JP2018054624A - バイオアッセイのシグナル増幅のための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料中に存在する低レベルの対象の分析物を検出する手段として、固体支持体にカップリングしている生体分子の高い特異性を利用し、結合剤と対象の分析物との相互作用によって生成されたシグナルをさらに増幅する。同定されるタンパク質が直接または捕捉抗体を通して不動態化した表面に結合している免疫化学(例えば、ELISAもしくはRIA)または免疫蛍光アッセイについて、約10,000倍の増幅を達成することができる。
【選択図】図1
Description
本発明は、バイオアッセイのシグナル増幅のための方法およびシステムに関する。
免疫アッセイは、研究および診断アッセイ両方のために重要なツールである。このように、このようなアッセイの感度を改善することが求められている。
本発明の実施形態は、対象の分析物の検出のための増幅方法、およびこのようなアッセイを行うためのキットを含む。本発明は、種々の方法で具体化し得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
シグナル増幅のための方法であって、
対象の分析物に、該対象の分析物を認識し、それに結合する複数の結合剤の分子を含む固体支持体を含む検出支持体を添加する工程と;
該検出支持体上の該複数の結合剤分子の少なくともいくつかを検出する工程と
を含む、方法。
(項目2)
前記検出支持体が、ビーズである、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記検出支持体が、検出可能な部分の複数の分子を含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
捕捉支持体を添加する工程をさらに含み、該捕捉支持体が、該捕捉支持体上の前記対象の分析物を固定化するために、該対象の分析物を認識し、それに結合する少なくとも1種の捕捉支持体結合剤を含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記対象の分析物が、前記検出支持体と相互作用する前に、前記捕捉支持体に結合する、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記対象の分析物が、前記検出支持体と相互作用した後に、前記捕捉支持体に結合する、項目4に記載の方法。
(項目7)
前記検出支持体上の前記複数の結合剤分子の少なくともいくつかを特異的に認識し、それに結合することができる結合剤を添加する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記検出支持体上の前記複数の結合剤分子の少なくともいくつかを特異的に認識し、それに結合することができる前記結合剤が、検出可能な部分を含む、項目7に記載の方法。(項目9)
前記捕捉支持体が、ビーズである、項目4に記載の方法。
(項目10)
前記捕捉支持体に結合している前記結合剤が、前記対象の分析物を認識し、それに結合することができる抗体または抗体断片である、項目4に記載の方法。
(項目11)
前記検出支持体に結合している前記複数の前記結合剤の分子が、前記対象の分析物を認識し、それに結合する抗体または抗体断片である、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記検出支持体上の前記複数の結合剤分子の少なくともいくつかを特異的に認識し、それに結合することができる前記結合剤が、抗体または抗体断片である、項目7に記載の方法。
(項目13)
前記検出支持体上の前記複数の結合剤分子の少なくともいくつかを特異的に認識し、それに結合することができる前記結合剤が、前記対象の分析物を捕捉固体支持体に結合するために使用される捕捉結合剤を認識しない、項目7に記載の方法。
(項目14)
前記検出支持体上の前記複数の結合剤分子の少なくともいくつかを特異的に認識し、それに結合することができる前記結合剤が、可溶性結合剤を含む、項目7に記載の方法。
(項目15)
前記検出支持体が、前記対象の分析物に対して特異的な10,000個超の結合剤分子を含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記検出支持体が、前記対象の分析物に対して特異的な100,000個超の結合剤分子を含む、項目1に記載の方法。
(項目17)
対象の分析物をアッセイするためのキットであって、検出支持体を含み、該検出支持体が、該対象の分析物を認識し、それに結合することができる複数の結合剤の分子を含む固体支持体を含む、キット。
(項目18)
捕捉支持体をさらに含み、該捕捉支持体が、前記対象の分析物を認識し、それに結合する少なくとも1種の捕捉支持体結合剤を含む、項目17に記載のキット。
(項目19)
前記検出支持体上の前記複数の結合剤を認識し、それに結合することができる結合剤をさらに含む、項目17に記載のキット。
(項目20)
前記検出支持体上の前記複数の結合剤分子の少なくともいくつかを特異的に認識し、それに結合することができる前記結合剤が、可溶性結合剤を含む、項目19に記載のキット。
(項目21)
前記検出支持体が、ビーズである、項目17に記載のキット。
(項目22)
前記検出支持体が、検出可能な部分の複数の分子を含む、項目17に記載のキット。
(項目23)
前記検出支持体に結合した前記複数の結合剤分子が、前記対象の分析物を認識し、それに結合することができる抗体または抗体断片である、項目17に記載のキット。
(項目24)
前記捕捉支持体が、ビーズである、項目18に記載のキット。
(項目25)
