CN117761314A - 一种基于非酶促的单分子免疫反应检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于非酶促的单分子免疫反应检测方法。本发明的检测方法利用液滴全部包裹，不仅可以解决磁珠落孔产生的加载效率不稳定问题，还可以降低背景噪音和信号散射，使得本发明相比于现有的常规ELISA方法的检测灵敏度具有显著提升，可以检测非常低浓度的蛋白，所需样本含量少，可以节约珍贵样本，减少基质效应。本发明中，磁珠实现全加载，保证了磁珠数量的稳定，降低了重复之间的差异。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于非酶促的单分子免疫反应检测方法。
背景技术
目前，临床的检测方法主要包括化学发光法(Chemiluminescence analysis，CLIA)和酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。CLIA的发光过程较短，荧光背景的本底较高，存在检测精度不高的问题。ELISA需要手动加样和洗板，耗时较长，受到操作人员手法不同的影响，实验结果也存在差异。此外，CLIA和ELISA等是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的，强度越高，被测定目标物的浓度越高。这种检测方法只能达到皮克级别的检测水平，灵敏度均较低。单分子免疫是以泊松分布为理论基础的新型免疫分析方法，检测的灵敏度能达到单分子水平。在癌症、神经系统障碍等疾病的早期阶段，血清中相关蛋白质标志物的浓度范围是10-16M到10-12M，但是常规免疫分析方法(化学发光、胶体金等)的灵敏度达不到这个水平。因此，单分子免疫可应用于癌症和神经系统障碍等疾病的早期诊断、治疗中的用药指导以及后期的疾病监测。单分子检测是对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性。Quanterix公司基于蛋白酶信号放大，利用一个微孔装载一颗磁珠的方式研发了Simoa系列的仪器。在已经商业化的Simoa HD-1分析仪中，磁珠通过重力被加载隔离，但只有5％的磁珠被分离和分析，因此，也导致了重复差异大，试剂稳定性差，成本高等问题，不适用于大规模产品化和应用推广。另外苏州宇测生物科技股份有限公司使用原位信号增强纳米粒子作为信号放大，并研发出相应的单分子免疫检测仪器。但是由于宇测通过单个蛋白分子将原位信号增强纳米粒子和磁珠连起来所需要克服的阻力较大，或者说通过单个蛋白分子结合在一起的原位信号增强纳米粒子和磁珠更容易断开，这就导致了检测系统的稳定性较差，检测结果的变异系数较大。并且很难分辨出磁珠上结合原位信号增强纳米粒子的个数，这使得单分子免疫的检测范围变窄。
现有的单分子检测技术存在检测体系复杂、对检测设备的精密度要求极高、检测试剂的稳定性差、对辅助耗材的精密度要求高、成本难以控制以及无法良好地应用于蛋白质检测等诸多问题。这些问题极大程度地阻碍了单分子检测技术在科研和医疗诊断市场中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供的一种基于非酶促的单分子免疫反应检测方法，通过液滴对磁珠全包裹的方式，能够显著提高检测项目样本浓度与荧光强度的灵敏度、相关性，优化了检测仪器的稳定性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种非酶促的单分子免疫反应检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)：取待测样品与固定在固相载体上的捕获抗体混合，孵育，清洗，获得第一复合物，所述捕获抗体与所述样品中的靶标分子的第一位点结合；
步骤(2)：取检测抗体、光学信号增强纳米粒子与步骤(1)所述的第一复合物混合，孵育，清洗，获得第二复合物，所述检测抗体与所述靶标分子的第二位点结合，所述检测抗体与所述光学信号增强纳米粒子偶联；
步骤(3)：用液滴包裹步骤(2)所述的第二复合物，分散，采集光学信号，分析，获得检测结果。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述采集所使用的光学成像设备包括尼康Eclipse Ti-U荧光显微镜、尼康Eclipse Ti系列的其他荧光显微镜、莱卡DMi8荧光显微镜、奥林巴斯IX系列荧光显微镜、CIS、CCD或CMOS相机。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述固相载体修饰有能够与抗体偶联的官能团。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述固相载体包括磁珠、微米尺度微球或纳米尺度微球中的一种或多种；
所述磁珠的粒径为1μm、1.5μm、2μm、2.5μm或3μm。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述靶标分子包括蛋白质、多糖、有生物活性的小分子或小分子与蛋白质的复合物中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述偶联包括直接偶联或间接偶联；
