CN117074658B - 一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117074658B CN117074658B CN202311346339.2A CN202311346339A CN117074658B CN 117074658 B CN117074658 B CN 117074658B CN 202311346339 A CN202311346339 A CN 202311346339A CN 117074658 B CN117074658 B CN 117074658B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detection
- aptamer
- aflatoxin
- aunps
- line
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 106
- MJBWDEQAUQTVKK-IAGOWNOFSA-N aflatoxin M1 Chemical compound C=1([C@]2(O)C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O MJBWDEQAUQTVKK-IAGOWNOFSA-N 0.000 title claims abstract description 72
- 239000002108 aflatoxin M1 Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 229930073161 aflatoxin M1 Natural products 0.000 title claims abstract description 67
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 30
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 76
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 52
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 50
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 49
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 37
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 31
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 20
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 20
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 14
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 14
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 13
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 11
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 101001018064 Homo sapiens Lysosomal-trafficking regulator Proteins 0.000 claims description 7
- 102100033472 Lysosomal-trafficking regulator Human genes 0.000 claims description 7
- 235000010703 Modiola caroliniana Nutrition 0.000 claims description 7
- 244000038561 Modiola caroliniana Species 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 7
- WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine hydrochloride Chemical compound Cl.ON WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 3
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 claims description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 abstract description 3
- 239000010409 thin film Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 11
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 9
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 6
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 5
- OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B1 Chemical compound C=1([C@@H]2C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 5
- 229930020125 aflatoxin-B1 Natural products 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 4
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 4
- 101100449517 Arabidopsis thaliana GRH1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 101100434479 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) AFB1 gene Proteins 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000010408 film Substances 0.000 description 3
- RWQKHEORZBHNRI-BMIGLBTASA-N ochratoxin A Chemical compound C([C@H](NC(=O)C1=CC(Cl)=C2C[C@H](OC(=O)C2=C1O)C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 RWQKHEORZBHNRI-BMIGLBTASA-N 0.000 description 3
- MBMQEIFVQACCCH-UHFFFAOYSA-N trans-Zearalenon Natural products O=C1OC(C)CCCC(=O)CCCC=CC2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K trisodium;6-oxido-4-sulfo-5-[(4-sulfonatonaphthalen-1-yl)diazenyl]naphthalene-2-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=CC=C2C(N=NC3=C4C(=CC(=CC4=CC=C3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 229930063498 Aflatoxin G1 Natural products 0.000 description 2