前記捕捉支持体結合剤が、前記対象の分析物を認識し、それに結合することができる抗体または抗体断片である、項目18に記載のキット。
(項目26)
前記検出支持体上の前記複数の結合剤分子の少なくともいくつかを特異的に認識し、それに結合することができる前記結合剤が、前記対象の分析物を認識し、それに結合することができる抗体または抗体断片である、項目19に記載のキット。
(項目27)
前記検出支持体上の前記複数の結合剤分子の少なくともいくつかを特異的に認識し、それに結合することができる前記結合剤が、検出可能な部分を含む、項目19に記載のキット。
(項目28)
前記検出支持体が、前記対象の分析物に対して特異的な1,000個超の結合剤分子を含む、項目17に記載のキット。
(項目29)
前記検出支持体が、前記対象の分析物に対して特異的な10,000個超の結合剤分子を含む、項目17に記載のキット。
(項目30)
前記検出支持体が、前記対象の分析物に対して特異的な100,000個超の結合剤分子を含む、項目17に記載のキット。
定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者が一般に理解する意味を有するべきである。さらに、他に状況によって必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むべきであり、複数の用語は、単数を含むべきである。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。公知の方法および技術は、他に示さない限り、当技術分野で周知の通常の方法によって、および本明細書を通して考察される様々な一般のおよびより特定の参考文献において記載されているように一般に行われる。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造元の仕様によって行われる。本明細書に記載されている実験室の手順および技術に関連して使用される命名法は当技術分野で周知のものであり、一般に使用される。
下記の用語は、他に示さない限り、下記の意味を有すると理解すべきである。
特定の態様において、本発明は、試料中に存在する低レベルの分析物(例えば、対象のタンパク質)を検出する手段として、固体支持体にカップリングしている高い特異性の生体分子を利用し、シグナルをさらに増幅する。特定の実施形態において、同定されるタンパク質が直接または捕捉抗体を通して不動態化した表面に結合している免疫化学(例えば、ELISAもしくはRIA)または免疫蛍光アッセイについて、少なくとも10,000倍のシグナル増幅を達成し得る。
代わりの実施形態において、本発明は、本発明の方法を行うためのキットを含み得る。一実施形態において、本発明は、検出支持体を含む対象の分析物をアッセイするためのキットであって、検出支持体は、対象の分析物を認識し、それに結合することができる複数の結合剤分子を含む固体支持体を含むキットを含み得る。一実施形態において、キットは、捕捉支持体を含み得、捕捉支持体は、対象の分析物を認識し、それに結合する少なくとも1種の捕捉支持体結合剤を含む。キットは、いくつかの実施形態において、検出支持体上の複数の結合剤分子を特異的に認識し、それに結合することができる結合剤をさらに含み得る。一実施形態において、検出支持体上の複数の結合剤分子を特異的に認識し、それに結合することができる結合剤は、可溶性結合剤である。
ビーズをベースとするシグナル増幅によるタンパク質の検出
対象のタンパク質またはタンパク質サブユニットは、偽陽性を最小化するために不動態化した表面、例えば、Neutravidin上で固定化された対象のタンパク質に対して特異的な抗体(例えば、ビオチン化ウサギ一次抗体)によって捕捉し得る(例えば、Jainら、Nature、2011年、473巻:484〜488頁を参照されたい)。次に、サンドイッチアッセイにおいて、タンパク質A/G、および第2の種(例えば、モルモット)において産生された、上記タンパク質に対して特異的な別のタイプの抗体(典型的には、それぞれ、1μmおよび2.8μmのビーズについて、>104個および>105個)でコーティングされた1μmまたは2.8μmのポリスチレンビーズを添加して、固定化された標的タンパク質サブユニットに結合させる。次いで、酵素、放射性タグ、または蛍光性材料、例えば、QDOTS(登録商標)にコンジュゲートしている(例えば、共有結合している)二次抗体または抗体断片(例えば、抗モルモット抗体)を添加し、対象の分析物に対して特異的な複数のビーズ結合一次抗体に結合させる。非結合のタンパク質分子または抗体は、連続的添加の間の洗浄(2回)によって除去される。
ビーズ増幅の様々なフォーマットを使用したリボソームタンパク質の捕捉
実験を行って、図2、パネルB(すなわち、方法2)において示した様々なアッセイフォーマットを比較した。本質的に、E.coliライセート(500,000個の細胞)は、細菌細胞を溶解し、6M(10,000個の細胞/μl)のチオシアン酸グアニジン中でその中のリボソームをタンパク質構成物に解離することによって調製した。次いで、チオシアン酸グアニジンの濃度を、リン酸緩衝液中への希釈(例えば、450μl中への90,000個の細胞の希釈)によって0.12Mまたは0.6Mに低減させた。次いで、リボソームタンパク質は、図2(表1)に示す捕捉検出方法の1つを使用して捕捉した。結果は、最初のインプット細胞、および細胞からの推定したリボソームタンパク質について示す。100個のE.coli細胞は、約2.7pgのリボソームタンパク質を有する。
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- 本明細書に記載の発明。
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