所述直接偶联包括通过物理吸附的方式偶联或通过化学修饰的方式偶联；
所述间接偶联包括通过生物素-链霉亲和素系统偶联。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述光学信号增强纳米粒子的粒径为100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm或300nm。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述光学信号增强纳米粒子的发光材料包括有机荧光染料、量子点、荧光蛋白、稀土发光材料、聚集诱导发光材料或聚合物发光材料中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述光学信号增强纳米粒子的载体材质包括聚苯乙烯、二氧化硅、葡聚糖、琼脂糖、无机金属化合物或聚丙烯酰胺中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述光学信号增强纳米粒子的结构包括中空结构、多孔结构或核壳结构中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法包括：
步骤(1)所述孵育的时间为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min；和/或
步骤(1)所述孵育的温度为25℃、30℃、35℃或40℃；和/或
步骤(2)所述孵育的时间为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min；和/或
步骤(2)所述孵育的温度为25℃、30℃、35℃或40℃。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述捕获抗体包括单克隆抗体，多克隆抗体中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述捕获抗体的来源包括大鼠源、小鼠源、兔源或山羊源等。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述捕获抗体厂家来源包括Medix、海肽、伊百新、Biospacific或Abcam等。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述固相载体用于检测样品与试剂的分离和清洗。所述捕获抗体通过物理吸附或化学修饰的方式固定在固相载体表面，并且能够与靶标分子的一个结合位点相结合，使其从样品中分离。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述固相载体的表面修饰有能够与抗体共价偶联的活性官能团，所述活性官能团包括羟基、羧基、氨基、巯基、烯基、炔基、琥珀酰亚胺酯基团及其衍生基团中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述靶标分子包括细胞炎症因子、阿尔兹海默症血液生物标志物或心肌标志物中的一种或多种；
所述细胞炎症因子包括IL-6和/或IL-17；
所述阿尔兹海默症血液生物标志物包括p-tau 181、p-tau 217、p-tau 231、NFL、Aβ-42或Aβ-40中的一种或多种；
所述心肌标志物包括cTnI；
所述肿瘤标志物包括PSA。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述检测抗体与光学信号增强纳米粒子的偶联物包括直接偶联和间接偶联方式，其中直接偶联是指所述的光学信号增强纳米粒子直接与检测抗体结合，即检测抗体通过物理吸附或化学修饰的方法，直接吸附或偶联在光学信号增强纳米粒子上。其中化学修饰是指所述光学信号增强纳米粒子的表面修饰有能够与抗体进行共价偶联的活性官能团，例如羟基、羧基、氨基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基(如甲苯磺酰基)及它们的衍生基团中的一种或多种。间接偶联是指通过抗检测抗体与生物素-链霉亲和素体系进行结合，将光学信号增强纳米粒子特异性标记在检测抗体上。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述检测抗体按照特异性特性分类可包括单克隆抗体，多克隆抗体中的一种或多种；所述检测抗体按照来源可包括大鼠源，小鼠源，兔源，山羊源等；所述检测抗体厂家来源包括Medix，海肽，伊百新，Biospacific，Abcam等。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述光学信号增强纳米粒子中使用的发光材料的选择，包括有机荧光染料、量子点、荧光蛋白、稀土发光材料、聚集诱导发光材料或聚合物发光材料中的一种或多种；
