BR112014020513B1 - Métodos e sistemas para amplificação de sinal de bioensaios - Google Patents
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Abstract
métodos e sistemas para a amplificação de sinal de bioensaios. a presente invenção refere-se a métodos e sistemas para a detecção de um analito de interesse por um ensaio amplificado. os métodos e sistemas da invenção utilizam a alta especificidade das biomoléculas que foram acopladas a um suporte sólido para amplificar ainda mais um sinal produzido pela interação de um agente ligante com o analito de interesse como um meio para detectar baixos níveis do analito de interesse presente em uma amostra. em determinadas modalidades, para ensaios imunoquímicos (por exemplo, elisa ou ria) ou de imunofluorescência em que uma proteína a ser identificada está ligada diretamente ou por meio de anticorpos de captura a uma superfície passivada, uma amplificação de ~10.000 vezes pode ser alcançada.
Description
[001] Esse pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano No. 61/601.244, depositado em 21 de fevereiro de 2012. CAMPO DA INVENÇÃO Essa invenção refere-se aos métodos e kits para a amplificação do sinal de bioensaios.
[002] Os imunoensaios são ferramentas importantes para pesquisa e ensaios de diagnóstico. Desse modo, há uma necessidade de melhorar a sensibilidade desses ensaios.
[003] O documento WO 2004/009848 descreve amplificação baseada em micropartículas em que as micropartículas estão ligadas a moléculas de sinalização e moléculas de ligação ao analito.
[004] O documento WO 03/104424 divulga conjugados moleculares que amplificam a sinalização através de reagentes de ligação específicos ao analito com um rótulo detectável.
[005] O artigo científico de Galikowska et. al, publicado em Eur J Clin Microbiol Infect Dis 30(9): 10671073 (2011) descreve que bactérias podem ser detectadas por bacteriófagos usando o ensaio de detecção baseado em ELISA.
[006] O artigo de Gutierrez et al., publicado em J Food Protection 60(1): 23-27 (1997) descreve que bactérias podem ser detectadas por anticorpos monoclonais em um ensaio de detecção baseado em ELISA.
[007] As modalidades da presente divulgação compreendem métodos de amplificação para a detecção de um analito de interesse e kits para a realização desses ensaios. A presente divulgação pode ser apresentada em uma variedade de maneiras.
[008] Em uma modalidade, conforme definido nas reivindicações, compreende um método para a amplificação de sinal que compreende: adicionar ao analito de interesse um suporte de detecção que compreende um suporte sólido, compreendendo uma pluralidade de moléculas de um agente ligante que reconhece e se liga ao analito de interesse; e detectar pelo menos parte da pluralidade das moléculas do agente ligante no suporte de detecção. Em uma modalidade, o método pode compreender ainda adicionar um suporte de captura, o qual compreende pelo menos um agente ligante ao suporte de captura que reconhece e se liga ao analito de interesse, a fim de imobilizá-lo sobre o suporte de captura. O método pode, em determinadas modalidades, incluir também a adição de um agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção. O agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção pode, em algumas modalidades, compreender uma porção detectável.
[009] Em ainda outras modalidades, a invenção compreende kits para executar os métodos divulgados na presente invenção.
[0010] A presente invenção pode ser melhor compreendida referindo-se às seguintes figuras não limitadoras.
[0011] A figura 1, nos quadros A e B, ilustra um ensaio de acordo com uma modalidade da presente invenção, onde o quadro A retrata uma modalidade de um imunoensaio amplificado da invenção, e o quadro B retrata um imunoensaio sanduíche padrão da técnica anterior.
[0012] A menos que seja definido de outra forma neste documento, termos científicos e técnicos usados juntamente com a presente invenção devem ter os significados que são comumente compreendidos pelas pessoas normalmente versadas na técnica. Além disso, a menos que seja exigido pelo contexto de outra forma, termos no singular devem englobar o singular. Em geral, as nomenclaturas usadas juntamente com, e técnicas de cultura de células e de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e proteínas e química de ácidos nucleicos e hibridização descritas na presente invenção são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas conhecidos geralmente são realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas, que são discutidas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que seja indicado de outra forma. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como é comumente realizado na técnica ou como descrito neste documento. As nomenclaturas utilizadas juntamente com os procedimentos de laboratório e as técnicas descritas na presente invenção são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica.
[0013] Os termos a seguir, a menos que sejam indicados de outra forma, devem ser interpretados como apresentando os seguintes significados:
[0014] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “um”, “uma” e “o/a” podem se referir a um ou mais, a menos que especificamente indicado de outra forma.
[0015] O uso do termo "ou" é usado para significar "e/ou", a menos que seja explicitamente indicado para se referir a apenas um ou caso as alternativas sejam mutuamente exclusivas, embora a divulgação embase uma definição que se refere a apenas alternativas e "e/ou." Conforme utilizado na presente invenção, “outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[0016] Em todo esse pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método sendo utilizado para determinar o valor ou a variação que existe entre as amostras.
[0017] O termo "suporte sólido" ou "suporte" significa uma estrutura que fornece um substrato no qual as biomoléculas podem se ligar. Por exemplo, um suporte sólido pode ser um poço de ensaio (ou seja, como uma placa de microtitulação), ou o suporte sólido pode ser um local em uma matriz, ou um suporte móvel, como uma esfera.
[0018] O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos e anticorpos quiméricos, por exemplo, gerados por mutagênese combinatória e exibição de fago. O termo "anticorpo" também inclui miméticos ou peptideomiméticos dos anticorpos. Peptideomiméticos são compostos à base de, ou derivados de peptídeos e proteínas. Os peptideomiméticos da presente invenção normalmente podem ser obtidos por modificação estrutural de uma sequência peptídica conhecida usando aminoácidos artificiais, restrições conformacionais, substituição isostérica e similares.
[0019] O termo "agente ligante" refere-se a uma molécula que pode se ligar especificamente e seletivamente a uma segunda molécula (ou seja, diferente) de interesse. A interação pode ser não covalente, por exemplo, como resultado da ligação de hidrogênio, interações de van der Waals ou interações hidrofóbicas ou eletrostáticas, ou pode ser covalente. O termo "agente ligante solúvel" refere-se a um agente ligante que não está associado com (ou seja, covalentemente ou não covalentemente ligado) a um suporte sólido.
