ES2636483T3 - Métodos y sistemas para la amplificación de señal de bioensayos - Google Patents

Métodos y sistemas para la amplificación de señal de bioensayos Download PDF

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ES2636483T3
ES2636483T3 ES13752350.2T ES13752350T ES2636483T3 ES 2636483 T3 ES2636483 T3 ES 2636483T3 ES 13752350 T ES13752350 T ES 13752350T ES 2636483 T3 ES2636483 T3 ES 2636483T3
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Dwight Lyman ANDERSON
Andrew J. Conrad
Stephen Eric ERICKSON
Ben Barrett HOPKINS
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

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Abstract

Un método para la amplificación de señal comprendiendo: adición al analito de interés de un soporte de detección comprendiendo un soporte sólido que incluye diversas moléculas de un agente de unión que reconoce y se une al analito de interés; y detectar por lo menos algunas de las diversas moléculas del agente de unión sobre el soporte de detección, añadiendo un agente de unión que puede reconocer y unirse específicamente al menos a algunas de las diversas moléculas del agente de unión en el soporte de detección.

Description

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DESCRIPCION
Metodos y sistemas para la amplificacion de senal de bioensayos
Esta solicitud reivindica prioridad a la Solicitud de Patente USA Provisional 61/601 244 presentada el 21 de febrero de 2012.
Campo de la invencion
Esta invencion esta relacionada con metodos y kits para la amplificacion de senal de los bioensayos. Antecedentes
Los inmunoensayos son importantes herramientas, tanto para los ensayos de investigacion como de diagnostico. Por tanto, es necesario mejorar la sensibilidad de tales ensayos.
WO 2004/009848 divulga la amplificacion basada en micropartmulas, donde las micropartmulas van unidas a moleculas de senalizacion y moleculas de union de analitos.
WO 03/104424 divulga conjugados moleculares que amplifican la senalizacion mediante reactivos de union espedficos de analitos con una etiqueta detectable.
Galikowska et al, Eur J ClinMicrobiol Infect Dis30 (9): 1067-1073(2011) demuestra que las bacterias pueden ser detectadas por bacteriofagos utilizando el ensayo de deteccion basado en ELISA.
Gutierrez et al., J Food Protection60 (1):23-27 (1997) expone que las bacterias pueden ser detectadas por anticuerpos monoclonales en un ensayo de deteccion basado en ELISA.
Resumen
Las realizaciones de la presente divulgacion comprenden metodos de amplificacion para la deteccion de un analito de interes, y kits para realizar tales ensayos. La presente divulgacion puede ser realizada de diversas maneras.
En una realizacion, la invencion, como viene definida en las reivindicaciones, comprende un metodo para la amplificacion de senal que incluye: anadir al analito de interes un soporte de deteccion que comprende un soporte solido, que incluye diversas moleculas de un agente de union que reconoce y se une al analito de interes; y detectar por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion. En una realizacion, el metodo puede comprender ademas anadir un soporte de captura, comprendiendo dicho soporte de captura por lo menos un agente de union de soporte de captura que reconoce y se une al analito de interes para inmovilizar el analito de interes sobre el soporte de captura. En determinadas realizaciones, el metodo puede comprender ademas la adicion de un agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion. El agente de union que puede reconocer espedficamente y unirse a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion, puede comprender en algunas realizaciones una fraccion detectable.
En otras realizaciones, la invencion comprende kits para llevar a cabo los metodos que se divulgan aqrn.
Breve descripcion de las figuras
La presente invencion puede entenderse mejor remitiendose a las siguientes figuras, entre otras.
La Figura 1, paneles A y B, ilustra un ensayo segun una realizacion de la presente invencion, donde el panel A representa una realizacion de un inmunoensayo amplificado de la invencion, y el panel B representa un inmunoensayo tipo sandwich estandar de la tecnica anterior.
La Figura 2, paneles A-E, ilustra diversos metodos de deteccion para protemas de interes segun realizaciones alternativas de la invencion.
Descripcion detallada
Definiciones
Salvo que aqrn se defina lo contrario, los terminos cientfficos y tecnicos utilizados en relacion con la presente invencion tendran el significado entendido habitualmente por los expertos en la tecnica. Ademas, y salvo que el contexto requiera lo contrario, los terminos en singular incluiran los plurales, y los terminos en plural incluiran el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en conexion con, y las tecnicas de, cultivo de celulas y tejidos, biologfa molecular, inmunologfa, microbiologfa, genetica y qmmica de las protemas y acidos nucleicos e hibridacion que se describen aqrn, son bien conocidas y utilizadas habitualmente en la tecnica. Los metodos y las tecnicas conocidos se llevan a cabo generalmente de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica, y como vienen descritos en diversas referencias generales y mas espedficas que se comentan en la presente especificacion, salvo que se indique lo contrario. Las reacciones enzimaticas y las tecnicas de purificacion se realizan segun las especificaciones del fabricante, tal como se llevan a cabo habitualmente en la tecnica o como se describen aqrn. Las nomenclaturas utilizadas en relacion con los procedimientos y tecnicas de laboratorio
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descritos aqrn son bien conocidas y utilizadas comunmente en la tecnica.
Salvo que se indique lo contrario, los siguientes terminos deben ser interpretados de acuerdo con estos significados:
Tal como se utilizan aqrn, los terminos "uno", "una", y "el" “la” pueden referir a uno o mas, salvo que se indique espedficamente lo contrario.
El termino “o” se emplea con el significado “y/o” a menos que se indique explfcitamente que se refiere solo a alternativas, o que estas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgacion contenga una definicion que se refiera a solo alternativas y “y/o”. Tal como se utiliza aqrn "otro/a" puede significar por lo menos un segundo o mas.
En esta solicitud, el termino “aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la variacion de error inherente al dispositivo, el metodo empleado en la determinacion del valor o la variacion que existe entre muestras.
El termino "soporte solido" o "soporte" significa una estructura que proporciona un sustrato sobre el que pueden ligarse biomoleculas. Por ejemplo, un soporte solido puede ser un pocillo de ensayo (es decir, tal como una placa de microtitulacion), o el soporte solido puede ser un lugar sobre una matriz, o un soporte movil, como una perla.
