PL236550B1 - Sposób wytwarzania biosensora kolorymetrycznego do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli i biosensor kolorymetryczny do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest Sposób wytwarzania biosensora kolorymetrycznego do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli i biosensor kolorymetryczny do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli. Biosensor służy do szybkiej detekcji komórek bakteryjnych w zbiornikach wodnych, jak i w procesach technologicznych, w których bakterie Escherichia coli często mogą stanowią źródło zanieczyszczenia.

Znany jest z opisu patentowego PL 222994 sposób wytwarzania preparatu diagnostycznego do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli, który polega na tym, że w pierwszym etapie otrzymuje się koloidalne złoto w procesie redukcji chlorku złota III w ilości 5-20 mg w obecności 5 mL 1% cytrynianu trisodowego, po czym w drugim etapie do otrzymanego roztworu koloidalnego złota o objętości 590 μl lub jej krotności zawierającej złoto w ilości 20-80 μg dodaje się przeciwciało specyficzne względem komórek bakteryjnych Escherichia coli w ilości 1-1,5 μg, a następnie dodaje się analizowaną próbkę, po czym dodaje się czynnik wywołujący reakcję barwną.

Z opisu patentowego US 2009/0123939 znane są wzbogacone biologicznie elek tro-aktywne nanocząstki magnetyczne do koncentracji, separacji i wykrywania bakterii utworzone z przewodzącego polimeru (na przykład przewodzących polianilin, polipiroli, politiofenów) związanych z nanocząstkami magnetycznymi (na przykład tlenkami metali magnetycznych Fe²⁺ i/lub Fe³⁺). Kompozycję w postaci cząstek można utworzyć w biologicznie zwiększonej, elektroaktywnej magnetycznej nanocząsteczkowej kompozycji (BEAM), zawierając ponadto wiążący element pary (np. przeciwciało) związany z przewodzącym polimerem kompozycji cząstek stałych. Ujawniono również sposoby i zestawy zawierające kompozycję w postaci cząstek oraz kompozycję nanocząsteczkową BEAM.

Bakteriofagi (fagi) to wirusy atakujące bakterie. Charakteryzują się one dużą specyficznością względem infekowanego gospodarza. Rozpoznają one swoiste receptory na powierzchni komórki bakteryjnej, przyłączają się do nich i poprzez wstrzyknięcie swojego materiału genetycznego, infekują bakterię. [Chen J. i wsp., Detection of Escherichia coli in Drinking Water Using T7 Bacteriophage-Conjugated Magnetic Probe. Analitical Chemistry 2015; 87:8977-8984].

Zdolność bakteriofagów do selektywnego wiązania bakterii oraz pojedynczych peptydów i białek wskazuje na ich duży potencjał w wytwarzaniu wysoce czułych biosensorów [Anany H. i wsp. Biocontrol of Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157:H7 in Meat by Using Phages Immobilized on Modified Cellulose Membranes. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(18):6379]. Ponadto, zastosowanie fagów jest bezpieczne zarówno dla zwierząt, jak i człowieka [Van Dorst B. i wsp., Recent advances in recognition elements of food and environmental biosensors: A review. Biosensors and Bioelectronics 2010, 26:1178-1194]. Wirusy te wykazują wysoką stabilność podczas przechowywania oraz są odporne na zmienne warunki środowiskowe, np.: kwaśne i zasadowe pH, temperaturę oraz obecność m.in. rozpuszczalników czy detergentów. Jednak główną ich zaletą w porównaniu z równie specyficznymi przeciwciałami, jest o wiele niższy koszt produkcji [Arya S. K., i wsp., Chemically immobilized T4-bacteriophage for specific Escherichia coli detection using surface plasmon resonance. Analyst 2010, 136:486-492].