[0020] Conforme utilizado na presente invenção, um "analito" refere-se a uma molécula ou composto que está sendo mensurado. Em algumas modalidades, o analito interage com um agente ligante. Conforme descrito na presente invenção, o termo "analito" pode referir-se a uma proteína ou peptídeo de interesse. Um analito pode ser um agonista, um antagonista ou um modulador. Ou um analito pode não ter um efeito biológico. Analitos podem incluir pequenas moléculas, açúcares, oligossacarídeos, lipídios, peptídeos, peptideomiméticos, compostos orgânicos e similares.
[0021] O termo "porção detectável", "biomolécula detectável" ou "repórter" refere-se a uma molécula que pode ser mensurada em um ensaio quantitativo. Por exemplo, uma porção detectável pode incluir uma enzima que pode ser usada para converter um substrato em um produto que pode ser mensurado (por exemplo, um produto visível). Ou uma porção detectável pode ser um radioisótopo que pode ser quantificado. Ou uma porção detectável pode ser um fluoróforo. Ou uma porção detectável pode ser uma molécula luminescente. Ou outras moléculas detectáveis podem ser usadas.
[0022] Conforme utilizado na presente invenção, o termo "zona de equivalência" indica a região em uma reação de precipitação em que a concentração do antígeno e do anticorpo leva à precipitação máxima. Assim, se o antígeno ou o anticorpo estiver em excesso, a precipitação não ocorre.
[0023] Em certos aspectos, a presente invenção utiliza a alta especificidade das biomoléculas que foram acopladas a um suporte sólido para amplificar adicionalmente um sinal como um meio para detectar baixos níveis dos analitos (por exemplo, uma proteína de interesse) presente em uma amostra. Em determinadas modalidades, para ensaios imunoquímicos (por exemplo, ELISA ou RIA) ou de imunofluorescência em que uma proteína a ser identificada está ligada diretamente ou por meio de anticorpos de captura a uma superfície passivada, uma amplificação de sinal de pelo menos 10.000 vezes pode ser alcançada.
[0024] Dessa forma, em certas modalidades, a presente invenção compreende um método para a amplificação de sinal que compreende adicionar ao analito de interesse um suporte de detecção que compreende um suporte sólido, compreendendo uma pluralidade de moléculas de um agente ligante que reconhece e se liga ao analito de interesse; e detectar pelo menos parte da pluralidade das moléculas do agente ligante no suporte de detecção. Em certas modalidades, o método pode compreender ainda adicionar um suporte de captura, o qual compreende pelo menos um agente ligante ao suporte de captura que reconhece e se liga ao analito de interesse, a fim de imobilizá-lo sobre o suporte de captura. Em uma modalidade, o analito de interesse está ligado ao suporte de captura antes de interagir com o suporte de detecção. Ou o analito de interesse pode se ligar ao suporte de captura após interagir com o suporte de detecção. O método compreende também a adição de um agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção. Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção é um agente ligante solúvel.
[0025] Em uma modalidade, o suporte de captura sólido pode ser um poço de ensaio (ou seja, como uma placa de microtitulação). Ou o suporte de captura sólido pode ser um local em uma matriz, ou um suporte móvel, como uma esfera. Em uma modalidade, o suporte de detecção é um suporte móvel, como uma esfera. Em determinadas modalidades, o analito de interesse pode estar em solução. Ou o analito de interesse pode ser uma proteína dentro de um microrganismo e/ou tecido, de modo que, após a fixação, as macromoléculas na célula funcionem como um suporte de captura. Por exemplo, em uma modalidade, os métodos de amplificação de imunoensaio podem ser utilizados para a detecção in situ das proteínas.
[0026] Em uma modalidade, o suporte de detecção que compreende uma pluralidade de moléculas de um agente ligante que reconhecem especificamente o analito de interesse são adicionadas em excesso a uma amostra que compreende o analito de interesse. Também em uma modalidade, o suporte de detecção compreende uma pluralidade de moléculas que compreende uma porção detectável. Alternativamente, onde um agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção é usado, o agente ligante solúvel pode compreender uma porção detectável.
[0027] Uma variedade dos agentes ligantes pode ser usada nos métodos da invenção. Por exemplo, a pluralidade dos agentes ligantes ligados ao suporte de detecção pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que reconhece o analito de interesse. Adicionalmente e/ou alternativamente, o agente ligante ao suporte de captura pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que reconhece o analito de interesse. Além disso e/ou alternativamente, o agente ligante que pode especificamente reconhecer e se ligar a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Ou o agente ligante, de acordo com qualquer um dos suportes de captura ou de detecção, ou o agente ligante que pode reconhecer e se ligar especificamente a pelo menos algumas dentre a pluralidade de moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção pode compreender uma proteína que se liga a um alvo não proteico (ou seja, por exemplo, uma proteína que se liga especificamente a um analito de molécula pequena de interesse, ou um receptor que se liga a uma proteína).
[0028] Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar especificamente a pelo algumas dentre as várias moléculas de agente ligante no suporte de detecção não reconhece o agente ligante de captura usado para ligar o analito de interesse ao suporte de captura sólido.
[0029] O uso de um suporte de detecção que compreende uma pluralidade de agentes ligantes que reconhecem o analito de interesse proporciona amplificação do sinal. Em modalidades alternativas, o suporte de detecção compreende mais de 1.000, mais de 10.000, mais de 100.000, mais de 500.000 ou mais de 1.000.000 de moléculas de agente ligante específicas para o analito de interesse. Dessa forma, em modalidades alternativas, o método da invenção fornece uma amplificação de 1.000, de mais de 10.000, de mais de 100.000, de mais de 500.000 ou de mais de 1.000.000 vezes o sinal observado em um imunoensaio padrão não amplificado que não compreende um suporte de detecção que compreende uma pluralidade dos agentes ligantes de detecção. Dessa forma, em modalidades alternativas, os métodos da invenção fornecem uma amplificação que varia de 1.000 a 1.000.000.000, ou de 1.000 a 100.000.000, ou de 5.000 a 10.000.000, ou de 10.000 a 1.000.000, ou de 10.000 a 500.000, ou de 50.000 a 500.000 vezes o sinal observado em um imunoensaio não amplificado padrão, que não compreende um suporte de detecção compreendendo uma pluralidade de agentes ligantes de detecção. Ou intervalos dentro dessas faixas podem ser alcançados.
[0030] Em algumas modalidades, o analito de interesse é uma proteína e os agentes ligantes são anticorpos. Dessa forma, em certas modalidades, a presente invenção compreende um método para a amplificação de sinal da detecção de proteínas por um imunoensaio.
[0031] O uso do suporte de detecção e/ou do suporte de captura pode compreender uma variedade de formatos.