El termino “anticuerpo” incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos sinteticos y anticuerpos quimericos, ej., generados por mutagenesis combinatoria y exposicion de fagos. El termino “anticuerpo” incluye tambien mimeticos o peptidomimeticos de anticuerpos. Los peptidomimeticos son compuestos basados en o derivados de peptidos y protemas. Los peptidomimeticos de la presente invencion pueden ser obtenidos tfpicamente por modificacion estructural de una secuencia de peptidos conocida utilizando aminoacidos no naturales, restricciones conformacionales, reemplazo isosterico y similares.
El termino “agente de union” se refiere a una molecula que puede unirse espedfica y selectivamente a una segunda (es decir, distinta) molecula de interes. La interaccion puede ser no covalente, por ejemplo, como resultado de enlaces de hidrogeno, interacciones de van der Waals, o interacciones electrostaticas o hidrofobicas, o puede ser covalente. El termino “agente de union soluble” se refiere a un agente de union que no va asociado (es decir, unido de forma covalente o no covalente) a un soporte solido.
Como se utiliza aqrn, un “analito” se refiere a una molecula o compuesto que estan siendo medidos. En algunas realizaciones, el analito interactua con una agente de union. Como se describe aqrn, el termino “analito” puede referirse a una protema o un peptido de interes. Un analito puede ser un agonista, un antagonista o un modulador. O un analito puede no tener un efecto biologico. Los analitos pueden incluir pequenas moleculas, azucares, oligosacaridos, lfpidos, peptidos, peptidomimeticos, compuestos organicos y similares.
El termino “fraccion detectable” o “biomolecula detectable” o “reporter” se refiere a una molecula que puede ser medida en un ensayo cuantitativo. Por ejemplo, una fraccion detectable puede comprender un enzima que puede ser utilizado para convertir un sustrato en un producto que puede ser medido (ej., un producto visible). O una fraccion detectable puede ser un radioisotopo que puede ser cuantificado. O una fraccion detectable puede ser un fluoroforo. O una fraccion detectable puede ser una molecula luminiscente. O se pueden utilizar otras moleculas detectables.
Como se utiliza aqrn, el termino “zona de equivalencia” indica la region en una reaccion de precipitacion en la que la concentracion de antfgeno y anticuerpo conduce a la maxima precipitacion. Por tanto, si hay un exceso de antfgeno o anticuerpo no se produce la precipitacion.
Metodos de amplificacion de senal
En determinados aspectos, la presente invencion utiliza la elevada especificidad de biomoleculas que han sido acopladas a un soporte solido para amplificar aun mas una senal, como un medio para detectar niveles bajos de los analitos (ej., una protema de interes) presentes en una muestra. En determinadas realizaciones, para ensayos inmunoqmmicos (por ejemplo, ELISA o RIA) o de inmunofluorescencia, en los que una protema que debe ser identificada se liga directamente o por anticuerpos de captura a una superficie pasivada, se puede alcanzar una amplificacion de senal de por lo menos 10 000 veces.
Por tanto, en determinadas realizaciones, la presente invencion comprende un metodo de amplificacion de senal que incluye anadir al analito de interes un soporte de deteccion, comprendiendo dicho soporte de deteccion un soporte solido que incluye diversas moleculas de un agente de union que reconoce y se une al analito de interes; y detectando como irnnimo algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion. En determinas realizaciones, el metodo puede comprender ademas la adicion de un soporte de captura, comprendiendo este por lo menos un agente de union de soporte de captura que reconoce y se une al analito de interes para inmovilizar el analito de interes sobre el soporte de captura. En una realizacion, el analito de interes se une al soporte de captura antes de interactuar con el soporte de deteccion. O el analito de interes puede unirse al soporte de captura despues de interactuar con el soporte de deteccion. El metodo comprende ademas anadir un agente de union que pueda
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reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion. En una realizacion, el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion es un agente de union soluble.
En una realizacion, el soporte solido de captura puede ser un pocillo de ensayo (es decir, como una placa de microtitulacion). O el soporte solido de captura puede ser un lugar sobre una matriz, o un soporte movil, como una perla. En una realizacion, el soporte de deteccion es un soporte movil, como pueden ser perlas. En determinadas realizaciones, el analito de interes puede estar en solucion. O el analito de interes puede ser una protema dentro de un microorganismo y/o un tejido, de forma que, al fijarlo, las macromoleculas en la celula funcionan como soporte de captura. Por ejemplo, en una realizacion se pueden emplear los metodos de amplificacion de inmunoensayo para la deteccion in situ de protemas.
En una realizacion, el soporte de deteccion que comprende diversas moleculas de un agente de union que reconoce espedficamente el analito de interes, se anade en exceso a una muestra que comprende el analito de interes. Tambien en una realizacion, el soporte de deteccion comprende diversas moleculas que incluyen una fraccion detectable. Alternativamente, donde se utiliza un agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion, el agente de union soluble puede comprender una fraccion detectable.
Se pueden utilizar diversos agentes de union en los metodos de la invencion. Por ejemplo, los diversos agentes de union ligados al soporte de deteccion pueden ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconoce el analito de interes. Adicional y/o alternativamente, el agente de union ligado al soporte de captura puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconoce el analito de interes. Adicional y/o alternativamente, el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente al menos a algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. O el agente de union en cualquiera de los soportes de captura o deteccion, o el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente al menos a algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion puede comprender una protema que se liga a una diana no proteica (es decir, como una protema que se une espedficamente a un analito de interes de moleculas pequenas, o un receptor que se une a una protema).
En una realizacion, el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion no reconoce el agente de union de captura utilizado para unir el analito de interes al soporte de captura solido.
El empleo de un soporte de deteccion que comprenda diversos agentes de union que reconozcan el analito de interes proporciona la amplificacion de la senal. En realizaciones alternativas, el soporte de deteccion comprende mas de 1000, o mas de 10 000, o mas de 100 000, o mas de 500 000, o mas de 1 000 000 de moleculas de agente de union espedficas para el analito de interes. Asf, en realizaciones alternativas, el metodo de la invencion proporciona una amplificacion de 1000, o mas de 10 000, o mas de 100 000, o mas de 500 000, o mas de 1 000 000 veces la senal captada en un inmunoensayo estandar no amplificado que no comprenda un soporte de deteccion incluyendo diversos agentes de union de deteccion. Asf, en realizaciones alternativas, el metodo de la invencion proporciona una amplificacion que va de 1000 a 1 000 000 000, o de 1000 a 100 000 000, o de 5000 a 10 000 000, o de 10 000 a 1 000 000, o de 10 000 a 500 000, o de 50 000 a 500 000 veces la senal captada en un inmunoensayo estandar no amplificado, que no comprenda un soporte de deteccion incluyendo diversos agentes de union de deteccion. O pueden lograrse rangos dentro de esos rangos.
