检测。然而凝血酶在血液内，浓度仅有纳摩尔水平，以上述材料作为受主，由于其消光系数低，导致检测灵敏度低(仅到达纳摩尔水平)。并且，血液具有极强的背景荧光干扰，产生荧光背景信号进一步降低检测灵敏度。
因此，研发一种检测灵敏度高、荧光背景低的凝血酶检测方法，成为人们亟待解决的问题。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种凝血酶的检测方法，以解决现有凝血酶检测方法存在的灵敏度低、背景荧光高等问题。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测凝血酶的组合物，包括标记有核酸适配子的银纳米三角片和标记有核酸适配子的上转换纳米粒子；所述银纳米三角片上标记的核酸适配子和上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为与凝血酶特异性结合的核苷酸序列。
优选的，所述银纳米三角片上标记的核酸适配子为5’端带有巯基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列；所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为5’端带有羧基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列。
优选的，所述银纳米三角片上标记的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述标记有核酸适配子的银纳米三角片的制备方法为将银纳米三角片与核酸适配子溶液混合过夜后离心，将离心后的沉淀分散于This缓冲溶液中。
优选的，所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的制备方法为上转换纳米粒子去配体后与核酸适配子溶液混合后离心，将离心后的沉淀分散于Tris缓冲溶液。
本发明还提供了一种凝血酶的检测方法，包括如下步骤：
1)将标记有核酸适配子的银纳米三角片溶液与标记有核酸适配子的上转换纳米粒子溶液混合均匀，得检测体系；
2)在所述检测体系中加入待检测样品，进行拉曼光谱检测。
优选的，所述标记有核酸适配子的银纳米三角片与所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的摩尔比为1:10～1:100。
更优选的，所述标记有核酸适配子的银纳米三角片与所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的摩尔比为1:20。
优选的，所述拉曼光谱的激发激光为波长为700～1000nm的近红外光，发射光为700～1000nm的近红外光。
更优选的，所述拉曼光谱的激发激光为波长为980nm的近红外光，发射光为808nm的近红外光。
本发明所述凝血酶检测方法的最低灵敏度检测可达189pM，该检测限低于常规荧光检测的0.5nM-1nM，因而可以将血液稀释到更低的浓度来减少背景干扰物对信号的干扰，实现对待检测样品中是否含有凝血酶的超灵敏检测。此外本发明所述凝血酶检测方法激发光与发射光均位于生物窗口内的近红外波段，背景荧光干扰低。本发明所述凝血酶检测方法还具有成本低、方法简单、便于操作等优点，广泛适用于医院临床疾病和健康状况诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中所使用的银纳米三角片扫描电镜图；
图2为实施例1中所使用的银纳米三角片在近红外波段的吸收图；
图3为实施例1中所使用的上转换纳米粒子扫描电镜照片；
图4为实施例1中加入不同浓度的凝血酶后凝血酶检测的近红外发光光谱图，其中，黑色实线为未加入凝血酶时的800nm发射光谱，方形、圆形、三角虚线分别代表加入200pM，500pM,600pM凝血酶后，光谱下降情况；
图5为实施例1中加入189pM凝血酶后凝血酶检测的近红外发光光谱图，其中黑色实线为未加入凝血酶时的光谱，黑色虚线为加入189pM凝血酶后的光谱。
具体实施方式
本发明公开了一种凝血酶的检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测凝血酶的组合物，包括标记有核酸适配子的银纳米三角片和标记有核酸适配子的上转换纳米粒子；所述银纳米三角片上标记的核酸适配子和上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为与凝血酶特异性结合的核苷酸序列。
其中，所述银纳米三角片上标记的核酸适配子为5’端带有巯基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列，所述银纳米三角片上标记的核酸适配子与银纳米三角片通过巯基配位结合。所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为5’端带有羧基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列，所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子与上转换纳米粒子通过羧基配位结合。
在一些实施方案中，所述银纳米三角片上标记的核酸适配子为SH-TBA29其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，5’端带有巯基修饰。所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为COOH-TBA15，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，5’端带有羧基修饰。