Sposób wytwarzania biosensora kolorymetrycznego do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że przeprowadzając, znanymi metodami, precypitację soli żelaza w środowisku alkalicznym otrzymuje się ferrofluid modyfikowany polietylenoiminą stanowiący matrycę biosensora, którą płucze się co najmniej trzy razy wodą dejonizowaną stabilizując pH na poziome równym 7, po czym dodaje się bakteriofagi T4 w ilości 10⁹ na 1 mg matrycy i inkubuje się co najmniej 12 godzin w temperaturze od 5-10°C z wytrząsaniem. Następnie magnetycznie odseparowuje się cząstki ferromagnetyczne niosące bakteriofaga T4, usuwa supernatant, płucze co najmniej pięciokrotnie buforem SM i dodaje się roztwór nasycony albuminy bydlęcej BSA w ilości 1 mg albuminy na 1 mL cząstek ferromagnetycznych z bakteriofagami T4 i tak otrzymany biosensor inkubuje się co najmniej 5 godzin w temperaturze pokojowej i płucze się buforem SM co najmniej 3 razy. Biosensor w ilości co najmniej 100 mg umieszcza się w przeźroczystym naczyniu szklanym, w buforze o składzie: czerwień fenolowa 0,5 mM, laktoza 100 mM.

Zestaw do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że składa się z biosensora kolorymetrycznego w postaci matrycy z ferrofluidu modyfikowanego polietylenoiminą z zimmobilizowanymi na niej bakteriofagami T4 w ilości 109 wirionów/100 mg matrycy, który to biosensor umieszczony jest w przeźroczystym naczyniu szklanym, w buforze, o składzie: czerwień fenolowa 0,5 mM, laktoza 100 mM oraz z magnesu kołowego umożliwiającego odseparowanie złoża

PL 236 550 B1 w trakcie procedury detekcji. Ilość biosensora w naczyniu szklanym wynosi co najmniej 100 mg, zaś ilość buforu co najmniej 0,5 mL. Zestaw może zawierać dodatkowo drugie naczynie szklane, w którym znajduje się próba negatywna. Skażenie wody bada się wówczas spektrofotometrycznie porównując badaną próbkę do próbki kontrolnej, mierząc absorbancję przy długości fali wynoszącej 438 nm i porównując z absorbancją próbki negatywnej.

Zaletą rozwiązania według wynalazku jest duża efektywność w detekcji E. coli w wodzie pitnej, wodociągowej, z wszelkiego rodzaju naturalnych akwenów wodnych z progiem detekcji na poziomie 100 komórek na litr. Proces unieruchomienia bakteriofaga na nośniku, zapobiega dyfuzji wirionów do środowiska reakcji, co uniemożliwia uruchomienie w komórkach bakteryjnych systemu oporności. Ponadto, system fagów związanych z matrycą, charakteryzuje się wyższą wytrzymałością mechaniczną, a co za tym idzie stabilnością całego układu niż systemy zastosowanie niezwiązanych wirionów. Dzięki temu procesy z jego udziałem są powtarzalne a wyniki wiarygodne. Podstawową zasadą wydajnej pracy unieruchomionego systemu jest efektywne wychwytywanie bakterii przez fagi, dzięki poprawnie wykonanej, zorientowanej immobilizacji wirusów na powierzchni nośnika. W tym celu wykorzystano różnicę w ładunku między białkami strukturalnymi faga, a tymi znajdującymi się na powierzchni nośnika. Ujemnie naładowana główka bakteriofaga, wiąże się z dodatnio naładowanymi grupami funkcyjnymi na powierzchni nośnika. W ten sposób dodatnio naładowany ogonek faga, wystawiony do środowiska / medium, efektywnie wychwytuje bakterie. Związanie faga z nośnikiem opartym o ferromagnetyk umożliwia szybką separację całego układu z płynu przy pomocy magnesu. Dzięki temu możliwe jest łatwe i szybkie odseparowanie immobilizowanego systemu ze środowiska reakcji oraz możliwość jego ponownego użycia.