所述有机荧光染料包括异硫氰酸荧光素、香豆素系列或罗丹明系列等；
所述量子点包括CdS、CdSe、CdTe或ZnSe；
所述稀土发光材料包括上转换发光材料或镧系元素类。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法所述光学信号增强纳米粒子中使用的粒子载体材质的选择，包括聚苯乙烯、二氧化硅、葡聚糖、琼脂糖、无机金属化合物、聚丙烯酰胺等中的一种或多种，按照结构分类可为中空结构、多孔结构和核壳结构等中的一种或多种。
本发明关键在于捕获抗体与靶标分子的第一位点的结合时长为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min，结合温度为25℃、30℃、35℃或40℃；检测抗体与靶标分子的第二位点结合的时长为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min，结合温度为25℃、30℃、35℃或40℃。
本发明关键在于一步法中，靶标分子与抗体的结合时长为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min，反应时间温度为25℃、30℃、35℃或40℃。
在本发明的一些具体实施方案中，上述非酶促的单分子免疫反应检测方法还包括：将捕获抗体固定到固相载体上，利用捕获抗体和靶标分子的第一位点结合，从而捕获样品中的靶标分子；同时加入检测抗体和光学信号增强纳米粒子的偶联物，检测抗体与靶标分子的第二位点结合；(一步法)
将上述免疫复合物用液滴进行包裹分散；
用光学成像设备检测由荧光微球发出的光学信号；
对光学信号增强纳米粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中靶标分子的浓度信息；
所述光学成像设备包括尼康Eclipse Ti-U荧光显微镜、尼康Eclipse Ti系列的其他荧光显微镜、莱卡DMi8荧光显微镜、奥林巴斯IX系列荧光显微镜、CIS、CCD或CMOS相机。
本发明的基于非酶促的单分子免疫反应检测方法有如下效果：
本发明使用的磁珠数量为100000个，利用液滴全部包裹，不仅可以解决磁珠落孔产生的加载效率不稳定问题，还可以降低背景噪音和信号散射，使得本发明比现有的常规ELISA方法的检测灵敏度平均高1000倍以上，可以检测非常低浓度的蛋白，所需样本含量少，可以节约珍贵样本，减少基质效应。本发明中，磁珠实现全加载，保证了磁珠数量的稳定，降低了重复之间的差异。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1单分子免疫检测IL-6荧光图片结果图；
图2示实施例1单分子免疫检测IL-6线性图；
图3示实施例2单分子免疫检测pTau-181荧光图片结果图；
图4示实施例2单分子免疫检测pTau-181线性图；
图5示对比例单分子免疫检测IL-6荧光图片结果图；
图6示对比例单分子免疫检测IL-6线性图。
具体实施方式
本发明公开了一种基于非酶促的单分子免疫反应检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明通过液滴对磁珠全包裹的方式，能够显著提高检测项目样本浓度与荧光强度的相关性，优化了检测仪器的稳定性。具体包括如下步骤：
1.将捕获抗体固定到固相载体上，加入靶标分子，利用捕获抗体和靶标分子的第一位点结合，从而捕获样品中的靶标分子；在一定温度下孵育后，清洗；
2.然后加入检测抗体和光学信号增强纳米粒子的偶联物，检测抗体与靶标分子的第二位点结合；在一定温度下孵育后，清洗；
3.将上述反应中形成的免疫复合物通入液滴生成芯片装置，从而包裹分散；
4.用光学成像设备检测由光学信号增强纳米粒子发出的光学信号；
5.对光学信号增强纳米粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中靶标分子的浓度信息。
本发明关键在于固相载体的选择，固相载体包括磁珠、微米尺度微球以及纳米尺度微球等，其中磁珠包括常规粒径的1μm，2μm，3μm等。
本发明关键在于捕获抗体的选择，抗体按照特异性特性分类可包括单克隆抗体，多克隆抗体中的一种或多种；抗体按照来源可包括大鼠源，小鼠源，兔源，山羊源等，抗体厂家来源包括Medix，海肽，伊百新，Biospacific，Abcam等。
本发明关键在于所述固相载体用于检测样品与试剂的分离和清洗。所述捕获抗体通过物理吸附或化学修饰的方式固定在固相载体表面，并且能够与靶标分子的一个结合位点相结合，使其从样品中分离。
本发明关键在于所述固相载体的表面修饰有能够与抗体共价偶联的活性官能团，包括羟基、羧基、氨基、巯基、烯基、炔基、琥珀酰亚胺酯基团及其衍生基团中的一种或多种。
本发明关键在于靶标分子的选择，包括蛋白质、多糖、有生物活性的小分子或小分子与蛋白质的复合物中的一种或多种，更适用于低丰度的靶标分子，实例如细胞炎症因子IL-6、IL-17，阿尔兹海默症血液生物标志物p-tau 181、p-tau 217、p-tau 231、NFL、Aβ-42、Aβ-40，心肌标志物cTnI，肿瘤标志物PSA等。