[0032] Por exemplo, em algumas modalidades, o analito de interesse pode ser primeiramente ligado ao suporte de captura e, em seguida, deixado interagir com o suporte de detecção. Dessa forma, o método pode incluir as etapas de ligar uma pluralidade de agentes ligantes que, podem se ligar especificamente a uma proteína de interesse, a um suporte de captura. O método pode compreender ainda adicionar o analito de interesse ao suporte de captura. Em seguida, o método pode compreender adicionar ao analito de interesse que está ligado ao suporte de captura um suporte de detecção que compreende uma pluralidade de agentes ligantes de detecção específicos para o analito de interesse, de modo que a detecção da pluralidade dos agentes ligantes de detecção forneça a amplificação do sinal.
[0033] Da mesma forma, em certas modalidades, o método pode compreender adicionar um terceiro agente ligante que pode reconhecer e se associar, especificamente, a uma pluralidade dos agentes ligantes de detecção. Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, à pluralidade dos agentes ligantes de detecção é um agente ligante solúvel. O terceiro agente ligante pode compreender uma porção detectável. Dessa forma, em algumas modalidades, a realização das etapas do método gera um complexo que compreende o suporte de captura:agente ligante de captura:analito de interesse:agente ligante de detecção:suporte de detecção:agente ligante solúvel:porção detectável.
[0034] A figura 1A representa uma modalidade de um imunoensaio amplificado da invenção de acordo com o formato acima. Por exemplo, e como descrito na figura 1A, o método pode compreender as etapas de fixação de uma pluralidade de agentes ligantes 208 a um suporte de captura sólido 214, de modo que os agentes ligantes podem reconhecer e capturar, especificamente, uma proteína de interesse 206. Em uma modalidade, a proteína pode ser isolada de uma membrana celular ou liberada de uma célula de interesse e, em seguida, ser adicionada à fase sólida. Em uma modalidade, o agente ligante de captura ligado ao suporte de captura sólido é um anticorpo primário, ou um fragmento de um anticorpo que reconhece a proteína. Por exemplo, em uma modalidade, o suporte de captura 214 pode ser um poço de microtitulação revestido com os anticorpos 208 à proteína de interesse 206 (por exemplo, anticorpo de coelho). Ou outros agentes ligantes, por exemplo, os receptores que reconhecem ligantes específicos, as moléculas de ácido nucleico que podem hibridizar com sequências complementares, polissacarídeos, lipídios, lipopolissacarídeos, ácidos teicoicos ou ácidos lipoteicoicos que reconhecem ligantes específicos, e similares, podem ser usados. Os anticorpos imobilizados 208 podem reconhecer, especificamente, o analito de interesse 206, enquanto que outras proteínas ou biomoléculas, 202, 204 não se ligam.
[0035] Em seguida, um suporte de detecção 216 (por exemplo, uma esfera) revestido com uma pluralidade de moléculas de um agente ligante de detecção 211 que também reconhece o analito de interesse 206 pode ser adicionado. Em uma modalidade, o suporte de detecção pode compreender milhares, dezenas de milhares ou até centenas de milhares do agente ligante de detecção. Em uma modalidade, o agente ligante de detecção é um anticorpo. Por exemplo, o agente ligante de captura pode ser um anticorpo de coelho que reconhece uma proteína de interesse, enquanto que o agente ligante de detecção pode ser um anticorpo primário de porquinho-da-índia, que também reconhece a proteína de interesse. Dessa forma, a proteína de links de interesse 206 liga o suporte de detecção 216 que compreende a pluralidade das moléculas do agente ligante de detecção 211, que reconhece a proteína de interesse 206 ligada ao agente ligante de captura 208 imobilizado sobre o suporte de captura sólido 214.
[0036] Em seguida, um agente ligante solúvel (por exemplo, um anticorpo secundário, como o anticorpo anti- porquinho-da-índia) 212 que reconhece o agente ligante de detecção 211 pode ser adicionado. Em uma modalidade, o agente ligante solúvel 212 é marcado com uma porção detectável 210 (ou seja, um repórter). Por exemplo, o agente ligante solúvel pode ser marcado com uma porção fluorescente (por exemplo, QDOTS®) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre). Ou, em uma modalidade, os agentes ligantes de detecção no segundo suporte podem ser marcados com tais porções detectáveis. Assim, uma amplificação muito grande do sinal pode ser originada de uma única molécula de proteína 206.
[0037] Dessa forma, como mostrado na figura 1A, como a proteína 206 pode reconhecer tanto os anticorpos primários (ou seja, um anticorpo de porquinho-da-índia 211 sobre a esfera 216 e um anticorpo de coelho 208 sobre o suporte de captura 214, ela pode facilitar a formação de complexos sanduíches entre pelo menos uma das esferas 216 e o anticorpo ligado 208 à superfície sólida 214. Em seguida, após remover por lavagem quaisquer esferas não ligadas 216, os grânulos ligados à proteína 206 de interesse podem ser detectados usando um anticorpo secundário 212 que reconhece o anticorpo primário 211 ligado à pérola. Em uma modalidade, o anticorpo secundário é ligado a uma porção detectável 210 como uma enzima, um fluoróforo, QDOTS® ou similares.
[0038] Dessa forma, o método pode compreender as etapas de fixação de uma pluralidade de agentes ligantes a um suporte sólido ("suporte de captura"), de modo que os agentes ligantes podem especificamente reconhecer e capturar um analito de interesse. Em seguida, o método pode compreender adicionar um segundo suporte móvel (por exemplo, uma esfera ou esferas) revestida(s) com dezenas de milhares de um segundo agente ligante ("suporte de detecção") que pode se ligar especificamente a pelo menos uma molécula imobilizada no primeiro suporte. O método pode incluir ainda a etapa de adição de um terceiro complexo agente ligante-repórter (por exemplo, um agente ligante solúvel acoplado a uma porção detectável) que se liga especificamente a pelo menos alguns dentre a pluralidade do segundo agente ligante no segundo suporte. Em seguida, o método pode compreender a etapa de detectar o complexo que compreende o suporte de captura:agente ligante de captura:analito de interesse:agente ligante de detecção:suporte de detecção:agente ligante solúvel:porção detectável. Conforme ilustrado na figura 1A, devido ao grande número de moléculas do agente ligante 211 ligadas ao suporte de detecção 216, que podem se ligar ao agente ligante solúvel 212 com moléculas repórteres 210, a amplificação do sinal (ou seja, a proteína 206 ligada ao agente ligante 208 no suporte de captura 214) é aumentada de maneira dramática.
