CN113376135B - 一种荧光传感系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种荧光传感系统，其由包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体CM6@Lip‑SH分散液与氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子NH2‑Au@Fe3O4分散液组成。本发明提供的荧光传感系统可用于快速检测展青霉素，选择性好，回收率高，背景干扰小，重现性好；无需依赖昂贵的大型仪器，前处理简单，且在保证结果准确性的同时，实现了快速检测，极大的节省了成本，提高了检测效率。

Description

一种荧光传感系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品检测分析技术领域，具体地说涉及一种荧光传感系统及其制备方法和应用。
背景技术
展青霉素(Patulin，PAT)是一种由曲霉属菌、青霉属菌和丝衣霉属菌产生的高度危险的霉菌毒素，经常在水果中被发现，特别是在苹果、葡萄及其衍生物中。急性和慢性摄入展青霉素可导致呼吸和泌尿系统损伤，使人神经麻痹、肺水肿和肾功能衰竭。由于展青霉素毒性高且广泛存在，美国、欧盟和中国规定了苹果汁中的最高限量为50ng mL-1。
近年来，展青霉素的检测方法主要包括气相/液相色谱法、气相/液相色谱法串联质谱法，酶联免疫分析法和薄层色谱法等，这些检测手段灵敏度高，样品检测量大，也非常适合于复杂样品的分离分析；但其中大多数需要昂贵的仪器、复杂的操作和漫长的时间，这限制了它们在现场测试的广泛应用，特别是在资源稀缺地区。
因此有必要研发一种高灵敏、高特异性展青霉素快速检测方法。
发明内容
本发明首先提供了一种荧光传感系统，其由包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体(CM6@Lip-SH)分散液与氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)分散液组成；
其中CM6@Lip-SH纳米材料分散液的脂质浓度为10mg mL-1，是将CM6@Lip-SH纳米材料分散在0.01mol L-1的PBS溶液中得到；其中NH2-Au@Fe3O4分散液的浓度为5mg mL-1，是将NH2-Au@Fe3O4分散在水中得到；
其中包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体(CM6@Lip-SH)分散液作为展青霉素的识别元件与荧光探针；氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)分散液作为脂质体表面巯基基团的识别元件与磁性分离材料；
其中包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体(CM6@Lip-SH)是通过如下方法制备得到的：
(1)将20mg胆固醇，60-140mg大豆磷脂，1-10mg DSPE-PEG-SH(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基)，0.01-0.2mg香豆素6溶于15mL二氯甲烷中，超声至分散均匀；将该分散液转移至圆底烧瓶且置于旋转蒸发仪中将溶剂完全挥发，形成一层薄膜附在瓶壁，往圆底烧瓶中加入2mL的0.01mol L-1PBS缓冲溶液(pH＝7.4)和50μLTCEP(10mmol L-1)溶液，继续水合1小时，最后得到绿色的凝胶状液体；
(2)将(1)所得的凝胶状液体在细胞破碎仪下超声3min，超声完成后再通过0.22μm的滤膜三次，随后在0.01mol L-1PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中透析3-6小时以去除杂质影响，最后分散在上述0.01mol L-1的PBS溶液中制备获得CM6@Lip-SH纳米材料分散液，脂质浓度为10mg mL-1。
其中所述的氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)是参考下列文献中的方法合成的。
参考文献1：A.O.Baskakov,A.Y.Solov'eva,Y.V.Ioni,S.S.Starchikov,I.S.Lyubutin,Khodos,II,et al.,Magnetic and interface properties of the core-shell Fe3O4/Au nanocomposites,Appl.Surf.Sci.422(2017)638-644.
参考文献2:S.Guo,S.Dong,E.Wang,A General Route to Construct DiverseMultifunctional Fe3O4/Metal Hybrid Nanostructures,Chem.Eur.J.15(2009)2416-2424.
