TWI777963B - 縱排重複性抗體結合蛋白及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明提供包含抗體結合蛋白或其片段之胺基酸序列之至少兩個重複的縱排重複性蛋白及具有在其膜上表現之該等重複的細胞，其可用於免疫分析中以改良檢測靈敏度及檢測極限。

Description

縱排重複性抗體結合蛋白及其應用

本發明係關於免疫分析領域。特定而言，本發明係關於縱排重複性蛋白及其在檢測目標分析物方面之應用。

基於所生成抗體試劑之特異性及選擇性，使用免疫分析來量化所關注之生物分子。免疫分析係一組敏感分析測試，其利用特異性抗體/抗原複合物來產生可經量測且與溶液中目標分析物之濃度有關之信號，該等免疫分析包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、西方墨點(Western blot)、流式細胞術及免疫組織化學(IHC)等。基於抗體之免疫分析利用藉助疏水、親水或電鍵聯結合於免疫吸附劑(結合至固體載體之抗原或抗體)上之免疫反應物(抗原或抗體)。然而，基於抗體之免疫分析中存在以下問題：(i)捕獲抗體在固體載體表面上之負載量有限；(ii)捕獲抗體結合於固體載體表面上之方向不同，由於抗原結合區位於固體載體之底部，故其導致靈敏度下降；(iii)由於其他蛋白可與捕獲抗體競爭固體載體表面上之結合位點，此引起捕獲抗體在固體載體表面上之負載量減少，故必須使用經純化抗體。US 20110312104提供自基板表面釋放利用蛋白A結合至表面之免疫球蛋白G以量測分析物之方法，該等分析物不僅為具有高分子量之抗原而且為具有低分子量之抗原。然而，此參考文獻仍無法完全避免上文所提及之問題。 因此，仍需要改良免疫分析方法以具有更佳之靈敏度及特異性。

本發明提供縱排重複性蛋白，其包含抗體IgG結合蛋白或其片段之胺基酸序列之至少兩個重複及一或多個使重複彼此連接之連接體。在一些實施例中，抗體IgG結合蛋白係蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或Fc受體或其片段、組合或片段組合。 在一些實施例中，縱排重複性蛋白包含抗體IgG結合蛋白或其片段之胺基酸序列之2至20、3至20、4至20、5至20、6至20、7至20、8至20、9至20、10至20、11至20、12至20、13至20、14至20、15至20、16至20、2至16、3至16、4至16、5至16、6至16、7至16、8至16、9至16、10至16、11至16、12至16、2至14、3至14、5至14、6至14、7至14、8至14、9至14、10至14、2至12、3至12、4至12、5至12、6至12、7至12、8至12、9至12、2至10、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、2至9、3至9、4至9、5至9或6至9個重複。在另一實施例中，縱排重複性蛋白包含抗體IgG結合蛋白或其片段之胺基酸序列之8個重複。胺基酸序列之實例性實施例包括(但不限於)蛋白G之C1、C2或C3片段之序列。蛋白G之C2片段之胺基酸序列之較佳實施例係SEQ ID NO:1。 縱排重複性蛋白中所用之連接體可相同或不同。連接體之實例性實施例包括(但不限於) GGGSG (SEQ ID NO:2)或GGGGSGGGGSV (SEQ ID NO:3)之胺基酸序列。 縱排重複性蛋白之實例性實施例亦包括(但不限於)蛋白G或其片段之胺基酸序列之8個重複及包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之胺基酸序列之連接體；SEQ ID NO:1之胺基酸序列之8個重複，及使重複彼此連接之包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之胺基酸序列之連接體；及包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之縱排重複性蛋白。 本發明提供包含在細胞膜上表現之縱排重複性蛋白之細胞，其中縱排重複性蛋白與細胞之跨膜蛋白融合。 本發明亦提供抗體-重複性蛋白複合物，其包含結合至本發明之縱排重複性蛋白或結合至本發明之細胞之多個抗體或其片段。在一個實施例中，抗體係檢測抗體或捕獲抗體。 本發明亦提供檢測試樣中之分析物之方法，其包含在免疫分析或抗體包覆之免疫分析中使用本發明之縱排重複性蛋白、細胞及抗體-重複性蛋白複合物來捕獲試樣中之分析物，並定性或定量檢測分析物。 在西方墨點及ELISA之一個實施例中，檢測試樣中之分析物之方法包含以下步驟： 提供視情況經分析物包覆之固體載體； 使多個檢測抗體結合至本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞，以形成檢測抗體複合物； 使檢測抗體複合物結合至包覆在固體載體中之分析物；及 定性或定量檢測分析物。 在夾心式ELISA之一個實施例中，檢測試樣中之分析物之方法包含以下步驟： 提供固體載體； 將捕獲抗體固定在固體載體上； 藉由捕獲抗體捕獲試樣中之分析物； 使多個檢測抗體結合至本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞，以形成檢測抗體複合物； 添加檢測抗體複合物以結合至分析物；及 定性或定量檢測分析物。 在夾心式ELISA之一個實施例中，檢測試樣中之分析物之方法包含以下步驟： 提供固體載體； 將本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞固定在固體載體上； 使多個捕獲抗體結合至本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞； 藉由捕獲抗體複合物捕獲試樣中之分析物； 添加檢測抗體以結合至分析物；及 定性或定量檢測分析物。 在競爭ELISA之一個實施例中，檢測試樣中之分析物之方法包含以下步驟： 提供固體載體； 將本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞固定在固體載體上； 使多個捕獲抗體結合至本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞，以形成捕獲抗體複合物； 將具有預定濃度之經信號標記之分析物與試樣中之分析物混合以形成混合物； 藉由捕獲抗體複合物捕獲混合物之分析物；及 定性或定量檢測分析物。 本發明亦提供用於檢測試樣中之分析物之套組，其包含視情況經抗原、分析物或捕獲抗體包覆之固體載體；及本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞。在一個實施例中，套組進一步包含檢測抗體或捕獲抗體。在一個實施例中，檢測抗體可進一步經標記。 本發明進一步提供使用西方墨點或ELISA檢測試樣中之分析物之套組，其包含視情況經分析物包覆之固體載體及本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞。在一個實施例中，本發明提供使用夾心式ELISA檢測試樣中之分析物之套組，其包含固體載體及本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞。在一個實施例中，本發明提供使用競爭ELISA檢測試樣中之分析物之套組，其包含經本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞包覆之固體載體及本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞。 在另一實施例中，本文所述之檢測抗體可進一步經標記。

