KR20200043915A - 생체물질 검출용 미세 입자 및 이를 이용한 생체물질 검출방법 - Google Patents

생체물질 검출용 미세 입자 및 이를 이용한 생체물질 검출방법 Download PDF

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Abstract

자석 반응 금속을 포함하는 코어, 및 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층을 구비한 코어-쉘 구조의 미세 입자; 및 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하는 생체물질 검출용 미세 입자가 제공된다.

Description

생체물질 검출용 미세 입자 및 이를 이용한 생체물질 검출방법{Microparticles for detecting biomaterials and method of detecting biomaterials using the same}
본 명세서에 개시된 기술은 생체물질 검출용 미세 입자 및 이를 이용한 생체물질 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 관심 대상 생체물질을 면역 진단의 방법을 이용하여 저비용으로 신속하고 고감도로 다중 검출할 수 있는 신규한 미세 입자 및 검출방법에 관한 것이다.
체외진단(IVD)은 인체로부터 채취된 혈액, 소변, 세포 등의 대상물을 분석하여 건강 상태를 진단할 수 있게 하는 기술로서, 면역 진단, 자가 혈당 측정, 분자 진단 기술이 있다. 이중 면역 진단 기술은 질병의 원인이 되는 특정 단백질의 유무를 항원-항체 반응을 통해 측정하는 것을 기초로 하여 매우 다양한 질환의 진단과 추적에 활용될 수 있다. 다만 면역 진단 기술은 타겟 단백질이 감지한계 이상의 농도로 존재하여야 진단이 가능한 단점이 있어, 낮은 농도의 단백질 발생 신호를 증폭하기 위해 다양한 기술이 개발되어 왔다.
특히 최근에는 합성화학과 생명과학의 발전으로 신약개발 및 진단 등의 분야에 있어 분석될 표적물질이 다양화되고, 극미량의 표적물질을 검출하기 위해 고감도의 신호발생을 보장하는 검출방법들 중 하나로서, 자성 입자들을 이용하는 여러 가지 방법들이 보고되어 왔다.(Modern magnetic immunoassay: Biophysical and biochemical aspects (2017) Regul. Mech. Biosyst., 9(1), 47-55)
종래의 자성 입자를 이용한 면역진단은 나노미터 단위 크기의 자성 입자를 사용하고 실리카로 표면을 개질된 것을 이용하여 왔다. 그런데 이러한 실리카 개질 표면을 갖는 자성 입자들은 면역 반응을 수행하는 웰 내부에서 효과적으로 추출하거나 방출하는데 어려움이 있다. 즉 이러한 작은 크기의 자성 입자는 용액 상태에서 흔히 부유하는 상태로 존재하여 분리하기가 용이하지 않아, 정량분석보다는 정성분석에 사용되는 경우가 많았다. 또한, 종래의 분석방법들은 한 번에 하나의 자성입자만을 검사할 수 있어서 시간이 오래 걸리고 검사가 복잡해지는 문제점이 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 자석 반응 금속을 포함하는 코어, 및 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층을 구비한 코어-쉘 구조의 미세 입자; 및 생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하는 생체물질 검출용 미세 입자가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 자석 반응 금속을 포함하는 코어, 및 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층을 구비한 코어-쉘 구조의 미세 입자를 제공하는 단계; 및 상기 쉘 층 위에 생체물질을 포획하기 위한 포획 프로브를 도입하는 단계를 포함하는 생체물질 검출용 미세 입자의 제조방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, (a) 상술한 생체물질 검출용 미세 입자를 제공하는 단계; (b) 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제공하는 단계; (c) 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 생체물질 검출용 미세입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출하는 단계를 포함하는 생체물질의 검출방법이 제공된다.
도 1은 생체물질 검출용 미세 입자의 일 구현예를 나타낸다.
도 2는 본 개시된 기술의 일 구현예에 따른 유리 코팅된 미세 입자(좌측)와 종래의 TEOS를 이용하여 실리카 코팅된 자성 입자(우측)의 표면을 나타내는 주사전자현미경 사진이다.
도 3은 일 구현예에 따른 마이크로로드 형태의 생체물질 검출용 미세 입자의 이미지이다.
도 4는 ELISA 방식(위)과 형광측정 방식(아래)에 의해 목적 단백질(target protein)을 검출하는 항원-항체 반응을 나타내는 모식도이다.
도 5는 면역반응 물질에 검출대상 항원이 적하된 경우의 반응을 나타낸 것으로, 면역진단에 사용된 포획항체가 결합된 마이크로로드, 시료액의 검출대상 항원, 검출항체와 형광이 결합된 형광-복합체의 구조와 작용원리를 나타낸 것이다.
도 6은 면역반응을 신속하게 진행하기 위해 자석봉과 히팅 블록을 이용한 혼합과 가열 과정을 나타낸 것이다.
도 7은 비특이적 물질을 제거하기 위한 마이크로로드와 자석봉의 세척 과정을 나타낸 것이다.
도 8은 마이크로로드의 표면을 아미노-실란화시키는 공정과 FITC에 의해 그 결과를 확인한 실험의 모식도이다.
도 9는 마이크로로드에 고정화된 항체의 균일도 및 세기(항체량)를 측정한 것으로, 구체적으로는 마이크로로드의 표면에 포획항체가 고정화된 마이크로로드 결합체에 검출항체-형광 복합체를 결합시킨 후의 명시야(bright field) 현미경 이미지(좌측)와 형광 현미경 이미지(우측)를 나타낸 것이다.
도 10은 TSH 항체를 자성입자 표면에 고정 후 관찰한 명시야 이미지 및 형광 이미지이다.
도 11은 TSH 농도에 따른 형광세기 값을 나타낸다.
도 12는 Human γ- interferon 항체를 자성입자 표면에 고정 후 관찰한 명시야 이미지 및 형광 이미지이다.
도 13은 1x 렌즈를 사용하여 200ms 노출시간동안 관찰한 γ- interferon 농도별 명시야 및 형광 신호 이미지와 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 14는 1x 렌즈를 사용하여 300ms 노출시간으로 관찰한 명시야 및 암시야 이미지와 형광세기를 나타낸 그래프이다.
도 15는 IFN-γ나 IL-10의 사이토카인을 자성입자에 각각 고정화 시켜 다중면역진단이 가능한지 실험한 결과이다.
이하, 본 명세서에 개시된 기술에 대해 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 본 명세서에서 어떠한 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 별도의 언급이 없는 한, 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다. 본 명세서에서 "상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 다른 층(중간층) 또는 구성 요소가 개재되거나 존재할 수 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 따르면, 생체물질 검출용 미세 입자가 제공된다. 도 1은 생체물질 검출용 미세 입자의 일 구현예를 나타낸다.
생체물질 검출용 미세 입자(100)는 자석 반응 금속을 포함하는 코어(110), 및 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층(120)을 구비한 코어-쉘 구조의 미세 입자(130); 및 생체물질을 포획하기 위해 쉘 층(120) 위에 도입된 포획 프로브(140)를 포함한다.
미세 입자(130)의 코어(110)는 자석 반응 금속을 포함하는데, 상기 자석 반응 금속은 상자성 물질일 수 있다. 예를 들어 상기 자석 반응 금속은 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn)을 포함한 합금일 수 있다. 상기 자석 반응 금속은 철, 니켈, 코발트, 망간 등과 같은 전이금속을 주성분으로 하여 가돌리늄(Gd), 터븀(Tb), 사마륨(Sm) 등과 같은 희토류 금속을 포함할 수 있고, 기타 붕소(B), 규소(Si), 탄소(C) 등을 포함할 수 있다. 상기 자석 반응 금속의 대표적인 예로서 철 합금 또는 코발트 합금을 들 수 있다. 구체적인 철 합금의 예로 Fe70B15Si10C5를 들 수 있고, 코발트 합금의 예로 Co68Mn7Si10B15를 들 수 있다.