- XWIYFDMXXLINPU-WNWIJWBNSA-N Aflatoxin G1 Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1[C@@H]1C=CO[C@@H]1O2 XWIYFDMXXLINPU-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000010811 Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000002115 aflatoxin B1 Substances 0.000 description 2
- 239000002098 aflatoxin G1 Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- -1 AFB Chemical compound 0.000 description 1
- 102100034212 AFG1-like ATPase Human genes 0.000 description 1
- 229930132918 Aflatoxin B2 Natural products 0.000 description 1
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930166256 Aflatoxin G2 Natural products 0.000 description 1
- WPCVRWVBBXIRMA-WNWIJWBNSA-N Aflatoxin G2 Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1[C@@H]1CCO[C@@H]1O2 WPCVRWVBBXIRMA-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 1
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 1
- 241000228230 Aspergillus parasiticus Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000780581 Homo sapiens AFG1-like ATPase Proteins 0.000 description 1
- VYLQGYLYRQKMFU-UHFFFAOYSA-N Ochratoxin A Natural products CC1Cc2c(Cl)cc(CNC(Cc3ccccc3)C(=O)O)cc2C(=O)O1 VYLQGYLYRQKMFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 101000725148 Rattus norvegicus Cytochrome P450 1A2 Proteins 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002097 aflatoxin B2 Substances 0.000 description 1
- WWSYXEZEXMQWHT-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B2 Chemical compound C=1([C@@H]2CCO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O WWSYXEZEXMQWHT-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 1
- 239000002100 aflatoxin G2 Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000019543 dairy drink Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001868 liquid chromatography-fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- DAEYIVCTQUFNTM-UHFFFAOYSA-N ochratoxin B Natural products OC1=C2C(=O)OC(C)CC2=CC=C1C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 DAEYIVCTQUFNTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000000581 reactive spray deposition Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 101150041393 rsd gene Proteins 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N zearalenone Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCCC(=O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/587—Nanoparticles
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒及其检测方法,试剂盒包括:核酸适配体特异性识别元件、荧光素(FAM)标记的DNA链、超纯水、检测试纸条;本发明解决生产现场的黄曲霉毒素M1快速检测目标,具有灵敏度高、特异性好,检测限达0.20 ng/mL,回收率在99%~101%,检测结果准确,能够无需样品前处理直接进行黄曲霉毒素M1的检测。检测黄曲霉毒素M1的核酸薄膜层析检测试纸条具有识别/分离双功能,因而特异性强、灵敏度高、操作简便且无须样品前处理;反应速度快,完成样品的检测操作和数据判读只需10~15 min;检测过程不需要复杂昂贵的仪器设备及较高的专业技术人员操作。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域,具体涉及一种黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素(AFs)是一类具有相似化学结构的二氢呋喃香豆素衍生物。AF包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)和黄曲霉素M1(AFM1),它们主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物。此外,AFs是主要的真菌毒素,占食品和饮料中真菌毒素污染的近93%。动物摄入被AFB1污染的食物或饲料后,AFB1在体内通过细胞色素P-448调节作用和氧化酶系统催化而转化为AFM1。羟基化代谢物的一部分从尿液和牛奶中排出,另一部分存在于动物的可食用部分。因此,检测牛奶中黄曲霉素M1(AFM1)的存在至关重要。目前市场上乳制饮用品受到黄曲霉素M1(AFM1)污染较为严重,不合格产品曝光事件被频繁报道。根据近5年Web of Science检索数据统计:黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种,高居污染物首位。