本發明提供包含抗體IgG結合蛋白或其片段之胺基酸序列之至少兩個重複的縱排重複性蛋白，及具有在其膜上表現之重複的細胞，其可用於免疫分析中以改良檢測靈敏度及檢測極限。 除如下文所定義者外，申請專利範圍及說明書中所用之術語應根據如熟習此項技術者所理解之其常用含義來理解。 應注意，除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。 除非另有說明，否則如本文所用，使用「或」意指「及/或」。在多項附屬項之情況下，使用「或」僅以擇一方式重新提及一個以上前述獨立項或附屬項。 如本文所用術語「分析物」或「目標分析物」可互換使用，且通常係指樣品中之經檢測及/或量測之物質或物質組。 如本文所用術語「結合分子」係指能夠結合另一所關注分子之分子。 如本文所用術語「分析物結合」分子係指能夠參與與分析物分子之特異性結合反應之任一分子(例如抗體)。 如本文所用術語「檢測(detecting或detection)」在獲得試樣中所存在分析物之量或濃度之絕對值以及獲得指示試樣中分析物含量之指數、比率、百分比、視覺或其他值之意義上，意欲包括定量及定性測定二者。評價可係直接或間接的，且實際上檢測之化學或生物化學物質當然無需為分析物本身，但可為(例如)其衍生物。 如本文所用術語「抗體」通常包含單株及多株抗體及其結合片段，尤其Fc片段以及所謂的「單鏈抗體」、嵌合、人類化、尤其CDR移植抗體及二價或四價抗體。亦包含免疫球蛋白樣蛋白，其係藉助包括(例如)噬菌體展示在內之技術來選擇，以特異性結合至試樣中所含之所關注分子。在此情況中，術語「特異性」及「特異性結合」係指針對所關注分子產生之抗體或其片段。 如本文所用術語「固定」係指將試劑固定至固體表面。當試劑固定至固體表面時，其係非共價結合或共價結合至表面。 在一態樣中，本發明提供縱排重複性蛋白，其包含抗體IgG結合蛋白或其片段之胺基酸序列之至少兩個重複及一或多個使重複彼此連接之連接體。在一些實施例中，抗體IgG結合蛋白係蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或Fc受體或其片段、組合或片段組合。抗體IgG結合蛋白在市面上有售(例如，由Thermo Fisher Scientific Inc.出售之彼等)且為業內已知。 蛋白A、蛋白G、蛋白A/G及蛋白L係結合至哺乳動物免疫球蛋白分子之微生物來源之天然及重組蛋白。該等蛋白可以純化、無鹽、凍乾形式以及包覆在微量板中及共價固定至多種固體載體獲得。 蛋白A係最初在金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )之細胞壁中發現之42 kDa表面蛋白。由於其結合免疫球蛋白之能力，已發現其在生物化學研究中之用途。其係由摺疊成三螺旋束之5個同源Ig結合域組成。每個域皆能夠結合來自許多哺乳動物種類之蛋白，最主要係IgG。 蛋白A/G係重組融合蛋白，其包括蛋白A及蛋白G二者之IgG結合域。因此，蛋白A/G可用於結合來自兔、小鼠、人類及其他哺乳動物試樣之寬泛範圍之IgG亞類。 蛋白L結合至某些免疫球蛋白κ輕鏈。由於κ輕鏈出現在所有類別之免疫球蛋白之成員(即，IgG、IgM、IgA、IgE及IgD)中，故蛋白L可純化該等不同類別之抗體。然而，僅具有適當κ輕鏈之每個類別內之彼等抗體會結合。通常，需要經驗測試以確定蛋白L是否有效地純化特定抗體。 蛋白G係在C組及G組鏈球菌(Streptococcal )中表現之免疫球蛋白結合蛋白，且已發現在藉助其結合至Fab及Fc區純化抗體方面之應用。蛋白G之C末端可結合至抗體。在蛋白G之胺基酸序列中，胺基酸306-331係C1片段，胺基酸347-402係C2片段且胺基酸418-473係C3片段。在片段中，C1及C3可結合至抗體之Fc片段及Fab片段，且C2可結合至抗體之Fc片段。 在一些實施例中，縱排重複性蛋白包含抗體IgG結合蛋白或其片段之胺基酸序列之2至20、3至20、4至20、5至20、6至20、7至20、8至20、9至20、10至20、11至20、12至20、13至20、14至20、15至20、16至20、2至16、3至16、4至16、5至16、6至16、7至16、8至16、9至16、10至16、11至16、12至16、2至14、3至14、5至14、6至14、7至14、8至14、9至14、10至14、2至12、3至12、4至12、5至12、6至12、7至12、8至12、9至12、2至10、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、2至9、3至9、4至9、5至9或6至9個重複。在另一實施例中，縱排重複性蛋白包含抗體IgG結合蛋白或其片段之胺基酸序列之8個重複。在一些實施例中，抗體IgG結合蛋白或其片段係蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或Fc受體或其片段。在一些實施例中，抗體IgG結合蛋白係蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或Fc受體或其片段、組合或片段組合。 在一些實施例中，抗體IgG結合蛋白或其片段之胺基酸序列包含蛋白G之C1、C2或C3片段之序列。在另一實施例中，胺基酸序列包含蛋白G之C2片段之序列。 在一個實施例中，蛋白G之C2片段之胺基酸序列如下。 TYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE (SEQ ID NO:1) 在一些實施例中，縱排重複性蛋白中所用之連接體可相同或不同。在一些實施例中，連接體包含GGGSG (SEQ ID NO:2)或GGGGSGGGGSV (SEQ ID NO:3)之胺基酸序列。 在一些實施例中，縱排重複性蛋白包含蛋白G或其片段之胺基酸序列之8個重複及包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之胺基酸序列之連接體。在一個實施例中，縱排重複性蛋白包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之8個重複及使重複彼此連接之包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之胺基酸序列之連接體。在另一實施例中，縱排重複性蛋白包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列。 TYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGGGGSGGGGSVETYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGGGGSGGGGSVETYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGGGGSGGGGSVETYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGGGGSGGGGSVETYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGGGGSGGGGSVETYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGGGGSGGGGSVETYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGGGGSGGGGSVETYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGGGGSGGGGSV (SEQ ID NO:4) 在另一態樣中，本發明提供細胞，其包含在細胞膜上表現之縱排重複性蛋白，其中該縱排重複性蛋白與細胞之跨膜蛋白融合。 在另一態樣中，本發明提供抗體-重複性蛋白複合物，其包含結合至本發明之縱排重複性蛋白或結合至本發明之細胞之多個抗體或其片段。在一個實施例中，抗體係檢測抗體或捕獲抗體。 本發明之縱排重複性蛋白、細胞及抗體-重複性蛋白複合物可用於免疫分析中；特定而言，ELISA及抗體包覆之免疫分析中。本發明之縱排重複性蛋白、細胞及抗體-重複性蛋白複合物提供高的抗體結合能力，增加固體載體中所累積之檢測抗體之量，且可在免疫分析中使用未純化之檢測抗體或捕獲抗體。因此，本發明提供在免疫分析中使用本發明之縱排重複性蛋白、細胞及/或抗體-重複性蛋白複合物之套組及方法。 在另一態樣中，本發明提供檢測試樣中之分析物之方法，其包含在免疫分析或抗體包覆之免疫分析中使用本發明之縱排重複性蛋白、細胞及/或抗體-重複性蛋白複合物來捕獲試樣中之分析物，並定性或定量檢測分析物。 