En determinadas realizaciones el analito de interes es una protema, y los agentes de union son anticuerpos. Asf, en determinadas realizaciones la presente invencion comprende un metodo para la amplificacion de senal de la deteccion de protemas por un inmunoensayo.
El uso del soporte de deteccion y/o el soporte de captura puede incluir diversos formatos.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, el analito de interes puede ligarse primero al soporte de captura, y permitirle luego interactuar con el soporte de deteccion. Por tanto, el metodo puede comprender los pasos de ligar diversos agentes de union que pueden unirse espedficamente a una protema de interes en un soporte de captura. El metodo puede comprender ademas anadir el analito de interes al soporte de captura. A continuacion, el metodo puede comprender anadir al analito de interes ligado al soporte de captura un soporte de deteccion comprendiendo diversos agentes de union de deteccion espedficos para el analito de interes, de forma que la deteccion de los diversos agentes de union de deteccion proporcione amplificacion de la senal.
En determinadas realizaciones, el metodo puede comprender tambien anadir un tercer agente de union que pueda reconocer y unirse espedficamente a los diversos agentes de union de deteccion. En una realizacion, el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a los diversos agentes de union de deteccion es un agente de union soluble. El tercer agente de union puede comprender una fraccion detectable. Asf, en algunas realizaciones, proceder a los pasos del metodo genera un complejo comprendiendo el soporte de captura: el agente de union de captura: el analito de interes: el agente de union de deteccion: el soporte de deteccion: el agente de union soluble: la fraccion detectable. La Figura
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1A representa una realizacion de un inmunoensayo amplificado de la invencion segun el formato indicado mas arriba. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 1 A, el metodo puede comprender los pasos de fijar diversos agentes de union 208 a un soporte solido de captura 214 de forma que los agentes de union pueden reconocer y capturar espedficamente una protema de interes 206.
En una realizacion, la protema puede ser aislada de una membrana celular, o liberada de una celula de interes, y anadida luego a la fase solida. En una realizacion, el agente de union de captura ligado al soporte solido de captura es un anticuerpo primario, o un fragmento de anticuerpo que reconoce la protema. Por ejemplo, en una realizacion, el soporte de captura 214 puede ser un pocillo de microtitulacion recubierto de anticuerpos 208 para la protema de interes 206 (ej., anticuerpo de conejo). O se pueden utilizar otros agentes de union, ej., receptores que reconocen a ligandos espedficos, moleculas de acido nucleico que pueden hibridar a secuencias complementarias, polisacaridos, lfpidos, lipopolisacaridos, acidos teicoicos o acidos lipoteicoicos que reconocen a ligandos espedficos y similares. Los anticuerpos inmovilizados 208 pueden reconocer espedficamente el analito de interes 206, mientras que otras protemas o biomoleculas 202, 204 no se ligan.
A continuacion se puede anadir un soporte de deteccion 216 (ej., una perla) recubierto con diversas moleculas de un agente de union de deteccion 211 que reconoce tambien el analito de interes 206. En una realizacion, el soporte de deteccion puede comprender de miles, a decenas de miles, a centenares de miles del agente de union de deteccion. En una realizacion, el agente de union de deteccion es un anticuerpo. Por ejemplo, el agente de union de captura puede ser un anticuerpo de conejo que reconoce una protema de interes, mientras que el agente de union de deteccion puede ser un anticuerpo primario de cobaya que tambien reconoce la protema de interes. De esta forma, la protema de interes 206 liga el soporte de deteccion 216 que comprende las diversas moleculas del agente de union de deteccion 211 que reconocen la protema de interes 206 ligada al agente de union de captura 208 inmovilizado sobre el soporte solido de captura 214.
A continuacion, se puede anadir un agente de union soluble (ej., un anticuerpo secundario, como un anticuerpo anti-cobaya) 212 que reconoce el agente de union de deteccion 211. En una realizacion, el agente de union soluble 212 va marcado con una fraccion detectable 210 (es decir, un reporter). Por ejemplo, el agente de union soluble puede ser marcado con una fraccion fluorescente (ej., QDOTS®) o un enzima (ej., peroxidasa de rabano). O, en una realizacion, los agentes de union de deteccion sobre el soporte secundario pueden ser marcados con tales fracciones detectables. Asf puede originarse una gran amplificacion de la senal a partir de una sola molecula proteica 206.
Asf, como se muestra en la Figura 1A, dado que la protema 206 puede reconocer ambos anticuerpos primarios (es decir, un anticuerpo de cobaya 211 sobre la perla 216 y un anticuerpo de conejo 208 sobre el soporte de captura 214), se puede facilitar la formacion de un complejo sandwich entre por lo menos una de las perlas 216 y el anticuerpo 208 ligado en la superficie solida 214. Luego, tras eliminar por lavado las perlas no ligadas 216, las perlas ligadas a la protema 206 de interes pueden ser detectadas utilizando un anticuerpo secundario 212 que reconoce el anticuerpo primario 211 ligado a la perla. En una realizacion, el anticuerpo secundario va ligado a una fraccion detectable 210 que puede ser un enzima, un fluoroforo, QDOTS®, o similares.
Por tanto, el metodo puede comprender los pasos de fijar diversos agentes de union a un soporte solido ("soporte de captura"), de modo que los agentes de union pueden reconocer y capturar espedficamente un analito de interes. A continuacion, el metodo puede incluir la adicion de un segundo soporte movil (ej., una perla o perlas) recubierto con decenas de miles de un segundo agente de union ("soporte de deteccion") que puede espedficamente ligarse a por lo menos una molecula inmovilizada sobre el primer soporte. El metodo puede incluir ademas el paso de anadir un tercer complejo agente de union-reporter (ej., un agente de union soluble acoplado a una fraccion detectable) que se une espedficamente a por lo menos alguna de la pluralidad del segundo agente de union en el segundo soporte. El metodo puede incluir luego el paso de detectar el complejo compuesto por el soporte de captura: agente de union de captura: analito de interes: agente de union de deteccion: soporte de deteccion: agente de union soluble: fraccion detectable. Como se ilustra en la Figura 1A, debido al gran numero de moleculas del agente de union 211 ligadas al soporte de deteccion 216, que puede ligar el agente de union soluble 212 con moleculas reporter 210, la amplificacion de senal (es decir, protemas 206 ligadas al agente de union 208 sobre el soporte de captura 214) aumenta espectacularmente.