[0039] A figura 1B fornece uma ilustração de um imunoensaio não amplificado da técnica anterior para fins de comparação. Dessa forma, o imunoensaio da figura 1B compreende a formação de um sanduíche que compreende um suporte de captura 214: o primeiro anticorpo primário 208: o analito de interesse 206: o segundo anticorpo primário 211: o anticorpo secundário 212: a porção detectável 210.
[0040] A figura 2 ilustra várias modalidades alternativas de imunoensaios amplificados que podem ser usados para detectar analitos de interesse, onde a ordem em que os vários componentes são adicionados ao ensaio varia.
[0041] Como mostrado na figura 2A (método 1), em algumas modalidades, o analito de interesse pode se ligar a um agente ligante de captura 230 e, em seguida, o agente ligante de captura se liga ao suporte de captura 240. Em seguida, o suporte de detecção 233 que compreende uma pluralidade dos agentes ligantes de detecção 211 pode ser adicionado. Finalmente, um agente ligante solúvel 212 que compreende uma porção detectável 210 e que reconhece os agentes ligantes de detecção 211 é adicionado.
[0042] Por exemplo, em uma modalidade, moléculas dos anticorpos primários 230 (por exemplo, de coelho) específicas para um analito de interesse 206 (por exemplo, uma proteína de interesse) e marcadas com biotina 205 são adicionados a fim de se ligar às moléculas do analito 206 em solução. Os anticorpos biotinilados 230 podem reconhecer, especificamente, o analito de interesse 206, enquanto que outras proteínas ou biomoléculas, 202, 204 não se ligam. Nesse ponto, uma esfera (ou esferas) de “captura” revestida com estreptavidina magnética 240 (por exemplo, com cerca de um micrômetro de diâmetro) pode ser adicionada para se ligar aos complexos de anticorpo biotinilado-proteína quantitativamente. Em uma modalidade, o método pode incluir bloquear os complexos de esfera- proteína pela adição de biotina e albumina de soro bovino (BSA).
[0043] Nesse ponto, uma esfera ou esferas de "detecção" 233 revestidas com milhares, dezenas de milhares a centenas de milhares de moléculas de um segundo anticorpo primário 211 que reconhece a proteína de interessam 206, mas que é produzida em uma espécie diferente (por exemplo, porquinho-da-índia) do que os anticorpos de captura biotinilados 230 são adicionadas para se ligar aos epítopos abertos e não ocupados no analito 206. A quantidade do anticorpo de detecção 211 pode ser detectada usando um anticorpo secundário 212 que reconhece o segundo anticorpo primário 211 (tal como um anticorpo anti-porquinho-da-índia para um anticorpo primário de porquinho-da-índia). Em uma modalidade, o anticorpo secundário 212 é marcado com uma porção detectável 210. Por exemplo, o anticorpo secundário pode ser marcado com uma porção fluorescente (por exemplo, QDOTS®) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre). Assim, uma amplificação muito grande do sinal pode ser originada de uma única molécula de proteína.
[0044] A figura 2B (método 2) ilustra uma forma alternativa de ensaio amplificado do método 1, mas onde o suporte ou suportes de detecção 233 compreendendo as moléculas do agente ligante de detecção 211 são adicionadas ao poço de ensaio com o agente ligante de captura 230 antes da adição do suporte de captura 240 que reconhece o agente ligante de captura 230. Uma vez que os complexos de suporte de captura:agente ligante de captura:analito de interesse:agente ligante de detecção:suporte de detecção são formados, as moléculas de um agente ligante solúvel 212 marcadas com uma porção detectável 210 podem ser adicionadas.
[0045] A figura 2C (método 3) ilustra uma forma alternativa do ensaio do método 1, mas onde o suporte ou suportes de detecção 233, compreendendo uma pluralidade de agentes ligantes de detecção 211 também compreende uma pluralidade de moléculas de uma porção detectável 210 ligada (por exemplo, por ligação covalente ou revestimento da superfície) à superfície dos suportes de detecção ao invés de estar ligada a um agente ligante solúvel separado. Em uma modalidade, esse método pode permitir o uso de menos agentes ligantes de detecção se o suporte de detecção compreende uma pluralidade de porções detectáveis. Por exemplo, a razão de porções detectáveis:agentes ligantes de detecção no suporte de detecção pode ser igual a 1:1, 5:1, 10:1, 100:1, 500:1, 1000:1 ou 10,000:1, ou maior. A porção detectável pode compreender uma porção fluorescente (por exemplo, QDOTS®) ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre). Além disso, pode ser observado que, nessa modalidade, não há necessidade de usar um agente ligante que possa especificamente reconhecer e se ligar a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante no suporte de detecção (por exemplo, anticorpo solúvel 212).
[0046] A figura 2D (método 4) ilustra uma forma alternativa do ensaio do método 3, mas onde o suporte ou suportes de detecção 233 revestidos com os agentes ligantes de detecção 211 e uma pluralidade de porções detectáveis 210 são adicionados antes da adição do suporte de captura 240. Em algumas modalidades, o(s) suporte(s) de detecção 233 revestidos com os agentes ligantes de detecção 211 e uma pluralidade de porções detectáveis 210 e o agente ligante de captura 230 são adicionados simultaneamente. Em uma modalidade, isso pode promover a formação de um complexo entre o analito de interesse 206 e o suporte de detecção 233, e o agente ligante de captura 230.
[0047] A figura 2E (método 5) ilustra uma forma alternativa do método 2, mas onde o(s) suporte(s) de detecção 233 é/são adicionado(s) antes da adição do agente ligante de captura 230 e o suporte de captura 240. Em uma modalidade, isso pode promover a formação de um complexo entre o analito de interesse 206 e o suporte de detecção 233.
[0048] Pode ser importante que o agente ligante que pode especificamente reconhecer e se ligar a pelo menos alguma das várias moléculas do agente ligante no suporte de detecção e/ou o agente ligante de detecção não se ligue ao suporte de captura ou ao agente ligante ao suporte de captura, uma vez que tal ligação poderia gerar um sinal de fundo. Dessa forma, em algumas modalidades, a etapa de detecção compreende a adição de um anticorpo secundário solúvel que reconhece o agente do anticorpo primário de detecção na esfera de detecção, mas em que o anticorpo secundário solúvel não reconhece o agente ligante de captura (por exemplo, o primeiro anticorpo primário) usado para ligar a proteína de interesse ao suporte de captura.
