ES2523316T3 - Bacteriófagos como agentes selectivos - Google Patents

Abstract

Un método para detectar un microorganismo diana en una muestra que contiene bacterias no elegidas como diana que comprende: formar una mezcla de reacción combinando la muestra con un medio nutritivo y una composición de bacteriófagos que comprende bacteriófagos específicos para las bacterias no elegidas como diana en la muestra, en donde las bacterias no elegidas como diana compiten con el microorganismo diana por los nutrientes en los medios, y en donde el bacteriófago lisa las bacterias no elegidas como diana en la muestra sin lisar el microorganismo diana, reduciendo de este modo la aparición de un resultado de la detección de falso negativo mediante la inhibición de la proliferación de bacterias no elegidas como diana a la vez que permitiendo al microorganismo diana proliferar en el medio, y detectar el microorganismo diana.

Description

DESCRIPCiÓN

Bacteriófagos como agentes selectivos

Campo de la invención

La presente memoria se refiere al campo de la microbiologia y más particularmente se refiere al uso de bacteriófagos en ensayos y procesos microbiológicos

Antecedentes de la invención

La contaminación bacteriana es la prinCipal causa de infecciones transmitidas por los alimentos y el agua en el mundo que provoca gastroenteritis, diarrea, calambres, vómitos y a menudo fiebre. En los paises subdesarrollados, estas infecciones matan aproximadamente 1,8 millones de personas al año, la mayoría de los cuales son niños. Los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) estima que 76 millones de estadounidenses se enferman, más de

300.000 son hospitalizados y 5.000 personas mueren a causa de enfermedades transmitidas por alimentos solo cada año. Después de comer alimentos contaminados, los seres humanos desarrollan diferentes grados de la enfermedad que van desde molestias gastrointestinales breves y leves, tal como la denominada "intoxicación por alimentos", a la enfermedad potencialmente normal. Las infecciones transmitidas por los alimentos más comúnmente reconocidas son las causadas por bacterias tales como, Salmonella, Listaría, Campylobacter, Staphylococcus aureus y E. coli 0157:H7. Por ejemplo, Salmonella se encuentra en el ambiente, particularmente en el intestino de aves, reptiles, animales de granja y seres humanos. La enfermedad en los seres humanos a menudo resulta de la ingestión de carnes, leche o huevos mal cocinados o de la contaminación cruzada de otros alimentos que se comen sin cocinar

Las enfermedades nocivas tales como el cólera y la siguelosis pueden ser transmitidas por agua contaminada y son causadas por bacterias que a menudo se pueden rastrear hasta las fuentes a lo largo de ríos y lagos. Gran parte de la contaminación se puede rastrear hasta los sistemas de alcantarillado sanitario que fugan y desbordan, plantas de tratamiento de aguas residuales, lixiviados de tanques sépticos y materia fecal asociada a escorrentía pluvial de las áreas con altas densidades de fauna silvestre, animales domésticos o ganado. Los principales patógenos bacterianos que se ha demostrado que provocan enfermedades intestinales humanas asociadas al agua potable son :Salmonella typhi (fiebre tifoidea), Salmonella paratyphi • A (fiebre paratifoidea); otras especies de Salmonella (salmonelosis, fiebre entérica); Shigella dystenteriae, S. ffexneri y S. sannei (disenteria bacilar); Vibria cha/erae (cólera); Leptaspira spp., (Ieptospirosis); Yersinia enterocolitíca (gastroenteristis); Francisella tularensís , (tularemia); Escherichía coli (gastroenteritis) y Pseudomonas aeruginosa (diversas infecciones). Debido a la gravedad de las enfermedades provocadas por las bacterias transmitidas por el agua y la importancia del agua como recurso natural, se controlan con frecuencia los niveles de bacterias "indicadoras" denominadas bacterias coliformes. Estas bacterias indicadoras generalmente son inofensivas, pero hay algunas excepciones. Determinadas cepas de E. coli se han asociado a infecciones gastrointestinales en adultos, conocidas como diarrea del viajero, infecciones de las vias urinarias y meningitis neonatal. Determinadas cepas de Klebseilla neumonía se han asociado a infecciones gastrointestinales, neumonia, infecciones urinarias intrahospitalarias, infecciones de heridas por quemadura, y como invasores secundarios en otras infecciones respiratorias. Enterobacter se ha asociado con infecciones intrahospitalarias del tracto urinario. Cnrobacter se ha asociado a infecciones urinarias, infecciones de de heridas superficiales, osteomielitis, meningitis neonatal y gastroenteritis.

De manera similar, la contaminación bacteriana en procedimientos de diagnóstico médicos o biológicos presenta un obstáculo problemático y costoso de dichos diagnósticos. La contaminación bacteriana en una muestra biológica tal como sangre, saliva o cultivo tisular puede afectar en gran medida un resultado satisfactorio de muchos ensayos biológicos. Los enfoques frecuentes comprenden el tratamiento de muestras biológicas con dosis muy altas de antibióticos a menudo sin resultados satisfactorios

La fermentación bacteriana industrial es otra area comercial afectada por la contaminación bacteriana. La producción industrial de etanol en los Estados Unidos en 2005 se estima en 4,4 mil millones de galones (16,7 mil millones de litros), hasta el doble del año anterior. El etanol se produce utilizando principalmente la fermentación con levadura (Saccharomyces), siendo el maiz la materia prima predominante. Otros organismos utilizados en menor medida para la producción de etanol comprenden las bacterias Zymomonas mobilis. Otras materias primas comprenden residuos de caña de azúcar, paja de arroz, cebada y trigo, residuos de patata, residuos de madera, residuos urbanos y residuos de la industria de bebidas. Con dichos materiales sirviendo como materia prima, no es sorprendente que la mayoria de las fermentaciones tengan lugar en presencia de contaminación bacteriana significativa. Lactooocillus son los principales contaminantes en la producción de etanol y su presencia y la producción de acido lactico resultante reduce la proliferación de la levadura y el rendimiento en etanol

Del mismo modo, los aminoacidos producidos por la fermentación son predominantemente lisina y ácido glutamico (1 millón de toneladas métricas en conjunto), con cantidades menores de treonina y triptófano. Esto representa un mercado de 3,5 mil millones de dólares en todo el mundo. El organismo principal que se utiliza para la producción es Corynebacterium glutamicum Las matelias primas para este proceso comprenden residuos de maiz en combinación con los productos de desecho con alto contenido en nitrógeno. Los Bacillus spp. aportan una cantidad considerable de

los contaminantes que pueden producirse, y al ser de crecimiento rapido, compiten con el Corynebacterium por los nutrientes. Otros productos de fermentación bacteriana comprenden metabolitos, vitaminas, antibióticos y enzimas producidos todos dentro de cultivos de microorganismos que son sensibles a la contaminación bacteriana

Los métodos convencionales para la detección de contaminación bacteriana emplean cultivo bacteriano no selectivo o selectivo, o enriquecimiento, seguido de cultivo en placa de los cultivos en medios selectivos para la verificación de las colonias sospechosas. Este enfoque consume mucho tiempo y puede durar varios días antes de que se obtengan resultados. Los métodos alternativos, utilizando inmunoanalisis o tecnologias de detección basadas en ácidos nucleicos, son mas rápidos. Sin embargo, estos métodos aún requieren una etapa de enriquecimiento para la producción de una señal detectable. El tiempo necesario para el enriquecimiento suficiente viene dictado por la tasa de crecimiento de las bacterias diana en la muestra.

La mayoría de los métodos de detección y recuento de bacterias de alta sensibílidad requieren una incubación durante la noche. Ademas, estos métodos a menudo adolecen de una falta de sensibilidad o especificidad o requieren un equipo costoso o considerable ex.periencia técnica para llevar a cabo. Un problema particular con estos métodos es que, durante la etapa de enriquecimiento, casi todas las bacterias en el cultivo gozan de crecimiento mejorado. La presencia de un gran número de bacterias no elegidas como diana en el cultivo de enriquecimiento produce interferencias con la detección de las bacterias diana, dando como resultado falta de sensibilidad, reactividad cruzada, los resultados positivos falsos y negativos falsos. Los científicos han intentado reducir este problema mediante la adición de antibióticos a los cultivos de enriquecimiento. Sin embargo, la presencia de antibióticos en los medios de enriquecimiento disminuye la tasa de crecimiento de las bacterias diana, alarga la cantidad de tiempo necesario para realizar el ensayo y no puede eliminar la reactividad cruzada.

Los ensayos de detección bacterianas más recientemente desarrollados combinan un cultivo bacteriano enriquecido con un bacteriófago lítico, un virus que infecla específicamente las bacterias diana. Los fagos liticos están entre los organismos más simples y mas abundantes en la tierra. Los fagos infectan bacterias anfitrionas respectivas e inyectan ADN del fago. Dentro de bacterias infectadas, el ADN del fago se replica y a continuaciÓn se incorpora en nuevas partículas víricas construidas por el anfitrión bacteriano. Las nuevas partículas de fago se liberan a continuación de sus células bacterianas anfitrionas por un proceso conocido como "lisis", que destruye la célula bacteriana infectada. La lisis permite la infección por fagos posterior de las bacterias adyacentes en un modelo exponencial rápido. A diferencia de los fagos líticos, los fagos moderados refuerzan su virulencia, resiliencia y la capacidad en general del anfitrión bacteriano para proliferar. En los ensayos de detecciÓn de bacterias recién desarrollados, los bacteriófagos líticos se marcan de alguna manera y se detecta la presencia del marcador cuando el fago infecta bacterias diana presentes en la muestra. Al igual que con los ensayos que emplean inmunoanálisis o sistemas de detección a base de acidos nucleicos, los ensayos que utilizan bacteriófagos como medios para la detección de bacterias diana también adolecen de la incapacidad de obtener resultados rápidos, muy sensibles causados por el tiempo requerido para cultivar y enriquecer las bacterias diana y la expanSión simultanea de bacterias no elegidas como diana en la muestra que interfiere o reacciona de foona cruzada con detección de las bacterias d iana

Por lo tanto, lo que se necesita es un método de detección bacteriana que sea muy sensible a concentraciones mínimas de unas bacterias diana en una muestra, como un contaminante tóxico bacteriano en los alimentos, el agua, el medio ambiente, medicinas, agricola, veterinario, farmacéutico o preparados de fermentación industrial sin embargo proporciona detección rapida sin crear la oportunidad para resultados de falsos positivos y negativos indeseables, y procedimientos de producción bacteriana que enriquecen el microorganismo diana y mejoran el rendimiento de la producción. El documento WO 9722713 describe la detección de M. tuberculosis entre otras bacterias utilizando fagos Menshikov et al. describen el empleo de fagos para detectar bacterias (Menshikov et al., kliniceskaa Laboratomaa Diagnostika, 1996, páginas 50-52).

Compendio de la invención

La invención solamente está limitada por sus reivindicaciones.

La presente invención aborda los problemas descritos anteriormente proporcionando métodos rapidos y muy sensibles y composiciones para la detección de uno o más microorganismos en una muestra. También se proporcionan procedimientos y composiciones para enriquecer la proliferación o la reproducción de uno o más microorganismos de interés a la vez que reducen o evitan la proliferación o la reproducción de las bacterias indeseables. Los microorganismos preferidos son las bacterias y las levaduras. Los microorganismos de interés preferidos son las bacterias.

Las composiciones proporcionadas en la presente memoria contienen uno o más bacleriófagos líticos como agentes selectivos para reducir, eliminar o controlar la proliferación de bacterias no deseadas o indeseables sin inhibición de la proliferación o reproducción del microorganismo de interés. En una realización, la composición contiene un bacteriófago lítico adaptado para el almacenamiento antes de su uso en un medio de enriquecimiento, diagnóstico o selectivo. En otra realización, la composición contiene un grupo o conjunto de bacteriófagos líticos específicos para las bacterias no deseadas o indeseables. En otra realización, la composición comprende uno o más bacteriófagos líticos en medios de

enriquecimiento para la propagación, la proliferación o cultivo de uno o más microorganismos selectos de interés. En otra realización, la composición comprende bacteriófagos líticos en los medios microbianos de cultivo en placa para el cultivo en placa, siembra en rayas, identificación, caracterización, recuento o aislamiento de una o más colonias de microorganismos especificos. Las composiciones pueden envasarse en kits con nutrientes, reactivos, antibióticos inclusive, o combinaciones de los mismos para el enriquecimiento, cultivo en placa, aislamiento, selección, identificación, recuento o detección del microorganismo de interés. Las composiciones son útiles en la producción de alcohol, aminoácidos (tales como, por ejemplo, lisina) u otra sustancia química, molécula, sustancia o producto en el cultivo bacteriológico, de levaduras u otro cultivo microbiológico de residuos agrícolas, industriales o de otras materias primas naturales o no estériles. Las composiciones y métodos descritos en la presente memoria también son útiles para detectar enfennedades en plantas y animales

Los procedimientos proporcionados en la presente memoria pueden emplear una o más de las composiciones de los bacteriófagos líticos descritos en la presente memoria durante la preparación, el enriquecimiento o el cultivo en placas del microorganismo diana de interés para reducir o inhibir la proliferación de bacterias no deseadas. Por ejemplo, las composiciones se pueden utilizar en un sistema de fermentación industrial para reducir la proliferación de bacterias competidoras y aumentar la eficiencia y/o el rendimiento durante la fermentación industrial u otra producción comercial de grandes cantidades de unos microorganismos deseables, tales como la levadura en una cervecería o panadería o bacterias recombinantes en una instalación de producción de proteínas recombinantes.