本发明所述检测抗体与光学信号增强纳米粒子的偶联物包括直接偶联和间接偶联方式，其中直接偶联是指所述的光学信号增强纳米粒子直接与检测抗体结合，即检测抗体通过物理吸附或化学修饰的方法，直接吸附或偶联在光学信号增强纳米粒子上。其中化学修饰是指所述光学信号增强纳米粒子的表面修饰有能够与抗体进行共价偶联的活性官能团，例如羟基、羧基、氨基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基(如甲苯磺酰基)及它们的衍生基团中的一种或多种。间接偶联是指通过抗检测抗体与生物素-链霉亲和素体系进行结合，将光学信号增强纳米粒子特异性标记在检测抗体上。
本发明关键在于检测抗体的选择，抗体按照特异性特性分类可包括单克隆抗体，多克隆抗体中的一种或多种；抗体按照来源可包括大鼠源，小鼠源，兔源，山羊源等，抗体厂家来源包括Medix，海肽，伊百新，Biospacific，Abcam等。
本发明关键在于光学信号增强纳米粒子中使用的发光材料的选择，包括有机荧光染料(如异硫氰酸荧光素、香豆素系列、罗丹明系列等)，量子点(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe)，荧光蛋白，稀土发光材料(如上转换发光材料、镧系元素类)，聚集诱导发光材料，聚合物发光材料中的一种或多种。
本发明关键在于光学信号增强纳米粒子粒径的选择，光学信号增强纳米粒子的粒径在100nm～300nm之间；包括常规采用的150nm，180nm，200nm，250nm，300nm等粒径。
本发明关键在于光学信号增强纳米粒子中使用的粒子载体材质的选择，包括聚苯乙烯、二氧化硅、葡聚糖、琼脂糖、无机金属化合物、聚丙烯酰胺等中的一种或多种，按照结构分类可为中空结构、多孔结构和核壳结构等中的一种或多种。
本发明关键在于捕获抗体与靶标分子的第一位点的结合时长在15～30min之间，结合温度在25℃～40℃之间；检测抗体与靶标分子的第二位点结合的时长在15min～30min之间，结合温度在25℃～40℃之间。
本发明关键在于一步法中，靶标分子与抗体的结合时长在15min～1h，反应时间温度在25℃～40℃之间。
本发明关键在于利用液滴对磁珠免疫复合物进行包裹分散。应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：IL-6单分子免疫反应检测
1.磁珠修饰抗体：
1)取16.7μL 30mg/mL Dynabeads M-270羧酸磁珠(Thermo M270)磁珠，置于2mL离心管中，混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
2)加入300μL磁珠稀释液(10mM PBS含有0.1％ TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清，重复上述清洗操作3次；
3)加入300μL磁珠偶联缓冲液(50mM MES，pH 5.0)，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
4)加入291μL磁珠偶联缓冲液，涡旋混匀，随即加入9μL 10mg/mL EDC，涡旋混匀，2～8℃振荡30min；
5)将磁珠溶液置于磁珠分离器上放置1min，弃上清，加入300μL磁珠偶联缓冲液，涡旋混匀，磁分离器上放置15s，弃上清；
6)快速加入300μL IL-6捕获抗体(Abcam Anti-IL-6抗体，ab9324)，涡旋混匀，2～8℃振荡2h；
7)将磁珠溶液置于磁珠分离器上放置1min，弃上清，加入300μL磁珠洗涤液，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
8)加入300μL磁珠封闭液(购自碧云天，货号：P0220)，涡旋混匀，室温振荡45min；
9)将磁珠溶液置于磁珠分离器上放置1min，弃上清，加入300μL磁珠稀释液，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清，重复上述清洗操作3次；
10)加入300μL磁珠稀释液，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
11)加入300μL磁珠保存液(10mM PBS含有0.1％ BSA和0.1％ TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，并置于2～8℃进行保存。
2.光学信号增强纳米粒子修饰抗体：
1)取100μL的1％的光学信号增强纳米粒子(购自苏州为度生物，货号：FG0300CA)置于离心机中，离心15min，弃上清；
2)加入500μL清洗液(10mM PBS含有0.1％ TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，离心15min，弃上清，重复上述清洗操作3次；
3)加入50μL的10mg/mL的EDC和50μL的10mg/mL的NHS，室温振荡反应30min；