在一個實施例中，檢測試樣中之分析物之方法包含以下步驟： 提供視情況經分析物包覆之固體載體； 使多個檢測抗體結合至本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞，以形成檢測抗體複合物； 使檢測抗體複合物結合至包覆在固體載體中之分析物；及 定性或定量檢測分析物。 上文所提及之實施例適用於西方墨點及ELISA。 在一個實施例中，檢測試樣中之分析物之方法包含以下步驟： 提供固體載體； 將捕獲抗體固定在固體載體上； 藉由捕獲抗體捕獲試樣中之分析物； 使多個檢測抗體結合至本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞，以形成檢測抗體複合物； 添加檢測抗體複合物以結合至分析物；及 定性或定量檢測分析物。 上文所提及之實施例適用於夾心式ELISA。 在一個實施例中，檢測試樣中之分析物之方法包含以下步驟： 提供固體載體； 將本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞固定在固體載體上； 使多個捕獲抗體結合至本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞； 藉由捕獲抗體複合物捕獲試樣中之分析物； 添加檢測抗體以結合至分析物；及 定性或定量檢測分析物。 上文所提及之實施例適用於夾心式ELISA。 在一個實施例中，檢測試樣中之分析物之方法包含以下步驟： 提供固體載體； 將本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞固定在固體載體上； 使多個捕獲抗體結合至本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞，以形成捕獲抗體複合物； 將具有預定濃度之經信號標記之分析物與試樣中之分析物混合以形成混合物； 藉由捕獲抗體複合物捕獲混合物中之分析物；及 定性或定量檢測分析物。 上文所提及之實施例適用於競爭ELISA。 在另一態樣中，本發明提供用於檢測試樣中之分析物之套組，其包含視情況經抗原、分析物或捕獲抗體包覆之固體載體；及本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞。在一個實施例中，套組進一步包含檢測抗體或捕獲抗體。在一個實施例中，檢測抗體可進一步經標記。抗原、分析物或捕獲抗體是否或哪一者視情況包覆在固體載體上取決於免疫分析之類型。 在一個實施例中，本發明提供使用西方墨點或ELISA檢測試樣中之分析物之套組，其包含視情況經分析物包覆之固體載體及本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞。 在一個實施例中，本發明提供使用夾心式ELISA檢測試樣中之分析物之套組，其包含固體載體及本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞。 在一個實施例中，本發明提供使用競爭ELISA檢測試樣中之分析物之套組，其包含經本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞包覆之固體載體及本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞。 用於固定縱排重複性蛋白或抗體-重複性蛋白複合物之固體載體可為基本上為水不溶性且可用於免疫分析中之任何惰性載體或載劑，包括呈(例如)平坦表面、顆粒、多孔基質等形式之載體。常用載體之實例包括自聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯及諸如此類製造之小片、珠及分析板或試管，包括96孔微量滴定板以及微粒材料，例如濾紙、瓊脂醣、交聯聚葡萄糖及其他多醣。或者，可使用反應性水不溶性基質，例如經溴化氰活化之碳水化合物及反應性受質。在一個實施例中，將經固定之捕獲試劑包覆在經鏈黴抗生物素蛋白包覆之96孔微量滴定板上。 為促進免疫分析，在本發明之套組及方法中所使用之檢測抗體亦可包含可檢測標記。可檢測標記可係不干擾分析物結合至檢測抗體及結合至本發明之縱排重複性蛋白或本發明之細胞之任一部分。 眾多標記可用於本發明之方法及套組。標記之實例包括(但不限於)放射性同位素、膠態金顆粒、螢光或化學發光標記及酶標記。放射性同位素之實例包括(但不限於)³⁵ S、¹⁴ C、¹²⁵ I、³ H及¹³¹ I。抗體可使用業內已知之技術經放射性同位素標記，且放射性可使用閃爍計數量測。其他放射性核種包括⁹⁹ Tc、⁹⁰ Y、¹¹¹ In、³² P、¹¹ C、¹⁵ O、¹³ N、¹⁸ F、⁵¹ Cr、⁵⁷ To、²²⁶ Ra、⁶⁰ Co、⁵⁹ Fe、⁵⁷ Se、¹⁵² Eu、⁶⁷ CU、²¹⁷ Ci及²¹² Pb。螢光或化學發光標記之實例包括(但不限於)稀土螯合物(銪螯合物)、螢光黃及衍生物、玫瑰紅及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅素、藻青蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二醛、螢哢明(fluorescamine)、丹磺醯、傘形酮、螢光素、發光胺標記、異發光胺標記、芳香族吖啶鎓酯標記、咪唑標記、吖啶鎓鹽標記、草酸酯標記、水母素標記、2,3-二氫酞嗪二酮、釕化胺反應性N-羥基琥珀醯亞胺酯標記、德克薩斯紅(Texas Red)、丹磺醯、麗絲胺(Lissamine)、藻紅蛋白(phycocrytherin)或市售螢光團。螢光標記可使用業內已知之技術偶聯至抗體。螢光可使用螢光計量化。生物素標記可使用業內已知之技術偶聯至抗體。經生物素標記之抗體可藉由酶偶聯之抗生物素蛋白及鏈黴抗生物素蛋白來檢測。酶標記之實例包括螢光素酶、蘋果酸去氫酶、尿素酶、過氧化物酶(例如，辣根過氧化物酶(HRPO))、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(例如，尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化酶、微過氧化酶及諸如此類。將酶偶聯至抗體之技術在業內已知。 在標記檢測抗體時，套組及方法亦可包含一或多種能夠在捕獲抗體、分析物及檢測器結合分子之間形成夾心時產生可檢測信號之試劑。對於經酶標記之檢測器結合分子，套組及方法可包括酶所需要之受質及輔因子，且對於螢光團標記，套組可包括產生可檢測發色團之染料前體。對於經生物素標記之檢測器結合分子，套組及方法可包括酶偶聯之抗生物素蛋白及鏈黴抗生物素蛋白、酶所需要之受質及輔因子。若檢測抗體未經標記，則套組及方法亦可分別包含檢測構件(例如特異性結合至檢測抗體之經標記抗體)及使用檢測構件之步驟。 本文所述之試樣可係以下多種體液中之任一者，包括組織、生檢、生物切片、血液、血清、精液、乳房滲出物、唾液、痰、尿液、胞質液、血漿、腹水、胸膜滲出液、羊水、膀胱沖洗液、支氣管肺泡灌洗液及腦脊髓液。在一些實施例中，試樣係組織、生檢、血液、血清或血漿，且在一個較佳實施例中，試樣係血清。 免疫分析之實例包括(但不限於) ELISA、西方墨點、流式細胞術、免疫組織化學、放射免疫分析、競爭性免疫分析、磁性免疫分析、記憶性淋巴球免疫刺激分析(MELISA)、側向流免疫層析分析、環繞光纖免疫分析(SOFIA)及凝集-PCR (ADAP)。 在諸如ELISA及西方墨點之免疫分析中，本發明之縱排重複性蛋白或細胞可結合多個檢測抗體以形成複合物，從而增加在欲結合至檢測抗體之分析物之位置中累積的檢測抗體之量。因此，檢測效率大幅提高且檢測靈敏度亦有所增加。 在諸如夾心式ELISA或競爭ELISA之基於抗體之免疫分析中，本發明之縱排重複性蛋白或細胞可固定在固體載體上以增加捕獲抗體在固體載體上之負載。因此，欲捕獲之分析物之量增加且檢測靈敏度亦有所改良。 特定而言，本發明係關於稱為縱排重複性蛋白之重組蛋白，其係藉由基因工程技術自蛋白之片段(Fc)結合域構築。縱排重複性蛋白較單體蛋白展現顯著較大之結合效率及對抗體之親和力。藉由將縱排重複性蛋白包覆在固相板(例如，板、膜及珠)上，板上之抗體負載量可顯著增加且抗體之抗原結合域(Fab)在板上之展示可係單向的(向外)。縱排重複性蛋白之另一應用係藉由混合縱排重複性蛋白與抗體來生成多蛋白/抗體複合物，此增加抗體在抗原區域上之累積量。此外，本發明係關於在其膜上表現縱排重複性蛋白之細胞，其在細胞表面上表現縱排重複性蛋白。藉由將細胞包覆在固相板上，板上之抗體負載量可顯著增加且板上抗體之抗原結合域(Fab)之展示可係單向的(向外)。細胞之另一應用係藉由簡單混合細胞與抗體來生成細胞/抗體複合物，此增加抗體在抗原區域上之累積量。與縱排重複性蛋白或細胞配對容許將抗體直接應用於免疫分析而無額外純化。本發明可使用多種抗體來顯著改良免疫分析之靈敏度及檢測極限。本發明之例示性實例顯示於下文中。