La Figura IB proporciona una ilustracion de un inmunoensayo no amplificado del tipo anterior para comparacion. Asf, el inmunoensayo de la Figura IB comprende la formacion de un sandwich que incluye un soporte de captura 214: primer anticuerpo primario 208: analito de interes 206: segundo anticuerpo primario 211: anticuerpo secundario 212: fraccion detectable 210.
La Figura 2 ilustra diversas realizaciones alternativas de inmunoensayos amplificados que pueden utilizarse para detectar analitos de interes, donde vana el orden en que los diversos componentes se anaden al ensayo.
Como se muestra en la Figura 2A (Metodo 1), en algunas realizaciones, el analito de interes puede ir ligado a un agente de union de captura 230, y luego el agente de union de captura unirse al soporte de captura 240. A continuacion, puede anadirse el soporte de deteccion 233 comprendiendo diversos
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agentes de union 211. Finalmente, se anade un agente de union soluble 212 comprendiendo una fraccion detectable 210 y que reconoce los agentes de union de deteccion 211.
Por ejemplo, en una realizacion, se anaden moleculas de un anticuerpo primario 230 (ej., conejo) espedfico para un analito de interes 206 (ej., una protema de interes) y marcadas con biotina 205 para que se unan a las moleculas de analito 206 en solucion. Los anticuerpos biotinilados 230 pueden reconocer espedficamente el analito de interes 206, mientras que otras protemas o biomoleculas, 202, 204 no se ligan. En este punto, se puede anadir una perla (o perlas) de “captura” recubierta de estreptavidina magnetica 240 (ej., de aproximadamente un micrometro de diametro) para ligar cuantitativamente los complejos de anticuerpo biotinilado-protema. En una realizacion, el metodo puede incluir bloquear los complejos perla-protema mediante la adicion de biotina y albumina de suero bovino (BSA).
En este punto, se anade una perla o perlas de “deteccion” 233 recubiertas con miles, decenas de miles, a cientos de miles de moleculas de un segundo anticuerpo primario 211 que reconoce la protema de interes 206, pero que es producido en una especie distinta (ej., cobaya) donde los anticuerpos de captura biotinilados 230 se anaden para unirse a epttopos abiertos, no ocupados sobre el analito 206. La cantidad de anticuerpo de deteccion 211 puede detectarse utilizando un anticuerpo secundario 212 que reconoce el segundo anticuerpo primario 211 (como un anticuerpo anti-cobaya para un anticuerpo primario de cobaya). En una realizacion, el anticuerpo secundario 212 se marca con una fraccion detectable 210. Por ejemplo, el anticuerpo secundario puede ser marcado con una fraccion fluorescente (ej., QDOTS®) o un enzima (ej., peroxidasa de rabano). Asf puede originarse una gran amplificacion a partir de una sola molecula de protema.
La Figura 2B (Metodo 2) ilustra una forma alternativa del ensayo amplificado del Metodo 1, pero donde el soporte o soportes de deteccion 233 que comprende moleculas de agente de union de deteccion 211 se anaden al pocillo de ensayo con el agente de union de captura 230 antes de la adicion del soporte de captura 240 que reconoce el agente de union de captura 230. Una vez se ha formado el o los complejos de soporte de captura: agente de union de captura: analito de interes: agente de union de deteccion: soporte de deteccion, se pueden anadir las moleculas de un agente de union soluble 212 marcadas con una fraccion detectable 210.
La Figura 2C (Metodo 3) ilustra una forma alternativa del ensayo del Metodo 1, pero donde el soporte o soportes de deteccion 233 que comprende diversos agentes de union de deteccion 211 comprenden tambien diversas moleculas de una fraccion detectable 210 ligadas a (ej., por union covalente o recubriendo la superficie) la superficie de los soportes de deteccion en lugar de ligarse a un agente de union soluble aparte. En una realizacion, este metodo puede permitir el uso de menos agentes de union de deteccion si el soporte de deteccion comprende diversas fracciones detectables. Por ejemplo, la relacion de fracciones detectables: agentes de union de deteccion en el soporte de deteccion puede ser 1:1, o 5:1, o 10:1, o 100:1, o 500:1, o 1000:1, o 10 000:1 o superior. La fraccion detectable puede comprender una fraccion fluorescente (ej., QDOTS®) o un enzima (ej., peroxidasa de rabano). Puede verse tambien que en esta realizacion no es necesario utilizar un agente de union que pueda reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion (ej., anticuerpo soluble 212).
La Figura 2D (Metodo 4) ilustra una forma alternativa del ensayo del Metodo 3, pero donde el soporte o los soportes de deteccion 233 recubiertos con agentes de union de deteccion 211 y diversas fracciones detectables 210, se anaden antes de la adicion del soporte de captura 240. En algunas realizaciones, el o los soportes de deteccion 233 recubiertos con agentes de union de deteccion 211 y varias fracciones detectables 210 y el agente de union de captura 230 se anaden simultaneamente. En una realizacion, esto puede facilitar la formacion de un complejo entre el analito de interes 206 y el soporte de deteccion 233 y el agente de union de captura 230.
La Figura 2E (Metodo 5) ilustra una forma alternativa del Metodo 2, pero en la que el soporte o soportes de deteccion 233 se anaden antes de la adicion del agente de union de captura 230 y el soporte de captura 240. En una realizacion, esto puede facilitar la formacion de un complejo entre el analito de interes 206 y el soporte de deteccion 233.
Puede ser importante que el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion y/o el agente de union de deteccion no se una al soporte de captura o el agente de union del soporte de captura, ya que esa union podna producir efecto de fondo. Asf, en determinadas realizaciones, el paso de la deteccion comprende la adicion de un anticuerpo secundario soluble que reconoce el agente anticuerpo primario de deteccion sobre la perla de deteccion, pero donde el anticuerpo secundario soluble no reconoce el agente de union de captura (ej., primer anticuerpo primario) utilizado para ligar la protema de interes al soporte de captura.