바람직하게는 미세 입자(130)는 영구자석이나 전자석과 같은 외부 자석에 의해 신속하게 수집되거나 분리될 수 있도록 수상에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것이 바람직하다. 코어(110)는 미세 입자(130) 총 부피의 60% 이상을 차지할 수 있다. 예를 들어 코어(110)는 미세 입자(130) 총 부피의 60 내지 99%, 바람직하게는 75 내지 99%일 수 있다. 또한 미세 입자(130)는 그 크기(예를 들어 직경 또는 길이)가 수십 내지 수백 ㎛ 정도일 수 있으며, 비중은 5 이상인 것이 바람직하다. 미세 입자(130)가 1 마이크로미터 미만의 크기를 갖는 나노입자일 경우 높은 비중을 가지는 입자(ex: 철의 경우 7.876)라 하더라도 수중에서 부유할 수 있다. 이 경우 미세 입자(130)를 이용하여 웰 내의 생체물질을 검출하는 바이오 어세이 과정에서 자장 인가 시 미세 입자의 낮은 자력으로 말미암아 상기 미세입자의 자성 제어가 원활하지 않아 분리에 어려움을 겪을 수 있다. 면역 반응을 촉진시키기 위해 자석봉을 웰 내에서 상하 이동할 때 미세 입자들의 탈부착이 발생하는데, 자석봉이 상하 이동하는 과정에서 자석봉에 한번 부착된 미세 입자들이 낮은 무게로 인하여 자기장을 제거하여도 웰 바닥으로 다시 떨어지지 않고 자석봉에 비특이적 결합으로 계속 잔존할 수 있다. 이 경우 웰 내 생체물질을 검출할 때 정량분석의 재현성이 저하될 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 생체물질 검출용 미세 입자의 경우 바이오어세이에서 종래 사용되는 실리카 비드에 비해서 그 크기가 매우 크고, 통상 자성 입자들이 실리카 내부에 분산되어 있는 종래의 실리카 비드와 달리 자석 반응 금속(자성 코어)이 미세 입자의 대부분의 부피를 차지하여 자력에 민감하게 반응하므로 정량분석 시 재현성이 우수하다.
한편, 본 생체물질 검출용 미세 입자(100)는 중심부에 자석 반응 금속이 있고 그 주위를 둘러싼 쉘 층(shell layer)을 구비함으로써 코어-쉘 구조를 형성하는데, 쉘 층(120)은 유기물 또는 무기물로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 유리(glass)이다. 또한 표면에 항체, 단백질 등의 포획 프로브를 고정시킬 수 있다. 바람직하게는 이를 위해 표면에 히드록시기, 아민기, 카르복실기와 같은 기능기가 도입된 것일 수 있다.
쉘 층(120)은 미세 입자(130)를 실질적으로 완전히 둘러쌀 수도 있지만, 필요시 또는 제조 과정에서 미세 입자의 표면이 쉘 층으로 완전히 덮이지 않고 미세 입자 표면의 일부 영역이 노출될 수도 있다.
쉘 층(120)의 두께는 1 내지 100㎛, 바람직하게는 1 내지 50㎛, 더 바람직하게는 1 내지 10㎛, 더더욱 바람직하게는 4 내지 8㎛일 수 있다. 쉘 층(120)의 두께가 상기 범위 미만에서는 쉘 층(120)의 표면이 부서지거나 크랙이 쉽게 발생 될 수 있고, 상기 범위 초과에서는 글라스 절단 가공시 레이저 특성 및 파장에 따른 문제가 발생할 수 있다.
상기 코어-쉘 구조는 코어 금속에 액상의 쉘 성분을 도포하여 형성되거나 중공형 틀에 코어 금속 성분을 충진하여 형성된 것일 수 있다.
쉘 층(120)은 유기물 또는 무기물의 액상 코팅액으로부터 고화된 것일 수 있다. 좀 더 구체적으로 쉘 층(120)은 유기물 또는 무기물 형태의 쉘 성분을 고온에서 녹이거나 흐름성이 있게 만드는 방식 또는 용매 중에 녹이는 방식을 통해 액상 코팅액을 만든 후 코어 금속에 도포하여 형성될 수 있다. 상기 유기물은 주로 고분자일 수 있고, 상기 무기물은 금속 혹은 세라믹, 특히 유리일 수 있다. 예를 들어, 쉘 층(120)을 형성하기 위해 플라스틱을 용매에 녹이거나 유리를 용융하여 얻은 코팅 액을 딥코팅, 스프레이코팅 등의 방식으로 미세 입자(130)에 도포할 수도 있다.
한편, 중공형 틀로서 유리 관을 사용하는 경우를 예를 들어 설명하면, 유리 관 안에 금속 분말을 투입 후 금속을 높은 온도에서 용융시키며 유리 관을 인발시키는 방식, 먼저 유리 재료를 인발하면서 그 내부에 용융된 금속을 주입시키는 방식, 금속 분말을 자외선 경화형 물질에 분산시킨 분산액을 유리 관 내에 충진한 후 자외선을 조사하여 경화시키는 방식 등이 있다. 이러한 방식들의 경우 중공형 틀 자체가 쉘 층이 될 수 있다.
상술한 방식으로 얻어진 미세 입자(130)는 표면 균일도가 매우 뛰어나다. 종래 바이오 어세이용 입자의 경우, 쉘 층(120)을 형성하기 위해 TEOS와 같은 실리카 전구체를 이용하여 코어 입자 표면 위에 성장시키는데, 이 경우 쉘 층(120)은 매우 거친 표면을 갖게 된다. 그리하여 검출대상 물질의 비특이적 결합이 많이 발생할 수 있다. 이는 불필요한 백그라운드 노이즈를 발생시키는 원인이 될 수 있다.
반면 쉘 층(120)을 형성하는 유리(glass), 예를 들어 보로실리케이트 글라스(Borosilicate glass)는 반응 시료와 화학적 반응에 의한 흡착에 의한 비특이적 반응(non-specific binding)이 거의 없다. 특히 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 미세 입자(130)는 액상의 성분으로부터 유래된 코팅 층을 쉘 층(120)으로 가지고 있으므로 매우 균일한 표면을 갖는다. 쉘 층(120) 표면의 평균 표면 거칠기(Ra)는 15nm 이하, 바람직하게는 10nm 이하, 더 바람직하게는 5nm 이하, 더욱 바람직하게는 2nm 이하, 특히 1.5nm 이하일 수 있다. 또한 Ra는 예를 들어 3nm 이상, 2nm 이상, 1nm 이상일 수 있다. 상기 범위의 표면 거칠기를 가질 경우 쉘 층(120) 표면에 반응 시료의 비특이적 흡착이 최소화될 수 있다.
도 2는 본 개시된 기술의 일 구현예에 따른 유리 코팅된 미세 입자(좌측)와 종래의 TEOS를 이용하여 실리카 코팅된 자성 입자(우측)의 표면을 나타내는 주사전자현미경 사진이다. 도 2를 참조하면, 본 개시된 기술의 일 구현예에 따른 유리 코팅된 미세 입자가 종래의 실리카 코팅 자성 입자에 비해 표면 균일도가 매우 우수함을 알 수 있다.
강도 및 투명도를 고려하여 미세 입자(130)의 쉘 층은 유리로 된 것일 수 있다. 상기 유리는 소다라임, 보로실리케이트, 알루미노실리케이트, 실리카, 알칼리 실리케이트, 파이렉스 및 석영으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물이 주성분이 될 수 있다. 바람직하게는 내열성, 내산성, 내수성이 요구되는 실험용으로 상기 유리는 보로실리케이트일 수 있다.
미세 입자(130)는 막대형, 평판형, 구형 등과 같은 정형적인 형태나 비정형적인 형태를 포함한 다양한 형태를 가질 수 있다. 미세 입자(130)가 평판 형태를 가질 경우에도 단면은 별형, 다각형, 원형 등의 다양한 모양을 가질 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 미세입자는 제조의 편이성과 관찰의 용이성으로 마이크로로드(microrod), 마이크로디스크(microdisc), 또는 마이크로비드(nicrobead) 형태인 것이 바람직하며, 특히 마이크로로드의 형태를 갖는 것이 바람직하다. 미세 입자(130)가 마이크로로드의 형태를 가질 경우 미세 입자들 간의 겹침에 의한 구분이 용이하고, 웰 내에 배치될 경우 포커싱이 쉬우며, 개별 입자가 차지하는 면적이 적어 하나의 관찰화면에 다수의 미세 입자들을 관찰할 수 있다. 한편 미세 입자가 별 모양과 같이 단면이 복잡한 구조를 갖는 형상을 가질 경우 웰 내부에서 움직이는 과정에서 서로 간 또는 벽과의 충돌에 의하여 모서리 부분의 깨짐이 발생할 수 있으므로 마이크로로드와 같이 단순한 형태를 갖는 것이 유리하다.