參照以下非限制性實驗實例將進一步理解本發明。實例 實例 1 表現本發明之縱排重複性蛋白 ( 多蛋白 G) 之細胞系及其抗體捕獲能力 多蛋白 G 之構築 將鏈球菌蛋白G之C2域定序並選殖，以產生1個蛋白G-C2域及蛋白G-C2域之8個重複(1個重複之胺基酸序列係SEQ ID NO:1)。將B7跨膜蛋白連接至所得域之C末端，以形成蛋白G-mB7及多蛋白G-mB7。基因序列自N末端至C末端分別係HA-蛋白G-連接體-mB7及HA-多蛋白G-連接體-mB7 (參見圖1)。穩定表現多蛋白 G 之細胞系 將基因序列插入慢病毒載體中並將所得載體轉染至3T3細胞系中，以分別形成蛋白G細胞及多蛋白G細胞。收集細胞膜蛋白並藉由西方墨點藉由添加小鼠抗HA抗體及HRP山羊抗小鼠IgG Fcγ抗體以確認蛋白G及多蛋白G是否正確表現來確認。如在圖2中所顯示，蛋白G-mB7 (分子量：38 KDa)及多蛋白G-mB7 (95 KDa)在細胞膜上正確表現。多蛋白 G 細胞對抗體之捕獲 將FITC偶聯之山羊抗小鼠免疫球蛋白G Fcγ抗體分別添加至蛋白G細胞或多蛋白G細胞用於結合分析。藉由流式細胞術量測結合強度。結果顯示，蛋白G細胞及多蛋白G細胞之螢光強度係159.63及8058.42 (參見圖3)。此證明，蛋白G細胞或多蛋白G細胞在細胞膜上穩定表現且可良好地結合至抗體。意外的是，多蛋白G細胞結合抗體之能力較蛋白G細胞結合抗體之能力大50倍。抗體結合至多蛋白 G 之特異性 將蛋白G細胞及多蛋白G細胞添加至3.3抗體(一種抗PEG抗體)且然後添加FITC偶聯之4臂PEG。使用流式細胞術來測定細胞表面上之螢光強度。蛋白G細胞及多蛋白G細胞之螢光強度分別係21.11及138.99 (參見圖4)。結果顯示，結合至蛋白G細胞或多蛋白G細胞之3.3抗體仍可結合至FITC偶聯之4臂PEG且由此證明，抗體在結合至蛋白G細胞或多蛋白G細胞後維持其特異性。實例 2 表現本發明之縱排重複性蛋白 ( 多蛋白 G) 之細菌細胞及其抗體捕獲能力 多蛋白 G 之構築 將鏈球菌蛋白G之C2域定序並選殖，以產生1個蛋白G-C2域及蛋白G-C2域之8個重複。使自主轉運蛋白黏著(AIDA)膜蛋白連接至所得結構域之C末端，以形成蛋白G-AIDA及多蛋白G-AIDA。基因序列自N末端至C末端分別係HA-蛋白G-連接體-AIDA及HA-多蛋白G-連接體-AIDA (參見圖5)。穩定表現多蛋白 G 之細胞系 將基因序列插入載體pET22b中以分別形成pET22b-蛋白G-AIDA及pET22b-多蛋白G-AIDA，並將所得載體轉形至大腸桿菌BL21 (E. coli BL21)中以分別形成蛋白G細菌及多蛋白G細菌。收集細胞膜蛋白並藉由西方墨點藉由添加抗HA抗體及HRP山羊抗小鼠IgG Fcγ抗體以確認蛋白G及多蛋白G是否正確表現來確認。如在圖6中所顯示，蛋白G-AIDA (分子量：70 KDa)及多蛋白G-AIDA (125 KDa)在細胞膜上正確表現。多蛋白 G 細菌對抗體之捕獲 將蛋白G細菌及多蛋白G細菌分別固定在96孔板上。將1μ g/mL辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之山羊抗小鼠IgG Fc抗體添加至孔，且然後添加ABTS用於催化著色。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。在1μ g/mL之抗體濃度下且結果顯示，多蛋白G細菌之吸光度較蛋白G細菌之吸光度高18.9倍(參見圖7)。實例 3 重複性蛋白 G ( 多蛋白 G) 之構築及其抗體捕獲能力 多蛋白 G 序列之構築 將鏈球菌蛋白G之C2域定序並選殖，以產生蛋白G-C2域之8個重複。將用作蛋白純化之標識符之組胺酸連接至所得域之C末端。基因序列自N末端至C末端係HA-多蛋白G (參見圖8)。多蛋白 G 之大量生產 為開發在免疫分析中使用之多種類型之多蛋白G，構築重複性多蛋白G (蛋白G之C2域之8個重複)並然後將其插入逆轉錄病毒載體pLNCX，以形成pLNCX-多蛋白G。將所得載體轉染至Expi293細胞中用於蛋白大量生產。藉由Ni親和管柱純化所產生之多蛋白G並然後藉由西方墨點(圖9A)及10% SDS-PAGE (非還原性條件) (圖9B)來確認。結果顯示，多蛋白G經正確構築並純化(65 KDa)。多蛋白 G 對抗體之捕獲 將不同濃度(1μ g/mL、5μ g/mL及10μ g/mL)之多蛋白G固定在96孔板上，並將1μ g/mL辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之山羊抗小鼠IgG Fc抗體添加至其中。然後添加ABTS用於催化著色。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。在1μ g/mL、5μ g/mL或10μ g/mL之抗體濃度下且結果顯示，多蛋白G可有效捕獲抗體且所捕獲抗體之量以濃度依賴性方式增加(參見圖10)。實例 4 多蛋白 G 及多蛋白 G 細胞極大地增加檢測抗體與抗原位點之結合量且由此增加免疫分析之靈敏度 藉由多蛋白 G 細菌增加夾心式 ELISA 之檢測靈敏度 將2μ g/mL之MTI (一種抗IFN α捕獲抗體)添加至ELISA板且然後將50 pg/mL、30 pg/mL、10 pg/mL及6 pg/mL之IFN α添加至其中。將與多蛋白G細菌未結合或結合之生物素偶聯物MT2 (一種抗IFN-α檢測抗體)添加至板，且然後添加用於著色催化之鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，與多蛋白G細菌結合之檢測抗體之吸光度顯著高於與多蛋白G未結合之檢測抗體之吸光度，且由此可增加夾心式ELISA檢測IFN α之靈敏度(參見圖11a)。 將1μ g/mL之AGP4 (一種抗PEG捕獲抗體，IgM型)添加至ELISA板，且然後將1000 pg/mL、300 pg/mL、100 pg/mL及30 pg/mL之派羅欣(一種經PEG修飾之蛋白藥物)添加至其中。將與多蛋白G細菌未結合或結合之生物素偶聯物3.3 (一種抗PEG檢測抗體，IgG型)添加至板，且然後添加用於著色催化之鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，與多蛋白G細菌結合之檢測抗體之吸光度顯著高於與多蛋白G細菌未結合之檢測抗體之吸光度，且由此可增加夾心式ELISA檢測派羅欣之靈敏度(參見圖11b)。藉由多蛋白 G 增加夾心式 ELISA 之檢測靈敏度 將2μ g/mL MTI (一種抗IFN α捕獲抗體)添加至ELISA板且然後將500 pg/mL、100 pg/mL、20 pg/mL、4 pg/mL及0.8 pg/mL IFN α添加至其中。將與多蛋白G未結合或結合之生物素偶聯物MT2 (一種抗IFN-α檢測抗體)添加至板，且然後添加用於著色催化之鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，與多蛋白G結合之檢測抗體之吸光度顯著高於與多蛋白G未結合之檢測抗體之吸光度，且由此可增加夾心式ELISA檢測IFN α之靈敏度(參見圖12 a)。 將1μ g/mL之AGP4 (一種抗PEG捕獲抗體，IgM型)添加至ELISA板，且然後將1000 pg/mL、100 pg/mL、10 pg/mL及1 pg/mL之派羅欣(一種經PEG修飾之蛋白藥物)添加至其中。