[0049] Em certas modalidades, os suportes sólidos de captura e/ou detecção podem ser tratados com um agente de passivação. Por exemplo, em determinadas modalidades, o analito de interesse pode ser capturado sobre uma superfície passivada superfície passivada (ou seja, uma superfície que foi tratada para reduzir a ligação não específica). Um tal agente de passivação é o BSA. Além disso e/ou alternativamente, onde o agente ligante utilizado é um anticorpo, os suportes sólidos de captura e/ou detecção podem ser revestidos com proteína A, proteína G, proteína A/G, proteína L ou outro agente que se liga com alta afinidade ao anticorpo do agente ligante. Essas proteínas se ligam ao domínio Fc dos anticorpos e, assim, podem orientar a ligação dos anticorpos que reconhecem a proteína ou as proteínas de interesse.
[0050] Os suportes de detecção e/ou captura podem ser esferas de poliestireno ou grânulos feitos de um material semelhante ou diferente, de modo que as esferas podem ser revestidas com proteínas, mas que não reagem com outros componentes no ensaio. Em certas modalidades, as esferas são suficientemente grandes de modo que uma pluralidade das moléculas do anticorpo pode ser fixadas à pérola. Por exemplo, as esferas podem variar de tamanho de cerca de 0,1 a 50, 0,2 a 40, 0,3 a 30, 1 a 20, 1 a 15 ou cerca de 1 a 3 μm de diâmetro. O tamanho das esferas pode depender do tamanho do ensaio a ser realizado. Para um ensaio realizado em um poço de microtitulação, esferas de cerca de 1 micrômetro (μm) podem ser utilizadas.
[0051] Em modalidades alternativas, o suporte de detecção pode compreender uma pluralidade de agentes ligantes de detecção. Por exemplo, em modalidades alternativas, o número de agentes ligantes no suporte de detecção pode ser maior que 100, maior que 500, maior que 1.000, maior que 5.000, maior que 10.000, maior que 20.000, maior que 50.000, maior que 100.000, maior que 500.000 ou maior que 1.000.000 moléculas do agente ligante de detecção. Por exemplo, em uma modalidade, o suporte de detecção pode compreender uma esfera que é revestida com dezenas ou centenas de milhares de moléculas de anticorpo. Em modalidades alternativas, pode haver cerca de 10.000 a 10.000.000, ou cerca de 50.000 a 500.000, ou cerca de 100.000 a 1.000.000 moléculas de agente ligante (por exemplo, um anticorpo primário) para uma esfera de suporte de detecção que apresenta cerca de 15 μm de diâmetro. Para esferas de suporte de detecção de diferentes tamanhos, uma cobertura de superfície correspondente pode ser usada. Ou intervalos dentro dessas faixas podem ser alcançados.
[0052] Conforme descrito acima, um agente ligante complexado com uma enzima ou material fluorescente (QDOTS® ou outro marcador fluorescente) pode ser adicionado para se ligar ao grande número de anticorpos usados como agentes ligantes de detecção em um suporte de detecção. Ensaios imunoquímicos (por exemplo, ELISA) ou de excitação e visualização de material fluorescente em um sistema de imageamento por emissão adequado podem ser usados para quantificar a proteína. Em uma modalidade, a chave para o grande fator de amplificação de sinal é a grande área superficial do suporte de detecção que pode acomodar a ligação dos agentes ligantes de detecção. Por exemplo, para os anticorpos, cerca de > 10.000 e > 100.000 moléculas podem ser usadas para revestir, respectivamente, pérolas de 1 μm e 2,8 μm.
[0053] A área ocupada pelas moléculas do analito de interesse sobre o suporte de captura deve satisfazer a acessibilidade à superfície do suporte de detecção. Por exemplo, uma matriz confluente bidimensional de 1.000.000 pérolas, funcionando como suportes de captura e com um tamanho de 1 μm pode ocupar cerca de 1 mm2. Em uma modalidade, diluições em série de uma amostra contendo 106 moléculas do analito de interesse podem ser aplicadas a um suporte de captura fixo (por exemplo, poço de microtitulação) a fim de produzir locais separados para cada aplicação de amostra. Para um suporte de captura móvel (por exemplo, uma esfera) o número de suportes de detecção de um tamanho específico que podem se ligar pode ser limitado por efeitos estéricos. Para os suportes fixos ou móveis, as moléculas individuais do analito de interesse que podem se ligar a uma esfera de 1 μm ou 2,8 μm revestida com > 104 ou > 105 anticorpos primários, respectivamente, podem proporcionar amplificação nessa faixa por ELISA, RIA ou ensaio de imunofluorescência, mediante ligação dos anticorpos secundários marcados.
[0054] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção pode compreender um método de amplificação do sinal em ensaios imunoquímicos ou de imunofluorescência indiretos por ~ 10.000 vezes, compreedendo: ligação das esferas de detecção de poliestireno (tipicamente com um micrômetro de diâmetro) revestidas com a proteína A/G e > 10.000 moléculas de anticorpo específicas para a proteína a ser identificada para as moléculas de proteína imobilizadas (diretamente ou por meio de anticorpos de captura específicos) com espaçamento adequado, sobre uma superfície passivada ou imobilizada sobre uma esfera de captura; remoção dos complexos pérola-anticorpo não ligados com lavagens; ligação dos anticorpos secundários complexados, por exemplo, com uma enzima ou material fluorescente (QDOTS®) ou outro marcador fluorescente); e quantificação da proteína, por exemplo, por ELISA ou por excitação e visualização do material fluorescente em um sistema de imageamento por emissão apropriado.
[0055] Além disso e/ou alternativamente, o analito de interesse pode estar em solução, e o ensaio pode compreender ter o analito ligado a uma pluralidade de suportes de detecção, como um meio de detectar o analito. Por exemplo, uma proteína em solução pode ser usada para ligar uma pluralidade de pérolas de detecção (por exemplo, de cerca de 15 a 20 μm de diâmetro), com cada uma das pérolas de detecção possuindo uma pluralidade de anticorpos, promovendo dessa forma a aglutinação das pérolas por ligação aos anticorpos em duas pérolas. Isso pode ser particularmente eficaz quando o antissoro policlonal é usado, uma vez que tal antissoro permitirá que os anticorpos reconheçam epítopos diferentes na proteína de interesse. As diluições em série da proteína podem ser testadas para aglutinação máxima das pérolas, a fim de determinar as concentrações ideais de anticorpo-pérolas e proteína, ou seja, a zona de equivalência. Um efeito prozona de excesso de anticorpo é improvável, uma vez que os anticorpos são imobilizados sobre as pérolas.