상기 마이크로로드의 길이가 10 내지 1,000㎛일 수 있다. 상기 마이크로로드의 길이가 상기 범위 미만에서는 서로 다른 길이의 입자간의 구분이 쉽지 않고, 상기 범위 초과에서는 입자들의 겹침이 발생할 수 있어 관찰이 용이하지 않을 수 있다. 또한, 상기 마이크로로드의 직경 대비 길이의 비(종횡비)는 2 이상, 5 이상 또는 10 이상일 수 있다. 종횡비가 상기 범위 미만에서는 구형의 미립자와 유사하여 서로 구별하기가 어려울 수 있으며 너무 크면 휘어질 수 있다.
바람직한 일 구현예로서, 미세 입자(130)는 유리가 코팅된 금속 미세와이어의 절단물일 수 있다. 유리가 코팅된 금속 미세와이어를 레이저로 단순히 절단함으로써 다양한 길이를 갖는 미세 입자(130)를 얻을 수 있다.
상술한 미세 입자(130)는 생명체로부터 유래된 특정 시료액 내의 생체물질을 검출하는 체외진단용으로 적합하게 사용될 수 있다. 상기 시료액은 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 신속 진단을 위해 상기 시료액의 전처리는 간소화되거나 경우에 따라서 생략될 수 있다.
상기 생체물질은 바이오마커, 혈액, 혈장, 혈청, 체액, 단백질, 펩타이드, 핵산, 박테리아, 바이러스, 소포체, miRNA, 엑소좀, 순환종양세포 등일 수 있다. 바람직하게는 상기 생체물질은 바이오마커일 수 있다. 특히 본 명세서에 개시된 기술은 한 번의 검사에서 여러 종의 생체물질을 검출하여 신속하게 질병을 조기진단할 수 있다는 점에서 바이오마커 검출용으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 상기 바이오마커는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가 등의 통상적인 과학 또는 의료분야에서 사용되는 것이면 제한 없이 이용가능하다. 상기 바이오마커는 예를 들어 혈액, 타액, 소변 등의 생체액에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있으며, 구체적으로 갑상선자극호르몬(TSH), 자유 T4, 당뇨 특이항원 HbA1c, 전립선암 특이항원 PSA, 자궁경부암 마커 및 유방암 마커로 이루어진 군중에서 선택될 수 있다.
시료액 내의 상기 생체물질을 포획하기 위해 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 입자는 쉘 층(120) 위에 포획 프로브(140)가 도입될 수 있다. 포획 프로브(140)는 상기 생체물질과 특이적으로 결합하여 상기 생체물질을 미세 입자(130)에 포획시키는 역할을 한다. 포획 프로브(140)는 항체, 단백질, 핵산 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 바이오마커와 특이적으로 결합하여 포획할 수 있는 포획항체일 수 있다. 포획 프로브(140)는 미세 입자(130)의 표면에 흡착시키거나 화학적으로 연결시켜 고정시킬 수 있으며, 바람직하게는 쉘 층(120)의 표면의 기능기와 연결될 수 있다. 예를 들어 포획 프로브(140)의 표면에 비오틴(biotin)을 도입하고 미세 입자(130)에는 비오틴과 결합하는 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘(strepavidin)을 도입하여 포획 프로브(140)를 미세 입자(130)에 부착시킬 수 있다. 또는 미세 입자(130) 표면의 히드록시기, 아미노기 또는 카르복실기를 이용하여 포획 프로브(140)를 미세 입자(130)에 연결시킬 수 있다.
상술한 생체물질 검출용 미세 입자를 이용하면 시료액 중의 원하는 생체물질을 고감도로 신속하게 분석할 수 있다. 도 3은 일 구현예에 따른 마이크로로드 형태의 생체물질 검출용 미세 입자의 이미지이다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 생체물질 검출용 미세 입자의 제조방법이 제공된다.
상기 생체물질 검출용 미세 입자의 제조방법의 일 구현예에 따르면, 먼저 (a) 자석 반응 금속을 포함하는 코어, 및 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층을 구비한 코어-쉘 구조의 미세 입자를 제공한다. 다음 (b) 상기 쉘 층 위에 생체물질을 포획하기 위한 포획 프로브를 도입한다. 일 구현예에서 상기 미세 입자는 표면이 유리(글라스)로 코팅된 마이크로로드일 수 있다. 상기 포획 프로브의 도입을 위해 상기 미세 입자는 적절히 표면 개질될 수 있다. 예를 들어 유리로 코팅된 마이크로로드에 대해 i) 유기용매, 염기 용액, 피란하(piranha) 용액으로 차례로 세정함으로써 로드의 표면 글라스를 Si-OH(실란올; silanol)로 개질시킨다. 다음 ii) 상기 표면 Si-OH에 대해 아세톤 또는 톨루엔 용매에 녹인 APTES(3-aminopropyltriethoxy silane) 용액을 처리하여 실란화 및 큐어링하는 공정으로 아미노-실란화시킬 수 있다. 또한 상기 마이크로로드의 표면 개질은 상기 이후에 감마-부티로락톤(γ-butyrolactone) 또는 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 반응시켜 상기 아민기를 카르복실기로 치환시킬 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 상술한 생체물질 검출용 미세 입자를 이용한 생체물질의 검출방법이 제공된다. 본 검출방법은 a) 상술한 생체물질 검출용 미세입자를 제공하는 단계, b) 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제공하는 단계, c) 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 생체물질 검출용 미세입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성시키는 단계, 및 d) 상기 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 검출 프로브는 상기 포획 프로브와 마찬가지로 상기 생체물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 단백질, 핵산 또는 압타머일 수 있으며, 예를 들어 바이오마커와 특이적으로 결합하며 발광물질을 구비한 검출항체일 수 있다.
상기 검출항체 및 상기 포획항체는 일반 면역진단에 쓰이는 항원에 대한 항체일 수 있다. 예를 상기 항원은 갑상선자극호르몬(TSH), 자유 T4, 당뇨 특이항원 HbA1c, 전립선암 특이항원 PSA, 자궁경부암 항원 또는 유방암 항원일 수 있다.
상기 발광물질은 상기 검출 프로브에 연결되어 자외선, 전자선, 화학반응, 효소-기질 반응 등과 같은 외부 자극에 의해 빛을 생성함으로써 상기 생체물질의 존재를 검출할 수 있게 한다. 상기 발광물질의 예로서, 형광분자, 양자점, 금속 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질 등을 들 수 있다. 이들 중 입수용이성 및 적용의 편이성 면에서 상기 발광물질로서, FITC(fluorescein isothiocyanate), 플루오레세인(fluorescein), FAM(fluorescein amidite), PE(phycoerythrin), TRITC(tetramethyl-rhodamine isothiocyanate), Cy3(Cyanine 3), Cy5(Cyanine 5), Cy7(Cyanine 7), 알렉사(Alexa) 플루오르 염료, 및 로다민 (rhodamine)으로 이루어진 군에서 선택되는 형광분자가 흔히 사용될 수 있다.
상기 검출방법은 면역진단 방법으로 수행될 수 있다. 상기 생체물질 검출용 미세입자-생체물질-검출 프로브의 복합체는 예를 들어 상기 포획항체가 고정화된 미세 입자 및 상기 생체물질에 특이적으로 결합하는 검출항체 및 상기 생체물질을 포함하는 시료액을 반응 튜브에서 혼합하여 만들 수 있다. 이때 상기 반응 튜브에서 상기 생체물질과 상기 미세 입자 사이의 제1 면역반응 및 상기 생체물질과 상기 검출항체 사이의 제2 면역반응을 동시에 유도함으로써 생체물질 검출용 미세입자-생체물질-검출 프로브의 복합체가 얻어질 수 있다.
상기 복합체의 형성은 외부 자력을 이용한 반응 촉진 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어 면역반응의 촉진을 위해 상기 반응 튜브는 히팅 블록(heating block)에 올려져 적절한 온도로 가열되고, 상기 반응 튜브의 내부에 자석봉을 상하로 연속적으로 이동시킴으로써 면역반응 물질들을 빠르게 혼합시킬 수 있다.
또한 상기 생체물질의 검출방법은 외부 자력을 이용한 상기 복합체의 세척 과정이 포함될 수 있다. 즉 상기 제1 및 제2 면역반응이 완료된 후, 상기 생체물질 검출용 미세입자-생체물질-검출 프로브의 복합체와 자석봉을 2개 이상의 세척 튜브에서 연속적으로 세척시키는 단계가 더 포함될 수 있다. 세척 후에 상기 복합체로부터의 발광 신호를 검출하여 상기 생체물질의 종류 및 양을 정확히 확인할 수 있다.