En determinadas realizaciones, los soportes solidos de captura y/o deteccion pueden ser tratados con un agente pasivante. Por ejemplo, en determinadas realizaciones el analito de interes puede ser capturado sobre una superficie pasivada (es decir, una superficie que ha sido tratada para reducir la union no espedfica). Un agente pasivante asf es BSA. Adicional y/o alternativamente, donde el agente de union
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utilizado es un anticuerpo, los soportes solidos de captura y/o deteccion pueden ir recubiertos con protema A, protema G, protema A/G, protema L, u otro agente que se una con alta afinidad al anticuerpo del agente de union. Esas protemas ligan el dominio Fc de los anticuerpos y asf pueden orientar la union de anticuerpos que reconocen la protema o protemas de interes.
Los soportes de deteccion y/o captura pueden ser perlas de poliestireno, o perlas hechas de un material similar o distinto, tales como perlas que pueden ir recubiertas con protemas, pero que no reaccionan con otros componentes en el ensayo. En determinadas realizaciones, las perlas son lo suficientemente grandes para que varias de las moleculas del anticuerpo puedan ligarse a la perla. Por ejemplo, el tamano de las perlas puede oscilar desde aproximadamente 0,1 a 50, o 0,2 a 40, o 0,3 a 30, o 1 a 20, o 1 a 15 o aproximadamente de 1 a 3 pm de diametro. El tamano de las perlas puede depender del tamano del ensayo a realizar. Para un ensayo realizado en un pocillo de microtitulacion, pueden utilizarse perlas de aproximadamente 1 micrometro (pm).
En realizaciones alternativas, el soporte de deteccion puede comprender diversos agentes de union de deteccion. Por ejemplo, en realizaciones alternativas, el numero de agentes de union en el soporte de deteccion puede ser superior a 100, o superior a 500, o superior a 1000, o superior a 5000, o superior a 10 000, o superior a 20 000, o superior a 50 000, o superior a 100 000, o superior a 500 000, o superior a 1 000 000 moleculas del agente de union de deteccion. Por ejemplo, en una realizacion, el soporte de deteccion puede comprender una perla recubierta con decenas o centenares de miles de moleculas de anticuerpo. En realizaciones alternativas, puede haber aproximadamente de 10 000 a 10 000 000, o aproximadamente de 50 000 a 500 000, o aproximadamente de 100 000 a 1 000 000 de moleculas de agente de union (ej., un anticuerpo primario) para una perla de soporte de deteccion que tiene un diametro de aproximadamente 15 pm. Para perlas de soporte de deteccion de distintos tamanos, se puede utilizar una cobertura de superficie correspondiente. O lograr rangos dentro de esos rangos.
Como se describe mas arriba, se puede anadir un agente de union formando complejo con un enzima o material fluorescente (QDOTS® u otra etiqueta fluorescente) para ligarse al gran numero de anticuerpos utilizados como agentes de union de deteccion sobre un soporte de deteccion. Se puede utilizar un ensayo inmunoqmmico (por ejemplo, ELISA), o excitacion y visualizacion de material fluorescente en un sistema de imagen de emision apropiado para cuantificar la protema. En una realizacion, la clave del factor de gran amplificacion de senal es la gran area de superficie del soporte de deteccion, que puede permitir la union de agentes de union de deteccion. Por ejemplo, para anticuerpos, pueden utilizarse aproximadamente > 10 000 y > 100 000 moleculas para recubrir perlas de 1 pm y 2,8 pm, respectivamente.
El area ocupada por las moleculas del analito de interes en el soporte de captura debe satisfacer la accesibilidad en la superficie del soporte de deteccion. Por ejemplo, una matriz bidimensional confluente de 1 000 000 perlas que funcionen como soportes de captura, y con un tamano de 1 pm, puede ocupar aproximadamente 1 mm2. En una realizacion, diluciones en serie de una muestra conteniendo 106 moleculas del analito de interes pueden aplicarse a un soporte de captura fijo (ej., pocillo de microtitulacion) para producir localizaciones separadas para cada aplicacion de muestra. Para un soporte de captura movil (ej., una perla) el numero de soportes de deteccion de un tamano determinado que pueden ligarse puede ser fraccionado por efectos estericos. Para soportes fijos o moviles, moleculas individuales del analito de interes que puedan unirse a una perla de 1 pm o 2,8 pm recubierta con >104 o >105 anticuerpos primarios, respectivamente, puede proporcionar amplificacion en este rango por ELISA, RIA o ensayo de inmunofluorescencia con la union de anticuerpos secundarios marcados.
Por ejemplo, en una realizacion, la invencion puede comprender un metodo de amplificacion de la senal en ensayos indirectos inmunoqmmicos o inmunofluourescentes por ~10 000 veces, comprendiendo: union de perlas de deteccion de poliestireno (tfpicamente de un diametro de un micrometro) recubiertas con protemas A/G y > 10 000 moleculas de anticuerpo espedfico para la protema a identificar en las moleculas de protema inmovilizadas (directamente o a traves de anticuerpos de captura espedficos) con un espaciado apropiado sobre una superficie pasivada o inmovilizada en una perla de captura; eliminacion de complejos perla-anticuerpo no ligados mediante lavados; union de anticuerpos secundarios formando complejo con, por ejemplo, un enzima o material fluorescente (QDOTS®) u otra etiqueta fluorescente); y cuantificar la protema, mediante, por ejemplo, ELISA o por excitacion y visualizacion del material fluorescente en un sistema de imagen de emision apropiado.
Adicional y/o alternativamente, el analito de interes puede estar en solucion, y el ensayo puede comprender ligar el analito en diversos soportes de deteccion como un medio para detectar el analito. Por ejemplo, una protema en solucion se puede utilizar para ligar diversas perlas de deteccion (ej., diametro de aproximadamente 15 a 20 pm), cada perla de deteccion con diversos anticuerpos, favoreciendo asf que se agrupen las perlas, uniendose a anticuerpos en dos perlas. Esto puede resultar especialmente efectivo cuando se utiliza antisuero policlonal, ya que dichos antisueros permitiran a los anticuerpos reconocer distintos epftopos en la protema de interes. Las diluciones en serie de la protema pueden ser comprobadas respecto a la maxima aglutinacion de perlas para determinar las concentraciones optimas de anticuerpo-perlas y protema, es decir, la zona de equivalencia. Es improbable un efecto prozona de exceso de anticuerpos, ya que los anticuerpos estan inmovilizados sobre las perlas.