4)光学信号增强纳米粒子溶液离心15min，弃上清，加入500μL偶联缓冲液(50mMMES，pH 5.0)，涡旋混匀，离心15min，弃上清，重复上述操作3次；
5)加入500μL偶联缓冲液，并涡旋混匀。加入0.1mg IL-6检测抗体(Abcam生物素Anti-IL-6抗体，ab84251)，室温振荡反应2h；
6)加入500μL偶联缓冲液，涡旋混匀，离心15min，弃上清；
7)加入500μL封闭缓冲液(购自碧云天，货号：P0220)，室温振荡封闭45min；
8)封闭后的光学信号增强纳米粒子溶液置于离心机中离心15min，弃上清；
9)加入500μL清洗液，涡旋混匀，离心15min，弃上清；
10)加入500μL光学信号增强纳米粒子保存液(10mM PBS含有0.1％ BSA和0.1％TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，离心15min，弃上清；
11)加入500μL光学信号增强纳米粒子保存液，涡旋混匀，并置于2～8℃进行保存。
3.单分子免疫反应检测：
1)待测样品制备：用样品稀释液(10mM PBS)将IL-6标准品梯度稀释成0pg/mL，0.01pg/mL，0.05pg/mL，0.1pg/mL，0.5pg/mL，1pg/mL，5pg/mL，10pg/mL，50pg/mL；
2)取100μL待测样品，加入1μL 1.6mg/mL磁珠抗体复合物，室温下混匀震荡反应30min；
3)反应后洗涤，加入50μL的光学信号增强纳米粒子检测抗体复合物，室温下混匀震荡反应30min；
4)最后将免疫复合物洗涤，加入10μL检测液(10mM PBS含有0.1％TW20，pH＝7.4)重悬，通入液滴生成芯片装置(购自中芯启恒，ZX-LD-100Y)中生成液滴包裹磁珠，在光学成像设备莱卡DMi8荧光显微镜下进行检测获得荧光图像并进行处理分析，得到实验结果。
4.实验结果
结果显示：本发明的IL-6项目检测线性范围0～50pg/mL，检测下限为0.01pg/mL，其R2＝0.9999，满足要求。荧光结果如图1所示，线形图如图2所示。
实施例2：p-Tau 181单分子免疫反应检测
1.磁珠修饰抗体：
1)取21.9μL 25.4mg/mL的Bangs 3.06μm羧基化(Bangs 11653)磁珠，置于2mL离心管中，混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
2)加入300μL磁珠稀释液(10mM PBS含有0.1％ TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清，重复上述清洗操作3次；
3)加入300μL磁珠偶联缓冲液(10mM MES，pH 5.0)，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
4)加入291μL磁珠偶联缓冲液，涡旋混匀，随即加入9μL 10mg/mL EDC，涡旋混匀，2～8℃振荡30min；
5)将磁珠溶液置于磁珠分离器上放置1min，弃上清，加入300μL磁珠偶联缓冲液，涡旋混匀，磁分离器上放置15s，弃上清；
6)快速加入300μL p-Tau 181捕获抗体(Medix，Anti-h p-Tau 181R13321SPTN-5)，涡旋混匀，2～8℃振荡2h；
7)将磁珠溶液置于磁珠分离器上放置1min，弃上清，加入300μL磁珠洗涤液，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
8)加入300μL磁珠封闭液(购自碧云天，货号：P0220)，涡旋混匀，室温振荡45min；
9)将磁珠溶液置于磁珠分离器上放置1min，弃上清，加入300μL磁珠稀释液，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清，重复上述清洗操作3次；
10)加入300μL磁珠稀释液，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
11)加入300μL磁珠保存液(10mM PBS含有0.1％ BSA和0.1％ TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，并置于2～8℃进行保存。
2.光学信号增强纳米粒子修饰抗体：
1)取100μL的1％的光学信号增强纳米粒子(购自苏州为度生物，货号：FG0300CA)置于离心机中，离心15min，弃上清；
2)加入500μL清洗液(10mM PBS含有0.1％ TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，离心15min，弃上清，重复上述清洗操作3次；
3)加入50μL的10mg/mL的EDC和50μL的10mg/mL的NHS，室温振荡反应30min；
4)光学信号增强纳米粒子溶液离心15min，弃上清，加入500μL偶联缓冲液(50mMMES，pH5.0)，涡旋混匀，离心15min，弃上清，重复上述操作3次；