상기 발광 신호의 검출은 예를 들어 ELISA 방법 또는 형광측정 방법으로 수행될 수 있다.
도 4는 ELISA 방식(위)과 형광측정 방식(아래)에 의해 목적 단백질(target protein)을 검출하는 항원-항체 반응을 나타내는 모식도이다.
좀더 구체적으로 설명하면, ELISA 방법은 시료 안에 있는 검출대상 물질을 거대자성입자에 고정되어 있는 포획 항체에 바인딩되도록 하고 그 후 검출항체를 처리한다. 이 검출항체는 포획항체가 바인딩한 검출대상 물질의 반대편 쪽에 바인딩한다. 검출항체에는 호스 래디시 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase, HRP)라는 효소가 콘쥬게이션(conjugation)되어 있어 TMB 기질을 과산화수소를 이용하여 분해하여 색깔을 내게 한다. 이 색깔의 정도를 OD 값으로 측정한다. 즉 이 방법은 시료에 검출대상 물질이 많아짐에 따라 비례하여 포획항체 및 검출항체가 정량적으로 많이 붙고, 그 결과 검출항체에 콘쥬게이션되어 있는 HRP가 많아져 효소반응이 상대적으로 빠르게 진행되어 TMB 기질의 색깔이 빠르게 변하는 원리를 이용한 것이다. 사전에 미리 검출대상 물질을 임의로 여러 농도를 처리하여 얻은 OD값을 가지고 표준곡선(standard curve)를 그린 다음, 실제 시료를 처리한 후에 얻은 OD값을 표준곡선과 대비함으로써 시료 내의 검출대상 물질의 양을 측정할 수 있다. 이때 모든 OD값 산출 및 농도계산은 분석기기에 설치되어있는 자동 분석 프로그램으로 실시할 수 있다.
형광측정 방법은 포획항체 및 검출항체를 사용하여 샌드위치 어세이를 하는 원리는 ELISA 방법과 동일하나 검출항체에 HRP 효소 대신 비오틴(biotin) 물질을 컨쥬게이션시킨 후 스트렙타비딘(streptavidin)과 콘쥬게이션되어 있는 형광물질을 처리해서 형광값을 측정한다. 포획항체에 먼저 TSH 단백질을 반응시켜 붙이고 그 후에 비오틴(biotin) 물질이 콘쥬게이션되어 있는 검출항체를 처리하여 검출항체를 포획항체가 TSH와 붙은 곳이 아닌 다른 쪽의 TSH에 붙인다. 그 후 스트렙타비딘과 콘쥬게이션되어 있는 형광물질 e-flour를 처리해서 미세 입자들 각각의 형광 신호를 측정한다. 검체에 속해있는 진단마커의 농도가 높을수록 자성입자의 형광신호가 강해지는 원리에 따라 명시야 현미경(bright field microscope)으로 반응 웰 안에서의 미세 입자들의 위치를 확인하고 그 위치에 해당되는 형광신호를 픽셀 단위로 측정하며, 10개 내외의 미세 입자들로부터 나오는 형광 신호를 자동 이미지 분석을 한다. 검출하고자 하는 대상물질을 농도별로 반응시켜 동일한 방법으로 나온 형광 값을 이용하여 그래프를 그린 표준 곡선(standard curve)에 시험 검출에서 나온 형광값을 적용시켜 최종 시료 안에 들어 있는 해당 검출대상 단백질의 검출 농도값을 산출한다. 모든 이미지 분석 및 형광값의 산출은 분석기기내에 설치되어있는 자동 이미지 분석 프로그램으로 실시한다. 도 5는 미세 입자를 이용한 TSH 농도별 형광실험 결과이다. 도 5의 (a)는 농도별 명시야(bright-field) 이미지와 형광 이미지이고, (b)는 10개의 미세 입자들을 이용하여 TSH 농도별로 형광값(medium)과 형광 CV값(%)을 측정한 결과를 나타낸 표이며, (c)는 TSH 농도별 형광 값을 나타낸 그래프이다. 도 5를 참조하면, TSH 농도에 따라 형광의 세기가 밝아지는 것을 뚜렷하게 확인할 수 있다.
이하 좀더 구체적으로 생체물질 검출용 미세 입자로서 마이크로로드를 사용하여 생체물질을 검출하는 과정의 일 구현예를 단계별로 설명한다.
제 1 단계: 마이크로로드의 제조 및 표면 처리
생체물질 검출용 미세 입자로 사용되는 마이크로로드를 준비하기 위하여, 본 출원인의 대한민국 특허공개공보 10-2018-0130436에 기재된 내용에 따라 유리 코팅된 미세와이어를 제조한다. 이어서 상기 미세와이어를 적절한 크기로 절단한다. 예를 들어 절단된 상기 미세와이어의 길이는 100~500㎛이고, 금속 코어의 직경은 50㎛, 코어를 둘러싼 유리 코팅의 두께는 5㎛이다. 따라서, 직경 60㎛, 길이가 100~500㎛인 최종 마이크로로드가 제조된다.
검체의 항원과 결합하는 포획항체를 상기 마이크로로드에 결합시킨다. 이를 위하여 마이크로로드의 유리 표면을 적절히 개질시킨다. 표면 개질은 아미노기 또는 카르복실기로 치환할 수 있다. 아민기 치환을 위해 로드의 표면 유리를 Si-OH(실란올; silanol)로 개질시킨 후 실란화 공정과 큐어링 공정을 통해 유리의 표면을 아미노-실란으로 개질시킬 수 있다.
상기 아미노-실란으로 표면 개질된 마이크로로드를 이용하여 포획항체를 고정화시킬 수도 있으나, 바람직하게는 상기 아미노기를 카르복실기로 치환시킨 마이크로로드를 이용할 수 있다. 1.5 ml E-tube에서 대략 상기 마이크로로드 1만개가 처리될 수 있다. 카르복실기 치환을 위해 감마-부티로락톤(γ-butyrolactone)을 사용하거나 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 사용할 수 있으며 바람직하게는 감마-부티로락톤이 좀더 효과적이다. 보다 자세한 내용은 하기 실시예에 기재한다.
제 2 단계: 포획항체가 고정화된 마이크로로드 결합체의 제조
상기 1 단계에서 제조한 (바람직하게는 카르복실기로) 표면 개질된 마이크로로드를 사용하여 시료액 내의 목표로 하는 바이오 마커 항원에 특이적으로 결합하는 포획항체를 고정시킨 마이크로로드 결합체를 제조한다. 상기 마이크로로드의 유리 코팅에 원하는 항체를 비특이적 반응으로 결합시킬 수 있다. 상기 포획항체는 시료액 등에 함유된 검출대상 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
제 3 단계: 면역반응 물질의 준비 단계
시료액 내 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체-형광물질 복합체(conjugate)를 준비한다. 이때, 만일 상기 시료액에는 복수 개의 마커 항원을 검출하고자 한다면, 각기 다른 형상(예를 들면, 다른 길이)의 마이크로로드를 준비한다. 각 마이크로로드는 상기 시료액에 포함된 복수 개의 마커중에서 각각 특정 마커만을 포획할 수 있는 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 상태로 구성시킨다.
아울러, 시료액 내의 검출대상 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체-형광물질 복합체(conjugate)를 준비한다. 상기 형광물질 대신에 효소를 사용할 수도 있다.
제 4 단계: 검체 투하 단계
바이오 마커에 해당하는 항원에 특이적으로 결합하는 포획항체가 고정화된 마이크로로드 결합체, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체-형광 복합체(conjugate)를 포함하는 반응 튜브에 검출대상 물질(검체)이 포함된 시료액을 투하한다. 만일, 상기 시료액에 바이오마커에 해당하는 항원이 있다면, 이들 간에 제1 면역반응 및 제2 면역반응이 유도될 것이다.
도 5는 면역반응 물질에 검출대상 항원이 적하된 경우의 반응을 나타낸 것으로, 면역진단에 사용된 포획항체가 결합된 마이크로로드, 시료액의 검출대상 항원, 검출항체와 형광이 결합된 형광-복합체의 구조와 작용원리를 나타낸 것이다.
제 5 단계: 혼합/가열 단계
제 4 단계가 진행된 반응 튜브를 히팅 블록(heating block)에 올린 후 적절한 온도로 가열하여 조절시킨다. 통상 면역반응은 35℃ 정도에서 활발하게 이루어진다. 아울러, 상기 반응 튜브의 내부에 자석봉을 상하로 연속적으로 이동시켜 상기 면역반응 물질을 빠르게 혼합시킴으로써 면역반응 시간을 단축시킨다.
도 6은 면역반응을 신속하게 진행하기 위해 자석봉과 히팅 블록을 이용한 혼합과 가열 과정을 나타낸 것이다.
제 6 단계: 세척 단계
반응이 완료된 후 마이크로로드와 자석봉을 2개 이상의 세척 튜브에서 연속적으로 세척시키고, 반응액을 적절한 농도로 희석시킨다. 이러한 세척과정에서 비특이적 물질이 제거되고, 마이크로로드의 세척/회수가 이루어질 수 있다.
도 7은 비특이적 물질을 제거하기 위한 마이크로로드와 자석봉의 세척 과정을 나타낸 것이다.
제 7 단계: 검출신호 측정 단계
반응이 완료된 후, 검출 신호를 측정하는데 이미지 분석을 통한 코드 인식을 수행하며, 1개의 형광물질로도 다중검지(multi-detection)를 구현하는 것이 가능하게 된다. 검출 신호의 측정방식으로서 검출항체에 형광물질이 결합된 경우 형광물질로부터 나오는 형광신호를 탐지할 수 있으며, 검출항체에 효소가 결합된 경우엔 ELISA 방식처럼 효소-기질 반응에 의한 발색을 탐지할 수 있다. 상기 단계를 모두 수행하는 데 대략 30분이 소요되며, 검출한계는 대략 수 pg/ml 내지 10,000 pg/ml이다.
상술한 검출방법에 있어서 상기 생체물질의 검출은 2종 이상의 상기 생체물질들에 대해 2종 이상의 상기 미세 입자들을 이용하여 다중검출하는 것일 수 있다. 각각의 미세 입자들은 길이, 직경, 두께, 형상, 색상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지될 수 있다. 상기 다중검출은 다양한 방식으로 표지된 상기 미세 입자들을 판독하는 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 시료액에는 복수 개의 항원이 포함되어 있고 상기 미세 입자들은 항원의 개수와 동일한 개수의 복수개 종류의 형상들로 구성될 수 있다. 이 경우, 각기 다른 형상의 미세 입자는 상기 시료액에 포함된 복수 개의 항원 중에서 각각 특정 검체만을 포획할 수 있는 특이적으로 결합하는 항체가 고정된 상태로 구성됨으로써 동시에 복수의 검체를 검출할 수 있는 것일 수 있다. 일례로 상기 미세 입자가 마이크로로드일 경우, 서로 다른 길이를 갖는 마이크로로드들을 사용하여 다중검출에 활용할 수 있다.
한편, 상기 히팅 블록의 온도 조절, 미세입자-생체물질-검출 프로브 복합체와 자석봉의 혼합 및 세척은 자동화된 장치로 수행되는 것이 바람직하다. 반응시간 및 온도의 조절에 의해 면역반응이 충분히 일어나도록 하여 복합체 형성율을 극대화함으로써 고감도 분석능을 달성할 수 있다.
이상 상술한 생체물질 검출용 미세 입자를 이용하여 바이오어세이를 할 경우에 많은 장점이 있다. 표면이 매우 균일한 쉘 층을 갖는 미세 입자를 사용함으로써 검체의 비특이적 결합을 방지할 수 있어 노이즈가 적고 신호증폭이 극대화될 수 있다. 또한 미세 입자의 크기가 나노 미터 스케일이 아닌 수십 내지 수백 마이크로미터 스케일이므로 자력의 세기가 크게 작용할 수 있다. 그리하여 수용액에서 부유하지 않고 잘 뭉치므로 자력에 의한 제어가 용이하다.
아울러, 상기 생체물질 검출용 미세 입자를 사용하여 바이오 어세이를 하는 과정에서 자석봉과 히팅 블록을 이용한 혼합과 가열 과정으로 면역반응을 신속하게 진행시킬 수 있어서 반응시간을 크게 단축시킬 수 있고, 상기 자석봉에서 미세 입자를 신속히 분리시킨 후 미세 입자와 자석봉을 세척시킬 수 있다. 그리하여 ELISA와 유사한 정밀도를 가지면서도 검사시간을 30분 이내로 단축할 수 있다.
특히 상술한 미세 입자의 경우 대량생산이 가능하고 형광 발광이 3차원적으로 강하게 이루어질 수 있다. 또한 상기 미세 입자들은 다양한 길이, 형상 또는 색상 등의 방식으로 구분되도록 용이하게 제작될수 있어서 다중검출에 적합하다. 예를 들어 유리 코팅 미세 와이어를 다양한 길이로 절단하여 만든 마이크로로드들을 사용하면 단 1개의 형광 물질로도 다중검출이 가능하다. 각 길이 정보로 코드화된 미세 입자들을 이미지 분석을 통해 해석함으로써 한번에 다중 탐지(multi-detection)가 가능하며, 고감도의 정확도를 유지할 수 있는 장점이 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 생체물질 검출용 미세 입자는 특히 내부에 금속 코어를 가지므로 명시야 현미경 관찰시 미세 입자가 매우 어둡게 나타나 배경과의 명암대비가 뚜렷하여 입자들 간 구별이 명확해질 수 있고 크기가 커서 형광 이미징시 뚜렷하게 보일 수 있다. 종래 바이오 어세이에 사용하는 입자보다 큰 수십 내지 수백 마이크로미터 크기의 입자를 사용하기 때문에 하나의 웰 내부에 포함된 입자들을 관찰할 때 저배율, 예를 들어 1X 배율의 렌즈를 사용할 수 있다. 따라서 미세 입자들의 관찰영역이 매우 넓어 신속한 분석이 가능할 뿐만 아니라 Focal length의 범위도 커서 이미징하는데 필요한 Z축 Stage의 오차에 상대적으로 덜 민감하므로 이미지 포커싱이 아주 용이하다.
이하, 실시예를 통하여 본 명세서에 개시된 기술에 대해 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 개시된 기술을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 개시된 기술의 기술적 사상이 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1. 마이크로로드의 제조
본 발명에서 제조되는 마이크로로드는 대한민국 특허공개공보 10-2018-0130436에 기재된 방법으로 글라스-코팅 미세와이어를 제조하여 이를 이용하였다. 먼저 상기 제조된 미세와이어를 100~500㎛씩 절단하였다. 이때, 금속 자성 코어의 직경은 50㎛이고, 코어를 둘러싼 글라스 코팅의 두께는 5㎛였다. 따라서, 외경 60㎛, 길이가 100~500㎛인 최종 마이크로로드가 제조되었다.
실시예 2. 마이크로로드의 표면 처리
상기 실시예 1에서 제조한 마이크로로드의 글라스 표면을 적절히 개질시켰다. 표면 개질은 아미노기 또는 카르복실기로 치환할 수 있다.
2-1. 아미노-실란으로 개질
먼저, 상기 마이크로로드의 글라스 표면에 아민기를 결합시키는 방식으로 표면처리하였다. 구체적으로, 상기 마이크로로드의 표면을 에탄올과 아세톤과 같은 유기용매, 10% NaOH를 함유한 염기 용액, 피란하(piranha) 용액으로 차례로 세정함으로써 로드의 표면 글라스를 Si-OH(실란올; silanol)로 개질시켰다. 다시 용매로 아세톤 또는 톨루엔을 사용하고 용질로 APTES(3-aminopropyltriethoxy silane)를 처리하는 실란화 공정과 큐어링 공정을 통해 글라스의 표면을 아미노-실란으로 개질시켰다.
최종적으로, FITC(Fluorescein isothiocyanate isomer)으로 아미노-실란을 코팅하여 형광을 측정함으로써 상기 아미노-실란의 개질의 균일도와 개질 정도를 확인하였다. 도 8은 마이크로로드의 표면을 아미노-실란화시키는 공정과 FITC에 의해 그 결과를 확인한 실험의 모식도이다.
2-2. 카르복실기로 치환
상기 아미노-실란의 표면처리된 것을 아민기부터 COOH로 치환하였다. 이것을 Carboxyl bead 제조 방법이라 명명하였다. 1.5 ml E-tube에 마이크로로드 (500 x 75㎛) 1만개가 처리될 수 있다. 하기의 2가지 방법이 이용되었다.
2-2-1. γ-Butyrolactone 이용
본 방법이 하기 <2-2-2> 방법보다 더 효과적인 것으로 판단된다. 구체적인 재료와 과정은 하기와 같다.
재료로는 Amine MicroDisk, (amine free) Dimethylformamide (DMF), γ-Butyrolactone : DMF (60ul : 1ml), TEA (Triethylamine), DW (ultra pure deionized water), 15ml tube를 사용하였다.
1. 마이크로로드를 99% 에탄올로 2~3번 세척하였다.
2. 95℃에서 5분 이상 베이킹(baking)하여 에탄올을 완전히 제거하였다.
3. DMF로 1회 세척하였다.
4. 15ml 튜브에 γ-Butyrolactone : DMF (60ul : 1ml) 비율로 넣고 혼합하였다.
5. 하기 조성대로 튜브에 첨가하였다.
γ-Butyrolactone : DMF (60ul : 1ml) 100 ul
TEA (Triethylamine) 8 ul
DMF (free) 500 ul
Total 608 ul
6. 2시간 동안 실온에서 상하로 뒤집으며 반응시켰다 (또는 900 rpm으로 2시간 동안 진탕(shaking)시켰다).
7. 1) DMF (1 ml) 2번, 2) 에탄올 (1ml) 2번, 3)　DW (1ml) 2번 (1ml)의 순으로 세척시켰다.
8. 상기 3번-7번을 1회 반복하였다.
9. DW 제거한 후 MES 완충액 (0.1M MES pH 5.0, Thermo Fisher Scientific, 28390) 또는 PBS 완충액으로 4℃에 보관하였다 (마이크로로드에 항체 고정은 MES 완충액이 보다 효과적인 것으로 판단된다.)
2-2-2. Succinic anhydride 이용
재료로는 Amine MicroDisk, (amine free) Dimethylformamide (DMF), Succinic anhydride, TEA (Triethylamine), DW (ultra pure water)를 이용하였다.
1. 99% 에탄올로 2~3번 세척하였다.
2. 95℃에서 5분 이상 베이킹하여 에탄올을 완전히 제거하였다.
3. DMF로 1회 세척하였다.
4. 하기 조성대로 튜브에 첨가하였다.
SA Succinic anhydride 0.12 g/ml (DMF에 용해) 100 ul
TEA (Triethylamine) 16 ul
DMF (free) 600 ul
Total 716 ul
5. 2시간 동안 실온에서 상하로 뒤집으며 반응시켰다 (또는 900 rpm으로 2시간 동안 진탕(shaking)시켰다).
6. 1) DMF (1 ml) 2번, 2) 에탄올 (1ml) 2번, 3)　DW (1ml) 2번 (1ml)의 순으로 세척시켰다.
7. 상기 3번-6번을 1회 반복하였다.
9. DW 제거한 후 MES 완충액 (0.1M MES pH 5.0, Thermo Fisher Scientific, 28390) 또는 PBS 완충액으로 4℃에 보관하였다 (마이크로로드에 항체 고정은 MES 완충액이 보다 효과적인 것으로 판단된다.)
실시예 3. 포획항체 고정과 고정 정도의 확인 실험
3-1. -COOH 활성화
1. 마이크로로드 2만개 이하(약 12,000개 정도)를 새로운 E-튜브에 옮겨 담았다.
2. 마그네틱 바를 이용하여 상기 마이크로로드를 한 쪽 벽면에 위치시킨 뒤 MES 완충액(pH 5.0) 500㎕로 1회 세척하였다. (이때 볼텍싱(vortex)과 원심분리를 함께 수행하는 것이 바람직하다.)
3. 하기 표 1 조성대로 1.5ml E-튜브에 첨가하였다. (총 200㎕)
[표 1]
Figure pat00001
4. 상기 E-튜브를 실온에서 30분 동안 천천히 진탕(shaking) 시켰다.(회전시키는 기계에서 30rpm으로 진행)
5. 마그네틱 바를 이용하여 마이크로로드를 한 쪽 벽면에 위치시킨 뒤 MES 완충액 500㎕으로 2회 세척하였다. (이때 볼텍싱(vortex)과 원심분리를 함께 수행하는 것이 바람직하다.)
3-2. 포획항체 고정
1. 세척 과정을 마친 E-튜브에서 MES 완충액을 완전히 제거하였다.
2. MES 완충액 300㎕와 cAb 10 ug을 넣은 후 실온에서 2시간 동안 천천히 진탕(shaking)시켰다. (회전시키는 기계에서 30rpm으로 진행)
3. 마그네틱 바를 이용하여 마이크로로드를 한 쪽 벽면에 위치시킨 뒤 0.1% BSA/PBS (with 0.1% Tween20, 0.05% Sodium azide)로 500㎕씩 2회 세척하였다.(이 (이때 볼텍싱(vortex)과 원심분리를 함께 수행하는 것이 바람직하다.)
3-3. Blocking
1. 세척 과정을 마친 E-튜브에서 0.1% BSA/PBS (with 0.1% Tween20, 0.05% Sodium azide)를 완전히 제거하였다.
2. 1% BSA/PBS (with 0.1% Tween20, 0.05% Sodium azide)를 500㎕ 넣은 후 실온에서 1시간 동안 천천히 진탕(shaking)시켰다. (회전시키는 기계에서 30rpm으로 진행)
3. 마그네틱 바를 이용하여 마이크로로드를 한 쪽 벽면에 위치시킨 뒤 0.1% BSA/PBS 완충액으로 500㎕씩 2회 세척하였다. (이때 볼텍싱(vortex)과 원심분리를 함께 수행하는 것이 바람직하다.)
※보관시에는 1% BSA/PBS (with 0.1% Tween20, 0.05% Sodium azide) 300㎕를 넣고 4℃에 보관하였다.
3-4. 검출항체 결합과 확인
1. 새로운 1.5ml E-튜브에 blocking 단계를 마친 마이크로로드를 약 120개정도 넣고 상층액을 제거하였다.
2. 0.1% BSA/PBS 완충액 100㎕를 넣어 마이크로로드를 잘 섞어준 후 0.1% BSA/PBS 완충액을 완전히 제거하였다.
3. 0.1% BSA/PBS 완충액을 이용하여 2ug/ml의 바이오틴-결합(conjugated) 검출항체 총 1ml을 준비하였다.
4. 0.1% BSA/PBS 완충액을 제거한 2번의 각각의 튜브에 상기 제조한 검출항체-표지자 용액을 100㎕씩 넣고 실온에서 1시간 동안 천천히 진탕(shaking)시켰다. (회전시키는 기계에서 30rpm으로 진행)
5. 마그네틱 바를 이용하여 마이크로로드를 한 쪽 벽면에 위치시킨 뒤 0.1% BSA/PBS 완충액으로 300㎕씩 2회 세척하였다.
6. 0.1% BSA/PBS 완충액으로 e-fluor 형광체를 2ug/ml의 농도로 맞춰 준비하여 각 튜브당 100㎕ 넣고 30분 동안 천천히 진탕(shaking) 시켰다.
7. 0.1% BSA/PBS 완충액 300㎕으로 2번 세척한 후, 스트립(strip)에 각 웰(well)당 약 20개 정도의 마이크로로드만을 넣었다.
8. 7번의 스트립을 측정기에서 Brightness 51, exposure -1의 수치로 측정하였다. 자성비드가 항체가 잘 올라갔는지 형광으로 확인하였다.
도 9는 마이크로로드에 고정화된 항체의 균일도 및 세기(항체량)를 측정한 것으로, 구체적으로는 마이크로로드의 표면에 포획항체가 고정화된 마이크로로드 결합체에 검출항체-형광 복합체를 결합시킨 후의 명시야(bright field) 현미경 이미지(좌측)와 형광 현미경 이미지(우측)를 나타낸 것이다.
상기 실시예를 통해 본 발명의 마이크로로드가 신속한 반응에 따른 빠른 검사가 가능하면서도 높은 정확도를 가지며, 다중 탐지가 가능함을 확인할 수 있다.
이에, 하기와 같은 종류의 항원의 검사에 본 발명의 마이크로로드를 사용하였다.
실험예 1. 갑상선 검사
1-1. 갑상선자극호르몬(TSH) 항체의 자성입자 표면 고정확인
TSH 검출에 사용한 항체는 aviva 회사의 Capture (cat. No. 02927) 항체를 구입해서 사용하였고 자성입자는 2,500개를 이용하여 항체를 고정하였다. 항체 고정 과정, 항체고정 확인 (Quality Control, QC) 등은 앞의 실시예 1,2,3를 바탕으로 실시 하였고 결과는 1-1과 같이 니콘 형광현미경 (Lens 배율 4x, 노출값 200 ms, gain 값 5.1과 11.4)로 확인한 결과 자성입자 평균 형광값이 84/140로 나타나 면역반응에 필요한 항체량이 고정되어 있음을 알 수 있고 또 자성입자간의 표준편차의 값이 10/11로 낮은 값이 나타나 각 자성입자에 골고루 항체가 고정되어 있음을 확인하였다.
도 10은 TSH 항체를 자성입자 표면에 고정 후 관찰한 명시야 이미지 및 형광 이미지이다.
1-2. 농도별 갑상선자극호르몬(TSH) 반응 실험
농도별 TSH 반응 실험은 TSH (LEE biosolution, cat. No. .996-51) 단백질을 구입한 TSH free Serum (Biospacific, ca. P11000)에 0, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20 ulU/ml 농도로 희석해서 준비 하였으며 이미 농도를 알고 있는 Control 물질 C1 (1 ulU/ml), C2 (10 ulU/ml)를 준비하였다.
E-tube에 준비된 500 ul TSH Serum 용액에 항체고정을 시킨 자성입자를 넣어서 상온에서 30 rpm으로 Shaker를 이용 1시간 동안 교반시켜 반응하게 한 다음 500 ul 세척용액(0.1% Tween20, 0.05% Sodium azide가 포함된 500 ul 의 0.1 % BSA/PBS buffer)으로 2번 정도 세척한 다음 2 ug/ml biotin conjugated TSH secondary antibody (AVIVA, ca00724)을 반응용액 (0.1 % BSA/PBS buffer)에 넣어 1시간 상온에서 200 rpm으로 교반하여 반응시킨 후 다시 전과정과 같이 2번 세척해주었다. 마지막으로 형광용액 2 ug/ml SAPE (ThermoFisher Scientific. cat. no S866) 500ul를 반응한 자성입자에 집어넣고 30분 동안 상온에서 200 rpm으로 교반하여 secondary antibody에 있는 Biotin와 SAPE 형광반응을 시켰다. 그후 Bright Field 이미지와 형광이미지를 형광현미경을 이용하여 찍어 각농도에서 자성입자의 형광값과 이에 따른 TSH농도를 도출하였다.
검체에 속해있는 진단마커의 농도가 높을수록 자성입자의 형광신호가 강해지는 원리로 반응 웰 안에서 Bright Field로 거대자성입자의 위치를 확인하고 그 위치에 해당되는 형광신호를 Pixel단위로 측정하여 평균을 구했다. 30개 이상의 자성입자의 평균을 구하고 여기서 30개 자성비드의 형광값의 Medium값을 구했다. 검출하고자 하는 타겟 물질을 농도별로 반응시켜 동일한 방법으로 나온 형광 값 이용 그래프를 그린 표준 곡선(Standard Curve)에 시험 검출에서 나온 형광값을 적용시켜 최종 시료안에 들어 있는 해당 Target 단백질의 검출 농도값을 산출했다. 이때 형광 Intensity과 TSH농도를 correlation 추세선을 그리고 이 추세선을 이용 농도계산 했다. 모든 이미지 분석 및 형광값의 산출은 분석기기에 설치되어있는 자동 이미지 분석 프로그램으로 실시했다. 그 결과 개발한 자성비드의 성능은 형광법으로 실시했을 때 TSH 0~20 ulU/ml의 농도를 정량화할 수 있었고 이미 알고 있는 C1/C2 안에 있는 TSH 농도를 비교할 수 있었다. 도 11은 TSH 농도에 따른 형광세기 값을 나타낸다.
도 11의 실험데이터를 보았을 때 실험농도와 형광세기값이 연관성이 높은 것으로 나왔다 (R2 값 : 0.9979) 그리고 TSH의 0.1 uIU/ml의 형광값과 0 ulU/ml의 형광값이 차이가 있게 결과가 나왔다. 그러므로 이 자성입자를 이용한 TSH실험에서 limit of detection (LOD) 값은 0.1 uIU/ml 이라고 말할 수 있다.
TSH 진단 농도구간 (정상농도 구간)이 0.5~5.0 uIU/ml (참고 0.5 uIU/ml이하 : TSH저하증, 5 uIU/ml 이상 : TSH 과대생산증) 이기 때문에 이 농도에서 분별력있는 실험데이터가 나와 상업화의 높은 가증성을 보였다.
대조구(Control)로 사용한 C1 (1 uIU/ml), C2 (10 uIU/ml) 등 TSH 포함한 외부 Serum을 가지고 자성비드 시스템으로 시험결과 C1은 1.07 ulU/ml C2는 10.89 uIU/ml으로 계산이 되어 serum 중에 있는 TSH 농도가 정확히 검출되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 2. Human γ- interferon
2-1. Human γ- interferon 항체의 자성입자 표면 고정확인
Human γ- interferon 검출에 사용한 항체는 ThermoFisher Scientific 회사의 항체 (cat. no. M700A)를 구입해서 사용하였고 자성입자는 2,500개를 이용하여 항체를 고정하였다. 항체 고정 과정, 항체고정 확인 (Quality Control, QC) 등은 앞의 실시예 1,2,3를 바탕으로 실시하였고 결과는 1-1과 같이 니콘 형광현미경 (Lens 배율 4x, 노출값 200 ms, gain 값 5.1과 11.4)로 확인한 결과 자성입자 평균 형광값이 82.33/145.18로 나타나 면역반응에 필요한 항체량이 고정되어 있음을 알수 있고 또 자성입자간의 표준편차의 값이 9.50 /10.11 로 낮은 값이 나타나 각 자성입자에 골고루 항체가 고정되어 있음을 확인하였다. 도 12는 Human γ- interferon 항체를 자성입자 표면에 고정 후 관찰한 명시야 이미지 및 형광 이미지이다.
2-2. Human γ- interferon 반응 실험
농도별 Human γ- interferon 반응 실험은 Human IFN-γ (ThermoFisher Scientific /cat. no. RIFNG100) 단백질을 사용하였고 0.1% Tween20를 포함한 0.1 % BSA/PBS buffer에 0, 10, 25, 50, 100, 500, 1000 pg/ml 농도로 희석해서 준비 하였다.
E-tube에 준비된 500 ul Human γ- interferon 용액에 항체고정을 시킨 자성입자를 넣어서 상온에서 30 rpm으로 Shaker를 이용 1시간 동안 교반시켜 반응하게 한 다음 500 ul 세척용액 ( 0.1% Tween20, 0.05% Sodium azide 가 포함된 500 ul 의 0.1 % BSA/PBS buffer) 으로 2번 정도 세척한 다음 2 ug/ml biotin conjugated TSH secondary antibody (AVIVA, ca00724)을 반응용액 (0.1 % BSA/PBS buffer)에 넣어 1시간 상온에서 200 rpm으로 교반하여 반응시킨 후 다시 전과정과 같이 2번 세척해준다. 마지막으로 형광용액 2 ug/ml SAPE (ThermoFisher Scientific. cat. no S866) 500ul를 반응한 자성입자에 집어넣고 30분 동안 상온에서 200 rpm으로 교반하여 secondary antibody에 있는 Biotin와 SAPE 형광반응을 시킨다. 그후 Bright Field 이미지와 형광이미지를 형광현미경을 이용하여 찍어 각농도에서 자성입자의 형광값과 이에 따른 TSH농도를 도출하였다.
검체에 속해있는 진단마커의 농도가 높을수록 자성입자의 형광신호가 강해지는 원리로 반응 웰 안에서 Bright Field로 거대자성입자의 위치를 확인하고 그 위치에 해당되는 형광신호를 Pixel단위로 측정하여 평균을 구했다. 이때 형광 이미징의 조건은 1x lens / exposure time: 200ms/ gain value 값은 31 이다. 30개 이상의 자성입자의 평균을 구하고 여기서 30개 자성비드의 형광값의 Medium값을 구했다. 검출하고자 하는 Target 물질을 농도별로 반응시켜 동일한 방법으로 나온 형광 값이용 그래프를 그린 Standard Curve에 시험 검출에서 나온 형광값을 적용시켜 최종 시료안에 들어 있는 해당 Target 단백질의 검출 농도값을 산출했다. 이때 형광 Intensity과 Human γ-interferon 농도를 corelation 추세선을 그리고 이 추세선을 이용 농도계산 했다. 모든 이미지 분석 및 형광값의 산출은 분석기기에 설치되어있는 자동 이미지 분석 프로그램으로 실시했다. 그 결과 개발한 자성비드의 성능은 형광법으로 실시했을 때 Human γ-interferon 0 ~ 1000 pg/ml의 농도를 정량화 할 수 있었다. 도 13은 1x 렌즈를 사용하여 200ms 노출시간동안 관찰한 γ-interferon 농도별 명시야 및 형광 신호 이미지와 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 13의 실험데이터를 보았을 때 실험농도와 형광세기 값이 연관성이 높은 것으로 나왔다 (R2 값 : 0.9934) 이결과를 보았을 때 검사농도범위 (Dynamic range)가 3~5 logs 이상 나올 수 있어 대부분의 정밀면역진단 가능한 것으로 사료된다.