当前检测黄曲霉素M1(AFM1)方法包括高效液相色谱-荧光检测(HPLC–FLD),超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。HPLC和UPLC-MS/MS因高准确度、灵敏度是最常用的检测方法,也是国家标准规定方法,但是存在成本高、耗时、操作繁琐、样品制备和预处理复杂,需要配备精密昂贵仪器和依靠专业操作人员,属于实验室检测方法,不适于现场快速检测。免疫分析法通常是酶联免疫吸附法(ELISA)及与其他方法相结合的测定方法,如荧光法、电化学法等。免疫分析法虽然具有高灵敏度和高选择性,但通常酶-底物反应需要较长的反应时间,且因食品基质对抗体和抗原结合有影响,易导致检测结果出现假阳性、假阴性,并且所涉及的抗体和酶具有生产成本高、批次重现性差及储存中易变性等局限性。
发明内容
基于此,本发明的目的之一是提供一种黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒,解决生产现场的快速检测目标,具有高灵敏、快速、高选择性和便携等优势。
为了实现上述发明目的,具体技术方案如下:
本发明提供一种黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒,所述检测试剂盒包括:核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)、荧光素(FAM)标记的DNA链(FAM-cDNA)、超纯水、检测试纸条;
所述核酸适配体基因序列如SEQ ID NO.1所示;
所述荧光素标记的DNA链基因序列如SEQ ID NO.2所示,其中是在5′修饰荧光素(FAM)。
优选地,所述核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)的制备方法,包括如下步骤:
S11:Fe3O4纳米粒子的制备:将FeCl3·6H2O与FeSO4·7H2O按质量比2:1加入至含100 mL超纯水的三口烧瓶中,超声5~10 min使其溶解,在N2气氛下,在温度为80℃下,缓慢滴加40~60 mL NH3·H2O,接着加入0.6 mol/L的40~60 mL柠檬酸钠溶液,300 rpm搅拌速度下反应1 h,用超纯水洗涤粗产物至上清液的pH=7,磁分离后倒掉上清液,将剩余物冻干12h;
S12:金纳米粒子(AuNPs)的制备:向超纯水中加入0.006 mol/L柠檬酸钠溶液和0.1 mol/L氯金酸溶液,磁力搅拌1 min后,迅速加入0.1 mol/L硼氢化钠溶液,待溶液变为酒红色后,继续搅拌10 min,然后于25℃水浴中继续反应2 h,所得溶液放置于4℃冰箱备用;
S13:Fe3O4@PEI纳米粒子的制备:取S11中10 mg的Fe3O4纳米粒子与5 mg/mL聚乙烯亚胺溶液(PEI)混合,在400~700 rpm机械搅拌5 h,聚乙烯亚胺溶液(PEI)在Fe3O4纳米粒子上成功自组装,将Fe3O4@PEI纳米粒子用超纯水洗涤5次备用;
S14:Fe3O4@AuNPs纳米粒子的制备:将上述S13制得的Fe3O4@PEI纳米粒子与上述20mL的S12制得的金纳米粒子(AuNPs)混合并超声,在40 kHz、200 W处理30 min,得到粗产物Fe3O4@PEI-Au纳米粒子,利用磁性分离性能将粗产物用超纯水洗涤3次以去除多余的金纳米粒子(AuNPs),接着将制得的Fe3O4@PEI-Au纳米粒子分散在0.4 mM的50 mL氯金酸溶液,并迅速加入0.5 mL的100 mg/mL盐酸羟胺,混匀10 min后,添加0.1~0.2 g聚乙烯吡咯烷酮(K30)并超声处理10 min,最后用超纯水洗涤3次以去除过量的聚乙烯吡咯烷酮(K30),制得Fe3O4@AuNPs纳米粒子,并将其冻干保存备用;
S15:核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)的制备:将10 mM的三(2-羧乙基)膦、100 μM核酸适配体(Aptamer)、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)和超纯水按照体积比1:1:5:5混匀,并于25℃下培养1 h,得到活化的适配体溶液,然后将2.35 mg/mL Fe3O4@AuNPs溶液1~2 mL添加到上述活化的适配体溶液中,并在25℃下振荡16 h,接着添加1%的十二烷基磺酸钠(SDS)10 μL,1 M的NaCl溶液100 μL进行盐老化,将盐老化后的溶液25℃下摇床振荡24 h后,磁分离反应混合物,并用超纯水洗涤3次,得到核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer),再将其分散在pH=8.0的STE缓冲液中,并于4℃下储存备用。
优选地,所述金纳米粒子(AuNPs)的粒径为5~6 nm。
优选地,所述检测试纸条包括样品垫、底衬板、反应膜和吸水垫;
所述反应膜位于中间,所述样品垫和吸水垫分别搭接于反应膜的两端;所述样品垫、吸水垫和反应膜搭接组装于底衬板上;所述反应膜上设置检测线T线和质控线C线,所述检测线T线靠近样品垫,所述质控线C线靠近吸水垫,所述质控线C线下方设置有磁条;所述检测线T线喷涂捕获DNA链C2-DNA,所述捕获DNA链C2-DNA的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地,所述反应膜为硝酸纤维素膜,所述样品垫为玻璃纤维。
基于同一发明构思,本发明的另一目的是提供一种利用黄曲霉毒素M1检测试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
S21:将核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)、荧光素(FAM)标记的DNA链(FAM-cDNA)按比例加入到超纯水中混合,震荡1 min后,室温下孵育10 min,制备出适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA);
S22:将S21制备的适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)加入到待测牛奶样本,混匀、室温孵育5~10 min,制备待测液;
S23:定性检测:吸取待测液滴加到检测试纸条的样品垫上,静置5 min,当检测线T线在365 nm紫外灯下呈现荧光带,质控线C线呈现紫红色,提示检测结果有效,形成阳性检测结果;当无黄曲霉毒素M1(AFM1)时,仅质控线C线呈现紫红色,提示检测结果为阴性;
S24:定量检测:吸取待测液滴加到检测试纸条的样品垫上,静置5 min,当检测线T线在365 nm紫外灯下呈现荧光带,质控线C线呈现紫红色,提示检测结果有效,形成阳性检测结果;使用荧光读数仪测定检测线T线荧光带强度,测定出待测液中黄曲霉毒素M1(AFM1)含量。
优选地,所述核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)和荧光素(FAM)标记的DNA链(FAM-cDNA)的浓度比为5:2。
优选地,所述适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)和待测牛奶样本的体积比为9:1。
本发明上述一个或多个技术方案具有如下技术效果:
本发明所提供的黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好,检测限为0.20 ng/mL,回收率在99%~101%,检测结果准确,能够无需样品前处理直接进行黄曲霉毒素M1(AFM1)的检测。检测黄曲霉毒素M1(AFM1)的核酸薄膜层析检测试纸条具有识别/分离双功能,因而特异性强、灵敏度高、操作简便且无须样品前处理;反应速度快,完成样品的检测操作和数据判读只需10~15 min;检测过程不需要复杂昂贵的仪器设备及较高的专业技术人员操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1、核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)制备流程;
图2、金纳米粒子(AuNPs)的表征图,其中,A:AuNPs水溶液照片、B:AuNPs的UV-vis光谱图、C:AuNPs的TEM图;
图3、Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@AuNPs纳米粒子的表征图,其中,A:Fe3O4纳米粒子在外加磁场下照片、B:Fe3O4纳米粒子的TEM图、C:Fe3O4@AuNPs纳米粒子外加磁场下照片、D:Fe3O4@AuNPs纳米粒子的TEM图;