5)加入500μL偶联缓冲液，并涡旋混匀。加入0.1mg p-Tau 181检测抗体(Medix，Anti-h Tau R13301 SPTN-5)，室温振荡反应2h；
6)加入500μL偶联缓冲液，涡旋混匀，离心15min，弃上清；
7)加入500μL封闭缓冲液(购自碧云天，货号：P0220)，室温振荡封闭45min；
8)封闭后的光学信号增强纳米粒子溶液置于离心机中离心15min，弃上清；
9)加入500μL清洗液，涡旋混匀，离心15min，弃上清；
10)加入500μL光学信号增强纳米粒子保存液(10mM PBS含有0.1％ BSA和0.1％TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，离心15min，弃上清；
11)加入500μL光学信号增强纳米粒子保存液，涡旋混匀，并置于2～8℃进行保存。
3.单分子免疫反应检测：
1)待测样品制备：用样品稀释液(10mM PBS)将pTau-181标准品梯度稀释成0pg/mL，0.1pg/mL，0.5pg/mL，1pg/mL，5pg/mL，10pg/mL，50pg/mL；
2)取100μL待测样品，加入1μL 1.6mg/mL磁珠抗体复合物，室温下混匀震荡反应30min；
3)反应后洗涤，加入30μL的光学信号增强纳米粒子检测抗体复合物，室温下混匀震荡反应60min；
4)最后将免疫复合物洗涤，加入10μL检测液(10mM PBS含有0.1％TW20，pH＝7.4)重悬，通入液滴生成芯片装置(购自中芯启恒，ZX-LD-100Y)中生成液滴包裹磁珠，在光学成像设备莱卡DMi8荧光显微镜下进行检测获得荧光图像并进行处理分析，得到实验结果。
4.实验结果
结果显示：本发明的p-Tau 181项目检测线性范围0～50pg/mL，检测下限为0.1pg/mL，其R2＝0.9971，满足要求。荧光结果如图3所示，线形图如图4所示。
对比例1：IL-6单分子免疫反应检测(未采用液滴分散方式)
1.磁珠修饰抗体：
1)取16.7μL 30mg/mL Dynabeads M-270羧酸磁珠(Thermo M270)磁珠，置于2mL离心管中，混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
2)加入300μL磁珠稀释液(10mM PBS含有0.1％ TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清，重复上述清洗操作3次；
3)加入300μL磁珠偶联缓冲液(50mM MES，pH 5.0)，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
4)加入291μL磁珠偶联缓冲液，涡旋混匀，随即加入9μL 10mg/mL EDC，涡旋混匀，2～8℃振荡30min；
5)将磁珠溶液置于磁珠分离器上放置1min，弃上清，加入300μL磁珠偶联缓冲液，涡旋混匀，磁分离器上放置15s，弃上清；
6)快速加入300μL IL-6捕获抗体(Abcam Anti-IL-6抗体，ab9324)，涡旋混匀，2～8℃振荡2h；
7)将磁珠溶液置于磁珠分离器上放置1min，弃上清，加入300μL磁珠洗涤液，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
8)加入300μL磁珠封闭液(购自碧云天，货号：P0220)，涡旋混匀，室温振荡45min；
9)将磁珠溶液置于磁珠分离器上放置1min，弃上清，加入300μL磁珠稀释液，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清，重复上述清洗操作3次；
10)加入300μL磁珠稀释液，涡旋混匀，磁分离器上放置1min，弃上清；
11)加入300μL磁珠保存液(10mM PBS含有0.1％ BSA和0.1％ TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，并置于2～8℃进行保存。
2.光学信号增强纳米粒子修饰抗体：
1)取100μL的1％的光学信号增强纳米粒子(购自苏州为度生物，货号：FG0300CA)置于离心机中，离心15min，弃上清；
2)加入500μL清洗液(10mM PBS含有0.1％ TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，离心15min，弃上清，重复上述清洗操作3次；
3)加入50μL的10mg/mL的EDC和50μL的10mg/mL的NHS，室温振荡反应30min；
4)光学信号增强纳米粒子溶液离心15min，弃上清，加入500μL偶联缓冲液(50mMMES，pH5.0)，涡旋混匀，离心15min，弃上清，重复上述操作3次；
5)加入500μL偶联缓冲液，并涡旋混匀。加入0.1mg IL-6检测抗体(Abcam生物素Anti-IL-6抗体，ab84251)，室温振荡反应2h；
6)加入500μL偶联缓冲液，涡旋混匀，离心15min，弃上清；