[0056] Em outra modalidade, onde o analito de interesse está dentro de um microrganismo ou de uma amostra de tecido, as células em uma amostra podem ser concentradas sobre a superfície de um filtro de tamanho de poro adequado (por exemplo, tipicamente um filtro spin de 0,45 μm para filtrar bactérias). Uma vez concentrado, elas podem ser lisadas em um volume pequeno de tampão, conforme descrito na presente invenção, para liberar as moléculas do analito de interesse. O lisado de células contendo o analito de interesse pode ser transferido da superfície do filtro para uma lâmina de vidro ou para o poço de uma placa de microtitulação. Nesse ponto, o analito de interesse (por exemplo, uma proteína) pode ser identificado pela formação de um retículo após a adição de ~ 300 a ~ 1.000 grandes pérolas de poliestireno (normalmente de 15 a 20 μm de diâmetro) revestidas com proteína G, proteína A ou proteínas A/G, e anticorpos específicos. A aglutinação das pérolas pode ser visualizada diretamente ou com o auxílio de ampliação, de 50 a 100 vezes. Novamente, a imobilização dos anticorpos nas esferas pode evitar efeitos prozona; entretanto, diluições em série da proteína misturada com um número constante de complexos pérola-anticorpo podem ser necessárias para observar a aglutinação da esferas grânulo por causa do possível excesso de antígeno. Os complexos esfera-proteína G-anticorpo (agrupados) com uma quantidade conhecida do analito de interesse podem servir como um controle positivo, e os complexos esfera-proteína G- anticorpo não agregados em tampão sem qualquer analito de interesse (por exemplo, um lisado de um controle negativo conhecido) pode servir como um controle negativo.
[0057] Em modalidades alternativas, a presente invenção pode compreender kits para realizar os métodos da invenção. Em uma modalidade, a invenção pode compreender um kit para analisar um analito de interesse que compreende um suporte de detecção, o qual compreende um suporte sólido compreendendo uma pluralidade de moléculas de agente ligante que podem reconhecer e se ligar ao analito de interesse. Em uma modalidade, o kit pode compreender um suporte de captura, o qual compreende pelo menos um agente ligante ao suporte de captura que reconhece e se liga ao analito de interesse. O kit pode, em algumas modalidades, compreender também um agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção. Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção é um agente ligante solúvel.
[0058] Os suportes de detecção e/ou captura podem compreender uma variedade de formatos. Em uma modalidade, o suporte de captura sólido pode ser um poço de ensaio (ou seja, como uma placa de microtitulação). Ou o suporte de captura sólido pode ser um local em uma matriz, ou um suporte móvel, como uma esfera. Em uma modalidade, o suporte de detecção é um suporte móvel, como uma esfera.
[0059] Uma variedade dos agentes ligantes pode ser usada nos kits da invenção. Por exemplo, a pluralidade das moléculas de agente ligante ligadas ao suporte de detecção pode ser moléculas de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que reconhece o analito de interesse. Adicionalmente e/ou alternativamente, o agente ligante ao suporte de captura pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que reconhece o analito de interesse. Além disso e/ou alternativamente, o agente ligante que pode especificamente reconhecer e se ligar à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção pode ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Em uma modalidade, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar especificamente à pluralidade das moléculas do agente ligante no suporte de detecção não reconhece o agente ligante de captura usado para ligar o analito de interesse ao suporte de captura sólido. Ou o agente ligante, ou qualquer um dos suportes de captura ou de detecção, ou o agente ligante que pode reconhecer e se ligar especificamente à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção pode compreender uma proteína que se liga a um alvo não proteico (ou seja, como uma proteína que se liga especificamente a um analito de molécula pequena de interesse, ou um receptor que se liga a uma proteína).
[0060] O suporte de detecção pode compreender uma pluralidade de moléculas de uma porção detectável. Além disso ou adicionalmente, o agente ligante que pode reconhecer e se ligar, especificamente, à pluralidade das moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção pode compreender uma porção detectável.
[0061] O uso de um suporte de detecção que compreende uma pluralidade de agentes ligantes que reconhecem o analito de interesse proporciona amplificação do sinal. Em modalidades alternativas, o suporte de detecção pode compreender uma pluralidade de agentes ligantes de detecção. Por exemplo, em modalidades alternativas, o número de agentes ligantes no suporte de detecção pode ser maior que 100, maior que 500, maior que 1.000, maior que 5.000, maior que 10.000, maior que 20.000, maior que 50.000, maior que 100.000, maior que 500.000 ou maior que 1.000.000 moléculas do agente ligante de detecção. Por exemplo, em uma modalidade, o suporte de detecção pode compreender uma esfera que é revestida com dezenas ou centenas de milhares de moléculas de anticorpo. Em modalidades alternativas, pode haver cerca de 10.000 a 10.000.000, ou cerca de 50.000 a 500.000, ou cerca de 100.000 a 1.000.000 moléculas de agente ligante (por exemplo, um anticorpo primário) para uma esfera de suporte de detecção que apresenta cerca de 15 μm de diâmetro. Para pérolas de suporte de detecção de diferentes tamanhos, uma cobertura de superfície correspondente pode ser usada. Ou intervalos dentro dessas faixas podem ser alcançados.
[0062] Dessa forma, em modalidades alternativas, o método da invenção fornece uma amplificação de 1.000, de mais de 10.000, de mais de 100.000, de mais de 500.000 ou de mais de 1.000.000 vezes o sinal observado em um imunoensaio padrão não amplificado que não compreende um suporte de detecção que compreende uma pluralidade dos agentes ligantes de detecção. Por exemplo, em modalidades alternativas, os kits da invenção fornecem uma amplificação que varia de 1.000 a 1.000.000.000, ou de 1.000 a 100.000.000, ou de 5.000 a 10.000.000, ou de 10.000 a 1.000.000, ou de 10.000 a 500.000, ou de 50.000 a 500.000 vezes o sinal observado em um imunoensaio não amplificado padrão, que não compreende um suporte de detecção compreendendo uma pluralidade de agentes ligantes de detecção. Ou intervalos dentro dessas faixas podem ser alcançados.