Rozwiązanie według wynalazku przedstawione jest w przykładzie wykonania i na rysunku, który przedstawia zestaw do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli z dodatkowym naczyniem zawierającym próbkę kontrolną.

P r z y k ł a d 1

W celu otrzymania matrycy biosensora - ferrofluidu modyfikowanego polietylenoiminą (PEI) (stałych cząsteczek ferromagnetyczne zawieszone w cieczy) - przeprowadzono precypitację soli żelaza w środowisku alkalicznym. 0,87 g chlorku żelaza (II) (FeCb) i 2,34 g chlorku żelaza (III) (FeCh) rozpuszczono w 100 mL odgazowanej przy użyciu N2 wody dejonizowanej. Tak przygotowaną mieszaninę, mieszano z wykorzystaniem mieszadła mechanicznego (150 obr/min) przez 30 minut w temperaturze 80°C. Następnie dodano 25 mL (25%) wody amoniakalnej i 0,76 mg cytrynianu sodu mieszając kolejne 30 minut w tej samej temperaturze. Do tak przygotowanej mieszaniny dodano 50 mL wodnego roztworu zawierającego 5 mL polietylenoiminy, całość mieszano przez kolejne 90 minut w niezmienionych warunkach. Po tym czasie, przy pomocy magnesu oddzielono od płynu, ferromagnetyczne cząsteczki modyfikowane PEI i przepłukiwano je wodą dejonizowaną aż do momentu ustabilizowania się pH na poziomie pH = 7,0. Tak przygotowaną matrycę (PCP) suszono w temperaturze 90°C, a następnie przechowywano w wodzie dejonizowanej w temperaturze 4°C. Skład chemiczny przygotowanej matrycy sprawdzano wykorzystując spektroskopię fourierowską w podczerwieni (FTIR). Komponent biologiczny biosensora stanowił bakteriofag T4 dzikiego typu. Wiriony były namnażane w płynnej hodowli Escherichia coli, poprzez infekcję komórek o gęstości optycznej równej 0,5 przy wielokrotności infekcji 0,1. Hodowlę prowadzono do uzyskania kompletnej lizy. Następnie wiriony były zagęszczane metodą precypitacji z PEG8000. Wiriony zostały zimmobilizowane na matrycy w następujący sposób. Matryca była płukana pięciokrotnie wodą dejonizowaną. Następnie 10 mL zawiesiny bakteriofaga T4 zostało dodane do 5 mL matrycy o koncentracji 15 mg x mL^-1 i inkubowane przez noc w temperaturze 10°C z wytrząsaniem. Cząstki ferromagnetyczne niosące bakteriofaga T4 zostały odseparowane magnetycznie. W następnym kroku, supernatant został usunięty, a liczba fagów zimmobilizowanych została zweryfikowana poprzez pomiar miana wolnych wirionów w supernatancie. Matryca z zimmobilizowanymi bakteriofagami T4 została pięciokrotnie przepłukana buforem SM (10 mM TRIS, 10 mM Mg²⁺, 0,1% żelatyny). Do matrycy z immobilizowanymi bakteriofagami T4 dodano roztwór nasycony albuminy bydlęcej (BSA) w celu zablokowania nośnika. Tak przygotowane biosensor inkubowano przez 5 godzin w temperaturze pokojowej, po czym pięciokrotnie płukanie buforem SM. Biosensor do wykorzystania w procesie detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli należy przechowywać w temperaturze 4°C.

Proces detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli przeprowadzono za pomocą zestawu składającego się z probówki 3 o objętości 1,5 mL, w której umieszczono 100 mg biosensora 1 zawierającego 109 wirionów bakteriofagów T4 w 1 mL buforu 2 o składzie: czerwień fenolowa 0,5 mM, laktoza 100 mM oraz magnesu kołowego 4, który umożliwia odseparowanie biosensora 1 w trakcie przeprowadzenia

PL 236 550 B1 procedury badania wody. Do probówki 3 zawierającej biosensor 1 dodano 1 mL badanej wody. Zawiesina uzyskała kolor czerwony. Zawartość probówki 3 dokładnie wymieszano i umieszczono w magnesie kołowym 4 w celu odseparowania biosensora

Próbkę inkubowano w temperaturze 15-37°C przez 30 minut. Zmiana barwy na żółtą oznaczała skażenie wody bakteriami Escherichia coli.