7)加入500μL封闭缓冲液(购自碧云天，货号：P0220)，室温振荡封闭45min；
8)封闭后的光学信号增强纳米粒子溶液置于离心机中离心15min，弃上清；
9)加入500μL清洗液，涡旋混匀，离心15min，弃上清；
10)加入500μL光学信号增强纳米粒子保存液(10mM PBS含有0.1％ BSA和0.1％TW20，pH＝7.4)，涡旋混匀，离心15min，弃上清；
11)加入500μL光学信号增强纳米粒子保存液，涡旋混匀，并置于2～8℃进行保存。
3.单分子免疫反应检测：
1)待测样品制备：用样品稀释液(10mM PBS)将IL-6标准品梯度稀释成0pg/mL，0.01pg/mL，0.05pg/mL，0.1pg/mL，0.5pg/mL，1pg/mL，5pg/mL，10pg/mL，50pg/mL；
2)取100μL待测样品，加入1μL 1.6mg/mL磁珠抗体复合物，室温下混匀震荡反应30min；
3)反应后洗涤，加入50μL的光学信号增强纳米粒子检测抗体复合物，室温下混匀震荡反应30min；
4)最后将免疫复合物洗涤，加入10μL检测液(10mM PBS含有0.1％TW20，pH＝7.4)重悬，转移至检测孔中，在光学成像设备莱卡DMi8荧光显微镜下进行检测获得荧光图像并进行处理分析，得到实验结果。
4.实验结果
结果显示：本发明的IL-6项目检测线性范围0～50pg/mL，检测下限为0.1pg/mL，检测下限高于采用液滴分散方法。荧光结果如图5所示，线形图如图6所示。
实施例和对比例数据对比：
| 实施例1 | 实施例2 | 对比例 | |
| 最低检测下限(pg/mL) | 0.01 | 0.1 | 0.1 |
最低检测下限是免疫学检测方法保证灵敏度的重要指标，值越低意味着灵敏度越高。实施例1采用液滴分散法，在灵敏度上能达到0.01pg/mL。不采用液滴分散方法的对比例，灵敏度相比而言会下降。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：取待测样品与固定在固相载体上的捕获抗体混合，孵育，清洗，获得第一复合物，所述捕获抗体与所述样品中的靶标分子的第一位点结合；
步骤(2)：取检测抗体、光学信号增强纳米粒子与步骤(1)所述的第一复合物混合，孵育，清洗，获得第二复合物，所述检测抗体与所述靶标分子的第二位点结合，所述检测抗体与所述光学信号增强纳米粒子偶联；
步骤(3)：用液滴包裹步骤(2)所述的第二复合物，分散，采集光学信号，分析，获得检测结果。
2.如权利要求1所述的非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，所述固相载体修饰有能够与抗体偶联的官能团。
3.如权利要求1或2所述的非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，所述固相载体包括磁珠、微米尺度微球或纳米尺度微球中的一种或多种；
所述磁珠的粒径为1～3μm。
4.如权利要求1至3任一项所述的非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，所述靶标分子包括蛋白质、多糖、有生物活性的小分子或小分子与蛋白质的复合物中的一种或多种。
5.如权利要求1至4任一项所述的非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，所述偶联包括直接偶联或间接偶联；
所述直接偶联包括通过物理吸附的方式偶联或通过化学修饰的方式偶联；
所述间接偶联包括通过生物素-链霉亲和素系统偶联。
6.如权利要求1至5任一项所述的非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，所述光学信号增强纳米粒子的粒径为100～300nm。
7.如权利要求1至6任一项所述的非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，所述光学信号增强纳米粒子的发光材料包括有机荧光染料、量子点、荧光蛋白、稀土发光材料、聚集诱导发光材料或聚合物发光材料中的一种或多种。
8.如权利要求1至7任一项所述的非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，所述光学信号增强纳米粒子的载体材质包括聚苯乙烯、二氧化硅、葡聚糖、琼脂糖、无机金属化合物或聚丙烯酰胺中的一种或多种。
9.如权利要求1至8任一项所述的非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，所述光学信号增强纳米粒子的结构包括中空结构、多孔结构或核壳结构中的一种或多种。
10.如权利要求1至9任一项所述的非酶促的单分子免疫反应检测方法，其特征在于，包括：
步骤(1)所述孵育的时间为15～60min；和/或
步骤(1)所述孵育的温度为25℃～40℃；和/或
步骤(2)所述孵育的时间为15～60min；和/或
步骤(2)所述孵育的温度为25℃～40℃。
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