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En otra realizacion, donde el analito de interes esta dentro de un microrganismo o una muestra de tejido, las celulas de una muestra pueden concentrarse sobre la superficie de un filtro con un tamano de poro apropiado (ej., tfpicamente filtro giratorio de 0,45 pm para bacterias). Una vez concentradas, pueden ser lisadas en un pequeno volumen de tampon como se describe aqm, para liberar moleculas del analito de interes. El lisado de celulas conteniendo el analito de interes puede ser transferido desde la superficie del filtro a un portaobjetos de vidrio o al pocillo de una placa de microtitulacion. En ese momento, el analito de interes (ej., una protema) puede ser identificado por la formacion de un entramado tras la adicion de perlas de poliestireno de tamano ~300 a ~1000 (tfpicamente de 15 a 20 pm de diametro) recubiertas de protema G, protema A o protemas A/G y anticuerpos espedficos. La aglomeracion de las perlas puede ser visualizada directamente o con la ayuda de un aumento de 50 a 100 veces. De nuevo, la inmovilizacion de los anticuerpos en las perlas puede obviar efectos prozona; no obstante, pueden ser necesarias diluciones en serie de la protema mezclada con un numero constante de complejos perla-anticuerpo, para observar la aglomeracion de las perlas debido al posible exceso de antfgeno. Los complejos perla- protema G- anticuerpo agregados (agrupados) con una cantidad conocida del analito de interes, pueden servir de control positivo, y complejos no agregados de perla-protema G-anticuerpo en tampon sin ningun analito de interes (ej., un lisado de un control negativo conocido) pueden servir de control negativo.
Kits para la amplificacion de senal
En realizaciones alternativas, la presente invencion puede comprender kits para llevar a cabo los metodos de la invencion. En una realizacion, la invencion puede comprender un kit para ensayar un analito de interes, incluyendo un soporte de deteccion, comprendiendo el soporte de deteccion un soporte solido que incluye diversas moleculas de agente de union que pueden reconocer y unirse al analito de interes. En una realizacion, el kit puede comprender un soporte de captura, que incluye por lo menos un agente de union de soporte de captura que reconoce y se une al analito de interes. En algunas realizaciones, el kit puede comprender ademas un agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion. En una realizacion, el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion es un agente de union soluble
Los soportes de deteccion y/o captura pueden comprender diversos formatos. En una realizacion, el soporte solido de captura puede ser un pocillo de ensayo (es decir, como una placa de microtitulacion). O el soporte de captura solido puede ser un lugar en una matriz, o un soporte movil, como un perla. En una realizacion, el soporte de deteccion es un soporte movil, como una perla.
En los kits de la invencion pueden utilizarse diversos agentes de union. Por ejemplo, las diversas moleculas de agente de union ligadas al soporte de deteccion pueden ser moleculas de un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo que reconoce el analito de interes. Adicional y/o alternativamente, el agente de union unido al soporte de captura puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconoce el analito de interes. Adicional y/o alternativamente, el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una realizacion, el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion no reconoce el agente de union de captura utilizado para ligar el analito de interes al soporte de captura solido. O el agente de union en cualquiera de los soportes de captura o deteccion, o el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion puede comprender una protema que se une a una diana no proteica (es decir, una protema que se une espedficamente a un analito de interes de molecula pequena, o un receptor que se une a una protema).
El soporte de deteccion puede comprender diversas moleculas de una fraccion detectable. Adicional y/o alternativamente, el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion puede comprender una fraccion detectable.
El uso de un soporte de deteccion que comprenda diversos agentes de union que reconozcan el analito de interes proporciona la amplificacion de la senal. En realizaciones alternativas, el soporte de deteccion puede comprender diversos agentes de union de deteccion. Por ejemplo, en realizaciones alternativas, el numero de agentes de union en el soporte de deteccion puede ser superior a 100, o superior a 500, o superior a 1000, o superior a 5000, o superior a 10 000, o superior a 20 000, o superior a 50 000, o superior a 100 000, o superior a 500 000, o superior a 1 000 000 de moleculas del agente de union de deteccion. Por ejemplo, en una realizacion, el soporte de deteccion puede comprender una perla recubierta con decenas o centenares de miles de moleculas de anticuerpo. En realizaciones alternativas, puede haber aproximadamente de 10 000 a 10 000 000, o aproximadamente de 50 000 a 500 000, o de aproximadamente 100 000 a 1 000 000 de moleculas de agente de union (ej., un anticuerpo primario) para una perla de soporte de deteccion que tiene un diametro de aproximadamente 15 pm. Para perlas de soporte de deteccion de tamanos distintos, puede utilizarse una cobertura de superficie correspondiente. O se pueden obtener rangos dentro de esos rangos.
Asf, en realizaciones alternativas, el metodo de la invencion proporciona una amplificacion de 1000, o mas de 10 000, o mas de 100 000, o mas de 500 000, o mas de 1 000 000 de veces la senal captada en un
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inmunoensayo estandar no amplificado, que no comprenda un soporte de deteccion incluyendo diversos agentes de union de deteccion. Por ejemplo, en realizaciones alternativas, los kits de la invencion proporcionan una amplificacion que oscila de 1000 a 1 000 000 000, o de 1000 a 100 000 000, o de 5000 a 10 000 000, o de 10 000 a 1 000 000, o de 10 000 a 500 000, o de 50 000 a 500 000 veces la senal que se capta en un inmunoensayo estandar no amplificado que no comprenda un soporte de deteccion que incluya diversos agentes de union de deteccion. O se pueden obtener rangos dentro de esos rangos.
Asf, en determinadas realizaciones, el kit puede comprender reactivos para un inmunoensayo basado en perlas. Asf, en una realizacion, el soporte de deteccion puede comprender una perla recubierta con moleculas de un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) que reconoce una protema de interes. En determinadas realizaciones, la perla puede ser una perla de poliestireno recubierta de protema G, protema A, o protemas A/G, que estan disponibles comercialmente (ej., Life Technologies/Invitrogen, Carlsbad CA) en una amplia variedad de tamanos. Otras perlas que pueden ser utiles incluyen perlas de sflice magnetica recubiertas de esas mismas protemas (perlas MagSi de AmsBio, Lake Forest, CA). En realizaciones alternativas, puede haber aproximadamente de 10 000 a 10 000 000 o de aproximadamente 50 000 a 1 000 000, o de aproximadamente 100 000 a 500 000 moleculas de agente de union (ej., un anticuerpo primario) para una perla de soporte de deteccion que tiene un diametro de aproximadamente 15 pm. Para perlas de soporte de deteccion de distintos tamanos, puede utilizarse una cobertura de superficie correspondiente. En determinadas realizaciones, las perlas de soporte de deteccion son lo suficientemente grandes como para que diversas moleculas del agente de union puedan ligarse a la perla. Por ejemplo, las perlas pueden tener un tamano que oscile de aproximadamente 0,1 a 50, o 0,2 a 40, o 0,5 a 30, o 1 a 20, o 1 a 15 o de aproximadamente 1 a 3 pm. Cuando el agente de union que debe ligarse a la perla es un anticuerpo, se pueden utilizar perlas disponibles comercialmente recubiertas previamente con protema G, protema A, o protemas A/G, ya que esas protemas se ligan al dominio Fc de los anticuerpos, orientando a los anticuerpos de forma que los dominios Fab estan libres para ligarse a epftopos de antfgenos.
Los kits para un inmunoensayo basado en perlas pueden comprender tambien anticuerpos para la protema de interes, donde tales anticuerpos son de una segunda especie. Esos anticuerpos resultan especialmente utiles en ensayos indirectos como se describe aqm, ya que permitiran la union espedfica de complejos de moleculas anti-anticuerpo secundario-reporter. Ademas, esos complejos anticuerpo secundario-reporter no se uniran a los anticuerpos primarios de la primera especie que fijan la protema diana a la superficie solida o a las perlas de las protemas A/G, obviando falsas reacciones positivas. Adicionalmente, los complejos anticuerpo secundario-reporter no se ligaran a la superficie de las perlas de protemas A/G, evitando asf falsas reacciones positivas.
Los kits pueden comprender tambien anticuerpos secundarios solubles que pueden ser marcados con un marcador detectable, o un agente de union que puede formar complejo con un marcador detectable. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un kit de la invencion puede comprender un anticuerpo secundario que va ligado a un fluoroforo. En una realizacion, el fluoroforo puede comprender un QDOT®. Por ejemplo, en una realizacion, conjugados anti-anticuerpo-QDOT® reconocen los diversos anticuerpos primarios unidos a la perla.
Los sustratos a utilizar en los kits de la presente invencion incluyen, entre otros, perlas de poliestireno, (Spherotech, Libertyville, 111.), perlas magneticas (Invitrogen; AmsBio), recubrimientos de latex, un filtro de membrana, un filtro de fibra o un sustrato solido poroso. Se pueden encontrar metodos para el uso de las perlas magneticas, por ejemplo, en el prospecto de Dynabeads Protein G Prod. N° 10003D, en Kala et al., Analytical Biochemistry 254:263-266 (1997) y en Dutton, Genetic Engineering News, Volumen 22, Numero 13, julio de 2002.
Hay un amplio espectro de partroulas, en especial perlas magneticas y de poliestireno, disponibles en el comercio, en una amplia gama de tamanos. Para determinadas realizaciones, un juego preferido de partroulas tiene un tamano medio de partroulas (es decir, la dimension mayor de las partroulas) de aproximadamente un micrometro (es decir, micron). Para determinadas realizaciones, un juego preferido de partroulas tiene un tamano de partroulas medio (es decir, la dimension mayor de las partroulas) no inferior a 10 micrometros (es decir, micrones). Son ejemplos de perlas disponibles en el comercio, perlas de poliestireno recubiertas de protema G, protema A y protemas A/G, y perlas de poliestireno recubiertas de estreptavidina, que pueden obtenerse de Invitrogen, Carlsbad, CA, o de Spherotech, Libertyville, 111. Otros proveedores de perlas de poliestireno y magneticas son Thermo Scientific Pierce, Millipore, Polyscience y New England Biolabs. AmsBio, Lake Forest, IL es un proveedor de perlas magneticas de sflice, que estan disponibles con todos los recubrimientos de protema senalados mas arriba. Invitrogen suministra tambien perlas magneticas con superficie epoxi, que ligan a los anticuerpos de forma covalente. Las perlas pueden ser de poliestireno, sflice, vidrio u otros materiales, planas o derivatizadas para su union a grupos qmmicos espedficos.
EJEMPLOS
Realizaciones de la presente invencion pueden ilustrarse tambien con los siguientes ejemplos, entre otros. Todo ejemplo que quede fuera del ambito de la reivindicacion se da solo a efectos comparativos.
Ejemplo 1: Deteccion de protemas con amplificacion de senal basada en perlas
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Una protema o subunidad proteica de interes puede ser capturada por anticuerpos espedficos de la protema de interes (ej., anticuerpos primarios de conejo biotinilados) inmovilizados sobre una superficie pasivada, como Neutravidina, para minimizar falsos positivos (ej., ver Jain et al., Nature, 2011, 473:484488). A continuacion, en un ensayo sandwich, perlas de poliestireno de 1 pm o 2,8 pm recubiertas con protema A/G y otro tipo de anticuerpos espedficos para la protema (tfpicamente >104 y >105 para perlas de 1 pm y 2,8 pm, respectivamente) producidos en una segunda especie (ej., cobayas) se anaden para que se liguen a las subunidades proteicas diana inmovilizadas. Despues, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo secundarios (ej., anticuerpos anti-cobaya) conjugados (ej., unidos covalentemente) a un enzima, etiqueta radiactiva, o material fluorescente como QDOTS® se anaden para que se enlacen con los diversos anticuerpos primarios unidos a la perla espedficos del analito de interes. Las moleculas de protema o anticuerpos no ligados se eliminan mediante lavados (2 veces) entre adiciones sucesivas.
Pueden utilizarse ELISA, RIA o ensayos de inmunofluorescencia para detectar y cuantificar la protema o subunidad proteica de interes. Para ensayos de fluorescencia, las manchas se excitan con luz UV, y se visualizan con un filtro de emision apropiado en un sistema de imagenes hiperespectrales con una camara.