P r z y k ł a d 2

Przygotowano biosensor 1 jak w przykładzie pierwszym. Dodatkowo przygotowano probówkę kontrolną 3a z próbą negatywną. W tym celu w probówce 3a o objętości 1,5 mL umieszczono 100 mg biosensora 1 zawierającego 10⁹ wirionów bakteriofagów T4 w 1 mL buforu 2 o składzie: czerwień fenolowa 0,5 mM, laktoza 100 mM, do której dodano 1 mL wody jałowej. Zawiesina uzyskała kolor czerwony. W probówce 3 o objętości 1,5 mL umieszczono 100 mg biosensora 1 zawierającego 10⁹ wirionów bakteriofagów T4 w lmL buforu 2 o składzie: czerwień fenolowa 0,5 mM, laktoza 100 mM, do której dodano 1 mL badanej wody. Skażenie wody sprawdzono spektrofotometrycznie porównując badaną próbkę do próbki kontrolnej. Zmierzono absorbancję przy długości fali wynoszącej 438 nm i porównano z absorbancją próbki negatywnej. Spektrofotometr umożliwia osiągnięcie maksymalnej czułości biosensora do poziomu detekcji 100 komórek na litr badanej wody.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania biosensora kolorymetrycznego do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli, znamienny tym, że przeprowadzając, znanymi metodami, precypitację soli żelaza w środowisku alkalicznym otrzymuje się ferrofluid modyfikowany polietylenoiminą stanowiący matrycę biosensora, którą płucze się co najmniej trzy razy wodą dejonizowaną stabilizując pH na poziome równym 7, po czym dodaje się bakteriofagi T4 w ilości 10⁹ na 1 mg matrycy i inkubuje się co najmniej 12 godzin w temperaturze od 5-10°C z wytrząsaniem, następnie magnetycznie odseparowuje się cząstki ferromagnetyczne niosące bakteriofaga T4, usuwa supernatant, płucze co najmniej pięciokrotnie buforem SM i dodaje się roztwór nasycony albuminy bydlęcej BSA w ilości 1 mg albuminy na 1 mL cząstek ferromagnetycznych z bakteriofagami T4 i tak otrzymany biosensor (1) inkubuje się co najmniej 5 godzin w temperaturze pokojowej i płucze się buforem SM, co najmniej 3 razy, następnie biosensor (1) w ilości co najmniej 100 mg umieszcza się w przeźroczystym naczyniu szklanym (3), w buforze (2) o składzie: czerwień fenolowa 0,5 mM, laktoza 100 mM.
2. 2. Zestaw do detekcji bakterii z gatunku Escherichia coli, znamienny tym, że składa się z biosensora (1) kolorometrycznego w postaci matrycy z ferrofluidu modyfikowanego polietylenoiminą z zimmobilizowanymi na niej bakteriofagami T4 w ilości 10⁹ wirionów/100 mg matrycy, który to biosensor (1) umieszczony jest w przeźroczystym naczyniu szklanym (3), w buforze (2), o składzie: czerwień fenolowa 0,5 mM, laktoza 100 mM oraz z magnesu kołowego (4) umożliwiającego odseparowanie złoża w trakcie procedury detekcji, przy czym ilość biosensora (1) w naczyniu szklanym (3) wynosi co najmniej 100 mg, zaś ilość buforu (2) wynosi co najmniej 0,5 mL.
3. 3. Zestaw według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera dodatkowo drugie naczynie szklane (3a), w którym znajduje się próba negatywna.