將與多蛋白G未結合或結合之生物素偶聯物3.3 Ab (一種抗PEG檢測抗體，IgG型)添加至板，且然後添加用於著色催化之鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，與多蛋白G結合之檢測抗體之吸光度顯著高於與多蛋白G未結合之檢測抗體之吸光度，且由此可增加夾心式ELISA檢測派羅欣之靈敏度(參見圖12 b)。藉由多蛋白 G 細菌增加西方墨點之檢測靈敏度 使50 ng/孔、10 ng/孔、2 ng/孔及0.4 ng/孔之派羅欣(一種經PEG修飾之蛋白藥物)經受10% (w/v) SDS-PAGE電解且然後印漬在硝化纖維素膜上。將與多蛋白G細菌未結合或結合的2μ g/mL之3.3Ab (一種抗PEG檢測抗體，IgG型)添加至膜，且然後添加HRP偶聯之山羊抗小鼠抗體用於著色。結果顯示，對於派羅欣，與多蛋白G細菌結合之3.3 Ab之檢測極限增強至0.4 ng/孔，而與多蛋白G細菌未結合之3.3 Ab之靈敏度係10 ng/孔(參見圖13)。結果顯示，多蛋白G細菌確實可增加西方墨點之靈敏度並改良其檢測極限。藉由多蛋白 G 增加西方墨點之檢測靈敏度 使20 ng/孔、10 ng/孔、5 ng/孔、2.5 ng/孔、1.3 ng/孔、0.6 ng/孔、0.3 ng/孔及0.1 ng/孔之派羅欣(一種經PEG修飾之蛋白藥物)經受10% (w/v) SDS-PAGE電解，且然後印漬在硝化纖維素膜上。將與多蛋白G未結合或結合的2μ g/mL之生物素偶聯之3.3Ab (一種抗PEG檢測抗體，IgG型)添加至膜，且然後添加鏈黴抗生物素蛋白-HRP用於著色。結果顯示，對於派羅欣，與多蛋白G結合之生物素-3.3 Ab之檢測極限增強至0.1 ng/孔，而與多蛋白G未結合之生物素-3.3 Ab之靈敏度係2.5 ng/孔(參見圖14)。結果顯示，多蛋白G確實可增加西方墨點之靈敏度並改良其檢測極限。實例 5 基於多蛋白 G 之板及基於多蛋白 G 細胞之板增加捕獲抗體之負載量 藉由基於多蛋白 G 細胞之板增加捕獲抗體之負載量 將多蛋白G細胞固定在板上以產生基於多蛋白G細胞之板。將0.0123μ g/mL、0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL及1μ g/mL之生物素-3.3 Ab (一種抗PEG捕獲抗體，IgG型)分別添加至基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。然後將用於著色催化之鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，在0.0123μ g/mL、0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL及1μ g/mL之生物素-3.3Ab下，負載於基於多蛋白G細胞之板上之抗體量較傳統基於聚苯乙烯之板之彼等分別高18、9.5、6、3.5及1.8倍，且較商業基於蛋白G之板之彼等分別高3.5、5.1、2.4、1.3及1.1倍。結果顯示，負載於基於多蛋白G細胞之板上之抗體量顯著高於傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板上之彼等(參見圖15)。藉由基於多蛋白 G 之板增加捕獲抗體之負載量 將多蛋白G固定在板上以產生基於多蛋白G之板。將0.0123μ g/mL、0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL及1μ g/mL之生物素-3.3Ab分別添加至基於多蛋白G之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。然後將用於著色催化之鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，在0.0123μ g/mL、0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL及1μ g/mL之生物素-3.3Ab下，負載於基於多蛋白G之板上之抗體量較傳統基於聚苯乙烯之板之彼等分別高14、20、10、2.2及1.3倍，且較商業基於蛋白G之板之彼等分別高7.8、5.8、4、1.3及1.15倍。結果顯示，負載於基於多蛋白G之板上之抗體量顯著高於傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板上之彼等(參見圖16)。實例 6 基於多蛋白 G 細胞之板增加多種抗原分析物之結合量 藉由基於多蛋白 G 細胞之板增加 CTL4 抗原之結合量 將0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL、1μ g/mL及3μ g/mL之抗CTLA4抗體分別添加至基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。將1μ g/mL之CTLA4-生物素、用於著色催化之鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS相繼添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，在0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL、1μ g/mL及3 μg/mL之抗CTLA4抗體下，結合至基於多蛋白G細胞之板中之抗CTLA4抗體之CTLA4-生物素的量顯著高於傳統基於聚苯乙烯之板之量。在0.0371μ g/mL及0.11μ g/mL之抗CTLA4抗體下，結合至基於多蛋白G細胞之板中之抗CTLA4抗體之CTLA4-生物素的量顯著高於商業基於蛋白G之板之量(參見圖17)。 將1μ g/mL或0.1 μg/mL之抗CTLA4抗體分別添加至基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。然後，分別將0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL、1μ g/mL及3 μg/mL之CTLA4-生物素添加至板。將用於著色催化之鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS相繼添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，在高濃度(1μ g/mL)之抗CTLA4抗體下，結合至基於多蛋白G細胞之板中之抗CTLA4抗體之CTLA4-生物素(0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL、1μ g/mL及3 μg/mL)的量與商業基於蛋白G之板之量相似，但顯著高於傳統基於聚苯乙烯之板之量(參見圖18)。然而，在低濃度(0.1μ g/mL)之抗CTLA4抗體下，結合至基於多蛋白G細胞之板中之抗CTLA4抗體之CTLA4-生物素(0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL、1μ g/mL及3 μg/mL)的量較商業基於蛋白G之板之量高6.5、2.4、2.2、1.3及1.1倍，而藉由傳統基於聚苯乙烯之板未檢測到分析物(參見圖19)。藉由基於多蛋白 G 細胞之板增加 PEG- 生物素之結合量 將0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL、1μ g/mL及3 μg/mL之3.3 Ab (一種抗PEG捕獲抗體，IgG型)分別添加至基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。