[0063] Dessa forma, em certas modalidades, o kit pode compreender reagentes para um imunoensaio baseado em esfera. Dessa forma, em uma modalidade, o suporte de detecção pode compreender uma esfera revestida com moléculas de um anticorpo (ou fragmento de anticorpo) que reconhece uma proteína de interesse. A esfera pode, em determinadas modalidades, ser uma esfera de poliestireno revestida com proteína G, proteína A ou proteínas A/G, que estão disponíveis comercialmente (por exemplo, junto a Life Technologies/Invitrogen, Carlsbad CA) em uma grande variedade de tamanhos. Outras esferas que podem ser úteis incluem esferas de sílica magnéticas revestidas com essas mesmas proteínas (esferas MagSi obtidas junto a AmsBio, Lake Forest, CA).
[0064] Em modalidades alternativas, pode haver cerca de 10.000 a 10.000.000, ou cerca de 50.000 a 1.000.000, ou cerca de 100.000 a 500.000 moléculas de agente ligante (por exemplo, um anticorpo primário) para uma esfera de suporte de detecção de cerca de 15 μm de diâmetro. Para pérolas de suporte de detecção de diferentes tamanhos, uma cobertura de superfície correspondente pode ser usada. Em certas modalidades, as esferas de suporte de detecção são suficientemente grandes, de modo que uma pluralidade das moléculas do agente ligante pode se ligar à esfera. Por exemplo, as pérolas podem variar de tamanho de cerca de 0.1 a 50, 0.2 a 40, 0.5 a 30, 1 a 20, 1 a 15 ou cerca de 1 a 3 μm de diâmetro. Onde o agente ligante a ser ligado à esfera é um anticorpo, esferas comercialmente disponíveis pré- revestidas com proteína G, proteína A ou proteínas A/G podem ser utilizadas, uma vez que essas proteínas se ligam ao domínio Fc dos anticorpos, orientando os anticorpos, de modo que os domínios Fab fiquem livres para se ligar aos epítopos dos antígenos.
[0065] Os kits para um imunoensaio baseado em esfera podem também compreender anticorpos primários adicionais para a proteína de interesse, onde tais anticorpos são de uma segunda espécie. Esses anticorpos têm especial utilidade em ensaios indiretos, como descrito na presente invenção, uma vez que eles acomodarão a ligação específica de complexos da molécula antianticorpo secundário-molécula repórter. Além disso, esses complexos anticorpo secundário-repórter não se ligarão aos anticorpos primários da primeira espécie que fixa a proteína alvo à superfície sólida ou às esferas de proteína A/G, evitando reações falso-positivas. Além disso, os complexos anticorpo secundário-repórter não se ligarão à superfície das esferas de proteína A/G, evitando assim reações falso- positivas.
[0066] Os kits também podem compreender anticorpos secundários solúveis que podem ser marcados com um marcador detectável ou um agente ligante que pode complexar com um marcador detectável. Por exemplo, em certas modalidades, um kit da invenção pode compreender um anticorpo secundário que é ligado a um fluoróforo. Em uma modalidade, o fluoróforo pode incluir um QDOT®. Por exemplo, em uma modalidade, conjugados antianticorpo-QDOT® reconhecem a pluralidade de anticorpos primários ligados a esfera.
[0067] Os substratos a serem usados nos kits da presente invenção incluem, mas não se limitam, às esferas de poliestireno (Spherotech, Libertyville, Illinois),esferas magnéticas (Invitrogen; AmsBio), revestimentos de látex, um filtro de membrana, um filtro de fibra, uma fibra livre ou um substrato sólido poroso. Métodos para o uso de esferas magnéticas podem ser encontrados, por exemplo, com o folheto da embalagem do produto de proteína G Dynabeads No. 10003D, em Kala et al., Analytical Biochemistry 254:263-266 (1997) e em Dutton, Genetic Engineering News, Volume 22, Número 13, julho de 2002.
[0068] Um amplo espectro de partículas, particularmente de esferas magnéticas e de poliestireno, é comercialmente disponível em uma ampla gama de tamanhos. Para algumas modalidades, um conjunto preferencial de partículas tem um tamanho de partícula médio (ou seja, a maior dimensão das partículas) igual a cerca de um micrômetro (ou seja, mícron). Para algumas modalidades, um conjunto preferencial de partículas tem um tamanho de partícula médio (ou seja, a maior dimensão das partículas) não menor que 10 micrômetros (ou seja, mícrons). Esferas comercialmente disponíveis exemplares são esferas de poliestireno revestidas com proteína G, proteína A e proteínas A/G, e esferas de poliestireno revestidas com estreptavidina disponíveis junto a Invitrogen, Carlsbad, CA ou a Spherotech, Libertyville, Illinois. Outros fornecedores de esferas de poliestireno e magnéticas incluem a Thermo Scientific Pierce, Millipore, Polyscience e New England Biolabs. AmsBio, Lake Forest, IL, é um fornecedor de esferas de sílica magnéticas, que são disponíveis com todos os revestimentos de proteína indicados acima. A Invitrogen fornece também grânulos magnéticos com superfície de epóxi, que se ligam covalentemente aos anticorpos. As esferas podem ser de poliestireno, sílica, vidro, ou outros materiais, planas ou derivatizadas para fixação a grupos químicos específicos.
[0069] As modalidades da presente invenção também podem ser caracterizadas pelos seguintes exemplos não limitadores. Quaisquer exemplos que não se enquadram no escopo da reivindicação são fornecidos apenas para fins comparativos
[0070] Uma proteína ou subunidade da proteína de interesse pode ser capturada por anticorpos específicos para a proteína de interesse (por exemplo, anticorpos primários de coelho biotinilados) imobilizados em uma superfície passivada, como Neutravidina, para minimizar falsos positivos (por exemplo, consulte Jain et al., Nature, 2011, 473: 484-488). Em seguida, em um ensaio sanduíche, esferas de poliestireno com 1 μm ou 2,8 μm revestidas com proteína A/G e outro tipo de anticorpos específicos para a proteína (tipicamente > 104 e > 105 para esferas de 1 μm e 2,8 μm, respectivamente) produzidas em uma segunda espécie (por exemplo, porquinhos-da-índia) são adicionadas para se ligar às subunidades da proteína alvo imobilizada. Em seguida, anticorpos secundários, ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, os anticorpos anti- porquinho-da-índia) que são conjugados (por exemplo, covalentemente ligados) com uma enzima, marcador radioativo ou material fluorescente, como QDOTS®, são adicionados para se ligar à pluralidade de anticorpos primários ligados a esfera específicos para o analito de interesse. As moléculas de proteína ou anticorpos não ligados são removidos por lavagens (2 vezes) entre adições sucessivas.
[0071] Ensaios de ELISA, RIA ou de imunofluorescência podem ser usados para detectar e quantificar a proteína ou a subunidade da proteína de interesse. Para analisar a fluorescência, as manchas são excitadas com luz UV e visualizadas com um filtro de emissão adequado em um sistema de imageamento hiperespectral, com uma câmera.
[0072] Experimentos foram realizados para comparar os vários formatos ensaio representados na figura 2, quadro B (ou seja, método 2). Essencialmente, lisados de E. coli (500.000 células) foram preparados por lise de células bacterianas, e por dissociação dos ribossomos nisto nos constituintes proteicos em tiocianato de guanidina 6 M (10.000 células/pL). A concentração de tiocianato de guanidina foi em seguida reduzida até 0,12 ou 0,6 M por diluição em tampão fosfato (por exemplo, diluição de 90.000 células em 450 μL). As proteínas ribossomais foram, em seguida, capturadas usando um dos métodos de detecção de captura mostrados na figura 2 (tabela 1). Os resultados são mostrados para as células de entrada iniciais e para as proteínas ribossomais estimadas das células; 100 células de E. coli possuindo cerca de 2,7 pg de proteína ribossomal.*Experimentos 1 e 2.
[0073] Experimentos adicionais foram realizados usando o método descrito no quadro 2E. Esse método utiliza a adição de esfera-Ab2 (esferas de carbóxi e anticorpos antirribossomais de coelho) ao lisado. Isso permite que as proteínas ribossomais se liguem à esfera, semelhantemente ao ELISA sanduíche normal, onde os anticorpos de “captura” são imobilizados em uma superfície. O Ab1-biotina (porquinho-da-índia) foi, em seguida, adicionado diretamente à mistura sem quaisquer etapas de lavagem. Os complexos esfera-Ab2-proteína-Ab1 são capturados usando esferas de estreptavidina (SA) e são detectados usando anticorpos secundários ao Ab2. Verificou-se que essa abordagem funcionou quando esferas de Ab-carbóxi (Ab2- esfera) e biotina, anticorpos de porquinho-da-índia (Ab1) foram utilizados.
[0074] Assim, nesse experimento, o lisado de 2.500/5.000/10.000/20.000 células foi incubado com cerca de 1,3 x 108 esferas de carbóxi (0,1 μm) com anticorpo antirribossomo de coelho (Ab antirribo). Em seguida, 10 ng (4 x 1010 moléculas de IgG) de anticorpos antirribossomo de porquinho-da-índia biotinilados foram acrescentados e, adicionalmente, incubados. Os complexos de esfera-Ab- riboproteína-Ab foram capturados com cerca de 4 x 107 esferas C1 SA Dynabeads. A detecção foi realizada com 10 ng de anticorpo anticoelho marcado com peroxidase de rábano silvestre (HRP). Um quinto da amostra foi carregado sobre uma microplaca para detecção com substrato Sirius HRP em um luminômetro. Pode-se observar que o sinal foi detectado por apenas 500 células correspondentes a cerca de 14 pg de proteína ribossomal.
Claims (15)
1. Método para amplificação de sinal, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: adicionar ao analito de interesse um suporte de detecção que compreende um suporte sólido, compreendendo uma pluralidade de moléculas de um agente ligante que reconhece e se liga ao analito de interesse; e detectar pelo menos parte da pluralidade das moléculas do agente ligante no suporte de detecção através da adição de um agente de ligação que possa reconhecer e se ligar especificamente a pelo menos parte da pluralidade de moléculas do agente de ligação no suporte de detecção.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o suporte de detecção é uma esfera; ou que compreende uma pluralidade de moléculas de uma porção detectável.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda adicionar um suporte de captura, o qual compreende pelo menos um agente ligante ao suporte de captura que reconhece e se liga ao analito de interesse, a fim de imobilizá-lo sobre o suporte de captura, preferencialmente em que o analito de interesse está ligado ao suporte de captura antes de interagir com o suporte de detecção; ou em que o analito de interesse está ligado ao suporte de captura depois de interagir com o suporte de detecção
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo de que o agente de ligação pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção que compreende uma porção detectável; o agente ligante pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de captura que é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo; o agente de ligação pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de captura que não reconhece o agente de ligação de captura usado para ligar o analito de interesse ao suporte sólido de captura, ou o agente de ligação pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de captura que compreende um agente de ligação solúvel.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o suporte de a captura é uma esfera.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 4, CARAC TERIZADO pelo fato de o agente ligante ligado ao suporte de detecção é um anticorpo ou fragmentos de anticorpos que reconhecem e se ligam ao analito de interesse.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a pluralidade de moléculas do agente de ligação ligado ao suporte de detecção são anticorpo ou um fragmento de anticorpo que reconhecem e se ligam ao analito de interesse..
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o suporte de detecção compreende mais de 10.000 moléculas do agente ligante específicas para o analito de interesse, ou em que o suporte de detecção compreende mais de 100.000 moléculas do agente ligante específicas para o analito de interesse.
9. Kit para analisar um analito de interesse, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: um suporte de detecção, o qual compreende um suporte sólido compreendendo uma pluralidade de moléculas de um agente ligante que pode reconhecer e se ligar ao analito de interesse e um agente de ligação que pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção.
10. Kit, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda um suporte de captura, o qual compreende pelo menos um agente ligante ao suporte de captura que reconhece e se liga ao analito de interesse.
11. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 10 , CARACTERIZADO pelo fato de que o suporte de detecção é uma esfera, ou em que o suporte de detecção compreenda uma pluralidade de moléculas de uma porção detectável.
12. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações de a 9 a 11, CARACTERIZADO de que a pluralidade de moléculas de agente de ligação ligados ao suporte de detecção são anticorpos ou fragmentos de anticorpos que podem reconhecer e se ligar ao analito de interesse.
13. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de ligação pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção que compreende um agente de ligação solúvel; o agente ligante pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção que é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que pode reconhecer e se ligar ao analito de interesse; ou o agente de ligação pode reconhecer e se ligar, especificamente, a pelo menos algumas das várias moléculas do agente ligante sobre o suporte de detecção que compreende uma porção detectável.
14. Kit, de acordo com qualquer umas das reivindicações de 10 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o suporte de captura é uma esfera, ou em que o suporte se captura do agente de ligação é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que pode reconhecer e se ligar ao analito de interesse.
15. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o suporte de detecção compreende mais de 1.000 moléculas do agente ligante específicas para o analito de interesse, em que o suporte de detecção compreende mais de 10.000 moléculas do agente ligante específicas para o analito de interesse, ou em que o suporte de detecção compreende mais de 100.000 moléculas do agente ligante específicas para o analito de interesse.
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