En una realización de los métodos de detección proporcionados en la presente memoria, uno o más bacteriófagos se utilizan durante la etapa de enriquecimiento de un ensayo para la detección de un microorganismo diana para reducir o inhibir la proliferación de bacterias contaminantes y permitir que se detecte la proliferación inalterada del microorganismo diana.

Los antibióticos que no alteran la proliferación o el enriquecimiento del microorganismo diana o deseable están comprendidos opcionalmente en las composiciones y procedimientos proporcionados en la presente memoria. Una combinación de antibióticos y bacteriófago en la composición permite la inhibiciÓn de dos tipos diferentes de bacterias no elegidas como diana. Por ejemplo, bacterias gram negativas y gram positivas. La velocidad y eficiencia de cualquier enriquecimiento depende en parte de la concentración y la composición de las bacterias competidoras presentes en la muestra. La eliminación o reducción de las bacterias contaminantes reduce la competencia por los nutrientes, y la concentración de sustancias que inhiben o que interfieren en el cultivo, aumentando de este modo la eficiencia de la etapa de enriquecimiento del proceso global. El tratamiento con fagos de la muestra en el método de detección aumenta la relación de diana a bacterias competidoras en la muestra, que requieren de este modo menos tiempo para el enriquecimiento para obtener una señal significativa y la mejora de la relación señal global a ruido en el ensayo

En una realización preferida, la composición de bacteriófagos contiene una o más bacteriófagos y uno o más anticuerpos. Cada uno puede seleccionarse para tener un tipo diferente de especificidad para las bacterias no elegidas como diana. Cuando se combina con una muestra, la especificidad conferida por la acción de un anticuerpo específico coordinado con el bacteriófago en el método de detección da como resultado especificidad y sensibilidad superiores

En otra realización de los métodos de detección proporcionados en la presente memoria, se utilizan uno o más bacteriófagos durante el cultivo microbiano en placa para reducir la proliferación de bacterias no deseadas en los medios de cultivo en placa y aumentar la capacidad para detectar, identificar, enumerar o caracterizar el microorganismo diana

Todavia en una realización adicional más, los presentes métodos proporcionan una fonna de reducir o eliminar la reactividad cruzada en el análisis y resultados de falsos positivos.

Las composiciones de bacteriófagos proporcionadas en la presente memoria se estabilizan preferentemente en una forma anhidra como un componente de una formulación del medio en polvo. En otra composición preferida, los bacteriófagos se estabilizan en una forma anhidra y se añaden a los medios de enriquecimiento o a los medios de cultivo durante la redisolución de los medios antes de la introducción de los microorganismos que van a cultivarse o sembrase en placas o antes de la introducción de la muestra a analizar la presencia del microorganismo diana o, altemativamente, añadir directamente a la muestra. Altemativamente, el bacteriófago está en fonna anhidra o liquida y se añade en cualquier momento antes o durante el proceso de enriquecimiento o de cultivo en placa, preferiblemente antes de la adición de microorganismo en la muestra

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un método muy sensible para la detección de un microorganismo o clase de microorganismos diana en una muestra

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método muy específico para la detección de un microorganismo

o clase de microorganismos diana en una muestra.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un ensayo de detección de microorganismos en donde se impide que las bacterias que interfieren no elegidas como diana crezcan, se reduzcan o eliminen

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método rápido para la detección de un microorganismo diana en una muestra, particularmente una bacteria diana tales como un alimento, agua, contaminante del medio ambiente, industrial o farmacológico.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un procedimiento rápido para la proliferación o la reproducción selectiva de un microorganismo deseado en un medio de enriquecimiento, proceso o cultivo.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar composiciones para su utilización durante el enriquecimiento de un microorganismo diana, en donde las composiciones contienen uno o mas agentes selectivos que inhiben, reducen o eliminan las bacterias no elegidas como diana sin reducir significativamente el enriquecimiento del microorganismo diana.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un medio de enriquecim iento microbiano para la proliferación de un microorganismo diana y reducir al minimo o evitar la proliferación de bacterias no elegidas como diana.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para evitar o reducir la proliferación bacteriana indeseable en las reacciones de fermentación industrial

Otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos mejorados de detección de microorganismos con la reducción de respuestas de falsos positivos debido a la inhibición o reducción de la presencia de bacterias reactivas de forma cruzada o no específicamente reactivas en la muestra.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos mejorados de detección de microorganismos con la reducción de las respuestas de falsos negativos debido a la inhibición o reducción de la presencia de bacterias que compiten o interfieren y al aumento de productividad del microorganismo diana.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento y composición para reducir la competencia microbiana en un medio de cultivo, aumentando de este modo la eficiencia y la velocidad de un proceso de enriquecimiento de un método analítico

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un kit de detección de microorganismos que contiene reactivos de detección y un componente de medios de enriquecimiento o el grupo de componentes para la detección rápida, sensible y específica de un microorganismo en una muestra

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición de bacteriófagos que mejora el rendimiento del producto en un proceso industrial de producción microbiológica.

Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención se pondran de manifiesto después de una revisión de la siguiente descripción detallada de las realizaciones y reivindicaciones dadas a conocer.

Descrípcíón detallada de la invención

Los métodos y composiciones para la detección y producción de uno o mas microorganismos en una muestra o proceso se describen en la presente memoria. También se describen procedimientos y composiciones para el enriquecimiento del cultivo o la reproducción de uno o más microorganismos de interés, mientras se reduce o evita el cultivo o la reproducción de bacterias indeseables.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden contener uno o más bacteriófagos líticos como agentes selectivos para reducir, eliminar o controlar la proliferación de bacterias no deseadas o no deseables en una muestra sin inhibición de la proliferación o la reproducción de un microorganismo de interés, y los procedimientos descritos en el presente documento utilizar las composiciones para enriquecer el microorganismo diana o deseable durante el cultivo de microorganismos. Estas composiciones preferiblemente aumentan la sensibilidad y la especificidad de la detección y disminuyen las cantidades de resultados de falsos positivos o falsos negativos.

Los bacteriófagos o fagos, son virus bacterianos que se unen a un organismo anfitrión que lleva un receptor de unión especifica. Los bacteriófagos se emplean en las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria debido a que presentan un alto grado de especificidad al unirse y lisar bacterias anfitrionas. Hay varias ventajas de utilizar fagos sobre los antibióticos. Los fagos sólo se multiplican en presencia de bacterias anfitrionas, y en presencia de un anfitrión apropiado aumentan en concentración proporcionando aún mayor disuasión para la proliferación de microorganismos no deseados. Los fagos pueden ser mucho más específicos que los antibióticos, y pueden seleccionarse fagos específicos para dirigirse a cepas bacterianas especificas. Los fagos son activos a concentraciones bajas y son capaces de infectar bacterias que son resistentes a los antibióticos. En comparación con los antibióticos, se necesitan concentraciones menores de fagos durante un período más corto para lograr la misma cantidad de destrucción bacteriana. Por lo tanto, los bacteriófagos son capaces de eliminar bacterias contaminantes más rapida y eficazmente que los antibióticos convencionales. Además, los preparados de fagos son muy simples y económicas de preparar y son sumamente estables. Las composiciones de fagos tienen una larga vida útil y los costes de producción son bajos, lo que hace el empleo de fagos económicamente viable

Composiciones de bacteriófagos

Las composiciones de bacteriófagos proporcionadas en la presente memoria contienen una o más cepas de fagos adecuados para la infección y destrucción de las especies y cepas bacterianas indeseables o contaminantes. En una realización, la composición contiene un bacteriófago litico aislado especifico para una o mas bacterias no deseadas o no deseables que esta adaptado al almacenamiento antes de su uso en un enriquecimiento o medio de cultivo en placa. En otra realización, la composición contiene un grupo o conjunto de bacteriófagos liticos específicos para las bacterias no deseadas o no deseables. En otra realización, la composición comprende uno o más bacteriófagos líticos en medios de enriquecimiento para la propagación, proliferación o cultivo de uno o más microorganismos seleccionados de interés. En otra realización, la composición comprende bacteriófagos liticos en los medios de cultivo en placa microbiana sólidos o semisólidos para el cultivo en placas, siembra en rayas, aislamiento, selección, caracterización, recuento o identificación de una o más colonias de microorganismos especificos. En otra realización, la composición comprende bacteriófagos liticos para controlar las bacterias u otros microorganismos no deseados en cultivos de levaduras, hongos o células eucariotas superiores tales como células vegetales o animales

Bacleriófagos

Los bacteriófagos de las composiciones proporcionadas en la presente memoria comprenden cualquier bacteriófago lítico específico para una bacteria que no sean el microorganismo diana que debe detectarse o enriquecerse. Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "bacteriófago", "bacteriófago litico" y "fago" se pueden utilizar indistintamente y se refieren a virus especializados en bacterias que infectan tipos especificos de bacterias y se replican en el anfitrión bacteriano y finalmente destruyen la célula bacteriana mientras que liberan numerosa prole de fagos en el medio. Los fagos no liIicos o moderados son también útiles en la composición descrita en la presente memoria siempre que los fagos no liticos o moderados se hayan modificado para provocar la lisis o evitar la proliferación de las bacteria anfitrionas. Un procedimiento para la modificación de dichos fagos se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 200310180319.

Un bacteriófago es especifico para una célula bacteriana cuando infecta la célula bacteriana dada y no infecta a las células bacterianas de otras especies o cepas. La especificidad de un fago para su anfitrión se determina en dos niveles. El primer nivel de referencia implica la interacción de los componentes de fagos con elementos complementarios en la superficie celular bacteriana, lo que determina la capacidad de los fagos para unirse a la célula e inyectar su ADN. Hay pruebas sustanciales de que la reproducción de fagos, la ingeniería genética de los elementos fibrosos, y la hibridación, puede alterar la especificidad del fago a este nivel. El segundo nivel de referencia sobre la especificidad es durante los hechos que ocurren dentro de la célula bacteriana, después de la inyección del ADN del fago. Por lo tanto, el bacteriófago contenido en las composiciones descritas en la presente memoria comprende fago genéticamente modificado o recombinante que se ha alterado para aumentar la afinidad de unión, la infecciosidad, el tamaño de la serie, la multiplicidad de infección (m.o.i.) o la capacidad litica de las bacterias para ser eliminadas de una muestra o cultivo

Se han aislado actualmente fagos especificos para más de 100 géneros de bacterias (Ackermann, 1996 Arch

Vir%~~ 141(2):209-18), y se han encontrado practica mente en todas partes que se han buscado. Se ha identificado un gran número de fagos que infectan a diferentes cepas de E. coli. Más de 20.000 cepas de bacterias (siendo 7.000 de Sa/monella) se han evaluado para la identificación de fagos (He y Pan, 1992, J. G/in. Microbio/. 30(3):590-4). Una serie de fagos dirigidos específicamente a Citrobacter y E. coli pero no Sa/monella se han descrito también, lo que demuestra que puede montarse un grupo de fagos para dirigirse a un conjunto especifico de organismos.

Para la erradicación de una determinada bacteria, se selecciona un bacteriófago que puede infectar la célula bacteriana, replicándose dentro de la célula bacteriana y lisando la célula bacteriana. Una amplia variedad de bacteriófagos estan disponibles para cualquier célula bacteriana dada, por ejemplo, de la American Type Culture Collection (ATCC, P.O. Box 1549 Manassas, VA., EE.UU.) o por aislamiento de fuentes naturales que albergan las células anfitrionas. Una lista de los tipos de fagos esta publicada como Catalogue of Bacteria & Bacteriophages. (American Type Culture Collection, Rockvil1e, Md. 1989). Depositarios de microorganismos similares publican datos equivalentes. Estos datos son útiles para incluir la identificación de los reactivos de bacteriófagos en las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria

Ademas de presentar especificidad y actividad antimicrobianas, los fagos tienen capacidad para producir autoampliación sustancial en un corto periodo. En condiciones óptimas de infección y del medio de cultivo del anfitrión, una combinación de fagolbacleria dada da lugar a un número constante de la prole de fagos. Para la detección de una detenninada célula bacteriana, se utiliza un bacteriófago preferiblemente que le da un tamaño de la serie óptimo o máximo, que es el número de la prole producida por célula. Preferiblemente, el tamaño de la serie de una célula bacteriana lisada es de aproximadamente 10 a 10.000 partículas de fago de prole de una única célula infectada. A fin de aumentar la tasa de infección de una muestra se prefieren tamaños de las series altos para eliminar las bacterias contaminantes más rápidamente. El tiempo de la serie preferido del fago incluido en las composiciones y procedimientos

descritos en la presente memoria es de dos minutos a cuatro horas. Se prefieren tiempos de series breves para la destrucción más rápida de las bacterias contaminantes. Una sola célula bacteriana puede ser infectada por varias partículas de fago (multiplicidad de infección, m.o.i.), y la irrupción del fago depende de la multiplicidad. Para producir altos rendimientos, generalmente se utiliza una m.oj. de 10. Se prefieren m.oj. superiores porque dan lugar a lisis más eficaz a concentraciones más bajas de bacterias no deseadas.