图4、Fe3O4纳米粒子、Fe3O4@PEI纳米粒子和Fe3O4@AuNPs纳米粒子的表征图,其中A:Zeta电位图、B:FT-IR图谱;
图5、Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@AuNPs纳米粒子的磁滞回线表征;
图6、检测试纸条结构示意图;
图7、适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)检测黄曲霉毒素M1(AFM1)原理示意图;
图8、适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)检测不同浓度的黄曲霉毒素M1(AFM1)的效果图,其中,A:加入不同浓度黄曲霉毒素M1(AFM1,0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10,20, 40, 80, 100, 1000 ng/mL)后传感器的荧光光谱图、B:I/I0与黄曲霉毒素M1(AFM1)浓度之间的线性关系图;
图9、适配体纳米荧光探针Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA检测黄曲霉毒素M1(AFM1)的特异性分析图,横坐标从左到右分别代表:Control是Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA,作为对照组;其他组竞争毒素分别为OTA是赭曲霉毒素A、ZEN是玉米赤霉烯酮毒素、AFB1是黄曲霉毒素B1、AFG1是黄曲霉毒素G1、Mix是黄曲霉毒素M1(AFM1)与其他4种竞争毒素(OTA、ZEN、AFB1、AFG1)混合形成的混合毒素;
其中检测试纸条:1、样品垫,2、底衬板,3、反应膜,4、检测线T线,5、质控线C线,6、磁条,7、吸水垫。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
本发明实施例中各种DNA链的序列如表1所示,所采用的核酸适配体(Aptamer)、荧光素(FAM)标记的DNA链(FAM-cDNA)、C2-DNA均由发明人自己设计,并由武汉金开瑞生物工程有限公司(中国,武汉)合成,且DNA序列经过高效液相色谱(HPLC)进行了进一步纯化。
表1 各种DNA链的序列
核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)的制备过程如图1所示。
实施例1
金纳米粒子(AuNPs)的制备:向超纯水中加入0.006 mol/L柠檬酸钠溶液和0.1mol/L氯金酸溶液,磁力搅拌1 min后,迅速加入0.1 mol/L硼氢化钠溶液,待溶液变为酒红色后,继续搅拌10 min,然后于25℃水浴中继续反应2 h,所得溶液放置于4℃冰箱备用即可制得粒径为5~6 nm的金纳米粒子(AuNPs)。
实施例2
Fe3O4纳米粒子的制备:将FeCl3·6H2O与FeSO4·7H2O按质量比2:1加入至含100 mL超纯水的三口烧瓶中,超声5~10 min使其溶解,在N2气氛下,在温度为80℃下,缓慢滴加40~60 mL NH3·H2O,接着加入0.6 mol/L的40~60 mL柠檬酸钠溶液,300 rpm搅拌速度下反应1h,用超纯水洗涤粗产物至上清液的pH=7,磁分离后倒掉上清液,将剩余物冻干12 h。
实施例3
Fe3O4@PEI纳米粒子的制备:取实施例2中10 mg的Fe3O4纳米粒子与5 mg/mL聚乙烯亚胺溶液(PEI)混合,在400~700 rpm机械搅拌5 h,聚乙烯亚胺溶液(PEI)在Fe3O4纳米粒子上成功自组装,将Fe3O4@PEI纳米粒子用超纯水洗涤5次备用。
实施例4
Fe3O4@AuNPs纳米粒子的制备:将实施例3制得的Fe3O4@PEI纳米粒子与20 mL的实施例1制得的金纳米粒子(AuNPs)混合并超声,在40 kHz、200 W处理30 min,得到粗产物Fe3O4@PEI-Au纳米粒子,利用磁性分离性能将粗产物用超纯水洗涤3次以去除多余的金纳米粒子(AuNPs),接着将制得的Fe3O4@PEI-Au纳米粒子分散在0.4 mM的50 mL氯金酸溶液,并迅速加入0.5 mL的100 mg/mL盐酸羟胺,混匀10 min后,添加0.1~0.2 g聚乙烯吡咯烷酮(K30)并超声处理10 min,最后用超纯水洗涤3次以去除过量的聚乙烯吡咯烷酮(K30),制得Fe3O4@AuNPs纳米粒子,并将其冻干保存备用。
对实施例1-4进行表征:
(1)金纳米粒子(AuNPs)的表征:
金溶胶粒径越大,其溶液就会偏向紫红色,紫外吸收峰对应波长也就越大,相反,粒径越小,溶液颜色将会偏向酒红色,紫外吸收峰对应波长就会越小。图2 A中可以观察到所制备的AuNPs溶液呈现酒红色。使用紫外-可见分光光度计(UV-vis)在350~700 nm范围内扫描AuNPs谱图,如图2 B所示,其特征吸收峰波长为506 nm,符合传统的AuNPs吸收光谱,与溶胶颜色相符,并且与荧光素(FAM)的荧光发射峰重叠,使得二者之间能够产生荧光共振能量转移(FRET)。此外,采用TEM分析了AuNPs的粒径、形貌及表面形态特征,如图2 C的TEM图中观察到AuNPs的形状呈现为球状,粒径大小约为6 nm,这是因为反应所加入的Na BH4强还原性使得AuNPs成核过程十分迅速,这也是各向异性生长几率非常小的原因。以上表征说明了AuNPs的成功合成。
(2)Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@AuNPs纳米粒子的磁分离性和TEM表征:
制备的Fe3O4纳米粒子溶液颜色偏灰黑色,在外加磁场的作用下Fe3O4纳米粒子50s内即可实现完全分离,具有良好的磁分离性能,如图3 A所示。制备的Fe3O4纳米粒子簇的平均直径约为15~20 nm,呈圆球形且表面粗糙,如图3 B的TEM图所示。如预期,AuNPs附着在Fe3O4纳米粒子圆球表面后溶液呈紫黑色,且同样在外加磁场的作用下50 s内即可实现完全分离,具有良好的磁分离性能,如图3 C所示,Fe3O4@AuNPs纳米粒子的TEM形貌图中也可以看到AuNPs和Fe3O4纳米粒子复合,这进一步说明成功合成了Fe3O4@AuNPs纳米粒子,如图3 D所示。
(3)Fe3O4纳米粒子、Fe3O4@PEI纳米粒子和Fe3O4@AuNPs纳米粒子的Zeta电位和FT-IR表征:
Zeta电位表征能够考察粒子表面的带电情况。如图4 A所示,PEI层修饰前与修饰后的Fe3O4分散在去离子水中的Zeta电势从-24.09 mV提高到24.88 mV,这是由于未修饰PEI的Fe3O4表面具有大量-COOH基团呈现负电性,而修饰了均匀一层带大量-NH2的PEI层后呈现强正电性,表明Fe3O4表面成功修饰了一层PEI层,形成Fe3O4@PEI纳米粒子,以用于后续的带负电荷的AuNPs吸附。Fe3O4@PEI纳米粒子与AuNPs吸附复合后的Fe3O4@AuNPs纳米粒子的Zeta电势降低到-10.89 mV,这证明了带负电性AuNPs成功附着带正电性Fe3O4@PEI表面。
PEI修饰的目的是将带正电荷的氨基引入到系统中,在Fe3O4NPs的表面上形成带正电荷的分子键。然后通过静电相互作用的机理,可以提高带负电荷的AuNPs在Fe3O4NPs表面的吸引力和结合效率。如图4 B所示,Fe3O4@PEI和Fe3O4@AuNPs的FT-IR光谱中2876 cm-1、1625cm-1和1673 cm-1的光谱峰分别归属于C-H、C-C和C=O,同时位于1583 cm-1附近的峰归属于氨基的弯曲振动,这证明了氨基的存在。并且这些特征峰表明通过引入PEI中氨基修饰方法,产生静电相互作用成功制备了Fe3O4@AuNPs。
(4)Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@AuNPs纳米粒子的磁滞回线表征:
如图5所示,Fe3O4纳米粒子的饱和磁化强度(MS)值为1.5 emu•g-1,表现出超顺磁性。虽然Fe3O4@AuNPs纳米粒子的MS值有所下降,但仍然保持良好的超顺磁性,能够实现快速分离作用。
实施例5