其中，优选的，所述标记有核酸适配子的银纳米三角片的制备方法为将银纳米三角片与核酸适配子溶液混合过夜后离心，将离心后的沉淀分散于Tris缓冲溶液中。
与核酸适配子溶液混合的银纳米三角片由银纳米三角片溶液离心得到。银纳米三角片溶液离心后收集银纳米三角片，与核酸适配子溶液混合。所述离心优选为10000rpm、离心两次，每次15min。
银纳米三角片与核酸适配子溶液混合过夜后离心收集标记有核酸适配子的银纳米三角片。所述离心优选为10000rpm、离心15min。
本领域技术人员可以理解，所述银纳米三角片用量依赖于核酸适配子溶液的浓度，以达到标记银纳米三角片的饱和标记。
优选的，所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的制备方法为上转换纳米粒子去配体后与核酸适配子溶液混合后离心，将离心后的沉淀分散于Tris缓冲溶液。
在一些实施方案中，所述上转换纳米粒子去配体的方法为上转换纳米粒子在pH3条件下经盐酸去配体3小时。所述离心优选为12000rpm、离心15min。
本发明还提供了一种凝血酶的检测方法，包括如下步骤：
1)将标记有核酸适配子的银纳米三角片溶液与标记有核酸适配子的上转换纳米粒子溶液混合均匀，得检测体系；
2)在所述检测体系中加入待检测样品，进行拉曼光谱检测。
本发明所述凝血酶的检测方法中标记有核酸适配子的银纳米三角片和标记有核酸适配子的上转换纳米粒子混合作为检测体系检测待测样品。由于标记银纳米三角片和上转换纳米粒子的两种核酸适配子均可与凝血酶特异性结合。待测样品中若有凝血酶存在，通过标记银纳米三角片和上转换纳米粒子的两种核酸适配子，银纳米三角片与上转换纳米粒子交联，强消光能力的银纳米三角片猝灭上转换纳米粒子的发光。对待检测样品进行激光激发，并分时段进行发光光谱的采集，依据采集的拉曼光谱中发光光谱的变化情况，确定待检测样品中是否含有凝血酶及相关浓度。
其中，作为优选，所述标记有核酸适配子的银纳米三角片与所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的摩尔比≤1:10，以保证上转换纳米粒子和银三角片纳米粒子的结合，有利于信号的稳定性与准确性。更优选为1:10～1:100。
在一些具体实施例中，所述标记有核酸适配子的银纳米三角片与所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的摩尔比为1:20，其既能保证上转换纳米粒子和银纳米三角片的有效结合，从而保证信号的稳定性与准确性，也不造成原料的浪费，节约成本。
本发明所述凝血酶的检测方法中所述拉曼光谱的激发激光为近红外光，生物背景荧光低和组织穿透深。优选为波长为700～1000nm的近红外光。更优选为波长为980nm的近红外光。
本发明所述凝血酶的检测方法中所述拉曼光谱的发射光为近红外光。优选为700～1000nm的近红外光。更优选为808nm的近红外光。
本发明所述凝血酶检测方法的的最低灵敏度检测可达189pM，该检测限低于常规荧光检测的0.5nM-1nM，因而可以将血液稀释到更低的浓度来减少背景干扰物对信号的干扰，实现对待检测样品中是否含有凝血酶的超灵敏检测。此外本发明所述凝血酶检测方法激发光与发射光均位于生物窗口内的近红外波段，背景荧光干扰低。本发明所述凝血酶检测方法还具有成本低、方法简单、便于操作等优点，广泛适用于医院临床疾病和健康状况诊断。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中所述巯基核酸适配子(SH-TBA29)与所述羧基核酸适配子(COOH-TBA15)均购自上海生工生物工程技术公司，两种适配子是特异性结合凝血酶的专用适配子序列。
实施例1
1)银纳米三角片的制备：取93mL去离子水，加入1mL 10mM的硝酸银、1mL 15mM的柠檬酸钠、4mL 1.75mM的PVP和240μL 30wt％的双氧水，并在室温下剧烈搅拌，随后迅速加入1mL 100mM的NaBH4，溶液在约30分钟后变成蓝色，合成得到银纳米三角片。扫描电镜及红外检测得到银纳米三角片，结果见图1和图2。图1说明合成了银纳米三角片，图2的吸收显示其偶极共振等离子体的吸收峰位在800nm，可以用来猝灭800nm的发光。
2)将核酸适配子标记到银纳米三角片上：取银纳米三角片溶液10mL在10000rpm连续离心两次，每次15min，最终重新分散在10mL体系中。然后取离心后的银纳米三角片1.8mL，与200μL巯基核酸适配子混合过夜后10000rpm离心15min，将离心后的沉淀重新分散稀释到1mL的Tris缓冲溶液中。其中，所述巯基核酸适配子为SH-TBA29，其序列如SEQ IDNO.1所示，5’端带有巯基修饰，即所述巯基核酸适配子的序列为5’-SH-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’。所述巯基核酸适配子与银纳米三角片通过巯基配位结合。
3)上转换纳米粒子的制备：将1mmol的稀土氯化物(其中包括0.795mmol YCl3·6H2O,0.20mmol YbCl3·6H2O和0.005mmol TmCl3·6H2O)放入容量为100ml的三颈瓶中，然后加入15ml的十八烯和6ml的油酸。然后将三颈瓶放入磁力搅拌加热器中，并同时通入氮气进行保护，缓慢加热到160℃，并在此温度下维持30min，待氯化物完全溶解后，得到颜色略有淡黄澄清透明的溶液。然后冷却到室温下，将溶有4mmol的NH4F、2.5mmol的NaOH的10ml甲醇溶液缓慢的滴加到三颈瓶中，然后缓慢加热到70℃，保持30min，将溶液中的甲醇完全蒸发掉，然后将溶液加热到300℃，反应90min，这时一直保持通氩气进行保护，并有冷却水回流，90min后冷却到室温，加入乙醇离心醇化三次，得到上转换纳米粒子。然后将得到的上转换纳米粒子溶解到6ml环己烷中备用。扫描电镜及红外检测得到上转换纳米粒子，结果见图3，获得均匀的上转换纳米粒子颗粒，粒径约20nm。