Ejemplo 2: Captura de protemas ribosomales utilizando varios formatos de amplificacion de perlas
Se llevaron a cabo experimentos para comparar los diversos formatos de ensayo representados en la Figura 2, panel B (es decir, Metodo 2). Esencialmente, se prepararon lisados de E.coli (500 000 celulas) lisando celulas bacterianas, y disociando los ribosomas contenidos a constituyentes proteicos en 6 M (10 000 celulas/pl) de guanidina tiocianato. La concentracion de guanidina tiocianato se redujo entonces a 0,12 o 0,6 M por dilucion en tampon fosfato (ej., dilucion de 90 000 celulas en 450 pl). Las protemas ribosomales fueron capturadas entonces utilizando uno de los metodos de deteccion de captura que se muestran en la Figura 2 (Tabla 1). Se muestran los resultados de las de entrada iniciales y de las protemas ribosomales estimadas de las celulas; 100 celulas de E. coli tienen aproximadamente 2,7 pg de protema ribosomal.
Metodo
N° de celulas E. coli Protema ribosomal calculada Senal sobre control celular 0
Metodo 2
2000 54 pg 6,17
10 000 270 pg 3,16
Metodo 5 (1)*
4000 108 pg 9,3
Metodo 5 (2)
500 14 pg 1,8
2000 54 pg 2,2
Experimentos 1 y 2.
Se realizaron experimentos adicionales utilizando el metodo presentado en el panel 2E. Este metodo utiliza la adicion de perla-Ab2 (perlas carboxi y anticuerpos anti-ribosomales de conejo) en el lisado. Esto permite a las protemas ribosomales unirse a la perla, de forma similar a un ELISA sandwich normal, donde los anticuerpos de “captura” son inmovilizados sobre una superficie. La Abl-biotina (cobaya) fue anadida entonces directamente a la mezcla, sin pasos de lavado. Los complejos perla-Ab2-protema-Abl se capturan utilizando perlas de estreptavidina (SA) y se detectan utilizando anticuerpos secundarios de Ab2. Se observo que este enfoque funcionaba cuando se utilizaban perlas carboxi-Ab de conejo (Ab2- perla) y biotina, anticuerpos de cobaya (Abl).
Asf, en este experimento, se incubaron lisados de 2500/5000/10 000/20 000 celulas con aproximadamente 1,3 x 108 perlas carboxi (0,1 pm) con anticuerpo anti-ribosomal de conejo (anti-riboAb). A continuacion, se anadieron anticuerpos anti-ribosomales de cobaya biotinilados 10 ng (4 x 1010 moleculas IgG) y se siguieron incubando. Los complejos perla-Ab-ribo protema-Ab fueron capturados con aproximadamente 4 x 107 CI SA Dynabeads. Se procedio a la deteccion con 10 ng de anti-anticuerpo de conejo marcado con peroxidasa de rabano (HRP). Una quinta parte de la muestra se coloco en una microplaca de deteccion con sustrato Sirius HRP en un luminometro. Puede verse que la senal que se capto fue de tan solo 500 celulas, correspondiendo a aproximadamente 14 pg de protema ribosomal.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para la amplificacion de senal comprendiendo:
    adicion al analito de interes de un soporte de deteccion comprendiendo un soporte solido que incluye diversas moleculas de un agente de union que reconoce y se une al analito de interes; y
    detectar por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union sobre el soporte de deteccion, anadiendo un agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente al menos a algunas de las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde el soporte de deteccion es una perla; o donde el soporte de deteccion comprende varias moleculas de una fraccion detectable.
  3. 3. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, comprendiendo ademas anadir un soporte de captura, comprendiendo dicho soporte de captura por lo menos un agente de union de soporte de captura que reconoce y se une al analito de interes para inmovilizar el analito de interes en el soporte de captura; de preferencia
    donde el analito de interes se liga al soporte de captura antes de interactuar con el soporte de deteccion; o
    donde el analito de interes se une al soporte de captura tras interactuar con el soporte de deteccion.
  4. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
    donde el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion comprende una fraccion detectable,
    donde el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las moleculas del agente de union en el soporte de deteccion es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo,
    donde el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion no reconoce el agente de union de captura utilizado para ligar el analito de interes al soporte de captura solido, o
    donde el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion comprende un agente de union soluble.
  5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, donde el soporte de captura es una perla.
  6. 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, donde el agente de union ligado al soporte de captura es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que puede reconocer y unirse al analito de interes.
  7. 7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde las diversas moleculas del agente de union ligado al soporte de deteccion son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que reconocen y se unen al analito de interes.
  8. 8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el soporte de deteccion comprende mas de 10 000 moleculas del agente de union espedfico del analito de interes, o donde el soporte de deteccion comprende mas de 100 000 moleculas del agente de union espedfico del analito de interes.
  9. 9. Un kit para ensayar un analito de interes comprendiendo: un soporte de deteccion, cuyo soporte de deteccion comprende un soporte solido, incluyendo diversas moleculas de un agente de union que puede reconocer y unirse al analito de interes, y un agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente al menos a algunas de las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion.
  10. 10. El kit de la reivindicacion 9, comprendiendo ademas un soporte de captura, comprendiendo dicho soporte de captura por lo menos un agente de union de captura que reconoce y se une al analito de interes.
  11. 11. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, donde el soporte de deteccion es una perla; o donde el soporte de deteccion comprende diversas moleculas de una fraccion detectable.
  12. 12. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde las diversas moleculas del agente de union ligado al soporte de deteccion son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que pueden reconocer y unirse al analito de interes.
  13. 13. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10,
    donde el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion comprende un agente de union soluble,
    5 donde el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de
    las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que puede reconocer y unirse al analito de interes, o
    donde el agente de union que puede reconocer y unirse espedficamente a por lo menos algunas de las diversas moleculas del agente de union en el soporte de deteccion comprende una fraccion 10 detectable.
  14. 14. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde el soporte de captura es una perla, o donde el agente de union de soporte de captura es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que puede reconocer y unirse al analito de interes.
  15. 15. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde el soporte de deteccion comprende mas de
    15 1000 moleculas del agente de union espedfico para el analito de interes;
    donde el soporte de deteccion comprende mas de 10 000 moleculas del agente de union espedfico del analito de interes; o donde el soporte de deteccion comprende mas de 100 000 moleculas del agente de union espedfico del analito de interes.
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ES13752350.2T 2012-02-21 2013-02-21 Métodos y sistemas para la amplificación de señal de bioensayos Active ES2636483T3 (es)

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