核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)的制备:将10 mM的三(2-羧乙基)膦、100 μM核酸适配体(Aptamer)、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)和超纯水按照体积比1:1:5:5混匀,并于25℃下培养1 h,得到活化的适配体溶液,然后将2.35 mg/mL Fe3O4@AuNPs溶液1~2 mL添加到活化的适配体溶液中,并在25℃下振荡16 h,接着添加1%的十二烷基磺酸钠(SDS)10 μL,1 M的NaCl溶液100 μL进行盐老化,将盐老化后的溶液25℃下摇床振荡24 h后,磁分离反应混合物,并用超纯水洗涤3次,得到核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer),再将其分散在pH=8.0的STE缓冲液中,并于4℃下储存备用,其中,所述核酸适配体(Aptamer)基因序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例6
如图6所示,用于检测黄曲霉毒素M1(AFM1)的检测试纸条包括样品垫1、底衬板2、反应膜3和吸水垫7;所述反应膜3位于中间,所述样品垫1和吸水垫7分别搭接于反应膜3的两端;所述样品垫1、吸水垫7和反应膜3搭接组装于底衬板2上;所述反应膜3上设置检测线T线4和质控线C线5,所述检测线T线4靠近样品垫1,所述质控线C线5靠近吸水垫7,所述质控线C线5下方设置有磁条6;所述检测线T线4喷涂捕获DNA链C2-DNA,所述捕获DNA链C2-DNA的基因序列如SEQ ID NO.3所示。其中,所述反应膜3为硝酸纤维素膜,所述样品垫1为玻璃纤维。
实施例7
黄曲霉毒素M1(AFM1)检测原理:如图7所示,适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)是利用Fe3O4@AuNPs-aptamer上的适配体(Aptamer)和FAM-cDNA中的cDNA链通过DNA碱基互补配对进行复合,使得Fe3O4@AuNPs-aptamer与FAM-cDNA之间距离靠近。并且由于金纳米粒子(AuNPs)的紫外吸收峰与荧光素(FAM)的荧光发射峰重叠,使得Fe3O4@AuNPs-aptamer和FAM-cDNA之间存在荧光共振能量转移(FRET),致使适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)表现为无荧光(FL OFF)。当检测体系中存在黄曲霉毒素M1(AFM1)时,Fe3O4@AuNPs-aptamer会迅速与黄曲霉毒素M1(AFM1)特异性结合,形成Fe3O4@Au-apt-AFM1纳米复合物,配合利用磁铁将其分离,体系上清液中只有被释放的荧光素(FAM)标记的DNA链(FAM-cDNA),从而检测体系的荧光信号恢复(FL ON),实现了黄曲霉毒素M1(AFM1)的定性检测。并且随着检测体系中黄曲霉毒素M1(AFM1)含量越多,上清液释放的FAM-cDNA越多,体系荧光信号越强,从而根据黄曲霉毒素M1(AFM1)浓度与荧光强度变化值之间的关系实现了黄曲霉毒素M1(AFM1)的定量检测。
黄曲霉毒素M1(AFM1)的具体检测方法为:
步骤1:将核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)、荧光素(FAM)标记的DNA链(FAM-cDNA)按比例加入到超纯水中混合,震荡1 min后,室温下孵育10 min,制备出适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA),其中,所述荧光素标记的DNA链FAM-cDNA基因序列如SEQ ID NO.2所示,其中是在5′修饰荧光素(FAM),核酸适配体特异性识别元件(Fe3O4@AuNPs-aptamer)和荧光素(FAM)标记的DNA链(FAM-cDNA)的浓度比为5:2;
步骤2:将步骤1制备的适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)加入到待测牛奶样本,混匀、室温孵育5~10 min,制备待测液,所述适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)和待测牛奶样本的体积比为9:1;
步骤3:定性检测:吸取待测液滴加到检测试纸条的样品垫上,静置5 min,当存在黄曲霉毒素M1(AFM1)时,适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)在缓冲液中与黄曲霉毒素M1(AFM1)形成Fe3O4@Au-apt-AFM1纳米复合物,并释放FAM-cDNA。释放的FAM-cDNA通过毛细管作用沿纤维素膜向上移动至检测线T时被C2-DNA捕获,检测线T线4在365 nm紫外灯下呈现荧光带,而“Fe3O4@Au-apt-AFM1”纳米复合物向上移动至质控C线被磁条捕获沉降形成肉眼可见的紫红色显色条带,质控线C线5呈现紫红色,提示检测结果有效,形成阳性检测结果;当无黄曲霉毒素M1(AFM1)时,仅质控线C线5呈现紫红色,提示检测结果为阴性;
步骤4:定量检测:吸取待测液滴加到检测试纸条的样品垫上,静置5 min,当存在黄曲霉毒素M1(AFM1)时,适配体纳米荧光探针(Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA)在缓冲液中与AFM1形成Fe3O4@Au-apt-AFM1纳米复合物,并释放FAM-cDNA。释放的FAM-cDNA通过毛细管作用沿纤维素膜向上移动至检测线T时被C2-DNA捕获,检测线T线4在365 nm紫外灯下呈现荧光带,质控线C线5呈现紫红色,提示检测结果有效,形成阳性检测结果;使用荧光读数仪测定检测线T线4荧光带强度,测定出待测液中黄曲霉毒素M1(AFM1)含量。
测试例1
利用实施例5-7,对构建的荧光适配体传感器检测黄曲霉毒素M1(AFM1)的分析性能进行多维度评价。取不同浓度黄曲霉毒素M1(AFM1)标准液(0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10,20, 40, 80, 100, 1000 ng/mL),结果见图8。图8 A显示在体系中加入不同浓度黄曲霉毒素M1(AFM1)后的荧光发射光谱图,随着黄曲霉毒素M1(AFM1)浓度的增加,荧光强度逐渐增加。检测线性相关性如图8 B所示,黄曲霉毒素M1(AFM1)浓度在1~100 ng/mL范围内,相比无黄曲霉毒素M1(AFM1)的荧光增强倍数(I/I0)与黄曲霉毒素M1(AFM1)浓度呈良好的线性关系,线性方程为:I/I0=0.0642C AFM1+6.7886。根据3σ/k(σ为空白样品的标准差)计算出该方法的检出限(LOD)为0.20 ng/mL。
测试例2
利用实施例5-7,黄曲霉毒素M1(AFM1)的浓度是10 ng/mL、其他组竞争毒素的浓度均为50 ng/mL。如图9所示,10 ng/mL AFM1可以使荧光强度呈现显著恢复,增强约8倍,而其它毒素与对照组相比,均未引起明显的荧光强度变化。这是因为黄曲霉毒素M1(AFM1)适配体只对黄曲霉毒素M1(AFM1)具有高特异性和亲和力,对其他毒素亲和力非常弱,因此其它毒素无法使黄曲霉毒素M1(AFM1)适配体与其互补打开,从而不能阻断探针的荧光共振能量转移(FRET)过程,荧光仍处于猝灭。同时,当加入黄曲霉毒素M1(AFM1)与干扰1其他毒素的混合溶液后,荧光恢复值与只加入黄曲霉毒素M1(AFM1)时基本一致,表明该传感器具有优异的抗干扰能力。以上结果证实构建的荧光适配体传感器可实现黄曲霉毒素M1(AFM1)的特异性检测。
测试例3
为了验证所建立方法在实际液态奶样品检测中的可行性和准确性,选择超市购买的牛奶作为实际样品,采用标准加入一定量的黄曲霉毒素M1(AFM1)模拟被黄曲霉毒素M1(AFM1)污染的牛奶样品,然后采用上述构建的检测方法进行检测,实验结果见表1。液态奶的回收率在99%~101%之间,相对标准偏差(RSDs)小于3%。以上结果表明,构建的荧光适配体传感器可用于特异性准确检测牛奶样品中的黄曲霉毒素M1(AFM1)。
表2 牛奶样品中检测AFM1的回收率(n=3)