將1 μg/mL之PEG5K-生物素、用於著色催化之鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS相繼添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，在0.0371μ g/mL、0.11μ g/mL、0.33μ g/mL、1μ g/mL及3μ g/mL之抗PEG抗體下，結合至基於多蛋白G細胞之板中之抗PEG抗體之PEG5K-生物素(1 μg/mL)的量顯著高於商業基於蛋白G之板之量及傳統基於聚苯乙烯之板之量(參見圖20)。藉由基於多蛋白 G 細胞之板增加 PEG2K-Lipo-Dox 之結合量 將1μ g/mL之3.3 Ab (一種抗PEG捕獲抗體，IgG型)分別添加至基於多蛋白G細胞之板及傳統基於聚苯乙烯之板。將0.0256μ g/mL、0.128μ g/mL、3.2μ g/mL、80μ g/mL及400μ g/mL之PEG2K-Lipo-Dox分別添加至板。藉由螢光分析儀量測PEG2K-Lipo-Dox至基於多蛋白G細胞之板及傳統基於聚苯乙烯之板的結合量。結果顯示，結合至基於多蛋白G細胞之板中之抗PEG抗體之PEG2K-Lipo-Dox的量顯著高於傳統基於聚苯乙烯之板之量(參見圖21)。實例 7 基於多蛋白 G 細胞之板極大地增加競爭 ELISA 之靈敏度 將0.1μ g/mL之抗CTLA4抗體分別添加至基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。將CTL4分析物及CTLA4-生物素添加至板以競爭性結合至抗CTLA4抗體之結合位點。然後將鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，基於多蛋白G細胞之板確實可檢測到CTL4分析物，且基於多蛋白G細胞之板之吸光度強度顯著高於傳統基於聚苯乙烯之板，而傳統基於聚苯乙烯之板無法檢測到CTLA4 (圖22)。 將1μ g/mL之抗PEG抗體分別添加至基於多蛋白G細胞之板及傳統基於聚苯乙烯之板。將PEG分析物及PEG-生物素添加至板，以競爭性結合至抗PEG抗體之結合位點。然後將鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，基於多蛋白G細胞之板可在0.01 nM下檢測到PEG5K及PEG750 (圖23，右圖)，而傳統基於聚苯乙烯之板無法檢測到PEG (圖23，左圖)。實例 8 多蛋白 G 細胞板極大地增加夾心式 ELISA 之靈敏度 將1μ g/mL之15.2 Ab (一種抗PEG抗體，IgG型)分別添加至基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。將0.1 nM、1 nM、10 nM及100 nM之PEG10K添加至板。將AGP4-生物素(一種生物素偶聯之抗PEG檢測抗體，IgM型)、鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS相繼添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，基於多蛋白G細胞之板可檢測到PEG10K，而傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板無法有效地檢測到PEG10K (圖24)。 將1μ g/mL之15.2 Ab (一種抗PEG抗體，IgG型)分別添加至基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。將0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM及1000 nM之PEG2K-Lipo-Dox添加至板。將AGP4-生物素(一種生物素偶聯之抗PEG檢測抗體，IgM型)、鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS相繼添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，基於多蛋白G細胞之板之吸光度值顯著高於傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板之吸光度值(圖25)。 將1μ g/mL之15.2 Ab (一種抗PEG抗體，IgG型)分別添加至基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。將0.00021 nM、0.002 nM、0.02 nM、0.2 nM及2 nM之派羅欣(一種經PEG修飾之蛋白藥物)添加至板。將AGP4-生物素(一種生物素偶聯之抗PEG檢測抗體，IgM型)、鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS相繼添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，基於多蛋白G細胞之板之吸光度值顯著高於商業基於蛋白G之板之吸光度值，而傳統基於聚苯乙烯之板無法檢測到派羅欣(圖26)。 將1μ g/mL之15.2 Ab (一種抗PEG抗體，IgG型)分別添加至基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板。將0.0001 nM、0.001 nM、0.01 nM、0.1 nM及1 nM之PEG2K-量子點添加至板。將AGP4-生物素(一種生物素偶聯之抗PEG檢測抗體，IgM型)、鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS相繼添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，基於多蛋白G細胞之板之吸光度值顯著高於傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板之吸光度值(圖27)。 鑒於以上內容，基於多蛋白G細胞之板可有效地用於免疫分析中並提供意外的免疫分析之靈敏度。實例 9 未純化之捕獲抗體可直接用於基於多蛋白 G 細胞之板中用於免疫分析 將1μ g/mL之經純化15.2 Ab (一種抗PEG捕獲抗體，IgG型)及腹水-15.2 Ab (未純化)分別添加至基於多蛋白G細胞之板及傳統基於聚苯乙烯之板。將0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM及1000 nM之PEG2K-Lipo-Dox添加至板。將AGP4-生物素(一種生物素偶聯之抗PEG檢測抗體，IgM型)、鏈黴抗生物素蛋白-HRP及ABTS相繼添加至板。在O.D. 405 nm下量測所得混合物。結果顯示，傳統基於聚苯乙烯之板在使用經純化15.2 Ab時可檢測到PEG2K-Lipo-Dox，而其在使用腹水-15.2 Ab (未純化)時無法檢測到PEG2K-Lipo-Dox。然而，基於多蛋白G細胞之板在使用經純化15.2 Ab或腹水-15.2 Ab (未純化)時皆可有效地檢測到PEG2K-Lipo-Dox (圖28)。此證明，在基於多蛋白G細胞之板中使用未純化之捕獲抗體不會影響檢測靈敏度，故基於蛋白G細胞之板具有顯著較高之靈敏度且可減少抗體純化步驟以節約成本。