Un ejemplo de un fago candidato para ser incluido en la composición descrita en el presente documento es phi29 de B. subtiJis, por que da una serie de 1.000 en un ciclo vital de 35 minutos. 5e prefieren fagos similares ricos con gran tamaño de la serie y ciclo de vida corto. Los diferentes tipos de bacteriófagos pueden obtenerse de proveedores comerciales o de depositarios biológicos tales como la American Type Culture Collection (ATCC) o la Oeutsche 5ammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH, (D5MZ), Braunschweig, Alemania, el German National Resource Centre for Biological Material. Dichos bacteriófagos comprenden, pero no se limitan a, fagos de Actinoplanes/Micromonospora (Ap3, AP4, Mm1, Mm3 Mm4, Mm5, phiUW 51); fagos de Amycolatopsis (W2, W4, W7, W11 ); fagos de Bacillus (GA-1, Phi 29, 5P~); fagos de Cellufomonas (02,03, 05,06, oa, 011, 013); fagos de Escherichia (lambda, M13, M13, mp18, M52, Mu, P1, PhiX174, Qn, R17, T1, T2, T3, T4, T5, T6, Tl, U3);fagos de Lactococcus (P001 , PODa); fago de Methanothermobacter (psi M2 (41M2» ; fagos de Nocardia/RhodococcuslGordonia (N4, N5, N13, N18, N24, N26, N36); fagos de Nocardioides (X1, X3, X5, X6, X10, X24); fagos de Nocardiopsis (03, 04); fagos de Promicromonospora (P1 , P2, P3, P4); fagos de Pseudomonas (Psp1 , Psp2, Psp3, Psp4, Psp5); fagos de Pseudonocardia (W3); fagos de Saccharomonospora (Tm1 , Tm2, Tm3);fagos de Saccharopolyspora (Mp1 , Mp2); fago de Saccharothrix (W1 ); fago de Sporichthya (5p1 ); fagos de Streptomyces (P23, P26, 51 , 52, 53, 54, 56 , S7, 5H10, phi A. streptomycini 111 , phi8238, phiC31); fagos de Terrabacter(Tb1 , Tb2); fago de Tsukamurella (Ts1 ).

Otros bacteriófagos con un alto nivel de especificidad se pueden desarrollar mediante el cribado de muestras utilizando los procedimientos descritos en la patente de Estados Unidos nO 6.322.783. Los fagos específicos para determinadas bacterias se pueden seleccionar también utilizando técnicas de rutina en et laboratorio debido a la capacidad del fago a mutar rápidamente, produciendo de este modo mutantes de espectro de anfitriones.

Aislamiento de fagos

Debido a que los bacteriófagos son especificas para una determinada especie o cepa de bacterias, se suelen encontrar asociados a sus bacterias anfitrionas específicas. Las fuentes bacterianas de fagos comprenden, pero no se limitan a muestras de aguas residuales; heces; suelo; profundidades oceánicas; aguas termales; desechos tales como de hospitales, granjas, y laboratorios; procesamiento de alimentos; envases de carne y corrales; y procesos agrícolas e industriales. Los fagos también pueden aislarse de los rios y lagos, estanques, pozos, acuiferos, así como de otras fuentes de agua (como por ejemplo el agua salada). Las fuentes de agua de lugares poco probables de contaminación son también fuentes preferibles.

Los procedimientos para el aislamiento de fagos son los siguientes. Generalmente, la muestra sospechosa de contener un bacteriófago se filtra en primer lugar y luego se enriquece. En un cultivo que contiene una bacteria anfitriona, se centrifuga una muestra y el sobrenadante se separa y se pasa a través de un filtro de microporos, tales como los filtros disponibles en el mercado de la compañía Millipore®, con poros lo suficientemente pequeños para impedir el paso de bacterias (aproximadamente 0,45 IJm a 0,2 IJm) pero lo suficientemente grandes para permitir el paso del fago. El sobrenadante filtrado se mezcla a continuación a diferentes diluciones con un cultivo puro de bacterias anfitrionas especificas. Las diluciones de bacterias y el sobrenadante se extienden sobre una placa de agar-agar nutritivo u otro sustrato nutritivo sólido para el cultivo bacteriano. Después de aproximadamente 8 a 24 horas, se manifiesta un césped bacteriano con manchas claras redondas, llamadas placas. Cada placa contiene muchos millones de partículas de fagos, toda la prole de un fago que se inmovilizó sobre el agar-agar. Un palillo de dientes estéril, u otro dispositivo similar, se introduce en una placa y se transfiere a un cultivo reciente de las bacterias en medio nutritivo líquido. De esta manera, se cultiva una solución madre homogénea del clan de fago y el fago puede estudiarse con más detalle o utilizarse para aplicaciones tales como, pero sin limitarse a, ensayos de selección y detección de bacterias y procesos de producción.

5e propagan cepas de bacteriófagos individuales (es decir, monofagos) y y a continuación se prueba la actividad contra cepas de múltiples bacterias para seleccionar fagos con especificidad para las cepas baclerianas deseadas. Cuando se intenta controlar la proliferación de una amplia variedad de especies bacterianas y cepas, se hacen esfuerzos para seleccionar los fagos que son líticos y especificas para más de una cepa bacteriana. También es posible seleccionar fagos apropiados basandose en las secuencias de proteínas que codifica ADN o ARN implicadas en la unión yfo la entrada del fago en su anfitrión especifico, o basándose en las secuencias de aminoácidos o propiedades antigénicas de dichas proteínas

Formulaciones de fagos

Las composiciones de fagos pueden tomar la forma de lisados relativamente crudos de cultivos bacterianos o preparados de virus muy purificados. Los fagos pueden formularse de varias maneras para el almacenamiento y expedición. En una realización, el fago se estabiliza en forma anhidra y se incluye como un componente de una formulación del medio en polvo, solo o incorporado en un polvo que contiene otras sustancias, tales como medios de cultivo, excipientes, agentes de carga, etc

En otra realización, fagos se secan por congelación o liofilizan en un polvo seco y se añaden a los medios de enriquecimiento como complemento durante la redisolución de un medio en polvo o se añaden después durante el proceso de enriquecimiento si se desea. Los fagos pueden almacenarse secos o liofilizados en papel de filtro o como una suspensión anhidra o liofilizada, que puede facilitar la expedición. La mayor parte de los fagos pueden liofilizarse en leche descremada (p. ej., 20%). Se han descrito muchos procedimientos para la liofilización de fagos y son bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, T. Kieser et a'-PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS, publicado por la John Innes Foundation, ISBN 0-7084-0623-8, capitulo 12). Los fagos también estan disponibles en forma líquida o suspensión .

En otra realización, el fago está en forma líquida y se combina con el medio por pulverización sobre un polvo del medio y se mezcla para distribución uniforme o el fago liquido se combina con medio líquido y se mezcla. El fago liquido está presente solo en una solución acuosa solo o en solución con otras sustancias tales como azúcares, poli meros, proteinas, sales, tampones o detergentes.

El medio con el que el bacteriófago se combina puede estar en forma liquida, sólida o semisólida o incorporado en una pelicula del medio tales como las placas PetrifilmN (3M, SI. Paul, Minnesota)

En otra realización, las suspensiones líquidas de fago se congelan con o sin crioprotector. Las composiciones liquidas se conservan refrigeradas, por ejemplo, a aproximadamente + 4·C, o crioprotegidas en glicerol (p. ej., al 50%) y se congelan en nitrógeno liquido a -BO· C. Los fagos se recuperan de los viales liofilizados o de nitrógeno liquido descongelado de la forma siguiente. Se preparan cultivos de bacterias anfitrionas que crecen activamente durante aproximadamente una a 48 horas y el fago liofilizado asépticamente se rehidrata con medio nutritivo. Los cultivos bacterianos se cultivan en una placa de agar-agar nutritivo como una capa de anfitrión con agar-agar blando (por ejemplo, como se describe en Adams, M.H. (1959) BACTERIOPHAGES, Inlerscience Publishers, Inc., Nueva York) y se añaden gotas de fago rehidratado o descongelado a la capa de anfitrión con agar-agar. Las placas se cultivan durante la noche y los fagos se aíslan de las placas resultantes empleando procedimientos convencionales.

Para propagar los fagos, se preparan placas con la capa de anfitrión con agar-agar blando como anteriormente y se cubre con aproximadamente 0,5 mi del fago concentrado. Alternativamente, el fago se añade directamente al anfitrión con agar-agar derretido antes del vertido sobre las placas. Para cantidades mayores, pueden prepararse matraces en T de gran tamaño con el agar-agar recomendado, y aproximadamente 12 mi de anfitrión con agar-agar blando derretido se vierten en la superticie. Se deja entonces que el fago corra sobre la superticie endurecida. Los fagos también pueden añadirse directamente al agar-agar blando derretido antes del vertido como se ha descrito anteriormente. Después de aproximadamente 24 horas de incubación, el agar-agar blando se raspa la superticie de las placas de agar-agar y se centrifuga a aproximadamente 1.000 rpm durante aproximadamente 25 minutos para sedimentar los restos celulares y el agar-agar. El sobrenadante se pasó a través de un filtro, preferiblemente un filtro de 0,45 IJm a 0,22 IJm , y el filtrado se almacena a aproximadamente 4· C a 8· C. Los lisados continúan siendo viables en condiciones de refrigeración durante largos períodos.

Los fagos también se puede propagar por proliferación de bacterias anfitrionas en caldos de cultivo, inoculación con fagos, incubando durante suficiente tiempo para provocar la lisis de las células bacterianas y filtrando el lisado resultante a través de un filtro de 0,45 a 0,2 IJm.

Los fagos también se conservan en los cultivos de bacterias lisadas y se conservan congelados para su posterior redisolución en medio de cultivo nutritivo. Los cultivos de bacterias lisadas se conservan congelados, por ejemplo con glicerol (p. ej., 10-50%) o DMSO (p. ej., 5%), en medios nutritivos y almacenados en nitrógeno liquido. Los cultivos de bacterias lisadas también pueden liofilizarse y conservarse congelados en leche descremada (p. ej., 20%), o una solución de sacarosa (p. ej., 12%) en el medio nutritivo. Los lisados bacterianos congelados se descongelan rapidamente en un baño de agua a aproximadamente 3rC, y la totalidad de la alícuota se inocula en medio reciente. Los procedimientos para la proliferación, lisis y almacenamiento de cultivos bacterianos que albergan partículas de fago son bien conocidos en la técnica.

Los preparados de fagos pueden ser monovalentes. por Que contienen un tipo de bacleriófago. o polivalentes, que contienen mas de un tipo de fago. Los preparados polivalentes, también conocidos como mezclas de fagos o grupos de fagos, se formulan para que incluyan varias especies de fa gas para dirigir más de una cepa o especie bacteriana. La combinación en un cóctel de fagos puede incluir varios fagos dirigidos a diferentes cepas bacterianas o puede tener acciones más amplias gracias al contener fagos dirigidos a varias especies bacterianas Los mezclas de fagos pueden incluir una mezcla de fagos especificos para varias especies bacterianas no relacionadas para eliminar bacterias contaminantes en un cultivo diseñado para enriquecer una bacteria diana

En una realización, se utiliza una combinación de fagos donde la combinación contiene el fago específico para Enterococcus spp.,Escherichia spp., E. coli,Pseudomonas spp., Shigella spp., Bacillus spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Proteus spp., Klebsiella spp., Lactobacillus spp. y Staphylococcus spp. En esta realización, la mezcla carece de fago específico para Sa/monella spp. y por lo tanto es útil para ennquecer una muestra para Salmonella cuando se cultiva en medios nutritivos con este cóctel de fagos como aditivo. Pueden diseñarse preparados de fagos similares para el enriquecimiento especifico de una bacteria diana deseada incluyendo fagos que son especificos para bacterias no deseadas y omitiendo fagos especificos para las bacterias diana. Los fagos especificos para los géneros de bacterias pueden combinarse para crear una mezcla antibacteriana de amplio espectro. En una realización preferida para la detección de bacterias patógenas en muestras de alimentos, se seleccionan fagos que son especificos para los miembros de la fam ilia de las Enterobacleriaceae distintos de la diana del método de detección.

Las mezclas de fagos pueden adaptarse a las bacterias que son frecuentes en algunas muestras. En una realización preferida, se seleccionan los fagos que son específicos para otras bacterias mas predominantes o en mayor concentración en la muestra distintas del microorganismo que va a detectarse. Las bacterias más frecuentes se aíslan a partir de una alta dilución de una detenninada muestra y se ensaya la sensibilidad a diversas cepas de bacteriófagos de manera análoga a la prueba de sensibilidad antimicrobiana. Una vez se conoce el perfil de una muestra bacteriana y se detennina el perfil de sensibilidad del fago, se formula el cóctel de fagos apropiado para una muestra detenninada para evitar la proliferación de las bacterias competidoras y enriquecer el organismo diana

En otra realización, pueden combinarse fagos especificos para géneros bacterianos para crear una mezcla antibacteriana de amplio espectro para su uso cuando se cultivan levaduras, hongos o células eucariotas superiores tales como células vegetales o animales.

Las concentraciones de fagos en medios de cultivo sólidos, semisólidos o líquidos útiles para el control de microorganismos indeseables en las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria son preferiblemente de 103a 1012 unidades fonnadoras de placas por mi (UFP/ml)

En otra realización, se incorporan antibióticos en medios especificas para toda una clase de microorganismos de la que se excluye el microorganismo diana, tales como las bacterias gram pOSitivas (tales como, pero sin limitarse a, lactobacilos y estafilococos) y los fagos se añaden a los medios para eliminar las bacterias gram negativas de reacción cruzada con el reactivo de detección especifica o el método empleado

Kits para ensayos de detección

Un kit para detectar una célula bacteriana en una muestra, también se proporciona en el presente documento. Los kits presentes pueden utilizarse en métodos tales como RCP, BAX, identificación bioquímica tales como API, microidentificatción, análisis de acidos grasos y ensayos enzimáticos tal como COLlLERT® (Idexx Laboratories, Inc.). El kit comprende medios de cultivo de microorganismos y uno o más bacteriófagos especificos para bacterias potencialmente competidoras, interfirientes o indeseables. La preparación de bacteriófago es un componente íntegro de los medios de cultivo, es un componente por separado inmovilizado sobre un sustrato sólido, o se proporciona como un aditivo líquido o sólido en polvo por separado. Ejemplos de sustratos sólidos son las fibras, filtros fibrosos, filtros de membrana, y partículas tales como perlas de latex, oro coloidal, partículas magnéticas, partículas de sílice, y otras partículas conocidas en la técnica. El kit comprende opcionalmente instrucciones impresas, una o más referencias positivas, una o más referencias negativas o combinaciones de las mismas

Además, el kit comprende opcionalmente reactivos y medios para la separación de un componente en la muestra de otro. Los medios para la separación comprenden, pero no se limitan a, reactivos y equipos de extracción liquido-liquido, así como sustancias sólidas tales como filtros, perlas de latex, particulas coloidales como por ejemplo bacterias, partículas magnéticas, medios para centrifugación, sustancias sólidas con características definidas tales como carga electrónica, la porosidad y superficies hidrófilas/hidrófobas, dispositivos de flujo lateral, dispositivos inmunocromatográficos y otras bien conocidos en la técnica.