本发明还提供了上述荧光传感系统在检测展青霉素中的应用。
本发明还提供了一种用上述荧光传感系统检测展青霉素的方法，该方法包括如下步骤：
所有荧光测量均在F-7000分光光度计上进行，进行实验时的激发波长为450-460nm，收集荧光强度信号时的发射波长为500-510nm；激发和发射的狭缝宽度为10nm；扫描速度为1200nm min-1，响应时间为0.5s；光电倍增管(PMT)电压为400V；
(1)将100-300μL包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体分散液逐滴滴加到50μL待测溶液中，搅拌反应一段时间后再加入800-1400μL氨基功能化的金包四氧化三铁NH2-Au@Fe3O4分散液，在室温下摇床震荡反应1-2小时；
(2)用磁铁吸附(1)中反应所得的混合分散液，并弃去上清液，用100-300μL的0.01mol L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)对磁力吸附的复合物进行复溶，测量并记录其在505nm处的荧光强度；
(3)首先利用固定的已知浓度的展青霉素标准溶液进行以上操作步骤，记录不同浓度下最终得到的荧光强度，然后通过分析与拟合得到不同展青霉素浓度(Cpatulin)和其对应的荧光强度相对空白的变化量(ΔF)之间的标准曲线以及计算公式(ΔF＝a*Cpatulin+b，a和b为常数)，最后将待测果汁样品溶液进行以上(1)和(2)操作步骤所得到的荧光强度代入上述标准曲线计算测定待测溶液中展青霉素浓度。
本发明的有益效果：
(1)首次合成了包覆香豆素6作为信号探针的巯基修饰脂质体(CM6@Lip-SH)，纳米脂质体表面积大、内空间大，能作为一种有效的载体材料负载荧光信号分子及巯基官能团。对展青霉素反应时间快、选择性高、可提高识别展青霉素的灵敏度。
(2)香豆素6具有优良的光物理性质，发射波长长，斯托克斯位移大，光稳定性好，选择香豆素6作为信号探针能提升荧光传感系统在检测展青霉素时的检测限和灵敏度。
(3)采用氨基修饰的金包四氧化三铁纳米粒子进行磁性分离，过程简单、绿色、试剂消耗低，能有效地消除展青霉素测定过程中的背景干扰。
(4)本发明以香豆素6的荧光信号分子并将其包覆在巯基修饰的纳米脂质体中来进行展青霉素的检测，并利用磁性分离有效消除测定中的背景干扰。所用仪器只有分光光度计，设备简单。总之，该荧光传感系统制备简单，价格低廉，可实现对果汁中的展青霉素的高灵敏和高特异性检测。
附图说明：
图1为实施例1中包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体(CM6@Lip-SH)的透射电镜(TEM)图片
图2为实施例1中展青霉素、CM6@Lip-SH以及展青霉素与CM6@Lip-SH结合物的紫外光谱图
图3氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)的TEM图片
图4氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)的VSM磁力图
图5为实施例2中当展青霉素的浓度在0.05-20ng mL-1时，与所最对应收集的复溶液的荧光强度(ΔF)变化之间的标准曲线(不含虚线)
图6为实施例2中荧光传感系统对50ng mL-1毒素干扰物(5-HMF、AOH、CIT、AFB1、OTA)存在下相对于空白溶液荧光强度的变化值(ΔF)，其中展青霉素的浓度固定为5ng mL-1
图7为实施例2中荧光传感系统对50ng mL-1重金属离子干扰物(Hg，As，Cr，Cd，Pb，Cu，Zn七种重金属离子)存在下相对于空白溶液荧光强度的变化值(ΔF)，其中展青霉素的浓度固定为5ng mL-1
具体实施方式
下面给出的实施例为对本发明作进一步的说明。本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读本发明实例后，本领域技术人员能领会并在公开的实施中做许多改变也可获得相同或类似的结果，均属于本发明的构思和范围。更具体的说，有些试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似结果。所有类似的取代或修饰均被认为本发明的构思和范围，所有上述等价形式均属于本发明权利要求书限定的范围。
原料来源及测试仪器：
大豆磷脂购买于上海麦克林生化科技有限公司；
胆固醇、氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl-triethoxysilane,APTES)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(polyethylene glycol)-thiol,DSPE-PEG-SH)、二氯甲烷、柠檬酸三钠、三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride,TCEP)、氢氧化铵、香豆素-6购买于阿拉丁试剂(上海)有限公司；
四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O)购买于Sigma-Aldrich公司(美国)；
七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、六水合氯化铁(FeSO4·7H2O)购买于上海泰坦科技有限公司；
透析袋(8-12KDa)购买于上海源叶生物科技有限公司；
Mycosep 228多功能净化柱购买于ROMER国际贸易(北京)有限公司；
展青霉素(patulin,PAT)、交链格孢酚(alternariol，AOH)、桔青霉素(citrinin，CIT)、黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)及赭曲霉毒素A(ochratoxin，OTA)、铅离子(Pd)、镉离子(Cd)、汞离子(Hg)、砷离子(As)、铬离子(Cr)、锌离子(Zn)和铜离子(Cu)购买于Sigma-Aldrich公司(美国)；
实验用水为二次去离子水；
苹果汁及葡萄汁购买于上海乐购超市；
所有荧光分析实验均在F-7000荧光分光光度计(日立，日本)上进行。
实施例1:
包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体(CM6@Lip-SH)和氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)的制备：
1、包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体(CM6@Lip-SH)的制备，具体步骤如下：
(1)将20mg胆固醇，100mg大豆磷脂，5mg DSPE-PEG-SH，0.1mg香豆素6溶于15mL二氯甲烷中，超声至分散均匀。将该分散液转移至圆底烧瓶且置于旋转蒸发仪中将溶剂完全挥发，形成一层薄膜附在瓶壁，往圆底烧瓶中加入2mL的0.01mol L-1PBS缓冲溶液(pH＝7.4)和50μL TCEP(10mmol L-1)溶液，继续水合1小时，最后得到绿色的凝胶状液体。
(2)将(1)所得的凝胶状液体在细胞破碎仪下超声3min，超声完成后再通过0.22μm的滤膜三次，随后在0.01mol L-1PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中透析3小时以去除杂质影响，最后分散在上述PBS溶液中，脂质浓度为10mg mL-1，得到包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体(CM6@Lip-SH)。
2、氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)的制备，具体步骤如下：(1)将4.46g六水合氯化铁和2.39g七水合硫酸亚铁溶于250mL去离子水中，然后快速加入10mL氨水并在80℃下搅拌1小时，反应结束后将得到的四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4)收集并用去离子水和乙醇清洗三次，在60℃下干燥12小时。
(2)将40mg四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4)和1.5mL浓度为0.03mol L-1的四水合氯金酸溶液加入到100mL浓度为0.035mol L-1的柠檬酸三钠溶液中，并在90℃下反应5分钟，随后将反应体系控制在50℃且持续搅拌20分钟，反应结束后磁力收集产物，用去离子水清洗三次，然后将其分散在去离子水中，使得分散液浓度为5mg mL-1。
(3)将1mL上述第(2)步所得的分散液再次分散在50mL的80％乙醇水溶液中，然后加入10μL的APTES(≥99％)并持续搅拌12小时，反应完成后使用磁力分离收集产物，用去离子水和乙醇清洗三遍，得到NH2-Au@Fe3O4纳米粒子，最终将得到的氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)分散在去离子水中，使得分散液浓度为5mg mL-1，于室温下保存备用。
本实施例的荧光传感系统由包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体(CM6@Lip-SH)分散液与氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)分散液组成；
其中CM6@Lip-SH纳米材料分散液的脂质浓度为10mg mL-1，是将CM6@Lip-SH纳米材料分散在0.01mol L-1的PBS溶液中得到；其中NH2-Au@Fe3O4分散液的浓度为5mg mL-1，是将NH2-Au@Fe3O4分散在水中得到。
实验结果：
(1)包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体(CM6@Lip-SH)的TEM图片如图1所示，CM6@Lip-SH呈球形囊泡结构，无任何聚集，分散性较好，粒径大小约为130nm。
(2)图2说明了展青霉素与CM6@Lip-SH的特异性结合作用，展青霉素的紫外特征峰为275nm，当展青霉素与CM6@Lip-SH一起孵育15min后，所形成的复合物的紫外光谱中发现275nm的峰消失，证明了展青霉素与CM6@Lip-SH可以发生特异性反应。
(3)氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)的TEM图片如图3所示，纳米粒子直径大小约为180nm，分布均匀，形貌良好；图4是氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子(NH2-Au@Fe3O4)的VSM磁力图，最大比磁化强度为53.2emu g-1，说明制备出来的纳米粒子磁力较强，易于后期的分离与检测。
实施例2:
实施例1制备得到的展青霉素荧光传感系统测定样品中的展青霉素
所有荧光测量均在F-7000分光光度计(日本日立公司)上进行，激发波长为455nm，发射波长为505nm。激发和发射的狭缝宽度为10nm。扫描速度为1200nm min-1，响应时间为0.5s。光电倍增管(PMT)电压为400V。
所有荧光测量均在F-7000分光光度计(日本日立公司)上进行，进行实验时的激发波长为455nm，收集荧光强度信号时的发射波长为505nm；激发和发射的狭缝宽度为10nm；扫描速度为1200nm min-1，响应时间为0.5s；光电倍增管(PMT)电压为400V；
具体的检测步骤：
(1)将200μL包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体分散液逐滴滴加到50μL待测溶液(葡萄汁和苹果汁)中，搅拌反应一段时间后再加入800-1000μL氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子，在室温下摇床震荡反应1-2小时；
(2)用磁铁吸附(1)中反应所得的混合分散液，并弃去上清液，用200μL的0.01molL-1PBS缓冲液(pH＝7.4)对磁力吸附的复合物进行复溶，测量并记录其在505nm处的荧光强度；
(3)首先利用固定的已知浓度的展青霉素标准溶液进行以上操作步骤，记录不同浓度下最终得到的荧光强度，然后通过分析与拟合得到不同展青霉素浓度(Cpatulin)和其对应的荧光强度相对空白的变化量(ΔF)之间的标准曲线以及计算公式(ΔF＝a*Cpatulin+b，a和b为常数)，最后将待测果汁样品溶液进行以上(1)和(2)操作步骤所得到的荧光强度代入上述标准曲线计算测定待测溶液中展青霉素浓度。
所有实验均在室温下完成，苹果汁和葡萄汁样品稀释四倍后过0.22μm滤膜，然后加入缓冲液中进行测定。
实验结果：
(1)荧光传感系统用于实际样品的检测：在若干份葡萄汁和苹果汁的检测中，有1份葡萄汁和1份苹果汁都检出了展青霉素，其含量分别为10.8ng mL-1和11.7ng mL-1。采用Mycosep 228多功能净化柱对果汁样品进行前处理后，参考文献报道的方法，采用UPLC-MS/MS方法检测该阳性样本，测定得到其含量分别为11.3ng mL-1和12.3ng mL-1，与本实施例的方法测定的结果基本一致，表明所发明的方法准确可靠。
(2)荧光传感系统检测方法的线性与灵敏度验证：在0.01mol L-1PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，添加不同浓度的展青霉素(0,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,5,10,15,20,25ng mL-1)，然后进行检测，结果如附图5所示，随着展青霉素浓度的不断增加，在0.05ngmL-1-20ng mL-1浓度范围内，其浓度(Cpatulin)与505nm处荧光强度变化(ΔF)呈线性关系，其中ΔF为加入不同浓度展青霉素后最终得到的荧光强度值(F)与空白溶液(未添加展青霉素)中荧光强度(F0)的变化值，标准曲线方程为ΔF＝303.5Cpatulin+22.4，线性相关系数为0.996，该方法所得最低检出限为0.033ng mL-1(S/N＝3)，表明实施例1的荧光传感系统具有较高的灵敏度，可以用于样品中痕量展青霉素的检测。
(3)荧光传感系统检测方法的选择性验证：为了考察所发明荧光传感系统的选择性，在0.01mol L-1PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，添加5ng mL-1展青霉素或者其干扰物，比较了实施例1的荧光传感系统对5ng mL-1展青霉素及其干扰物(5-HMF，AOH，CIT，AFB1，OTA以及Hg，As，Cr，Cd，Pb，Cu，Zn七种重金属离子，浓度均为50ng mL-1)的荧光强度相应变化(ΔF)。如附图6和附图7所示，5ng mL-1展青霉素的ΔF为2100左右，而50ng mL-1的干扰真菌毒素和重金属离子的ΔF非常小，接近于空白溶液中的荧光强度值。考虑到真实样品中存在着多种真菌毒素和重金属，我们研究了该传感系统在这些干扰物质单独存在或者共存的情况下对5ng mL-1展青霉素荧光强度变化值(ΔF)的影响。从图中可看出荧光信号变化值ΔF没有显著变化，与只存在5ng mL-1展青霉素相差不大。建立的传感系统的高特异性可以归结为两点：一是展青霉素和巯基基团之间的高优先级和特异性反应；二是NH2-Au@Fe3O4纳米粒子中NH2基团可与重金属离子结合来消除干扰。
(4)荧光传感系统检测方法的重现性验证：在含有10ng mL-1展青霉素的0.01molL-1PBS溶液(pH＝7.4)中对荧光传感器的重现性进行了评估，在一天内重复测试6次来研究日内精密度；在连续6天内每天进行测试来分析日间精密度。所得到的日内和日间相对标准差(RSD)分别为3.5％和4.5％，表明所建立的传感系统重复性好，稳定性好。
(5)荧光传感系统检测方法的回收率验证：采用基质加标法对方法的回收率进行考察，取空白苹果汁和葡萄汁样本，分别添加低、中、高三个浓度水平(0.1ng mL-1，1ng mL-1和10ng mL-1)的展青霉素标准品，回收率结果为96.2-107.6％之间。
综上可见，实施例1中制备的，以包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体与氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子所构建的荧光传感系统，可以快速检测展青霉素，获得高灵敏度，同时选择性好，回收率高，重现性好。与现有检测方法相比，无需依赖昂贵的大型仪器，前处理简单，且在保证结果准确性的同时，实现了快速检测，极大的节省了成本，提高了检测效率。
本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种荧光传感系统，其特征在于其由包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体CM6@Lip-SH分散液与氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子NH2-Au@Fe3O4分散液组成；
其中CM6@Lip-SH分散液的脂质浓度为10mg mL-1，是将CM6@Lip-SH分散在0.01mol L-1的PBS溶液中得到；其中NH2-Au@Fe3O4分散液的浓度为5mg mL-1，是将NH2-Au@Fe3O4分散在水中得到；
其中包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体CM6@Lip-SH是通过如下方法制备得到的：
(1)将20mg胆固醇，60-140mg大豆磷脂，1-10mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基，0.01-0.2mg香豆素6溶于15mL二氯甲烷中，超声至分散均匀；将该分散液转移至圆底烧瓶且置于旋转蒸发仪中将溶剂完全挥发，形成一层薄膜附在瓶壁，往圆底烧瓶中加入1-3mL的0.01mol L-1PBS缓冲溶液，pH＝7.4，和20-50μL浓度为10mmol L-1的三(2-羧乙基)膦溶液，继续水合1小时，最后得到绿色的凝胶状液体；
(2)将(1)所得的凝胶状液体在细胞破碎仪下超声3min，超声完成后再通过0.22μm的滤膜3-6次，随后在0.01mol L-1PBS缓冲溶液，pH＝7.4，中透析3-6小时以去除杂质影响，最后分散在上述PBS溶液中制备获得CM6@Lip-SH纳米材料，脂质浓度为10mg mL-1。
2.权利要求1所述荧光传感系统在检测展青霉素中的应用。
3.一种用权利要求1所述荧光传感系统检测展青霉素的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将100-300μL包覆香豆素6的巯基修饰纳米荧光脂质体CM6@Lip-SH分散液滴加到50μL待测溶液中，搅拌反应一段时间后再加入800-1000μL氨基功能化金包四氧化三铁纳米粒子NH2-Au@Fe3O4分散液，在室温下摇床震荡反应1-2小时；
(2)用磁铁吸附(1)中反应所得的混合分散液，并弃去上清液，用100-300μL的0.01molL-1PBS缓冲液pH＝7.4对磁力吸附的复合物进行复溶，测量并记录其在505nm处的荧光强度；
(3)首先利用固定的已知浓度的展青霉素标准溶液进行以上操作步骤，记录不同浓度下最终得到的荧光强度，然后通过分析与拟合得到不同展青霉素浓度Cpatulin和其对应的荧光强度相对空白的变化量ΔF之间的标准曲线以及计算公式ΔF＝a*Cpatulin+b，最后将待测果汁样品溶液进行以上(1)和(2)操作步骤所得到的荧光强度代入上述标准曲线计算测定待测溶液中展青霉素浓度。
4.根据权利要求3所述的检测展青霉素的方法，其中荧光测量在F-7000分光光度计上进行，进行实验时的激发波长为450-460nm，收集荧光强度信号时的发射波长为500-510nm；激发和发射的狭缝宽度为10nm；扫描速度为800-1400nm min-1，响应时间为0.5s；光电倍增管PMT电压为400V。
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