圖1顯示本發明之多蛋白G之基因序列，其在細胞膜上表現。對於蛋白G細胞，序列自N末端至C末端包括人類流行性感冒血球凝集素(HA)、蛋白G (C2)、連接體(L)及mB7。對於多蛋白G細胞，序列自N末端至C末端包括HA、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L及mB7。 圖2藉由西方墨點顯示蛋白G細胞及多蛋白G細胞中之蛋白G表現。泳道1：3T3細胞；泳道2：蛋白G細胞；及泳道3：多蛋白G細胞。 圖3顯示蛋白G細胞及多蛋白G細胞捕獲抗體之能力。左圖：3T3細胞；中間圖：蛋白G細胞；及右圖：多蛋白G細胞。 圖4顯示由蛋白G細胞及多蛋白G細胞捕獲之抗體之抗原結合能力。左圖：3T3細胞；中間圖：蛋白G細胞；及右圖：多蛋白G細胞。 圖5顯示本發明之多蛋白G之基因序列，其在細菌之膜上表現。對於蛋白G細胞，序列自N末端至C末端包括人類流行性感冒血球凝集素(HA)、蛋白G (C2)、連接體(L)及AIDA。對於多蛋白G細胞，序列自N末端至C末端包括HA、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L及AIDA。 圖6藉由西方墨點顯示蛋白G細菌及多蛋白G細菌中之蛋白G表現。泳道1：BL21細菌；泳道2：蛋白G細菌；及泳道3：多蛋白G細菌。 圖7顯示蛋白G細菌及多蛋白G細菌捕獲抗體之能力。 圖8顯示本發明之多蛋白G之基因序列。序列自N末端至C末端包括HA、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L、C2、L及6個組胺酸。 圖9A及9B顯示多蛋白G之西方墨點(A)及SDS-PAGE (B)。泳道1：PBS作為陰性對照；及泳道2：多蛋白G。 圖10顯示多蛋白G捕獲抗體之能力。 圖11a及b顯示在夾心式ELISA中藉由使用多蛋白G細菌檢測IFN-α (a)及派羅欣(PEGASYS) (b)之靈敏度(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖12a及b顯示在夾心式ELISA中藉由使用多蛋白G檢測IFN-α (a)及派羅欣(b)之靈敏度(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖13顯示，多蛋白G細菌增加西方墨點之靈敏度並改良其檢測極限。 圖14顯示，多蛋白G增加西方墨點之靈敏度並改良其檢測極限。 圖15顯示基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板的捕獲抗體負載量(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖16顯示基於多蛋白G之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板的捕獲抗體負載量(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖17顯示，在相同CTLA4-生物素濃度下，捕獲連續稀釋之抗CTLA4抗體之基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板的CTLA4-生物素結合量(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖18顯示，在連續稀釋之CTLA4-生物素濃度下，捕獲高濃度抗CTLA4抗體之基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板的CTLA4-生物素結合量(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖19顯示，在連續稀釋之CTLA4-生物素濃度下，捕獲低濃度抗CTLA4抗體之基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板的CTLA4-生物素結合量(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖20顯示，在相同PEG5K-生物素濃度下，捕獲連續稀釋之抗PEG抗體之基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板的PEG5K-生物素結合量(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖21顯示，在連續稀釋之PEG2K-Lipo-Dox濃度下，捕獲抗PEG抗體之基於多蛋白G細胞之板及傳統基於聚苯乙烯之板的PEG2K-LipoDox結合量(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖22顯示，在競爭ELISA中基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板對CTLA4之檢測靈敏度(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖23顯示，在競爭ELISA中基於多蛋白G細胞之板及傳統基於聚苯乙烯之板對PEG 5K及PEG750之檢測靈敏度(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖24顯示，在夾心式ELISA中基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板對PEG10K之檢測靈敏度(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖25顯示，在夾心式ELISA中基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板對PEG2K-Lipo-Dox之檢測靈敏度(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖26顯示，在夾心式ELISA中基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板對派羅欣(一種經PEG修飾之蛋白藥物)之檢測靈敏度(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖27顯示，在夾心式ELISA中基於多蛋白G細胞之板、傳統基於聚苯乙烯之板及商業基於蛋白G之板對PEG2K-量子點之檢測靈敏度(誤差槓：平均值=/- SD)。 圖28顯示，使用未純化之捕獲抗體及經純化捕獲抗體，基於多蛋白G細胞之板及傳統基於聚苯乙烯之板對PEG2K-Lipo-Dox之檢測靈敏度(誤差槓：平均值=/- SD)。