그리고 Human γ- interferon의 10 pg/ml의 형광값과 0 pg/ml의 형광값이 차이가 있게 결과가 나왔다. 그러므로 이 자성입자를 이용한 Human γ-interferon 실험에서 limit of detection (LOD) 값은 10 pg/ml 이하일 수 있다는 실험결과가 나왔다.
2-3. Human γ- interferon의 Limit of detection (LOD) 실험
Human γ-interferon 2-1 실시의 예의 실험에서 본 자성입자를 이용한 Human γ-interferon실험에서 limit of detection (LOD) 값은 10 pg/ml 이하 일 수 있다는 실험결과가 나왔기 때문에 낮은 농도의 Human γ-interferon 0, 0.625, 1.25, 2.5 pg/ml를 준비해서 LOD실험을 하였다. 실험의 방법은 Human γ-interferon 2-1 실시의 예와 동일하나 낮은 형광값을 검출하기 위해서 1x lens / exposure time 300ms/ gain value 31으로 exposure time (노출시간)을 200 ms에서 300 ms으로 형광조건을 변경하였다. 도 14는 1x 렌즈를 사용하여 300ms 노출시간으로 관찰한 명시야 및 암시야 이미지와 형광세기를 나타낸 그래프이다.
도 14를 보면 Human γ-interferon의 R2 값이 0.9958로 0 ~ 2.5 pg/ml의 낮은 농도구간에서도 농도별 corelation 값이 높게 나왔으며 0 pg/ml의 형광값과 0.625 pg/ml의 형광값이 차이가 있게 결과가 나왔다. 본 자성입자를 이용한 Human γ-interferon실험에서 limit of detection (LOD) 값은 0.625 pg/ml인 것으로 확인이 되었고 이는 보통의 자성입자의 면역진단시스템 LOD 20 pg/ml 보다 감도가 40배 정도 좋은 것으로 여겨진다.
2-4. 다중면역진단실험
다중면역진단은 한번의 면역진단으로 많은 마커를 측정할 수 있기 때문에 시간 및 비용을 줄일 수 있고 진단 정확성도 높이는 장점을 가지고 있다. (Multiplex Immunoassays utilizing differential affinity using Aptamers generated by MARAS (2017), 7:6397). 본 자성입자는 여러 가지 길이로 제조 가능하기 때문에 다중면역진단이 가능하다. 3가지의 길이의 자성입자를 준비하고 3가지의 사이토카인을 각각 고정화 시켜 다중면역진단이 가능한지 실험하였다. 자성입자 200 um 는 TNF α 면역진단 용으로 (Recombinant human TNF α, ThermoFisher Scientific, cat. no. RTNFAI/ Capure Ab : eBioscience, cat.no. 14-7348-81// Detection Ab : biotin conjugated, eBioscience, cat. no. 13-7349-81), 300 um는 IFN-γ 면역진단용으로 (2-1실시의 예와 동일) 400 um는 IL-10 면역진단용으로 (Recombinant human IL-10, ThermoFisher Scientific, cat. no. RIL1025/ Capture Ab: ThermoFisher Scientific, cat. no. M010/ Detection Ab : ThermoFisher Scientific, cat. no. M011B)사용하였다. 실험의 방법은 Human γ- interferon 2-1 실시의 예와 동일하게 실험하였고 IFN-γ 나 IL-10 의 한 종류의 사이토카인만을 첨가하여 첨가한 해당 자성입자가 지정한 사이토카인만을 잡고 반응하는지 시험하였다. 그 결과 50 pg/ml, 500 pg/ml의 IFN-γ만을 첨가한 반응은 해당 자성입자 300㎛만이 농도에 따라 신호를 내었고 50 pg/ml, 500 pg/ml의 IL-10 만을 첨가한 반응은 해당 자성입자 400 um만이 농도에 따라 신호를 내는 것으로 확인이 되었다. 도 15는 IFN-γ나 IL-10의 사이토카인을 자성입자에 각각 고정화 시켜 다중면역진단이 가능한지 실험한 결과이다.
이러므로 이 자성입자를 이용한 면역진단시스템에서 다중진단이 가능하다는 것을 알 수 있었다.

Claims (20)

  1. 자석 반응 금속을 포함하는 코어, 및 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층을 구비한 코어-쉘 구조의 미세 입자; 및
    생체물질을 포획하기 위해 상기 쉘 층 위에 도입된 포획 프로브를 포함하는 생체물질 검출용 미세 입자.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 자석 반응 금속은 철, 니켈, 코발트 또는 망간의 합금을 포함하는 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 코어가 상기 미세 입자 총 부피의 60% 이상인 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 코어-쉘 구조는 상기 코어에 액상의 쉘 성분을 도포하여 형성되거나 중공형 틀에 코어 금속 성분을 충진하여 형성된 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 쉘 층은 유기물 또는 무기물의 액상 코팅액으로부터 고화된 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 쉘 층 표면의 평균 표면 거칠기(Ra)는 15nm 이하인 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 쉘 층의 두께는 1 내지 100㎛인 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 미세 입자는 유리가 코팅된 금속 미세와이어의 절단물인 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 미세 입자는 수중에서 부유하지 않는 크기 및 비중을 갖는 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  10. 제1 항에 있어서,
    상기 미세 입자는 마이크로로드의 형태를 갖는 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 마이크로로드의 길이가 10 내지 1,000㎛인 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  12. 제10 항에 있어서,
    상기 마이크로로드의 종횡비가 2 이상인 것인 생체물질 검출용 미세입자.
  13. 제1 항에 있어서,
    상기 생체물질은 생명체로부터 유래된 시료액 내의 바이오마커인 것인 생체물질 검출용 미세입자.
  14. 제1 항에 있어서,
    상기 포획 프로브는 상기 쉘 층의 표면의 기능기와 연결된 것인 생체물질 검출용 미세 입자.
  15. 자석 반응 금속을 포함하는 코어, 및 상기 코어를 둘러싸며 균일한 두께를 갖는 쉘 층을 구비한 코어-쉘 구조의 미세 입자를 제공하는 단계; 및
    상기 쉘 층 위에 생체물질을 포획하기 위한 포획 프로브를 도입하는 단계를 포함하는 생체물질 검출용 미세 입자의 제조방법.
  16. (a) 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 따른 생체물질 검출용 미세 입자를 제공하는 단계;
    (b) 생체물질과 특이적 결합을 할 수 있으며 외부 자극에 의해 발광하는 발광물질이 컨쥬게이션된 검출 프로브를 제공하는 단계;
    (c) 상기 포획 프로브, 상기 생체물질 및 상기 검출 프로브를 반응시켜 생체물질 검출용 미세입자-생체물질-검출 프로브의 복합체를 형성시키는 단계; 및
    (d) 상기 외부 자극에 의해 상기 복합체 내 상기 발광물질로부터 방출되는 발광 신호를 측정하여 상기 생체물질을 검출하는 단계를 포함하는 생체물질의 검출방법.
  17. 제16 항에 있어서,
    상기 복합체의 형성은 외부 자력을 이용한 반응 촉진 과정을 포함하는 것인 생체물질의 검출방법.
  18. 제17 항에 있어서,
    상기 생체물질의 검출은 2종 이상의 상기 생체물질들에 대해 2종 이상의 상기 미세 입자들을 이용하여 다중검출하는 것인 생체물질의 검출방법.
  19. 제18 항에 있어서,
    상기 다중검출은 길이, 직경, 두께, 형상, 색상 또는 식별 코드에 의해 서로 구분되도록 표지된 상기 미세 입자들을 판독하는 과정을 포함하는 것인 생체물질의 검출방법.
  20. 제16 항에 있어서,
    상기 미세 입자는 마이크로로드의 형태를 가지는 것인 생체물질의 검출방법.
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