Los reactivos útiles para separaciones comprenden, pero no se limitan a, anticuerpos, moléculas de acidos nucleicos, estreptavidina, avidina, biolina, carbohidratos, proteínas, péptidos, proteína A, proteína G, moléculas pequeñas y otros ligandos de unión bien conocidos en la técnica. Dichos reactivos y medios para separar pueden ser dirigidos hacia, y ser útiles para la separación, cualquier componente de todo el proceso de ensayo como por ejemplo la preparación de la muestra, enriquecimiento. proliferación o reproducción. y pruebas. Dichos reactivos y medios para la separaCión, y combinaciones de los mismos, son bien conocidos para los expertos en la técnica y se contemplan en las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria. Los medios para realizar separaciones en los kits diseñados para detectar componentes de microorganismos utilizando anticuerpos, moléculas de ácidos nucleicos y

5

10

15

20

25

30

35

Ácido Cítrico Acetona y butanol Riboflavina Vitamina 912

Dextrano Goma de xantano

Antibióticos y relacionados otros ligandos de unión son bien conocidos en la técnica y están dentro del alcance de las composiciones 'i métodos descritos en la presente memoria

El rendimiento de un análisis bioquímico completo generalmente requiere aislar la molécula en forma pura de otras moléculas en un extracto de una muestra biológica, a continuación, caracterizarla y analizar su función. Los análisis bioquímicos pueden caracterizar una molécula, cuantitativa o semicuantitativamente, y los ensayos de detección pueden oscilar desde el simple tipo de análisis proporcionado por determinaciones espectrofotométricas, la actividad enzimática y la tinción de gel para determinar la concentración y pureza de proteinas y ácidos nUcleicos, a análisis más detallados

Los reactivos para la detección del organismo de interés estan opcionalmente provistos con el kit y comprenden ligandos detectables tales como anticuerpos o secuencias de ácidos nucleicos específicas para el organismo que debe detectarse o enzimas o sustratos u otras moléculas o indicadores químicos o bioquímicos. Los ligandos pueden conjugarse con un marcador detectable que es colorimétrico, radiactivo, fluorescente, quimioluminiscente, bioluminiscente, electroquímico, enzimático o metabólico, u otros marcadores utilizados rutinariamente en la técnica. Dichos reactivos son bien conocidos para los expertos en la técnica

Procedimientos de utilización de las composiciones de bacteriófagos

Los procedimientos proporCionados en la presente memoria emplean una o más de las composiciones de bacteriófagos líticos descritas anteriormente durante el enriquecimiento o de cultivo en placa de un microorganismo deseable o diana de interés para reducir, inhibir o eliminar la proliferación de bacterias no deseadas.

En una realización, las composiciones son útiles en un sistema de fennentación industrial para reducir la proliferación de bacterias competidoras y aumentar la eficiencia y el rendimiento durante la fermentación industrial u otra producción comercial de grandes cantidades de un organismo deseable, tal como levaduras en una fábrica de cerveza o panadería,

o bacterias recombinantes en una instalación de producción de proteinas recombinantes, o células o tejidos eucarióticos en un proceso industrial o fannacéutico. El aumento de producción de microorganismos da como resultado una mayor producción del producto producido por este organismo. Una lista de productos frecuentes producidos utilizando microorganismos se exponen a continuación en la Tabla 1 Los procedimientos de enriquecimiento de microorganismos proporcionados en la presente memoria son particularmente útiles cuando la materia prima o el material de aporte no es estéril y por lo tanto contiene un microorganismo contaminante. Por ejemplo, el enriquecimiento de levaduras (tal como, pero no limitado a, Saccharomyces o Zymomonas mobilis ) en una reacción de fermentación que contiene materia prima aumenta la produCCión de etanol. Otras materias primas comprenden la caña de azúcar, paja de arroz, cebada y desperdicios de trigo, desperdicios de patata, desperdicios de madera, residuos urbanos y residuos de la industria de bebidas. Con dichos materiales que sirven como materias primas no es sorprendente que la mayoría de las fermentaciones tengan lugar en presencia de contaminación bacteriana significativa. Los lactobacilos son los principales contaminantes en la producción de etanol y su presencia y la producción de acido láctico resultante reduce el rendimiento de etanol y reduce la proliferación de la levadura.

Los aminoácidos producidos por fermentación son predominantemente lisina y acido glutámico (1 millón de toneladas métricas en conjunto), con cantidades menores de treonina y triptófano. Esto representa unos 3,5 miles de millones de dólares en el mercado mundial. El organismo principal utilizado para la producción es Corynebacterium glutamicum. Las materias primas para este proceso comprenden residuos de maíz combinados con productos residuales con alto contenido en nitrógeno. Las especies de bacilos aportan una considerable cantidad de las contaminaciones que pueden ocurrir, y que al ser de crecimiento rápido, compiten con las Corynebac/erium por los nutrientes.

TABLA 1· Productos de fermentación industrial

Metabolito Producido por

Aspergillus niger Clostridium acetobutyricum Ashbya gossipii Pseudomonas denitrificans Propionibacterium shermanii Leuconostoc mesenteroides Xanthomonas campestris

Producidos por

Penicilina

Penicillium chrysogenum

Eritromicina

Streptomyces erythreus

Estreptomicina

Strepfomyces griseus

Cefalosporina

Cepha/osporium acrimonium

Griseofulvina

Griseofulvina Penicillium

Ciclosporina

Tolypocladium infla/um

10

5

10

15

20

25

30

35

40

Giberelina Gibberella fujikuroi Enzimas Producidas por

Am ilasas

Aspergillus oryzae

Glucamilasa

Aspergillus niger

Celulasa

Reesii Trichoderma

Invertasa

Saccharomyces cervisiea

Lactasa

Kluyveromyces fragilis

Lipasa

Saccaromycopsis lipolytica

Pectinasa y proteasa

Especies de Aspergillus

Proteasa

Especies de Bacillus

Cuajo microbiano

Mucor pusillus y Mucor meihei

Los expertos en la técnica entienden que, cuando se utiliza en un procedimiento de enriquecimiento para la producción, tal como la fermentación industrial, la producción recombinante u otra producción comercial, la muestra a la que se añade la composición de bacteriófago es una cantidad sumamente grande tal como el contenido de una cuba de producción, recipiente, reactor (tal como un reactor microbiológico para la producción de un producto biológico utilizando bacterias o levaduras) o fermentador.

Alternativamente, la composición de bacteriófagos se utiliza en un método para la detección de un microorganismo diana en una muestra. En una realización, uno o más bacteriófagos se utilizan durante la etapa de enriquecimiento de un método para la detección de una diana bacteriana para reducir o inhibir la proliferación de bacterias contaminantes y preferentemente permitir la proliferación de las bacterias diana que deben detectarse.

En otra realización, se utilizan uno o más bacteriófagos durante el cultivo en placa microbiana para reducir la proliferación de bacterias no deseadas en los medios de recubrimiento y aumentar la capacidad de aislar, detectar, enumerar o identificar el microorganismo diana Medios de cultivo en placas adecuados comprenden tanto los medio sólidos y/o semisólidos.

Poblaciones de dianocitos

Los procedimientos descritos en la presente memoria son útiles para la detección, la proliferación, la reproducción, el enriquecimiento, el aislamiento, la caracterización, la recuento o identificación de cualquier microorganismo de interés. Los expertos en la técnica apreciaran que no hay limite a la gama de poblaciones de microorganismos diana aparte de la disponibilidad del fago específico necesario para eliminar contaminantes competidores o indeseables. Preferiblemente, los microorganismos diana son las bacterias. Un compendia de las bacterias para las que los procedimientos y composiciones son útiles es el Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Lippincott Wiliiams & Wilkins). Las células bacterianas diana contempladas por los presentes procedimientos comprenden, pero no se limitan a, células bacterianas que son alimentos, agua o contaminantes ambientales, patógenos de importancia agrícola, médica o veterinaria, y las células bacterianas útiles en procesos fannacéuticos, industriales o comerciales. Las células bacterianas diana específicas comprenden, pero no están limitadas a, todas las especies de Salmonella, todas las cepas de E. coli, entre otras, pero no limitadas a E. coli 0157:H7, todas las especies de Listeria, entre otras, pero no limitadas a L monocytogenes, colifonnes, todas las especies de Legionella y todas las especies de Campylobacter.

Las bacterias patógenas también pueden incluir, pero no estan limitadas a Acinetobacter calcoaceticus, Actinomyces israelii, Bacillus spp. (Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus), Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucellae (Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella sU/s, Brucella canis), Costridium spp. (Clostridium tetani, Clostridium perfringens), Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumomae, enterococos (Enterococcus faecalis ), Escherichia coli, Eubacterium alactolyticum, Enterobacter spp. (Enterobacter e/oacae), Francisella tularensis, Flavobacferium meningosepticum, Helicobacter pylori, Klebsiellae (Klebsiella pneumoniae), Legionella spp. (Legionella pneumophilia), Leptospira interrogans, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Proteus, (Proteus mirabilis, Proteus vulgaris), Pseudomonas aeruginosa, Providencia alcalifaciens, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Rickettsia prowazekii , Salmonella (Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis typhl), Serratia spp., estafilococos (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis), Shigella spp. (Shigella dysenteriae), Spirillum minus, estreptococos, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio spp. (Vibrio cho/erae, Vibrio vulnificus), Xanthomonas maltophilia, y Yersinsia spp (Yersinia pestis).

Las células bacterianas diana contempladas por los presentes procedimientos también comprenden. pero no se limitan a, células bacterianas que se encuentran por ser sistemas contaminantes de importancia comercial, tales como las utilizadas en las industrias de fennentación comercial, la producción de etanol, la producción de antibióticos, la producción de aminoácidos, productos farmacéuticos, la producción de vino, la producción farmacéutica, el tratamiento de residuos, el tratamiento de agua, biodegradación, etc Dichas bacterias comprenden, pero no se limitan a, organismos tales como Lactobacillus spp., Corynebacterium spp., Brevibaacterium spp. y Acetobacter spp. durante la producción de etanol. Otros ejemplos de bacterias comprenden las enumeradas en W. Levinson et al., MEDICAL MICROBIOLOGY & IMMUNOLOGY, McGraw-Hill Cos., Inc., 6 a ed., páginas 414-433 (2000). Todos los cultivos de bacterias se cultivan usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica

Los expertos en la técnica entienden que el término "microorganismo diana" significa una sola especie, cepa o estirpe, asi como grupos o familias de organismos. Por ejemplo, el procedimiento es útil para la detección de Salmonella enteritidis, así como todas las Salmonella

Los procedimientos proporcionados en la presente memoria para la detección de una diana proporcionan alta sensibilidad de detección en un corto período de tiempo sin necesidad de prolongados enriquecimientos del cultivo. Por ejemplo, los presentes procedimientos pueden proporcionar la detección o cuantificación de menos de aproximadamente 100, menos de aproximadamente 50 o menos de aproximadamente 10 células bacterianas en una muestra. Preferiblemente, los presentes procedimientos pueden proporcionar la detección o cuantificación de menos de aproximadamente cinco, menos de aproximadamente cuatro, menos de aproximadamente tres, o menos de aproximadamente dos células bacterianas en una muestra. Más preferiblemente, los procedimientos pueden proporcionar la detección y cuantificación de una sola célula bacteriana en una muestra

Un tiempo de generación bacteriana se define por la tasa de crecimiento bacteriano en condiciones nutritivas convencionales (medio de cultivo, pH, temperatura, etc.) durante la fase de crecimiento exponencial. Las bacterias diana preferiblemente tienen un tiempo de generación de 10 minutos a 36 horas. Son preferibles las bacterias que tienen tiempos de generación mas cortos dentro de este intervalo, reduciendo de este modo el tiempo requerido para la etapa de enriquecimiento en el ensayo de detección. Sin embargo, la presente invención es particularmente útil para las bacterias diana con largos tiempos de generación ya que evita o inhibe la proliferación de microorganismos no selectivos de crecimiento más rápido.

Empleo de bacteriófagos corno agentes de selección en medios de cultivo

Cuando se utiliza como agente de selección en medios de cultivo, el bacteriófago se añade al medio de cultivo similar a cualquier aditivo de cultivo que se añada de forma rutinaria. El empleo de bacteriófagos en lugar de antibióticos reduce el tiempo de incubación necesario debido a que el bacteriófago no perjudica la proliferación de todas las bacterias, inclusive la diana, a la vez que destruye las baderias contaminantes. Como se utiliza en la presente memoria, contaminante se define como un organismo o agente presente en el cultivo que no pretende, ni desea estar presente antes, durante o al término del período de cultivo. Los medios de cultivo de actuación rápida, no selectivos, se evitan tradicionalmente en muchas aplicaciones debido a que el potencial de contaminación de las especies para superar al cultivo es una preocupaCión. El tratamiento con bacteriófagos permite el empleo de medios de cultivo de actuación rapida en ausencia de antibióticos, alentando de este modo el rapido crecimiento a la vez que impide la proliferación excesiva de bacterias contaminantes.