综上所述,本发明所制备的黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒,可以解决生产现场的快速检测目标,具有灵敏度高、特异性好,检测限达0.20 ng/mL,回收率在99%~101%,检测结果准确,能够无需样品前处理直接进行黄曲霉毒素M1(AFM1)的检测。检测黄曲霉毒素M1(AFM1)的核酸薄膜层析检测试纸条具有识别/分离双功能,因而特异性强、灵敏度高、操作简便且无须样品前处理;反应速度快,完成样品的检测操作和数据判读只需10~15 min;检测过程不需要复杂昂贵的仪器设备及较高的专业技术人员操作。
Claims (7)
1.一种黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括:核酸适配体特异性识别元件Fe3O4@AuNPs-aptamer、荧光素标记的DNA链FAM-cDNA、超纯水、检测试纸条;
所述核酸适配体基因序列为:5′-ATCCGTCACACCTGCTCTGACGCTGGG
GTCGACCCGGAAAATGCATTCCCCTGTGGTGTTGGCTCCCGTAT-3′;所述荧光素标记的DNA链基因序列为:5′-ATACGGGAGCCAACGT-3′,其中是在5′修饰荧光素;
所述检测试纸条包括样品垫(1)、底衬板(2)、反应膜(3)和吸水垫(7);所述反应膜(3)位于中间,所述样品垫(1)和吸水垫(7)分别搭接于反应膜(3)的两端;所述样品垫(1)、吸水垫(7)和反应膜(3)搭接组装于底衬板(2)上;所述反应膜(3)上设置检测线T线(4)和质控线C线(5),所述检测线T线(4)靠近样品垫(1),所述质控线C线(5)靠近吸水垫(7),所述质控线C线(5)下方设置有磁条(6);所述检测线T线(4)喷涂捕获DNA链C2-DNA,所述捕获DNA链C2-DNA的基因序列为5′-ACGTTGGCTCCCGTAT-3′。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒,其特征在于:所述核酸适配体特异性识别元件Fe3O4@AuNPs-aptamer的制备方法,包括如下步骤:
S11:Fe3O4纳米粒子的制备:将FeCl3·6H2O与FeSO4·7H2O按质量比2:1加入至含100 mL超纯水的三口烧瓶中,超声5~10 min使其溶解,在N2气氛下,在温度为80℃下,缓慢滴加40~60 mL NH3·H2O,接着加入0.6 mol/L的40~60 mL柠檬酸钠溶液,300 rpm搅拌速度下反应1h,用超纯水洗涤粗产物至上清液的pH=7,磁分离后倒掉上清液,将剩余物冻干12 h;
S12:金纳米粒子AuNPs的制备:向超纯水中加入0.006 mol/L柠檬酸钠溶液和0.1 mol/L氯金酸溶液,磁力搅拌1 min后,迅速加入0.1 mol/L硼氢化钠溶液,待溶液变为酒红色后,继续搅拌10 min,然后于25℃水浴中继续反应2 h,所得溶液放置于4℃冰箱备用;
S13:Fe3O4@PEI纳米粒子的制备:取S11中10 mg的Fe3O4纳米粒子与5 mg/mL聚乙烯亚胺溶液混合,在400~700 rpm机械搅拌5 h,聚乙烯亚胺溶液在Fe3O4纳米粒子上成功自组装,将Fe3O4@PEI纳米粒子用超纯水洗涤5次备用;
S14:Fe3O4@AuNPs纳米粒子的制备:将S13制得的Fe3O4@PEI纳米粒子与20 mL的S12制得的金纳米粒子AuNPs混合并超声,在40 kHz、200 W处理30 min,得到粗产物Fe3O4@PEI-Au纳米粒子,利用磁性分离性能将粗产物用超纯水洗涤3次以去除多余的金纳米粒子AuNPs,接着将制得的Fe3O4@PEI-Au纳米粒子分散在0.4 mM的50 mL氯金酸溶液,并迅速加入0.5 mL的100 mg/mL盐酸羟胺,混匀10 min后,添加0.1~0.2 g聚乙烯吡咯烷酮并超声处理10 min,最后用超纯水洗涤3次以去除过量的聚乙烯吡咯烷酮,制得Fe3O4@AuNPs纳米粒子,并将其冻干保存备用;
S15:核酸适配体特异性识别元件Fe3O4@AuNPs-aptamer的制备:将10 mM的三(2-羧乙基)膦、100 μM核酸适配体、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液和超纯水按照体积比1:1:5:5混匀,并于25℃下培养1 h,得到活化的适配体溶液,然后将2.35 mg/mL Fe3O4@AuNPs溶液1~2 mL添加到活化的适配体溶液中,并在25℃下振荡16 h,接着添加1%的十二烷基磺酸钠10 μL,1 M的NaCl溶液100 μL进行盐老化,将盐老化后的溶液25℃下摇床振荡24 h后,磁分离反应混合物,并用超纯水洗涤3次,得到核酸适配体特异性识别元件Fe3O4@AuNPs-aptamer,再将其分散在pH=8.0的STE缓冲液中,并于4℃下储存备用。
3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒,其特征在于:所述金纳米粒子AuNPs的粒径为5~6 nm。
4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒,其特征在于:所述反应膜(3)为硝酸纤维素膜,所述样品垫(1)为玻璃纤维。
5.一种利用权利要求1-4任意一项所述黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
S21:将核酸适配体特异性识别元件Fe3O4@AuNPs-aptamer、荧光素标记的DNA链FAM-cDNA按比例加入到超纯水中混合,震荡1 min后,室温下孵育10 min,制备出适配体纳米荧光探针Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA;
S22:将S21制备的适配体纳米荧光探针Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA加入到待测牛奶样本,混匀、室温孵育5~10 min,制备待测液;
S23:定性检测:吸取待测液滴加到检测试纸条的样品垫上,静置5 min,当检测线T线(4)在365 nm紫外灯下呈现荧光带,质控线C线(5)呈现紫红色,提示检测结果有效,形成阳性检测结果;当无黄曲霉毒素M1时,仅质控线C线(5)呈现紫红色,提示检测结果为阴性;
S24:定量检测:吸取待测液滴加到检测试纸条的样品垫上,静置5 min,当检测线T线(4)在365 nm紫外灯下呈现荧光带,质控线C线(5)呈现紫红色,提示检测结果有效,形成阳性检测结果;使用荧光读数仪测定T线(4)荧光带强度,测定出待测液中黄曲霉毒素M1含量。
6.根据权利要求5所述的利用黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒的检测方法,其特征在于:所述核酸适配体特异性识别元件Fe3O4@AuNPs-aptamer和荧光素标记的DNA链FAM-cDNA的浓度比为5:2。
7.根据权利要求5所述的利用黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述适配体纳米荧光探针Fe3O4@Au-apt-FAM-cDNA和待测牛奶样本的体积比为9:1。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311346339.2A CN117074658B (zh) | 2023-10-18 | 2023-10-18 | 一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311346339.2A CN117074658B (zh) | 2023-10-18 | 2023-10-18 | 一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒及其检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117074658A CN117074658A (zh) | 2023-11-17 |
CN117074658B true CN117074658B (zh) | 2023-12-26 |