4)核酸适配子修饰到上转换纳米粒子上：取1mg上转换纳米粒子，在pH3条件下经盐酸去配体3小时后，离心重新分散在Tris缓冲液中。在Tris缓冲溶液中，加入0.1mL羧基核酸适配子溶液，反应过夜，离心半小时重新分散在Tris缓冲溶液中。其中，所述羧基核酸适配子为COOH-TBA15，其序列如SEQ ID NO.2所示，5’端带有羧基修饰，即所述羧基核酸适配子的序列为5’-COOH-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。所述羧基核酸适配子与上转换纳米粒子通过羧基配位结合。
5)凝血酶的检测：将步骤2)得到的核酸适配子标记的银纳米三角片与步骤4)得到的核酸适配子标记上转换纳米粒子混合，分别200pM、500pM、600pM三个不同浓度的凝血酶，通过近红外波长980nm波长激光激发，对近红外波段700-900nm范围内扫描，对808nm发射波长进行监测，根据发射光强下降情况，确定凝血酶的有无及先关浓度。实验结果如图4所示，控制对照光谱(无凝血酶)800nm发射最强，而光强随着添加凝血酶的浓度200pM，500pM，600pM而逐渐下降。。
结果显示，加入不同量的凝血酶，上转换发光光谱的下降情况不同，随着加入量的增加，光谱下降越多。
加入能产生变化的最低凝血酶浓度为189pM，如图5所示，加入189pM的凝血酶后，800nm发射的光谱略微下降。若无凝血酶，800nm发射将不会发射变化。
应当指出的是，上述实施例不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所
<120> 一种凝血酶的检测方法
<130> MP1621583
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttggtgtg gttgg 15

Claims (6)

1.一种检测凝血酶的组合物，其特征在于，包括标记有核酸适配子的银纳米三角片和标记有核酸适配子的上转换纳米粒子；所述银纳米三角片上标记的核酸适配子和上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为与凝血酶特异性结合的核苷酸序列；所述银纳米三角片上标记的核酸适配子为5’端带有巯基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列；所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为5’端带有羧基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列；所述银纳米三角片上标记的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述标记有核酸适配子的银纳米三角片的制备方法为将银纳米三角片与核酸适配子溶液混合过夜后离心，将离心后的沉淀分散于Tris缓冲溶液中。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的制备方法为上转换纳米粒子去配体后与核酸适配子溶液混合后离心，将离心后的沉淀分散于Tris缓冲溶液。
4.一种凝血酶的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将标记有核酸适配子的银纳米三角片溶液与标记有核酸适配子的上转换纳米粒子溶液混合均匀，得检测体系；
2)在所述检测体系中加入待检测样品，进行拉曼光谱检测；
所述银纳米三角片上标记的核酸适配子为5’端带有巯基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列；所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子为5’端带有羧基的与凝血酶特异性结合的核苷酸序列；所述银纳米三角片上标记的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述上转换纳米粒子上标记的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述标记有核酸适配子的银纳米三角片与所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的摩尔比为1:10～1:100；所述拉曼光谱的激发激光为波长为700～1000nm的近红外光，发射光为700～1000nm的近红外光。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述标记有核酸适配子的银纳米三角片与所述标记有核酸适配子的上转换纳米粒子的摩尔比为1:20。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述近红外光谱的激发激光为波长为980nm的近红外光，发射光为808nm的近红外光。
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