En una realización, las muestras se enriquecen en presencia de aproximadamente 1><107 UFPfml de cada bacteriófago durante aproximadamente 40 horas a 35Q C aunque la temperatura puede variar. El número de unidades formadoras de placa puede ajustarse mayor o menor para conseguir mas o menos infección. El tiempo de incubación es preferiblemente inferior a 40 horas, preferiblemente inferior a 18 horas, preferiblemente inferior a 10 horas, preferiblemente inferior a 6 horas o preferiblemente inferior a 2 horas. Los tiempos de incubación pueden ajustarse dependiendo del tiempo de la serie

De acuerdo con el procedimiento, se añaden mezclas de bacteriófagos a cualquiera de los cultivos de pequeño volumen

o a reacciones de fermentación industrial a gran escala. Debido a que los bacteriófagos se multiplican en presencia de la bacteria anfitriona, no se necesitan altas concentraciones en los cultivos de fermentación a gran escala, reduciendo de este modo los costes asociados al mantenimiento de un cultivo libre de contaminantes.

La adición de bacteriófagos se utiliza para controlar una amplia gama de microflora autóctona en cultivos bacterianos. El tratamiento con un grupo de bacteriófagos elimina una mezcla de bacterias competidoras del medio nutritivo. Una combinación de amplio espectro de bacteriófagos puede reducir drásticamente el número total de bacterias contaminantes de una muestra permitiendo de este modo un mayor acceso a los nutrientes para las bacterias diana a detectar y menos exposición a sustancias potencialmente inhibidoras producidas por las bacterias indeseables. Esto optimiza las condiciones de crecimiento para las bacterias diana lo que permite una reproducción más rápida y menor tiempo para producir detecciones positivas.

Otras ventajas de los presentes procedimientos son la reducción de respuestas de falsos negativos y falsos positivos mediante el ensayo de detección. En presencia de las altas concentraciones de microorganismos competidores en un cultivo, las bacterias diana nunca pueden alcanzar una concentración que sea lo suficientemente alta para ser detectada por el método analítico, independientemente del tiempo permitido para el enriquecimiento, lo que da como resultado un falso negativo. No es esencial que las bacterias diana sean el único organismo en la muestra o incluso el organismo en mayor concentración. Es suficiente que la productividad de las bacterias diana sea tal que la concentración sea detectable por el método analítico. El empleo de fagos para inhibir o retardar la proliferación de microorganismos

competidores en el enriquecimiento mejora la productividad de las bacterias diana y reduce las respuestas de falsos negativos por el método analítico. El fago también proporciona un significativo tiempo de enriquecimiento reducido para conseguir un nivel detectable y permite medidas correctivas antes y minimiza el coste

Las respuestas de falsos positivos también se reducen empleando los presentes procedimientos. Se sabe que pueden ocurrir reacciones de falsos positivos cuando un ensayo de detección presenta reactividad cruzada, o reactividad no específica a las bacterias no elegidas como diana. Por ejemplo, surgen respuestas de falsos positivos cuando se emplean anticuerpos en el ensayo de detección que unen el organismo diana y también reaccionan de forma cruzada con bacterias no elegidas como diana presentes en la muestra. Los fagos presentan perfiles de especificidad de unión para las bacterias que son diferentes de los perfiles de especificidad de los anticuerpos. Cuando los anticuerpos, las moléculas de ácidos nucleicos, los productos químicos, bioquímicos, enzimáticos u otros medios que se utilizan para detectar el organismo diana presentan reactividad cruzada o reactividad no especifica a los organismos no selectivos, pueden utilizarse fagos para reducir la concentración del organismo causal a limites detectables por debajo y de este modo reducir las respuestas de falsos positivos

Ensayos de detección

Los procedimientos descritos en la presente memoria proporcionan la detección, identificación, recuento o caracterización de las bacterias diana en una muestra, lal como, pero no limitada a, E. coli 0157:H7, Salmonella spp., Legionella spp., Campylobacter spp., coliformes, coliformes fecales, y Listeria spp. Los procedimientos reducen los problemas que se encuentran normalmente cuando el cultivo de bacterias antes del análisis, enriqueciendo las poblaciones de células diana o minimizando las especies competidoras. En una realización, se incuba una muestra en presencia de una mezcla de bacteriófagos que es especifica y tiene capacidad para lisar una o más especies de bacterias indeseables y no es especifica para o no lisa las especies bacterianas diana. Después de la incubación de la muestra con bacteriófagos se detecta, identifica, enumera o caracteriza la presencia de las células bacterianas diana replicadas. Existen ensayos de detección general en la técnica y pueden modificarse para incorporar la adición de una etapa de selección en la que los bacteriófagos actúan como mediadores. Ejemplos de ensayos de detecciÓn de bacterias se encuentran en las patentes de EE.UU. nO 5.498.525; nO 6.555.331; nO 6.322.783; publicación de patente de Estados Unidos 2004f0137430; Blackburn 1993 J. App/ Bacterio/. 75:199-214; Peplow et al. 1999 App/. Environ Microbio/. 65:1055-1060 y Swaminathan et a/.1994Annu. Rev. Microbio/. 48:401-426. Preferiblemente, el microorganismo de interés se detecta utilizando inmunoanálisis, RCP, procedimientos químicos, bioquímicos, enzimáticos o de cultivos

Cualquier ensayo o combinación de ensayos de detección, caracterización o identificación bacteriana puede emplearse en los presentes procedimientos. Muchos de dichos ensayos bacterianos son conocidos en la técnica y muchos están disponibles en el mercado. Para los ensayos en los que la bacteria es un patógeno de alimentos, los ejemplos de dichos ensayos comprenden, pero no se limitan a los inmunoanálisis, tales como el RAPIDCHEK E. co1i0157, análisis con Salmonella y Listeria disponibles en el mercado de Strategic Diagnostics Inc. (Newark, Delaware); el análisis VIP E. co/i disponible en el mercado de BioControl Systems Inc. (Bellevue, Washington); los análisis REVEAL disponibles en el mercado de Neogen Corporation, Lansing, Michigan; los análisis IMMUNOCARD STAT! E. coli0157:H7 disponibles en el mercado de Meridian Diagnostics, Inc., Cincinnati, Ohio; el OXOID Listena Rapid Test disponible en el mercado de Oxoid Limited, Hampshire, Inglaterra; el análisis VIDAS ECO o la tecnología Vitek disponible en el mercado de bioMerieux Inc. (Hazelwood, MO); y el Unique Sa/monella Assay disponible en el mercado en Tecra International Pty LId. (Chatswood, Australia).

Los ensayos adicionales para caracterizar o identificar bacterias patógenas de los alímentos comprenden, pero no se limitan a, ensayos de aglutinación, tales como el REMEL E. coli0157 Latex de REMEL, Inc. (Lenexa, KS), REMEL E. coli H7 Latex de REMEL, Inc., y el REMELSalmonella Latex de REMEL, Inc.; kits de caracterización de bacterias tales como el sistema REMEL MicrolD de REMEL, Inc., y el sistema bioMerieux api20E de bioMerieux· Vitek. Inc., análisis de reacción en cadena de la ADN polimerasa (RCP) tales como el BAX E. coli 0157:H7, análisis con Salmonella spp. y Listeria spp. de DuPont Qualicon Inc., Wilmington, DE; pruebas de motilidad para determinar la presencia y la estructura de tipos de flagelos tales como los flagelados H7; y pruebas de toxicología que identifican las características de las toxinas prodUCidas por una bacteria. Las pruebas realiz.adas por los servicios externos, tales como el Serotipado H 1-58 tal como el realizado por el E. co/i Reference Center (Departamento de Ciencias Veterinarias de la Universidad Estatal de Pennsylvania, Universily Pan::, PA) y la prueba H Serology, (realizada también por la E. coli Reference Center), se utilizan también para este fin en algunas realizaciones.

En algunas realizaciones, el ensayo de caracterización y la identificación supone colocar la flora microbiana aislada del enriquecimiento del cultivo primario en condiciones de cultivo secundario eficaces para indicar la identidad bacteriana_ En tales casos, las bacterias del enriquecimiento primario pueden rayarse directamente sobre varias placas de agar-agar de alta selectividad o colocarse en otro medio muy selectivo. Debido al grado de selectividad del medio, el posterior crecimiento de una colonia sola puede proporcionar una base para la identificación de una cepa bacteriana Los procedimientos de cultivo primario o secundario eficaces para indicar la identidad bacteriana, comprenden los que

contienen sustancias químicas específicas, enzimas o sustratos enzimaticos que cuando son actuados por bacterias especificas, producen cambios detectables tales como un cambio de color, pH, potencial redox, fluorescencia , turbidez, luminiscencia, agregación o cualquier otro cambio, como por ejemplo agar-agar y caldo cromógenos muchos de los cuales están disponibles en el mercado y se describe en el manual DIFCO.

Algunos ejemplos de agar-agar para seleccionar, caracterizar o identificar bacterias E. coli0157 comprenden CefixiePotassium Tellurite Sorbitol MacConkey agar ("CT-SMAC"); disponible de Secton, Dickinson and Company, Sparks, MD; y RAIN80W Agar 0157, disponible en 8iolog. Inc., Hayward, CA. Algunos ejemplos de agar-agar selectivos para el enriquecimiento e identificación de bacterias Sa/monel/a comprenden placas ASAP Sa/monel/a (d isponibles en AES Laboratoire, Combourg, Francia), placas de desoxicolato de xilosa y lisina (XLD) y placas Brilliant Green Sulfadiazine (BGS), ambas disponibles en Becton, Dickinson and Company. Otros ejemplos de agar-agar para la caracterización de bacterias comprenden Eosin Methylene Blue (EMB), Phenol Red Sorbitol Agar, Slood Agar, y agar Luria Serlani (LB), todos disponibles en Becton, Dickinson and Company. Un ejemplo de agar-agar selectivos para el enriquecimiento y la identificación de bacterias Listeria es placas ALOA Lis/eria monocytogenes en AES Laboratoire, Combourg, Francia. El listado de ejemplos de agar-agar y medios para seleccionar, caracterizar, enumerar o identificar bacterias no es restrictivo, y cualquier entorno que indica, detecta, selecciona, caracteriza, enumera o identifica bacterias esta dentro del alcance de los procedimientos. Los presentes procedimientos contemplan el empleo de fagos como agentes selectivos en cualquiera y todas las etapas de cultivo en un proceso, así como un medio directo para detectar, identificar, tipificar, enumerar o caracterizar células bacterianas provenientes de dichas etapas

Los procedimientos descritos en la presente memoria, principalmente el enriquecimiento del cultivo y la detección, permiten la detección rápida de microorganismos tales como las células bacterianas. Por ejemplo, los procedimientos pueden realizarse en menos de aproximadamente 48 horas, más preferiblemente en menos de aproximadamente 32 horas, mas preferiblemente en menos de aproximadamente 16 horas y aún mas preferiblemente en aproximadamente ocho horas o menos

Enriquecimiento de cultivos bacterianos en ensayos de detección

Todos los procedimientos normalizados para la detección de microorganismos requieren una etapa de enriquecimiento de la muestra en el medio de crecimiento. La etapa de enriquecimiento amplia el número de microorganismos diana en la muestra. El presente procedimiento contempla la utilización de bacteriófagos como agentes selectivos en medios microbiológicos para inhibir la proliferación de determinadas bacterias no elegidas como diana durante el enriquecimiento. En una realización preferida, se utiliza un grupo de bacteriófagos durante el enriquecimiento para inhibir o destruir los organismos competidores en un kit de ensayo o prueba para microorganismos tales como Sa/monel/a en los ali mentos o Legionel/a o coliformes en agua

La etapa de enriquecimiento está opcionalmente acompañada por una etapa de inmunoseparación, tal como mediante la utilización de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos. Los anticuerpos también pueden ser fijados sobre un soporte sólido para aislar los microorganismos diana. Son preferibles los anticuerpos que tienen especificidad para los receptores de superficie en el microorganismo diana. Los anticuerpos preferiblemente tienen mínima reactividad cruzada con otros microorganismos y son específicos para un tipo de célula. Sin embargo, en caso de que se utilice un anticuerpo que reacciona de forma cruzada con otras cepas o especies, el tratamiento de la muestra antes de la detección con un grupo de bacteriófagos evitara la proliferación o eliminara cualquier bacteria contaminante de la muestra que reacciona de forma cruzada con anticuerpos. Por ejemplo, se han desarrollado anticuerpos que son especificos para Sa/monel/a. No todos los anticuerpos contra Sa/monel/a son específicos y algunos pueden reaccionar de forma cruzada con células distintas de Sa/monel/a. Este problema se supera evitando la proliferación de células distintas de Sa/monella que reaccionan de forma cruzada antes de la detección mediante la adición a la mezcla de enriquecimiento de un grupo de bacteriófagos especifico para las células distintas de Sa/monel/a que reaccionan de forma cruzada

Durante el proceso de enriquecimiento convencional, los microorganismos no selectivos pueden proliferar en exceso la diana. Una estrategia común ha sido añadir un agente de selección tal como un antibiótico al medio para oponerse a la proliferación de organismos no selectivos. Ejemplos de agentes de selección comprenden antibióticos, colorantes, sales biliares, detergentes y otras sustancias conocidas por los expertos en la técnica. Por desgracia, la adición de antibióticos inhibe la proliferación de organismos no selectivos, pero también puede afectar a la proliferación de la diana. Los antibióticos que alteran la proliferación de las bacterias diana están preferiblemente ausentes en los procedimientos descritos en la presente memoria

Un procedimiento particularmente preferido es aquel en donde la especificidad total del procedimiento global se determina por una combinaciÓn de bacteriófagos, antibióticos y el procedimiento de detección (tal como un inmunoanálisis, análisis bioquímico o RCP).

Aumento de señal en análisis de bioluminiscencia

La bioluminiscencia tiene quizás la mayor sensibilidad intrínseca entre los procedimientos de detección bioquímicos. La expresión del gen bacteriano (lux) de luciferasa puede detectarse con alta sensibilidad midiendo la luz emitida por las células que expresan el gen en presencia de un sustrato adecuado. Varios investigadores han incorporado lux en un genoma de fago para expresar lux en una bacteria diana (Loessner et al. 1996. Appl. Enviran. Microbiol. 62(4):11331140.; Duzhii el al. 1994. Mol. Gen .Mikrobiol Virusol. (3):36-8). Los fagos se puede utilizar de esta manera para detectar directamente el organismo diana. En los presentes procedimientos, también se puede utilizar fagos en combinación con este procedimiento de detección, como con otros procedimientos de detección, para mejorar el rendimiento del procedimiento de detección como se demuestra mediante el siguiente ejemplo

La sensibilidad intrínseca de los ensayos de bioluminiscencia es insuperable, pero a menudo no se realiza. La detección de la luz por debajo del nivel de fotones individuales se consigue fácilmente, sin embargo surgen limitaciones en primer lugar en conseguir los fotones emitidos al detector y en segundo lugar en d istinguirlos de las falsas señales de fondo como por ejemplo la fosforescencia. En muestras complejas, los fotones emitidos son oscurecidos fácilmente por dispersión o absorción por otros componentes de la muestra. La geometría de la muestra es también un factor en la distribución eficiente de los fotones emitidos al detector. La luz emitida se observara más fácilmente si las células que expresan luciferasa se separan de los componentes opacos del medio y de las posibles fuentes de fondo y se colocan en una capa delgada con acoplamiento óptico cerca del detector. El tratamiento de la muestra con fagos disminuye las células no infectadas, no luminiscentes en el cultivo mientras que favorece una proliferación mejor, más rápida de las células diana luminiscente debido a la competencia reducida de nutrientes.

La reducción de las células no elegidas como diana en cultivos en suspensión reduce la dispersión de la luz por estas células. La lisis de las células no elegidas como diana por bacteriófagos reduce el ruido en el ensayo mejorando de este modo la relación señal a ru ido. Una relación señal a ru ido mejorada permite la detección de una señal fiable en el cultivo mucho antes y por lo tanto requiere menos tiempo para la etapa de enriquecimiento.

La invención se describirá con mayor detalle mediante ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos se ofrecen a título ilustrativo, y no pretenden limitar ni definir la invención modo alguno.

Ejemplo 1

Cultivo de un nuevo bacten"ófago utilizando un cultivo de E. coli como anfitrión

Se cultiva E. coli en medio líquido utilizando procedimientos normalizados a temperatura ambiente o a una temperatura elevada en un recipiente de cultivo, tales como un matraz, hasta que la concentración de E. coli alcanza un valor deseado. Ejemplos de medios comúnmente utilizados para la proliferación de E. coli comprenden los caldos Triptic Soy Broth (TSB) I Brain Hearl Infusion (BHI). En la etapa cuando el número de células de E. coli se propaga a, por ejemplo, de 2 a 3x1 O por mi de medio de cultivo (p. ej., D.O. = 0,2), el bacleflófago se añade enlonces al medio de CUltiVO. Una vez se ha añadido el bacteriófago al medio de cultivo, el cultivo se mantiene sustancialmente bajo las mismas condiciones que el cultivo anterior con el fin de permitir que la E. colí sea infectada con el bacteriófago resultante en la reproducción y amplificación del bacteriófago y por último a la lisis de las células E. coli. Como consecuencia, cuando el cultivo se mantiene durante un período predeterminado de tiempo, se obtiene un líquido de cultivo del bacteriófago en donde hay pocos o ningún superviviente de E. coli. El líquido de cultivo se purifica a continuación, de acuerdo con procedimientos convencionales para eliminar restos de células E. coli, por ejemplo, por centrifugación o filtración a través de filtros de 0,45 jJm a 0,2 jJm, produciendo de este modo un lisado de cultivo bacteriano líquido, estéril, aclarado, que contiene el bacleriófago

El bacteriófago según la presente invención también puede obtenerse a partir de cultivos de bacterias que crecen en medios de cultivo de agar-agar sólido o semisólido que contiene, por ejemplo, polipeptona y extracto de levadura, utilizando procedimientos normalizados bien conocidos por los expertos en la técnica. En este cultivo, puede ser posible utilizar un medio de cultivo de agar-agar de dos capas teniendo las capas diferentes concentraciones de agar-agar. El cultivo que utiliza dicho medio de cultivo de agar-agar de dos capas de este tipo puede llevarse a cabo añadiendo E. co/i y fagos a la capa superior, semisólida e incubando el medio de cultivo a temperatura ambiente o a temperatura elevada. El cultivo resultante de los fagos puede entonces procesarse disolviendo la capa semisólida de agar-agar con un líquido adecuado, tales como medios de cultivo liquido, agua, solución salina, tampón o similares, y separando los materiales sólidos, p. ej., reslos de células, procedentes de fagos solubles por centrifugación o filtración, dando de ese modo un líquido clarificado que contiene altas concentraciones de fago.

La superticie de E. coli tiene una configuración de receptor capaz de absorber un bacteriófago. Absorción, o fijación, precede a la inyección de los genes de la bacleriófago (ADN o ARN), en las células de E. eoli. Una vez Que los genes del fago se encuentran dentro de la célula bacteriana, redirigen los procesos metabólicos de la célula anfitriona para producir partículas de bacteriófago que se acumulan hasta que finalmente la series célula revienta liberando la prole de bacleriófagos en el liquido de cultivo.

5

15

25

35

45

55

En el cultivo de algunos bacteriófagos como se describió anteriormente, se prefiere añadir una pequeña cantidad de un metal tal como magnesio, manganeso, calcio o similar al medio de cultivo para cultivar las bacterias, tales como E. co/i. Los procedimientos adecuados para el aislamiento de cepas de bacteriófagos puros a partir de una muestra que contiene bacteriófagos son bien conocidos, y dichos procedimientos pueden ser adaptados por el experto en la técnica a la luz de la orientación proporcionada en la presente memoria. El aislamiento de bacteriófagos a partir de muestras adecuadas procede por lo general filtrando las muestras a través de un filtro de 0,45 IJm o 0,25 IJm para eliminar organismos vivos, mezclando el filtrado con caldo nutritivo, inoculando el caldo con una alta concentración de una cepa bacteriana anfitriona, p. ej., E. eoli, e incubando para enriquecer la mezcla con bacteriófagos que pueden infectar la cepa anfitriona. Después del enriquecimiento, la mezcla se filtra para eliminar los residuos bacterianos dejando bacteriófagos líticos en el filtrado. Las diluciones en serie del filtrado se colocan en placas en un césped confluente de bacterias E. coli, y la infección de una sola célula bacteriana por un solo fago da como resultado la producción y liberación en la zona circundante, de muchos fagos, que a su vez infectan y lisan bacterias vecinas. Sin embargo, el agar-agar limita la propagación fisica de los fagos en toda la placa en una cantidad limitada de tiempo, produciendo pequeñas areas visiblemente claras denominadas placas donde los bacteriófagos han destruido las células bacterianas dentro del césped confluente de crecimiento bacteriano. Puesto que una placa con una morfolog ía distinta surgió de una particula de fago que se replicó en las bacterias dentro de esa área del césped bacteriano, la pureza de un preparado de bacteriófagos se puede asegurar eliminando el material en esta placa con una pipeta pasteur estéril, palillo de dientes o un dispositivo similar (un "rascador de placa"), y utilizando este material como inoculo para ulteriores ciclos de crecimiento de los fagos. El bacteriófago producido en dichos ciclos representan una única cepa o "monofago". Cada fago es identificado únicamente por su tamaño, morfología estructural, composición de proteinas, y la secuencia genómica. Por consiguiente, la pureza de un preparado de fagos (como por ejemplo la confirmación de que es un monofago y no un preparado de fagos polivalentes) se evalúa mediante una combinación de técnicas tales como la microscopia electrónica, SDS-PAGE, análisis del producto de la digestión de la restricción de ADN y ultracentrifugación anamica.

Ejemplo 2

Utilización de bacteriófagos en medios de enriquecimiento microbiano para suprimir la proliferación de organismos reactivos de forma cruzada como medio para reducir la aparición de resultados de fa/sos positivos

En el campo de experimentación con patógenos de alimentos es frecuente analizar muestras de alimentos para detectar la presencia de bacterias Sa/monella. Los procedimientos para realizar dichas pruebas comprenden el cultivo de una muestra de alimentos en un medio de enriquecimiento primario que produce la reproducción de cualquier Salmonella presente junto con otros microorganismos en la muestra. El líquido de cultivo resultante se analiza con un ensayo de detección tal como un inmunoanálisis. Se sabe que algunos anticuerpos contra Salmonella útiles en dicho inmunoanálisis presentan reactividad cruzada con microorganismos íntimamente relacionados, como Citrobacter spp. (J. Bacterio/ogy, 1978, 134(2), págs. 462-469). Dicha reactividad cruzada puede provocar respuestas de falsos positivos. En los casos en que un analisis de detección presente reactividad cruzada es útil para inhibir selectivamente la proliferación de organismos de reacción cruzada y con ello reducir la cantidad de respuestas de falsos positivos.

En este experimento, se cultivaron individualmente Citrobacter freundii y Salmonella enteritidis en caldo de soja triptico (TSB) durante 18 horas a 3rC. Los recuentos de células vivas para cada cultivo se detenninaron mediante técnicas convencionales de dilución en placas. Muestras de fago FF2-20-1 especifico para C. freundii (proporcionado por

107

Strategic Oiagnostics Inc., Newark, Delaware) se formularon a UFP/ml en medio TSB. Se añadió cultivo de c. freundii a los medios de TSB con y sin el fago FF2-20-1 hasta concentraciones finales de 0, 1, 10, 100, 1.000, 10.000, Y 100.000 unidades formadoras de colonias por mi (ufelml). Cada tratamiento con C. freundii se inoculó junto con O, 1, 10, Y 100 ufclml de S. enteritidis. Todas las muestras se incubaron a 35"C durante 18 horas. Después de 18 horas de incubación, todas las muestras se analizaron con un inmunoanálisis de flujo lateral (LFI), que detecta específicamente C. freundii y no reacciona de forma cruzada con S. enteritidis. Cuanto mayor sea el nivel de desarrollo de la señal (resultado de la carta de colores) en el LFI, mayor será la concentración de e freundii. Además, las concentraciones de S. enteritidis y C. freundii en todos los tratamientos se determinaron cultivando en placas diluciones en serie en un medio indicador selectivo (medio ASAP, AES, Comborg, Francia) que pueden distinguir entre Sa/monella y Citrobacter

Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 2 y demuestran que la adición de bacteriófagos específicos para C. Freundii en el cultivo reduce en gran medida la concentración de bacterias C. Freundii contaminantes en cultivos de S. enteritidis después de 18 horas de incubación. En los cultivos que no contenían Sa/monella o fagos, el Citrobacter alcanzó muy altas concentraciones (aproximadamente 108 ufcfml). Un análisis de detección que emplea anticuerpos de Salmonella que presenta reactividad cruzada para Citrobacterdaría una respuesta de falso positivo a dicho cultivo cuando no hayan Salmonella presentes. La adición de fagos específicos al enriquecimiento evita el crecimiento de organismos con reactividad cruzada disminuyendo de este modo las respuestas de falsos positivos.

Tabla 2

Concentración de inoculación de C. freundii (ufcfml) O 1 10 100 1000 10.000 100.000

Fago 1 3 3 2 2 3 10 O Sin fago 1 11 11 11 11 11 11 Concentración de inoculación de S enteritidis (ufcfml) 1 I 10 100 Resultado de la carta de colores LFI de C freundH Fago Sin fago Fago Sin fago Fago Sin fago 3 3 4 3 3 3 2 2 3 11 5 11 3 11 3 11 3 11 5 11 4 11 3 11 5 11 5 11 4 11 3 11 5 11 5 11 11 11 11 11 11 11

imagen1

Ejemplo 3

Utilización de bacteriófagos en medios de enriquecimiento microbiano como un medio para mejorar la productividad del 5 organismo diana y disminuir resultados de falsos negativos

Se cultivaron individualmente Citrobacter freundii y Salmonella enteritidis en caldo de soja tríptico (TSB) durante 18 horas a 3rC. Se determinaron los recuentos de células vivas para cada cultivo por técnicas convencionales de dilución con siembra en placas. Se formularon muestras de fago FF2-20-1 específico para C. freundii (Strategic Diagnostics Inc.) a 1 x 107 UFPfml en medio TSB. El cultivo de C. freundii se añadió a medios TSB con y sin el fago FF2-20-1 hasta 10 concentraciones finales de O, 1, 10, 100, 1.000, 10.000, Y 100.000 ufcfml. Cada tratamiento con C. freundii se inoculó junto con D, 1, 10, Y 100 ufc/ml de S. enteritidis. Todas las muestras se incubaron a 35"C durante 18 horas. Después de 18 horas de incubación, se evaluaron las muestras con un inmunoanálisis de flujo lateral (LFI) que detecta S.enteritidis y no reacciona de forma cruzada con C. freundii. Cuanto mayor sea el nivel de desarrollo de la señal (resultado de la carta de colores) en la LFI, mayor será la concentración de Salmonella . Además, se determinaron las concentraciones

15 de S. enteritidis por siembra en placas con diluciones en serie de todos los tratamientos en medio agar-agar selectivo ASAP (AES, Comborg, Francia).

Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 3 y demuestran que la adición de bacteriófagos especificas para C. freundii aumenta en gran medida la productividad de S. enteritidis en cultivos contaminados con e freundii después de 18 horas de incubación. Los cultivos de referencia no tratados con bacteriófago presentaban 20 reducción de proliferación de s . enteritidis debido a la presencia de c . freundii que contamina el cultivo. En algunos cultivos contaminados con C. freundii, la concentración de Salmonella con el fago fue de hasta 106 ufc/ml mientras que la concentración de Sa/monella en los cultivos correspondientes sin fago fue inferior a 103ufcfml. Dicha reducción drastica en la productividad de Salmonella en presencia de microorganismos competidores puede conducir a resultados

de falsos negativos en los ensayos de detección. La adición de fago al enriquecimiento puede mejorar la productividad de las bacterias diana y evitar resultados falsos negativos

Tabla 3

Concentración

Concentración de inoculación de S. enterftidis (ufc/ml>

de inoculación de C. freundii

O I 1 I 10 I 100

(ufcfml)

Resuffado de la carta de colores LFI de C. freundii

Fa

o Sin fa o Fa o Sin fa o Fa o Sin fa o Fa o Sin fa o

O

O

11 11 11 11 11 11

1

O O 11 11 11 11 11 11

10

O O 11 6 11 10 11 11

100

O O 11 1 11 5 11 10

1000

O O 11 2 11 5 11 9

10.000

O O O 1 11 3 11 6

100.000

O O 11 1 11 2 11 6

Concentración de inoculación de C. freundii (ufcfml)

Concentración de inoculación de S. enterftidis (ufclml)

O 1 I 10

100

Fa o <1E3

Concentración resultante de S. enteritidis (ufclml) Sin fa o Fa o Sin fa o Fa o Sin fa o Fa o <1E3 1 3E8 2 SE8 16E8 17E8 22ES Sin fa o 70E7

1 10 100 1000

<1E3 <1E3 <1E3 <1E3 <1E3 <1E3 <1E3 <1E3 70E7 21E8 S OE7 80E7 21E8 <1E3 <1E3 <1E3 10ES 80E7 21E8 1 1E8 70E7 30E7 S 2E6 a OES 1 OES 1 8ES 80ES 23ES 90E7 60E7 10E6 18E6

10.000 100.000

<1E3 <1E3 <1E3 <1E3 <1E3 2 1E8 <1E3 <1E3 32E8 3 5ES 10ES S OES 2 2ES 1 3ES 2 2E6 12E6

Ejemplo 4

5 Empleo de bacteriófagos para reducir el tiempo de enriquecimiento y aumentar la sensibilidad del procedimiento

Se cultivaron individualmente Citrobacter freundii (ATCC 9809) y Salmonella enleritidis en caldo de soja triptico (TSB)

durante 18 horas a 3rC. Los recuentos de células vivas para cada cultivo se determinaron por técn icas convenciona les

de dilución con siembra en placas. Muestras de fago FF2-20-1 especifico para C.freundii se formularon para 106 ufplml

en medio TSB. Se añadió cultivo de C. freundii a medio TSB con y sin el fago FF2-20-1 a una concentración final de 10 105 ufclml. Cada tratamiento de C. freundii se inoculó junto con O, 0,02, 0,1, 2,0 Y 10 ufcfml de S. enteritidis. Todas las

muestras se incubaron a 3SoC y se tomaron muestras periÓdicamente durante un periodo de 24 horas. En cada periodo

de muestreo, se analizó una submuestra de cada tratamiento por un inmunoanálisis de flujo lateral (LFI) que

detecta S. enteritidis y no reacciona de forma cruzada con C. freundii. Cuanto mayor sea el nivel de desarrollo de la

señal (resultado de la carta de colores), en el LFI, mayor será la concentración de S. enteritidis. Además, se determinó 15 la concentración de S. enteritidis en todos los tratamientos a las 24 horas por diluciones en serie con siembra en placas

en un medio de agar-agar selectivo indicador (BGS Media, Difco)

Tabla 4

Concentración t Concentración Resultado de la carta de colores

Concentración final in icial de fagos

inicial de LFI de Salmonella en el momento

de Salmonella (ufpfml)

Salmonella

Triplicado del muestreo

(ufcfml) (ufcfml)

I 3h

6h 9h

12 h

15hl24hl 24 h

<10~

O

1

·

· · · · ·

<1052 <105

3

·

· · · · ·

<10~

1

·

· · · · ·

<105 <1050,02 2

·

· · · · ·

3

·

· · · · ·

5

10

15

20

25

<10~

1

-

-

-

-

-

·

<105

0,1

2

-

-

-

-

-

-

.

<105

3

·

·

°

4x10 '

1

1

9

-

-

-

·

2

2

0,5

9

3x107

-

-

-

·

3

-

-

-

-

1

9

1x107

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1

0,5

2

11

-

-

·

10

2

-

-

-

0,5

2

11

9x107

3

-

-

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3

11

8x107

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1

-

-

-

-

-

-

<105

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-

-

-

-

-

-

.

.

<105

3

-

-

-

·

0,02

1 2 3 · -- . -- · -· 1 1 1 11 11 11 6 6 9 3,1x101:1 4,1x108 2,2x108

10'

0,1 1 2 3 --- --- --- 2 2 2 11 11 11 9 9 9 4,4x10'" 4,5x108 4,Ox108

2

1 2 3 --· --- 2 4 4 11 11 11 11 11 11 6 6 6 8,5x101:! 1,3x109 1,1x109

8,3x101:1

1 8

11 11

7

--

10 2

7

11 11

7

1,3x109

--

3

--

8

11 11

7

1,1x109

I t Todos los grupos de tratamiento contenían una concentración inicial de 10~ ufc/ml de C.freundii en el momento de la inoculación de S. enferitidis.

Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 4, más arriba, y demuestran que la presencia de bacleriófagos contra C.freundii en cultivos que contienen tanto C. freundii como concentraciones muy bajas de S. enteritidis producen una reducción significativa en la cantidad de tiempo de enriquecimiento requerido para detectar Salmonella. Del mismo modo, la presencia de fago de C. freundii dio como resultado una sensibilidad mejorada. Con fago, los cultivos de Salmonella que contienen las concentraciones de partida de 0,02 ufc/ml, se detectaron facilmente mientras que sin fago, la concentración más baja de Salmonella que se detectó fue de 2 ufcfml. Sin el fago, dos grupos de tratamiento, que contienen 0,02 y 0,1 ufcfml de S. enteritidis, nunca alcanzaron concentraciones detectables utilizando el LFI y por lo tanto son falsos negativos La adición del fago redujo el número de respuestas de falsos negativos utilizando el procedimiento de detección LFI

Ejemplo 5

Empleo de bacteriófagos para reducir los resultados de falsos positivos al detectar Salmonella en la carne de vacuno

Muestras de 25 gramos de carne de vacuno (35) se enriquecieron en 225 mi de medio RapidChek (Strategic Diagnostics Inc.) a 42"C durante 24 horas. Un conjunto adicional de 35 muestras de carne de vaca se enriquecieron en condiciones similares en medio RapidChek de Salmone/la enriquecido con una mezcla de cinco fagos dirigidos específicamente a E. coli y Citrobacter spp.

E. coli y Citrobacter son contaminantes microbiológicos frecuentes de la carne de vaca, están estructuralmente muy estrechamente relacionados con Salmonella, y con frecuencia reaccionan de forma cruzada con anticuerpos dirigidos contra antígenos de Salmonella empleados en inmunoanálisis para detectar Salmonella en los alimentos. Los cinco fagos utilizados en este ejemplo se seleccionaron específicamente para lisar E. coli y Citrobacter spp. que reaccionan de forma cruzada con anticuerpos de Salmonella

A las 24 horas, todas las muestras se analizaron utilizando un inmunoanálisis de flujo lateral (LFI) para la detección de Salmonella spp. Además, todas las muestras se sembraron en estrías para Brilliant Green Sulfa Agar (BGS) y Xylose Lysine Tergitol4 Agar (XL T4) para la detecci6n selectiva de Salmonella spp. y se incubaron durante 4B horas a 37°C

Trece de 35 muestras se describieron como LFI positivo del tratamiento sin fagos, ninguno de las cuales se confirmaron como positiva utilizando metodología de cultivo (placas XLT4 Y BGS). No se describieron resultados positivos de LFI de las muestras enriquecidas utilizando el medio RapidChek enriquecido con fagos ni fueron ninguna de estas muestras positivas utilizando procedimientos de cultivo. Por lo tanto, hubo 13 de 35 resultados falsos positivos sin el fago y ninguno con el fago

Ejemplo 6

Mej ora de especificidad de los análisis bioquímicos para /a detección de coliformes en e/ agua

Los coliformes son una clase general de bacterias que habitan en el intestino del hombre y de otros animales y utilizan la enzima beta-D-galactosidasa para fermentar el azúcar lactosa. Aunque algunos coliformes se encuentran en el intestino del hombre, la mayoria se encuentra en todo el entomo y tienen poca importancia sanitaria (Greenberg, A.E. y Hunt, DA (Eds.) 1985 LABORATORY PROCEDURES FOR THE EXAMINATION OF SEAWATER AND SHELLFISH, 53 ed. The American Public Health Association, Washington, DC). Los coliformes fecales son miembros del grupo coliforme lotal de bacterias. Se caracterizan por su capacidad de fermentar la lactosa a 112,1"F (44,5"C) Y se consideran indicadores de contaminación fecal más especificas que son los coliformes que fermentan la lactosa sólo a 95"F. (35"C). E. coli y algunas cepas de Klebsiella pneumoniae son las principales coliformes fecales (THE ORINKING WATER DICTIONARY, Copyright © 2000, American Water Wor1<s Association)

Numerosos productos comerciales están disponibles para la detección de coliformes que dependen de la enzima beta-D-galactosidasa para convertir un sustrato incoloro en una molécula coloreada o fluorescente, o provocar otras reacciones bioquímicas tales como la formación de gas, y de ese modo indicar la presencia de coliformes en una muestra de agua. Ejemplos de dichos productos son Colilert® de IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME.; Colitag™, CPI International, Santa Rosa, CA; m-CoIiBlue24® de Hach Company, Loveland, CO.; CoIiGeI™, E*Colite™ y PathoGel™ de Chann Sciences, Inc. Malden, MA.; Colifast®, Oslo, Noruega; ColiTrak®, BioControl Systems, Inc., Bellevue, WA.; y otros.

Una limitación de estas técnicas es que otras bacterias aparte de las coliformes expresan beta-D-galactosidasa y provocan resultados de falsos positivos. Por ejemplo, la Guia de Resolución de Problemas para el producto mColiBlue24 de Hach Company afirma que la cantidad de falsos positivos de la prueba de coliformes totales es del 26,8%, debido a la presencia en las muestras de agua de las bacterias positivas a beta-D-galactosidasa conocidas que no son coliformes. Del mismo modo, numerosas bacterias marinas provocan resultados de falsos positivos en dichos análisis, como por ejemplo Vibrio SPP., y por lo tanto su uso para pruebas de calidad del agua marina es limitado (J.M. Pisciotta, et a/., 2002. Applied and Environmental Microbi%gy, 68(2), págs. 539-544)

Los bacteriófagos, como se describe en la presente memoria, reactivan a bacterias que se sabe provocan resultados falsos positivos en dichos análisis bioquímicos, pueden incorporarse al análisis para evitar o reducir la proliferación de dichas bacterias y de este modo reducir las reacciones de falsos positivos. Muchos de dichos análisis son conocidos por los expertos en la técnica, como por ejemplo, pero sin limitarse a, analisis de agua tales como EnterolerFM, IDEXX Laboratories, Inc., y medios microbiológicos, inclusive medios cromógenos, tales como los contenidos en el DIFCO MANUAL (11 a edición, 1998, Difco Laboratories, División de Becton Dickinson and Campan y, Sparks, MD.), todos los cuales se incluyen por referencia en el presente documento. Dichos análisis bioquímicos se pueden utilizar para la recuento, caracterización, identificación, clasificación o el aislamiento de microorganismos en cualquier campo de operación, como por ejemplo pero sin limitarse a pruebas en alimentos, agua y aire, diagnósticos médicos, diagnósticos veterinarios, ensayos agrícolas y medioambientales, procesos industriales, comerciales y farmacéuticos, la calidad del producto y similares.

Ejemplo 7

Mejora de especificidad de un método analítico para coliformes fecales en muestras de agua por bacteriófagos

Un cultivo de bacterias coliformes no fecales Klebsiella oxytoca (Strategic Diagnostics Inc.) se sembró en estrías en una placa con TSA (Difco) y se incubó durante la noche a 37"C. Una sola cepa de las colonias se transfirió a 10 mi de TSB (Difco) y se incubó durante la noche a 37"C. Se prepararon diluciones en serie de diez veces del cultivo TSB de

K. oxytoca en agua con peptona (Oifco). El bacteriófago Kss3.2-5 (Strategic Oiagnostics Inc.) infecta a K. oxytoca provocando lisis bacteriana. Se prepararon 50 mi de solución de fago Kss3.2-5 a una concentración de 107ufp/ml en agua destilada estéril. Tubos Colilert para la detección de coliformes en agua se adquirieron en IDEXX Laboratories. Cinco tubos Colilert se redisolvieron con 10 mi de la solución de fago y cinco tubos Colilert se redisolvieron con 10 mi de agua destilada estéril. Todos los tubos se mezclaron hasta que se disolvió el reactivo en polvo. Un mi de las diluciones bacterianas 10.5, 10-6, 10.7 Y 10-3 se mezclaron en cada uno de los tubos Colilert con y sin fago. Un mi de agua con peptona se añadió a dos tubos y sirvió como referencias negativas. Todos los tubos se incubaron a 37"C durante 18 horas según las especificaciones del fabricante

K. oxytoca produjo resultados positivos claros en el ensayo Colilert lo que indica la presencia de una coliforme, sin embargo, K. Oxytoca no es una coliforme fecal y por lo tanto los resultados no son suficientes para indicar la presencia de contaminación fecal y bacterias potencialmente patógenas en la muestra. En presencia de fago, todas las diluciones ensayadas de este cultivo de bacterias produjeron resultados negativos mejorando la especificidad de la prueba para coliformes fecales

Fago

Dilución de Klebsiella oxytoca

10'

10 10' 10 ninguna

Sin

+++ +++ +++ +++ -

Con

- - - - -

Ejemplo 8

Reducción en respuestas de falsos positivos en un método analítico para coliformes totales en muestras de agua por bacteriófagos

5 Aeromonas veronii(American Type Culture Collection, ATCC 51106), una bacteria no coliforme, se cultivó durante 6 horas a 30°C en TSB en una sola cepa de colonias. El cultivo TSB se diluyó por un factor de diez en agua con peptona Se rehidrataron cuatro tubos Colilert (IDEXX Laboratories) con agua desionizada estéril. Un mi de cultivo diluido de A veronii se inoculó en tubos Colilert por duplicado. Dos tubos más se inocularon con 1 mi de agua con peptona como referencias negativas. Uno de los tubos con A veranii y uno de los tubos con referencia negativa recibieron

10 107 ufp/ml (concentración final) del fago 15-11 de Aeramonas (Strategic Diagnostics Inc.) en medio TSB. La otra serie recibió el mismo volumen de medio TSB sin fago. Los tubos se incubaron durante la noche a 37"C según las especificaciones del fabricante. Después de la incubación, el tubo con A varonii sin el fago se había vuelto de color amarillo bril1ante, indicando falsamente la presencia de una coliforme. El tubo con A. veranii sin el fago pennaneció incoloro indicando una respuesta negativa. Por lo tanto, la presencia del bacteriófago eliminó la respuesta de falso

15 positivo producida por el A. veranii en el análisis.

Ejemplo 9

Nuevas composiciones de bacteriófagos y procedimientos de recuento de bacterias diana

En este ejemplo se vislumbra que un medio de agar-agar utilizado para la detección y recuento de bacterias colifonnes podría hacerse más específico para la detección y recuento de colifonnes fecales, reduciendo al mínimo la proliferación

20 de coliformes no fecales utilizando fagos específicos incorporados en el medio sólido o semisólido.

Se preparó MI Agar (Difco) utilizado para la detección de bacterias coliformes rehidratando el medio como indica el fabricante, se hirvió durante un minuto y se enfrió a 50"C. Se añadió a continuación fago kss3.2-5 de Klebsiella (Strategic Oiagnostics Inc.) a la mitad del medio de agar-agar fundido a una concentración final de 2,6 x 108 un idades formadoras de placa por mi (ufp/ml). Alícuotas de cinco mi de MI Agar fundido con y sin fago se superpusieron a 25 continuación en placas que contenian agar-agar triplicasa soja (TSA) y se enfriaron a temperatura ambiente. La cepa 1055-1 de Klebsiella oxytoea , coliforme no fecal, se cultivó en caldo de tripticasa soja (TSB) durante 18 horas a 37"C. Se prepararon diluciones en serie de diez veces de cultivo de K. oxytoca en agua con peptona y las diluciones 10-3 y 10· 9 se aplicaron a la superficie de ambos tratamientos con MI Agar solidificado y se incubaron a 37"C durante 18 h. Se contaron las colonias bacterianas bajo la fuente de luz UV para discernir las coliformes según las instrucciones del

30 fabricante. Los datos demuestran que la incorporación del fago en el medio de agar-agar solidificado provoca una reducción en el número de bacterias no coliformes

Dilución de K. Oxytoca aplicada a la placa

Número de colonias

MI Agar

MI Agar wlfago

10·

66 O

10·\1

11 O

Ejemplo 10

Nuevas composiciones de bacteri6fagos y procedimientos de recuento de coliformes fecales

En este ejemplo se demuestra el empleo de fagos para aumentar la especificidad de un procedimiento desde un procedimiento general de recuento de colifonnes hasta un procedimiento de recuento de coliformes fecales. La cepa 5 4157 de E. coli, coliforme fecal, se cultivó en caldo de tripticasa soja (TSB) a 3r C durante 18 horas y se diluyó en serie en sstf (PBS) (Sigma). Además, la cepa 1055-1 de Klebsiella oxytoca, coliforme no fecal, se cultivó en agar-agar con tripticasa y soja (TSA) a 3T'C durante 18 horas y se diluyó en serie en PBS. Se rehidrataron con agua potable estéril treinta tubos Cotilert para la detección de bacterias colifonnes (IDEXX Laboratories). Se añadieron cien micro litros (1 00 !JI) de una dilución 10. 8 del cultivo de E. coli a cada uno de los 30 tubos. Además, se añadieron 100 !JI de la dilución 10.8 10 de Klebsiella a cada uno de los 20 tubos. Por último, se añadieron 100 !JI de fago kss3.2 -5 de Klebsiella (Strategic Diagnostics Inc.) diluido en PBS hasta una concentración final de 108 un idades formadoras de placas por mi a 10 de los tubos que contenían tanto E. colicomo K Oxytoca. Todos los tubos se taparon, se mezclaron y se incubaron a 3rC durante 18 horas. Después de 18 horas en los tubos se evaluó la presencia de color amarillo que indica la presencia de bacterias coliformes. el número de tubos positivos se utilizó para calcular el número más probable (NMP) de bacterias 15 (Blodgell, R. 1998; actualización de enero de 2001, Apéndice 2; Most Probably Numbers from Serial Dilutions. En: US FOOD, DRUG AND ADMINISTRATION, CENTER FOR FOOD SAFETY AND APPLlED NUTRITION, BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL. Edición 8, Revisión A/1998), utilizando las tablas suministradas en la Guia del Usuario del producto de Coilert. La composición de los medios que contienen bacteriófago dio lugar a un nuevo procedimiento con mejor especificidad para la recuento de coliformes fecales. La adición del fago eliminó eficazmente

20 los coliformes no fecales K oxytoca del análisis lo que permite el recuento de sólo los coliformes fecales, E. coli.

Tratamiento

nO de total de tubos nO de tubos positivos Indice NMPf100 mi

E. coli

10 3 3,6

E. coli + K. oxytoca E. cofi + K. oxytoca + Fago kss3 .2-5

10 10 10 3 > 23,0 3,6

Aunque en la práctica o pruebas de la presente invención pueden emplearse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, los procedimientos y materiales adecuados se han descrito anterionnente Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo a titulo ilustrativo y no pretenden ser limitativos.

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES

   Un método para detectar un microorganismo diana en una muestra que contiene bacterias no elegidas como diana que comprende·

   formar una mezcla de reacción combinando la muestra con un medio nutritivo y una composición de bacteriófagos que comprende bacteriófagos especificos para las bacterias no elegidas como diana en la muestra, en donde las bacterias no elegidas como diana compiten con el microorganismo diana por los nutrientes en los medios, y en donde el bacleriófago lisa las baclerias no elegidas como diana en la muestra sin lisar el microorganismo diana, reduciendo de este modo la aparición de un resultado de la detección de falso negativo mediante la inhibición de la proliferación de bacterias no elegidas como diana a la vez que permitiendo al microorganismo diana proliferar en el medio, y

   detectar el microorganismo diana.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1 que comprende además la incubación de la mezcla de reacción durante el tiempo suficiente para permitir la lisis de las bacterias no elegidas como diana en la muestra y una proliferación en el número de bacterias diana a concentraciones detectables

3. 3.

   El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacteriófagos comprende dos o más bacteriófagos especificos para diferentes bacterias no elegidas como diana.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1 en donde el microorganismo diana es una bacteria.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacleriófagos comprende un bacteriófago que lisa bacterias gram negativas.

6. 6.

   El método de la reivindicación 1 en donde el microorganismo diana es Salmonella y la composición de bacteriófagos comprende un bacteri6fago especifico para la lisis de E. coli o Citrobacter.

7. 7.

   El método de la reivindicación 1 en donde el microorganismo diana es Salmonella y la composición de bacteriófagos comprende un primer bacteriófago especifico para la lisis de E. coli y un segundo bacteriófago específico para la lisis de Citrobacter.

   8 El método de la reivindicación 1 en donde la mezcla de reacción comprende además un antibiótico

8. 9.

   El método de la reivindicación 8 en donde el antibiótico inhibe la proliferación de bacterias gram positivas.

9. 10.

   El método de la reivindicación 1 en donde el microorganismo diana se detecta utilizando un producto químico, una enzima, una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo

10. 11.

    El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacteriófagos reduce la proliferación de bacterias no elegidas como diana que reaccionan de forma cruzada con un reactivo de detección utilizado para detectar el microorganismo diana, reduciendo de este modo la aparición de un resultado de la detección falso positivo

11. 12.

    El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacteriófagos aumenta la sensibilidad de detección.

    13 El método de la reivindicación 1 en donde la composición de bacteriófagos inhibe la proliferación de

    microorganismos competidores acortando de ese modo el tiempo necesario para permitir una proliferación en el número

    de bacterias diana a concentraciones detectables
12. 14. Un método para enriquecer un microorganismo diana en una muestra que contiene bacterias no elegidas como diana que comprende·

    formar una mezcla de incubación combinando la muestra con una composición de bacteriófagos que comprende bacteriófagos especificos para las bacterias no elegidas como diana en la muestra, e

    incubar la mezcla de incubación,

    en donde el bacteriófago lisa las bacterias no elegidas como diana en la muestra, dejando viable el microorganismo diana.
13. 15. El método de la reivindicación 14, en donde la mezcla de incubación comprende además un antibiótico.

    45 16. El método de la reivindicación 14, en donde la muestra es una muestra industrial, biológica, alimentaria, farmacéutica, comercial o de fermentación.
14. 17. El método de la reivindicación 14, en donde la composición de bacteriófagos mejora el rendimiento del microorganismo diana

    18 El método de la reivindicación 14, en donde la muestra es un reac10r microbiológico para la producción de un producto biológico.

15. 19.

    El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra industrial, biológica, alimentaria, farmacéutica, comercial o de fermentación

16. 20.

    El método de la reivindicación 1, en donde la composición de bac1eriófagos mejora el rendimiento del microorganismo diana.

17. 21 . El método de la reivindicación 1, donde la composición de bacteriófagos es un liquido o está en un sustrato sólido o semisólido
18. 22. Un método para detectar un microorganismo diana en una muestra que contiene bacterias no elegidas como diana que comprende:

    formar una mezcla de reacción combinando la muestra con una composición de bacteriófagos que comprende bac1eriófagos específicos para las bacterias no elegidas como diana en la muestra, en donde las bacterias no elegidas como diana en la muestra reaccionan de forma cruzada con un reactivo de detección utilizado para detectar el microorganismo diana, y en donde el bacleriófago lisa las bacterias no elegidas como diana sin lisar el microorganismo diana, reduciendo de este modo la aparición de un resultado de detección de falsos positivos, y detectar el microorganismo diana.

19. 23.

    El método de la reivindicación 22, que comprende además la incubación de la mezcla de reacción durante un tiempo suficiente para permitir la lisis de las bacterias no elegidas como diana en la muestra y una proliferación en el número de bacterias diana a concentraciones detectables

20. 24.

    El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos comprende dos o más bacteriófagos especificos para diferentes bacterias no elegidas como diana.

21. 25.

    El método de la reivindicación 22, en donde el microorganismo diana es una bacteria

22. 26.

    El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos comprende un bacteriófago que lisa bacterias gram negativas.

23. 27.

    El método de la reivindicación 22, en donde el microorganismo diana es Salmonella y la composición de bacteriófagos comprende un bacteriófago especifico para la lisis de E. coli o Citrobacler.

24. 28.

    El método de la reivindicación 22, en donde el microorganismo diana es Salmonella y la composición de bacteriófagos comprende un primer bac1eriófago específico para la lisis de E. coli y un segundo bac1eriófago específico para la lisis de Citrobacter.

25. 29.

    El método de la reivindicación 22, en donde la mezcla de reacción comprende además un antibiótico.

    30 El método de la reivindicación 29, en donde el antibiótico inhibe el crecimiento de bac1erias gram positivas

    31 El método de la reivindicación 22, en donde el microorganismo diana se detecta usando un producto quimico, enzima, molécula de ácido nucleico o anticuerpo

26. 32.

    El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos aumenta la sensibilidad de detección

27. 33.

    El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bac1eriófagos inhibe el crecimiento de microorganismos competidores acortando de ese modo elliempo necesario para permitir una proliferación del número de bacterias diana a concentraciones detectables

28. 34.

    El método de la reivindicación 22, en donde la muestra es una muestra industrial, biológica, alimentaria, farmacéutica, comercial o de fermentación.

29. 35.

    El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos mejora el rendimiento del microorganismo diana

30. 36.

    El método de la reivindicación 22, en donde la composición de bacteriófagos es un líquido o está en un sustrato sólido o semisólido.