Family
ID=88715745
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311346339.2A Active CN117074658B (zh) | 2023-10-18 | 2023-10-18 | 一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117074658B (zh) |
Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106970063A (zh) * | 2017-03-02 | 2017-07-21 | 江苏大学 | 一种基于二氧化硅包覆金纳米三角的表面增强拉曼真菌毒素检测方法 |
WO2017197914A1 (zh) * | 2016-05-17 | 2017-11-23 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条及其应用以及利用适配体检测黄曲霉毒素b1或m1的试纸条 |
CN107841527A (zh) * | 2017-11-07 | 2018-03-27 | 天津科技大学 | 一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法 |
CN108008128A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-05-08 | 江南大学 | 核酸适配体识别和功能化磁性微球分离预处理的卡那霉素快速检测试纸及其制备和应用 |
CN108267572A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-07-10 | 江苏大学 | 一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法 |
CN108593742A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-09-28 | 南京工业大学 | 一种定量检测黄曲霉毒素b1的电化学适配体传感器及其应用 |
CN109632910A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-16 | 温州大学 | 功能化Fe3O4/Au纳米复合材料的制备方法及其在真菌毒素检测的应用 |
CN113252903A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-08-13 | 南昌大学 | 一种用于现场检测的磁性荧光微球免疫层析试剂盒及其制作方法与检测方法 |
KR20210130612A (ko) * | 2020-04-22 | 2021-11-01 | 김성천 | 핵산을 단순하게 추출하고 분석하여 표적핵산 검사 방법 및 장치 |
CN113758910A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-07 | 江苏大学 | 一种测定醋醅中黄曲霉毒素b1的拉曼增强光谱方法 |
CN113774063A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-12-10 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 呕吐毒素特异性核酸适配体及应用 |
CN113881790A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-01-04 | 郑州轻工业大学 | 磁性四氧化三铁@适配体及其与荧光试纸条联合在检测食源性致病菌方面的应用 |
CN115901892A (zh) * | 2021-08-24 | 2023-04-04 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种检测dna及以dna为识别分子的目标物的检测方法及装置 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112816450B (zh) * | 2021-01-07 | 2022-12-06 | 青岛农业大学 | 检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及检测黄曲霉毒素b1的方法 |
-
2023
- 2023-10-18 CN CN202311346339.2A patent/CN117074658B/zh active Active
Patent Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017197914A1 (zh) * | 2016-05-17 | 2017-11-23 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条及其应用以及利用适配体检测黄曲霉毒素b1或m1的试纸条 |
CN106970063A (zh) * | 2017-03-02 | 2017-07-21 | 江苏大学 | 一种基于二氧化硅包覆金纳米三角的表面增强拉曼真菌毒素检测方法 |
CN107841527A (zh) * | 2017-11-07 | 2018-03-27 | 天津科技大学 | 一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法 |
CN108267572A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-07-10 | 江苏大学 | 一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法 |
CN108008128A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-05-08 | 江南大学 | 核酸适配体识别和功能化磁性微球分离预处理的卡那霉素快速检测试纸及其制备和应用 |
CN108593742A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-09-28 | 南京工业大学 | 一种定量检测黄曲霉毒素b1的电化学适配体传感器及其应用 |
CN109632910A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-16 | 温州大学 | 功能化Fe3O4/Au纳米复合材料的制备方法及其在真菌毒素检测的应用 |
KR20210130612A (ko) * | 2020-04-22 | 2021-11-01 | 김성천 | 핵산을 단순하게 추출하고 분석하여 표적핵산 검사 방법 및 장치 |
CN113252903A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-08-13 | 南昌大学 | 一种用于现场检测的磁性荧光微球免疫层析试剂盒及其制作方法与检测方法 |
CN115901892A (zh) * | 2021-08-24 | 2023-04-04 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种检测dna及以dna为识别分子的目标物的检测方法及装置 |
CN113774063A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-12-10 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 呕吐毒素特异性核酸适配体及应用 |
CN113758910A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-07 | 江苏大学 | 一种测定醋醅中黄曲霉毒素b1的拉曼增强光谱方法 |
CN113881790A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-01-04 | 郑州轻工业大学 | 磁性四氧化三铁@适配体及其与荧光试纸条联合在检测食源性致病菌方面的应用 |
