CN107727632B - 一种sers增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，属于纳米传感检测领域。本发明方法将凝血酶的两种适配体DNA分子分别修饰到Au@Ag纳米粒子和Ag纳米粒子的表面，通过控制纳米粒子表面的DNA修饰量，在存在凝血酶的条件下通过适配体分子与凝血酶的结合，两种纳米粒子形成相间排列的链状结构，并具有较强的拉曼信号增强效果，凝血酶含量越高，链状结构越长，拉曼信号强度越强，根据凝血酶含量和拉曼信号强度的对应关系，可以实现凝血酶的定量检测。本发明方法操作简单、灵敏度高、并且可以实现血清样本中的凝血酶检测，同时这种纳米结构组装体为其它以适配体为识别分子的目标物检测提供了重要的理论基础。
Description
技术领域
本发明属于纳米传感检测领域，具体涉及一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法。
背景技术
蛋白质是生命活动的主要载体，是生物功能的主要执行者，几乎所有的生理和病理过程均能引起蛋白质相应的变化，因此蛋白质检测在生命科学基础研究、人体健康评价、疾病诊断、药物和食品分析以及生物安全监控等方面具有很高的应用价值，而在生物医学诊断领域对与疾病相关蛋白的检测是一项非常重要的任务。
目前对于蛋白质检测的常用方法是基于抗原抗体特异性识别的免疫分析方法，主要包括蛋白质免疫印迹(Western Blot），酶联免疫吸附（ELISA）、亲和色谱和蛋白质芯片等，但是这种方法需要依赖于高灵敏高特异性的抗体的制备，而抗体的制备周期长、成本高，并且自身的稳定性易受环境温度、pH等条件的影响，从而导致抗体的活性和灵敏度降低，难以达到检测需求，使得此种方法存在一定的检测弊端。而基于色谱、质谱的仪器检测方法虽然具有较高的灵敏度，但是所需设备昂贵、需要专业的操作人员进行分析，在科研实验室中应用广泛，而限制了其广泛的应用。因此，开发高灵敏、高特异性、快速、准确、低沉本的检测方法局域非常重要的意义。
核酸适配体是通过体外筛选得到的一类单链DNA或RNA分子，这类分子能够发挥与抗体相同的亲和识别功能，但是具有优于抗体的特性，其可以体外大量合成，缩短了制备周期，DNA分子不易受环境等因素的影响，具有比抗体更高的稳定性，同时DNA分子易于修饰功能性基团，其引入的氨基、羧基、巯基、生物素、荧光素等分子更易进行传感检测方法的构建。因此随着纳米传感技术的发展，将纳米材料与适配体结合构建的纳米传感器在生物检测领域发挥着越来越重要的作用。其中应用最广泛的纳米粒子是纳米金、纳米银等贵金属纳米粒子，这种纳米粒子具有易于合成、小尺寸效应、表面效应、光学效应和良好的生物相容性。表面增强拉曼光谱是一种超灵敏的检测手段，甚至能达到单分子的检测水平，而金属纳米粒子的表面增强拉曼特性为SERS传感器的构建提供了重要的基底材料，由纳米粒子组装成的不同结构表现出不同的SERS增强效果，因此纳米组装体的研究成为SERS检测的重要研究方向。
发明内容
要解决的技术问题：对蛋白质进行检测的广泛应用的免疫学检测方法依赖抗体的使用，而抗体的制备周期长，并且抗体的稳定性容易受环境的影响，进一步影响检测结果的灵敏度和特异性。基于仪器的检测方法所需仪器价格昂贵，并且需要专业的操作人员进行复杂的样品前处理流程，限制了此类方法的普遍应用。
技术方案：一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，包括如下步骤：
（1）Au@Ag纳米粒子修饰凝血酶的一段适配体
将新合成的Au@Ag纳米粒子在7000r/min的转速下离心10min，去除上清，用0.01MpH7.2的PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬并浓缩两倍，测得纳米粒子的浓度为20nM，然后将29bp的凝血酶适配体DNA分子加入到Au@Ag纳米粒子溶液中，使得其终浓度为50nM，在室温下孵育4h，将纳米粒子在7000r/min条件下进行离心，以除去未结合的DNA分子，再用PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬；
29bp的适配体DNA序列：5’-SH-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’。
（2）Ag纳米粒子修饰凝血酶的另一段适配体
将新合成的Ag纳米粒子在10000r/min的条件下离心，去除上清并用0.01M pH7.2的PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬，并进行5倍浓缩，测得Ag纳米粒子的浓度为20nM，将15bp的凝血酶适配体DNA分子加入到Ag纳米粒子溶液中，使得其终浓度为50nM，在室温下孵育4h，将纳米粒子在10000r/min条件下进行离心，以除去未结合的DNA分子，再用PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬；
15bp的适配体DNA序列：5’-SH-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。
（3）链状纳米粒子的组装以及SERS信号进行凝血酶的检测
在步骤（1）和步骤（2）制备的DNA修饰的纳米粒子中加入终浓度为2~10μM的信标分子，
在室温下孵育2h后，将纳米粒子进行离心以去除未结合的信标分子，再用结合缓冲液将两种纳米粒子进行重悬；取等体积的两种纳米粒子溶液进行充分混合，然后将其分装到PCR管中，每管100μL，在每管中分别加入浓度为0pg/mL、0.001pg/mL、0.005pg/mL、0.01pg/mL、0.05pg/mL、0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL的凝血酶分子，在室温下孵育30~60min后，测定每管中SERS信号的强度。
本发明所述的基于链状纳米粒子组装检测凝血酶的SERS方法中步骤（1）中所述的步骤（1）中Au@Ag纳米粒子的粒径为50nm，Au核的粒径为20nm，Ag壳的厚度为15nm。
本发明所述的基于链状纳米粒子组装检测凝血酶的SERS方法中所述的Ag纳米粒子的粒径为20nm。
本发明所述的基于链状纳米粒子组装检测凝血酶的SERS方法中所述的信标分子为对氨基苯硫酚4-ATP。
本发明所述的基于链状纳米粒子组装检测凝血酶的SERS方法中所述的4-ATP的浓度为5μM。
本发明所述的基于链状纳米粒子组装检测凝血酶的SERS方法中所述的步骤（4）中的结合缓冲液为含150mM甘氨酸、10mM KCl、pH8.5的0.01M Tris缓冲液。
本发明所述的基于链状纳米粒子组装检测凝血酶的SERS方法中所述的步骤（4）中凝血酶和适配体修饰的纳米粒子的孵育时间为40min。
本发明所述的Au@Ag纳米粒子是以20nm的金纳米粒子为种子在其表面沉积银壳。20nm金纳米粒子合成的具体步骤为：在洁净的三口瓶中加入96mL的超纯水，再加入2.5质量浓度为0.4%的氯金酸，磁力搅拌并加热沸腾，10min后加入1.5mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠，溶液从无色变为酒红色后停止加热，继续搅拌15min，即得到20nm金纳米粒子。取5mL以上合成的金纳米粒子加入200μL质量浓度为1%的PVP溶液，100μL浓度为0.1M的抗坏血酸溶液，再加入70μL浓度为0.1mM的硝酸银溶液，混合均匀后，室温避光震荡反应1h即得20nm Au核、15nm厚度 Ag壳的50nm的Au@Ag纳米粒子。
本发明所述的银纳米粒子的合成步骤为：在100mL的锥形瓶中依次加入20mL超纯水、5mL 1%的PVP、0.5mL 0.01mol/L硼氢化钠和0.5mL1%柠檬酸三钠水溶液，置于冰浴条件。然后，将5mL 1%的PVP溶液和5mL 0.1%的硝酸银溶液装入针管中，并固定在微流注射泵的两边，以20mL/h的速度同时将两种溶液加入到锥形瓶中，在搅拌反应的状态下，溶液从无色逐渐变成深黄色，然后将反应体系置于80℃反应2h去除未反应的硼氢化钠，最后溶液变为亮黄色，即得粒径为20nm的银纳米粒子。
注：本发明所有的DNA分子由上海生工生物工程有限公司合成。
有益效果：由于银纳米粒子比金纳米粒子具有更强的拉曼增强效果，但是合成大粒径的粒径均一的银纳米粒子比较困难，而以金纳米粒子为核心表面包裹银壳的合成方法简单，不仅增强了拉曼信号强度同时还能保证纳米粒子的均一性，为后续纳米粒子的组装提供了便利。因此本发明以金纳米粒子为核心形成了Au@Ag的核壳结构，将Au@Ag纳米粒子和Ag纳米粒子分子分别修饰凝血酶的两种适配体DNA分子，并控制适配体DNA分子在纳米粒子上的修饰量，利用适配体分子与凝血酶的识别与结合，形成适配体—凝血酶—适配体的夹心结构，相应的Au@Ag纳米粒子和Ag纳米粒子形成相间排列的链状结构。所形成的链状结构的纳米粒子的接触位点具有较强的拉曼信号增强效果，并且凝血酶含量越高，链状结构越长，拉曼信号强度越强，根据凝血酶含量和拉曼信号强度的对应关系，可以实现凝血酶的定量检测。
附图说明
图1链状纳米结构的TEM图。
图2凝血酶检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，包括如下步骤：
（1）Au@Ag纳米粒子和Ag纳米粒子的合成
在洁净的三口瓶中加入96mL的超纯水，再加入2.5质量浓度为0.4%的氯金酸，磁力搅拌并加热沸腾，10min后加入1.5mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠，溶液从无色变为酒红色后停止加热，继续搅拌15min，即得到20nm金纳米粒子。取5mL以上合成的金纳米粒子加入200μL质量浓度为1%的PVP溶液，100μL浓度为0.1M的抗坏血酸溶液，再加入70μL浓度为0.1mM的硝酸银溶液，混合均匀后，室温避光震荡反应1h即得20nm Au核、15nm厚度 Ag壳的50nm的Au@Ag纳米粒子。
在100mL的锥形瓶中依次加入20mL超纯水、5mL 1%的PVP、0.5mL 0.01mol/L硼氢化钠和0.5mL1%柠檬酸三钠水溶液，置于冰浴条件。然后，将5mL1%的PVP溶液和5mL 0.1%的硝酸银溶液装入针管中，并固定在微流注射泵的两边，以20mL/h的速度同时将两种溶液加入到锥形瓶中，在搅拌反应的状态下，溶液从无色逐渐变成深黄色，然后将反应体系置于80℃反应2h去除未反应的硼氢化钠，最后溶液变为亮黄色，即得粒径为20nm的银纳米粒子。
（2）Au@Ag纳米粒子修饰凝血酶的一段适配体
将步骤（1）合成的Au@Ag纳米粒子在7000r/min的转速下离心10min，去除上清，用0.01M pH7.2的PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬并浓缩两倍，测得纳米粒子的浓度为20nM，然后将29bp的凝血酶适配体DNA分子加入到Au@Ag纳米粒子溶液中，使得其终浓度为50nM，在室温下孵育4h，将纳米粒子在7000r/min条件下进行离心，以除去未结合的DNA分子，再用PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬；
29bp的适配体DNA序列：5’-SH-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’。
（3）Ag纳米粒子修饰凝血酶的另一段适配体
将步骤（1）合成的20nm的Ag纳米粒子在10000r/min的条件下离心，去除上清并用0.01M pH7.2的PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬，并进行5倍浓缩，测得Ag纳米粒子的浓度为20nM，将15bp的凝血酶适配体DNA分子加入到Ag纳米粒子溶液中，使得其终浓度为50nM，在室温下孵育4h，将纳米粒子在10000r/min条件下进行离心，以除去未结合的DNA分子，再用PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬；
15bp的适配体DNA序列：5’-SH-GGTTGGTGTGGTTGG-3’；
（4）链状纳米粒子的组装以及凝血酶检测灵敏度的分析
在步骤（2）和步骤（3）制备的DNA修饰的纳米粒子中加入终浓度为5μM的信标分子4-ATP，
在室温下孵育2h后，将纳米粒子进行离心以去除未结合的信标分子，再用结合缓冲液（含150mM甘氨酸、10mM KCl、pH8.5的0.01M Tris缓冲液）将两种纳米粒子进行重悬；取等体积的两种纳米粒子溶液进行充分混合，然后将其分装到PCR管中，每管100μL，在每管中分别加入浓度为0pg/mL、0.001pg/mL、0.005pg/mL、0.01pg/mL、0.05pg/mL、0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL的凝血酶分子，在室温下孵育40min后，测定每管中SERS信号的强度。根据每种凝血酶浓度下SERS信号只得出，在0.001~0.5pg/mL的浓度范围内，凝血酶检测的线性关系良好，并通过计算得出检测的灵敏度为0.27×10-3pg/mL。
（5）实际样本检测分析
在人血清中添加浓度为0.006 pg/mL、0.02 pg/mL、0.04 pg/mL、0.1 pg/mL、0.2pg/mL的凝血酶，用此方法测定添加回收结果，凝血酶在人血清中检测的添加回收率在96.5~98.3%范围内，可以实现实际样本的检测。
Claims (7)
1.一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）Au@Ag纳米粒子修饰凝血酶的一段适配体
将新合成的Au@Ag纳米粒子在7000r/min的转速下离心10min，去除上清，用0.01MpH7.2的PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬并浓缩两倍，测得纳米粒子的浓度为20nM，然后将29bp的凝血酶适配体DNA分子加入到Au@Ag纳米粒子溶液中，使得其终浓度为50nM，在室温下孵育4h，将纳米粒子在7000r/min条件下进行离心，以除去未结合的DNA分子，再用PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬；
29bp的适配体DNA序列：5’-SH-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’；
（2）Ag纳米粒子修饰凝血酶的另一段适配体
将新合成的Ag纳米粒子在10000r/min的条件下离心，去除上清并用0.01M pH7.2的PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬，并进行5倍浓缩，测得Ag纳米粒子的浓度为20nM，将15bp的凝血酶适配体DNA分子加入到Ag纳米粒子溶液中，使得其终浓度为50nM，在室温下孵育4h，将纳米粒子在10000r/min条件下进行离心，以除去未结合的DNA分子，再用PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬；
15bp的适配体DNA序列：5’-SH-GGTTGGTGTGGTTGG-3’；
（3）链状纳米粒子的组装以及SERS信号进行凝血酶的检测
在步骤（1）和步骤（2）制备的DNA修饰的纳米粒子中加入终浓度为2~10μM的信标分子，
在室温下孵育2h后，将纳米粒子进行离心以去除未结合的信标分子，再用结合缓冲液将两种纳米粒子进行重悬；取等体积的两种纳米粒子溶液进行充分混合，然后将其分装到PCR管中，每管100μL，在每管中分别加入浓度为0pg/mL、0.001pg/mL、0.005pg/mL、0.01pg/mL、0.05pg/mL、0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL的凝血酶分子，在室温下孵育30~60min后，测定每管中SERS信号的强度。
2.根据权利要求1所述的一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，其特征在于所述的步骤（1）中Au@Ag纳米粒子的粒径为50nm，Au核的粒径为20nm，Ag壳的厚度为15nm。
3.根据权利要求1所述的一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，其特征在于所述的Ag纳米粒子的粒径为20nm。
4.根据权利要求1所述的一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，其特征在于所述的信标分子为对4-ATP。
5.根据权利要求4所述的一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，其特征在于所述的4-ATP的浓度为5μM。
6.根据权利要求1所述的一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，其特征在于所述的步骤（3）中的结合缓冲液为含150mM甘氨酸、10mM KCl、pH8.5的0.01M Tris缓冲液。
7.根据权利要求1所述的一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，其特征在于所述的步骤（3）中凝血酶和适配体修饰的纳米粒子的孵育时间为40min。
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