<110> 臺北醫學大學

<120> 縱排重複性抗體結合蛋白及其應用

<140> 106123547

<141> 2017-07-13

<160> 4

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 55

<212> PRT

<213> 鏈球菌

<400> 1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<212> 人工序列

<220>

<223> 合成？

<400> 3

<210> 4

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Claims (19)

1. 一種縱排重複性蛋白，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之8至20個重複，該等SEQ ID NO：1之胺基酸序列之8至20個重複由一或多個連接體連續地將該等重複連接，其中該連接體包含GGGGSGGGGSV(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列。
2. 如請求項1之縱排重複性蛋白，其中該縱排重複性蛋白包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之8個重複。
3. 如請求項1之縱排重複性蛋白，其中該縱排重複性蛋白包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列。
4. 一種細胞，其包含在該細胞膜上表現之如請求項1之縱排重複性蛋白，其中該縱排重複性蛋白與該細胞之跨膜蛋白融合。
5. 一種抗體-重複性蛋白複合物，其包含結合至如請求項1之縱排重複性蛋白或結合至如請求項4之細胞之多個抗體或其片段。
6. 如請求項5之抗體-重複性蛋白複合物，其中該抗體係檢測抗體或捕獲抗體。
7. 一種檢測試樣中之分析物之方法，其包含在免疫分析或抗體包覆之 免疫分析中使用如請求項1之縱排重複性蛋白、如請求項4之細胞或如請求項6之抗體-重複性蛋白複合物來捕獲該試樣中之分析物，並定性或定量檢測該分析物。
8. 如請求項7之方法，其包含以下步驟：提供經分析物包覆或未經分析物包覆之固體載體；使多個檢測抗體結合至如請求項1之縱排重複性蛋白或如請求項4之細胞，以形成檢測抗體複合物；使該檢測抗體複合物結合至包覆在該固體載體中之該分析物；及定性或定量檢測該分析物。
9. 如請求項7之方法，其包含以下步驟：提供固體載體；將捕獲抗體固定在該固體載體上；藉由該捕獲抗體捕獲試樣中之該分析物；使多個檢測抗體結合至如請求項1之縱排重複性蛋白或如請求項4之細胞，以形成檢測抗體複合物；添加該檢測抗體複合物以結合至該分析物；及定性或定量檢測該分析物。
10. 如請求項7之方法，其包含以下步驟：提供固體載體；將如請求項1之縱排重複性蛋白或如請求項4之細胞固定在該固體載 體上；使多個捕獲抗體結合至該縱排重複性蛋白或該細胞；藉由捕獲抗體複合物捕獲試樣中之該分析物；添加檢測抗體以結合至該分析物；及定性或定量檢測該分析物。
11. 如請求項7之方法，其包含以下步驟：提供固體載體；將如請求項1之縱排重複性蛋白之片段或如請求項4之細胞固定在該固體載體上；使多個捕獲抗體結合至該縱排重複性蛋白或該細胞，以形成捕獲抗體複合物；將具有預定濃度之經信號標記之分析物與試樣中之該分析物混合以形成混合物；藉由該捕獲抗體複合物捕獲該混合物之該分析物，該分析物為經信號標記之分析物或試樣中之分析物；及定性或定量檢測該分析物。
12. 一種用於檢測試樣中之分析物之套組，其包含經抗原、該分析物或捕獲抗體包覆或未經抗原、該分析物或捕獲抗體包覆之固體載體；及如請求項1之縱排重複性蛋白或如請求項4之細胞。
13. 如請求項12之套組，其進一步包含檢測抗體或捕獲抗體。
14. 如請求項13之套組，其中該檢測抗體可進一步經標記。
15. 如請求項12之套組，其中該固體載體係小片、珠、分析板或試管。
16. 如請求項12之套組，其中該固體載體係96孔微量滴定板。
17. 如請求項12之套組，其用於西方墨點(western blot)或ELISA中，包含經分析物包覆或未經分析物包覆之固體載體及如請求項1之縱排重複性蛋白或如請求項4之細胞。
18. 如請求項12之套組，其用於夾心式ELISA中，包含固體載體；及如請求項1之縱排重複性蛋白或如請求項4之細胞。
19. 如請求項12之套組，其用於競爭ELISA中，包含經如請求項1之縱排重複性蛋白或如請求項4之細胞包覆之固體載體；及如請求項1之縱排重複性蛋白或如請求項4之細胞。

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