Non-Patent Citations (13)
Title |
---|
上转换荧光-适配体免疫层析试纸条的构建及其在黄曲霉毒素B1检测上的应用;李丹阳;李立煌;艾超超;任磊;;厦门大学学报(自然科学版)(第02期);全文 * |
基于TMR磁传感器的黄曲霉毒素B_1定量检测方法研究;牛群峰;赵旭燕;惠延波;王莉;周潼;刘任波;;河南工业大学学报(自然科学版)(第03期);全文 * |
基于分子发夹/荧光微球的侧向层析法定量检测黄曲霉毒素B1;周子明;谢彩玲;赵斌;郭狄;;分析测试学报(第06期);全文 * |
基于特异性生物识别分子的黄曲霉毒素快速分析方法研究进展;曾昆;杜道林;薛永来;;生物技术通报(第08期);全文 * |
基于适配体的功能化纳米探针在食品安全检测中的应用进展;周迎卓;王欣;刘宝林;;食品工业科技(第10期);全文 * |
核酸适配体侧流层析分析技术在真菌毒素检测中的应用;赵颖;王楠;陆安祥;冯晓元;郭晓军;栾云霞;;生物技术通报(第08期);全文 * |
核酸适配体技术在食品中霉菌毒素检测的研究进展;杜兵耀;文芳;王加启;郑楠;张养东;赵圣国;;食品科学(第17期);全文 * |
电化学分析法应用于黄曲霉毒素检测的进展研究;杨谦;苏会岚;罗欢;王琴;岑耀颖;;化学传感器(第02期);全文 * |
自组装制备Fe_3O_4@Au复合纳米粒子用于固定化葡萄糖氧化酶;王显祥;黄硕;单志;杨婉身;;科学通报(第04期);全文 * |
适配体生物传感器在赭曲霉毒素检测中的应用;赵阳阳;吕蕾;刘仁杰;金永东;郭志军;;食品科技(第06期);全文 * |
适配体生物传感器在黄曲霉毒素检测中的应用;冯巾;崔承弼;黄宝玺;梁成云;戢爽;吕蕾;田静;郭志军;;食品科技(第08期);全文 * |
食品中黄曲霉菌及黄曲霉毒素B1的快速检测方法研究;刘启君;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》(第01期);第B024-736页 * |
高灵敏磁分离荧光传感法检测黄曲酶毒素B1;曾云龙;张敏;易守军;何盼;赵敏;夏晓东;唐春然;;光子学报(第11期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117074658A (zh) | 2023-11-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zong et al. | Facile detection of tumor-derived exosomes using magnetic nanobeads and SERS nanoprobes | |
US10006908B2 (en) | Core-shell nanoparticles with multiple cores and a method for fabricating them | |
CN108982834B (zh) | 纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法 | |
Ye et al. | An electrochemical immunoassay for Escherichia coli O157: H7 using double functionalized Au@ Pt/SiO2 nanocomposites and immune magnetic nanoparticles | |
Agoston et al. | Rapid isolation and detection of erythropoietin in blood plasma by magnetic core gold nanoparticles and portable Raman spectroscopy | |
Lee et al. | Detection of glyphosate by quantitative analysis of fluorescence and single DNA using DNA-labeled fluorescent magnetic core–shell nanoparticles | |
CN112391347B (zh) | 磁-光复合纳米结构、其制造方法以及检测、分离或成像分析物的方法 | |
Zhao et al. | Selective and sensitive fluorescence detection method for pig IgG based on competitive immunosensing strategy and magnetic bioseparation | |
CN113092766A (zh) | 多种真菌毒素的检测试剂盒,其制备方法及检测方法和应用 | |
EP3851854A1 (en) | Biomaterial-detecting microparticle and biomaterial detection method using same | |
CN111650379A (zh) | 一种金壳磁性拉曼增强纳米标签的制备及免疫层析应用 | |
Ge et al. | Ultra-sensitive magnetic immunoassay of HE4 based on surface enhanced Raman spectroscopy | |
Sadiq et al. | Gold nanoparticles-based colorimetric assays for environmental monitoring and food safety evaluation | |
Liu et al. | Luminescent Rhodamine B doped core–shell silica nanoparticle labels for protein microarray detection | |
CN1580765A (zh) | 一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用 | |
CN117074658B (zh) | 一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒及其检测方法 | |
US20180284110A1 (en) | Clustered precious metal nanoparticles in a stable colloidal suspension and biological applications using the same | |
CN107084951B (zh) | 基于时间分辨荧光标记-适配体检测玉米赤霉烯酮的方法 | |
CN113238037A (zh) | 一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系及其检测方法 | |
Chen et al. | Biomagnetic glass beads for protein separation and detection based on surface-enhanced Raman scattering | |
CN111744472A (zh) | 一种多孔硅铂金纳米酶材料的制备方法及应用 | |
CN115060893A (zh) | 三维均相填充型磁性-贵金属复合纳米酶、其新冠抗原免疫层析试纸及应用 | |
CN113406330A (zh) | 一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法 | |
Li et al. | An improved chemiluminescence immunoassay for the ultrasensitive detection of aflatoxin B1 | |
CN113376135B (zh) | 一种荧光传感系统及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |