CN108371942A - 一种复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米磁性材料和生物技术领域,具体涉及一种复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA‑Ni2+及其制备和应用。本发明通过二硫键作用,将BSA表面巯基化的磁性Fe3O4纳米粒子与金纳米粒子自组装形成超顺磁性Fe3O4@Au纳米粒子,采用MPA对超顺磁性Fe3O4@Au纳米粒子表面羧基化后,通过酰胺键作用再与亲和配体NTA‑Ni2+偶联,所制得的Fe3O4@Au/MPA/NTA‑Ni2+复合磁性纳米粒子具有超顺磁性,其平均水合粒径为100nm~1000nm,平均Zeta电位为0~‑25mv,分散性良好;其应用于蛋白质分离纯化时,过程简便,分离快速,且循环使用6次后,仍具有较高的分离纯化效率。
Description
技术领域
本发明属于纳米磁性材料和生物技术领域,具体涉及一种复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+及其制备和应用。
背景技术
随着生物技术的发展,用重组技术制备蛋白质药物成为研究热点,而蛋白质药物研究中,蛋白质的分离纯化又是最为关键的一环,分离纯化效率和成本直接影响了蛋白质药物的开发,因此,蛋白质的分离纯化技术的优化刻不容缓。
现有分离纯化蛋白质方法包括有盐析、有机溶剂、膜分离技术、离子交换技术和亲和层析技术,其中亲和层析法是基于固定化配体与带有亲和标签的蛋白的相互作用而进行分离的,其特异性和选择性领先于其他分离技术而受到广泛应用,但处理工艺复杂、费时且对微量蛋白的纯化效率不高,从而限制了其在该方向中的广泛应用。
由于比表面积高、溶解性能好、快速分离等优点,磁性纳米粒子在蛋白质分离纯化领域具有独特的优势。随着磁性纳米粒子的生物分离和生物分析的发展,将磁性纳米粒子与金纳米粒子结合,形成复合磁性纳米粒子(Fe3O4@Au)越来越受欢迎。文献[Bao,J.;Chen,W.;Liu,T.;Zhu,Y.;Jin,P.;Wang,L.;Liu,J.;Wei,Y.;Li,Y.ACS Nano2007,1,293–298.]通过化学键制备了Au-Fe3O4纳米粒子,并成功应用于蛋白质分离。专利103115934A公开了一种基于Fe3O4@Au纳米粒子间接富集免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法。但是这些所报道的纳米复合物没有完好的金壳,导致Fe3O4磁性纳米粒子稳定性较差,且其表面官能团的修饰也不是很均匀。
有研究报道,通过聚乙烯亚胺的桥连作用经过三个步骤成功制备了结构良好的Fe3O4/Au核/壳纳米材料,即首先合成聚乙烯亚胺(PEI)修饰的Fe3O4纳米粒子,由于-NH2使其表面带正电荷,然后利用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子,所制备的金纳米粒子表面带负电荷,再通过静电吸附作用自组装成Fe3O4/Au核/壳纳米材料;再用巯基丙酸将Fe3O4/Au核/壳纳米材料进行表面修饰,进一步将其与NTA-Ni2+鳌合,得到了生物功能化的磁性-NTA-N2 +-复合纳米材料。然后将其应用于His-Tag融合蛋白的富集、纯化和分离。结果表明,此材料可以从细胞裂解液中特异有效的富集His-Tag融合麦芽糖键合蛋白(MBP),材料经EDTA和NiCl2处理后可重复使用。由于Fe3O4/Au核/壳纳米材料是通过静电吸附形成,作用力较弱,导致稳定性不高。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备及其分离纯化组氨酸标签蛋白质的应用,不但解决了其稳定性和表面修饰不均匀的问题,还大大提高了其分离纯化效率及循环利用率。
一种复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+,所述复合磁性纳米粒子是由磁性Fe3O4纳米粒子为核,通过TEOS和APTES-COOH使其表面羧基化,加入BSA通过酰胺键的形成进一步使Fe3O4纳米粒子表面巯基化,再加入金纳米粒子利用二硫键自组装形成结构密实的核壳磁性Fe3O4@Au纳米粒子,采用MPA修饰使其表面富含羧基,最后与NTA-Ni2+偶联得到,所述复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的分子结构式如下式一所示:
其中:所述的TEOS为正硅酸四乙酯,所述的APTES-COOH为羧基化的氨丙基三乙氧基硅烷,所述MPA为3-巯基丙酸,所述的BSA为牛血清白蛋白,所述的NTA为次氮基三乙酸。
具体的,所述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的平均水合粒径为100nm~1000nm,平均Zeta电位为0~-25mv。
上述两种复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子:将FeCl3·6H2O、醋酸铵、柠檬酸三钠以质量比为1︰2~5︰0.2~1的比例溶于乙二醇中,加热至170℃时保持1h,冷却至室温,将溶液转移到反应釜中200℃反应8~16h,进行磁分离,用无水乙醇和水交替洗涤3~4次后分散在无水乙醇中;
2)Fe3O4纳米粒子的表面改性:将马来酸酐(顺丁烯二酸酐)置于圆底烧瓶中,在冰水浴条件下逐滴加入APTES,混匀搅拌,待反应物变成白色固体,即APTES-COOH则停止反应;将步骤1)制得的含Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和氨水加入到无水乙醇中,分散均匀后置于40℃的水浴锅反应,加入TEOS反应2~5h;加入APTES-COOH,继续反应6~9h后磁分离或离心分离,用去离子水洗涤3~4次后分散在超纯水中,得到表面改性的Fe3O4纳米粒子;其中Fe3O4纳米粒子、氨水、TEOS和APTES-COOH的质量比为1︰10~200︰0.1~3︰1~10;
3)Au纳米粒子的制备:将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜,再用超纯水清洗;将HAuCl4溶液置于三口烧瓶中,在冷凝回流下将溶液加热至沸腾;快速加入2mL柠檬酸三钠溶液,反应10min后去除热源继续搅拌15min,得到酒红色的溶液即为胶体金溶液,4℃保存待用;其中HAuCl4溶液的质量体积浓度为0.01%,柠檬酸三钠溶液的质量体积浓度为为1%;
4)Fe3O4@Au纳米粒子的制备:将步骤2)中制得的含表面改性的Fe3O4纳米粒子水溶液,用PBS缓冲液磁分离清洗3~5次,最后分散在PBS缓冲液中;加入EDC搅拌30min,再加入NHS和BSA,反应过夜,用PBS缓冲液洗涤数次并分散在PBS缓冲液中;加入过量的步骤3)中制得的胶体金溶液,室温搅拌过夜,磁分离或离心分离,用PBS缓冲液洗涤数次分散在PBS缓冲液中,得到Fe3O4@Au纳米粒子;其中PBS缓冲液浓度为0.01M,pH为7.4,Fe3O4@SiO2-COOH、EDC、NHS和BSA的质量比为1︰2~10︰2~10︰2~10;
5)Fe3O4@Au表面羧基化:将步骤4)中制得Fe3O4@Au纳米粒子磁分离,并用超纯水洗涤3次,分散在超纯水中;加入3-巯基丙酸(MPA),用0.1mol/L的NaOH或KOH溶液调节pH至10,室温下搅拌14h,磁分离或离心分离,用PBS缓冲液洗涤3~5次,最后分散在PBS缓冲液中,得到表面羧基化的Fe3O4@Au磁性纳米粒子;其中碱液为0.1mol/L的NaOH或KOH溶液,Fe3O4@Au纳米粒子和MPA质量比为1︰3~20;
6)Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备:向步骤5)中制得的表面羧基化的Fe3O4@Au磁性纳米粒子(Fe3O4@Au/MPA)溶液中加入EDC,搅拌0.5~1h;再加入NHS,搅拌0.5~1.5h;然后加入溶解在PBS缓冲液中的NTA,在室温下搅拌过夜,反应结束后磁分离,用超纯水洗涤数次,并分散在超纯水中;最后加入过量NiCl2溶液,反应2~4h,用结合缓冲液洗涤3次,最后分散在结合缓冲液中,得到Fe3O4@Au/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子;其中NiCl2溶液溶度为1M,Fe3O4@Au/MPA、EDC、NHS和NTA的质量比为1︰2~10︰2~10︰0.1~5。
其中,EDC为1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,NHS为N-羟基丁二酰亚胺,BSA为牛血清白蛋白。
一种利用上述复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+快速分离纯化组氨酸标签蛋白质的方法,其特征在于,包括以下步骤:取含Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子的结合缓冲液,加入含组氨酸标签蛋白质溶液,在冰水浴中搅拌孵育2~6h,磁分离,取上清液;磁分离后的磁性纳米粒子采用浓度梯度洗脱,收集上清液;将全部上清液进行SDS-PAGE分析和蛋白质浓度测定;其中Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+和组氨酸标签蛋白质的质量比为10~50︰1,结合缓冲液中含20mM PBS、500mM NaCl和5mM咪唑,pH为7.4,洗脱所用洗脱液为咪唑洗脱液,即在浓度为pH 8.0、20mM的PBS中,咪唑浓度分别为250mM、500nM、1M、2M,每种浓度的洗脱液均洗涤2次;
所述组氨酸标签蛋白质为绿色荧光组氨酸标签蛋白质;
所述分离纯化后的复合磁性纳米粒子的重复利用需要将分离纯化后的黑色磁性纳米粒子分散于超纯水中,加入过量NiCl2溶液反应,反应2~4h,用结合缓冲液洗涤3次,最后分散在结合缓冲液中。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1)通过二硫键作用,将BSA表面巯基化的磁性Fe3O4纳米粒子与金纳米粒子自组装形成超顺磁性Fe3O4@Au纳米粒子,其核/壳结构明显,具有良好的热稳定性和单分散性。
2)采用MPA对超顺磁性Fe3O4@Au纳米粒子表面羧基化后,通过酰胺键作用再与亲和配体NTA-Ni2+偶联,从而实现复合磁性纳米粒子与带有组氨酸标签蛋白质间的螯合作用,提高其对蛋白质的捕获效率。
3)所制得的Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子具有超顺磁性,其平均水合粒径为100nm~1000nm,平均Zeta电位为0~-25mv,分散性良好;其应用于蛋白质分离纯化时,过程简便,分离快速,且循环使用6次后,仍具有较高的分离纯化效率。
附图说明
图1为本发明Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的水合粒径分布图;
图2为本发明Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的Zeta电位分布图;
图3为本发明Fe3O4@Au的TEM图;
图4为本发明Fe3O4@Au/MPA/NTA的红外光谱图;
图5为本发明Fe3O4、Fe3O4@Au、Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的磁滞回线图;
图6为本发明Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的XPS谱图;
图7为本发明Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+用于绿色荧光组氨酸标签蛋白质(His-tagged GFP)的SDS-PAGE图;
图8为本发明蛋白质浓度测定结果;
图9为本发明绿色荧光组氨酸标签蛋白质(His-tagged GFP)荧光标准曲线;
图10为本发明Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+用于分离纯化蛋白质混合溶液的SDS-PAGE图;
图11为本发明Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+重复使用后用于分离纯化蛋白质混合溶液的SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作进一步说明,但并不局限于此,凡采用对本发明技术方案同等替换或修改,而不脱离本发明技术原理及主旨,均应涵盖在本发明要求的保护范围。
下述实施例1~5均为Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子的制备,采用动态光散射激光粒度仪(DLS)对其水合粒径分布及Zeta电位分布进行测定,结果表明所制得的Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子的平均水合粒径为100nm~1000nm,平均Zeta电位为0~-25mv,单分散性良好。
实施例1:
上述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+采用如下方法制备而成,包括如下步骤:
1)溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子:1.156g六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、3.3012g醋酸铵(NH4AC)、0.3424g柠檬酸三钠溶于60mL乙二醇,加热至170℃时保持1小时;冷却至室温后,将溶液转移到反应釜中,在200℃反应16小时;反应结束后进行磁分离,用无水乙醇和水交替洗涤3次,最后分散在无水乙醇中;
2)Fe3O4纳米粒子的表面改性:①取1.96g马来酸酐(顺丁烯二酸酐)置于10mL圆底烧瓶中,冰水浴的条件下逐滴加入3.4mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),放入转子搅拌,待反应物变成白色固体,APTES-COOH即停止反应。②取含90mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和5mL的0.898g/mL氨水加入到100mL无水乙醇中,分散均匀后置于40℃的水浴锅反应;加入45μL的0.93g/mL正硅酸四乙酯(TEOS),反应2h;加入300mg APTES-COOH,再反应7h后结束反应,磁分离或离心分离,用去离子水洗涤3次,最后分散在超纯水中;
3)Au纳米粒子的制备:将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜,再用超纯水清洗;将配置质量体积比为0.01%HAuCl4溶液置于200mL的三口烧瓶中,在冷凝回流下将溶液加热至沸腾;快速加入2mL新配置的质量体积比为1%柠檬酸三钠溶液,反应10min去除热源继续搅拌15min,得到酒红色的溶液即为胶体金溶液,4℃保存待用;
4)Fe3O4@Au纳米粒子的制备:取含90mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液,用30mL pH7.4的PBS缓冲液磁分离清洗5次,最后分散在50mL PBS缓冲液中;加入250mg1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌30min,再加入250mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和270mg牛血清白蛋白(BSA),反应过夜,用PBS缓冲液洗涤数次并分散在PBS缓冲液中;加入过量的胶体金溶液,室温搅拌过夜,磁分离或离心分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤3次,最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中;
5)Fe3O4@Au表面羧基化:取90mg Fe3O4@Au纳米粒子并进行磁分离,用超纯水洗涤3次,最后分散在超纯水中;加入540mg 3-巯基丙酸(MPA),用0.1mol/.L NaOH溶液调节pH至10,室温下搅拌14h,磁分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤5次,最后分散在0.01M PBS(pH7.4)中;
6)Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备:取90mg表面羧基化的Fe3O4@Au磁性纳米粒子(Fe3O4@Au/MPA)溶液,加入250mg EDC,搅拌0.5h;再加入250mg NHS,搅拌1.5h;然后加入30mg次氮基三乙酸(NTA)(溶解在0.01M pH为7.4的PBS溶液中),在室温下搅拌过夜,反应结束后磁分离,用超纯水洗涤3次,并分散在超纯水中;最后加入过量1M NiCl2溶液,反应4h,用PBS缓冲液洗涤3次,最后分散在PBS(pH=7.4,20mM PBS,500mM NaCl,5mM咪唑)中。
DLS结果表明,Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子的平均水合粒径为813.2nm,PDI为0.329(见图1),平均Zeta电位为-11.2mv(见图2),单分散性良好。从Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+溶液在外加磁场作用下的分离效果可以看出,在没有外加磁场时,复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+为黑色均匀溶液,在外加磁场作用下快速分层,如2min内,上层为无色透明液体,下层为黑色磁性纳米粒子,结果表明该复合磁性纳米粒子可实现快速分离的目的。从图3所示的Fe3O4@Au的TEM图可以看出,Au成功地包覆在磁性Fe3O4内核表面,Au纳米粒子的粒径约为8~12nm,Fe3O4磁性内核的粒径约为200nm,且核壳Fe3O4@Au具有较好的分散稳定性,无聚集现象。从图3所示Fe3O4@Au/MPA/NTA的FTIR谱图可以看出,580cm-1处是Fe3O4中Fe-O键的伸缩振动峰,为Fe3O4磁性纳米粒子的特征吸收峰,1225cm-1是羧基中O-H弯曲振动峰,1396、1647、2923cm-1处对应于酰胺键中的C-N、C=O、N-H振动吸收峰,说明NTA成功修饰在复合磁性纳米粒子表面。图4为Fe3O4、Fe3O4@Au、Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的磁滞回线图,横坐标为外加磁场强度,纵坐标为单位质量磁性物质在外加磁场存在时的感应磁性大小。从图4可以看出,三条曲线都经过原点,即当外加磁场为0时,Fe3O4、Fe3O4@Au、Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的磁感应强度都为0,符合超顺磁的概念,说明所制备的磁性纳米粒子均是超顺磁性的,且随着磁性Fe3O4内核表面的包覆和进一步修饰,磁化值降低,可以用于蛋白分离。图5所示的Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的XPS谱图表明有Fe、Au、C、Ni元素的存在,从而证实了其化学结构。
实施例2
上述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+采用如下方法制备而成,包括如下步骤:
1)溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子:1.156g六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、2.312g醋酸铵(NH4AC)、0.8216g柠檬酸三钠溶于60mL乙二醇,加热至170℃时保持1h;冷却至室温后,将溶液转移到反应釜中,在200℃反应8h;反应结束后进行磁分离,用无水乙醇和水交替洗涤3次,最后分散在无水乙醇中;
2)Fe3O4纳米粒子的表面改性:①取1.96g马来酸酐(顺丁烯二酸酐)置于10mL圆底烧瓶中,冰水浴的条件下逐滴加入3.4mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),放入转子搅拌,待反应物变成白色固体,APTES-COOH即停止反应。②取含90mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和1mL的0.898g/mL氨水加入到100mL无水乙醇中,分散均匀后置于40℃的水浴锅反应;加入30μL的0.93g/mL正硅酸四乙酯(TEOS),反应2h;加入300mg APTES-COOH,再反应7h后结束反应,磁分离或离心分离,用去离子水洗涤3次,最后分散在超纯水中;
3)Au纳米粒子的制备:将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜,再用超纯水清洗;将配置质量体积比为0.01%HAuCl4溶液置于200mL的三口烧瓶中,在冷凝回流下将溶液加热至沸腾;快速加入2mL新配置的质量体积比为1%柠檬酸三钠溶液,反应10min去除热源继续搅拌15min,得到酒红色的溶液即为胶体金溶液,4℃保存待用;
4)Fe3O4@Au纳米粒子的制备:取含90mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液,用30mL pH7.4的PBS缓冲液磁分离清洗4次,最后分散在30mL PBS缓冲液中;加入270mg 1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌30min,再加入270mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和360mg BSA,反应过夜,用PBS缓冲液洗涤数次并分散在PBS缓冲液中;加入过量的胶体金溶液,室温搅拌过夜,磁分离或离心分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤3次,最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中;
5)Fe3O4@Au表面羧基化:取90mg Fe3O4@Au纳米粒子并进行磁分离,用超纯水洗涤3次,最后分散在超纯水中;加入450mg 3-巯基丙酸(MPA),用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至10,室温下搅拌14h,磁分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤4次,最后分散在0.01M PBS(pH7.4)中;
6)Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备:取90mg表面羧基化的Fe3O4@Au磁性纳米粒子(Fe3O4@Au/MPA)溶液,加入360mg EDC,搅拌0.5h;再加入360mg NHS,搅拌1.5h;然后加入50mg次氮基三乙酸(NTA)(溶解在0.01M pH为7.4的PBS溶液中),在室温下搅拌过夜,反应结束后磁分离,用超纯水洗涤3次,并分散在超纯水中;最后加入过量1M NiCl2溶液,反应3h,用PBS缓冲液洗涤3次,最后分散在PBS(pH=7.4,20mM PBS,500mM NaCl,5mM咪唑)中。
实施例3
上述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+采用如下方法制备而成,包括如下步骤:
1)溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子:1.156g六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、5.78g醋酸铵(NH4AC)、0.2312g柠檬酸三钠溶于60mL乙二醇,加热至170℃时保持1h;冷却至室温后,将溶液转移到反应釜中,在200℃反应10h;反应结束后进行磁分离,用无水乙醇和水交替洗涤4次,最后分散在无水乙醇中;
2)Fe3O4纳米粒子的表面改性:①取1.96g马来酸酐(顺丁烯二酸酐)置于10mL圆底烧瓶中,冰水浴的条件下逐滴加入3.4mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),放入转子搅拌,待反应物变成白色固体,APTES-COOH即停止反应。②取含90mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和20mL的0.898g/mL氨水加入到100mL无水乙醇中,分散均匀后置于40℃的水浴锅反应;加入145μL的0.93g/mL正硅酸四乙酯(TEOS),反应2h;加入300mg APTES-COOH,再反应7h后结束反应,磁分离或离心分离,用去离子水洗涤3次,最后分散在超纯水中;
3)Au纳米粒子的制备:将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜,再用超纯水清洗;将配置质量体积比为0.01%HAuCl4溶液置于200mL的三口烧瓶中,在冷凝回流下将溶液加热至沸腾;快速加入2mL新配置的质量体积比为1%柠檬酸三钠溶液,反应10min去除热源继续搅拌15min,得到酒红色的溶液即为胶体金溶液,4℃保存待用;
4)Fe3O4@Au纳米粒子的制备:取含90mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液,用30mL pH7.4的PBS缓冲液磁分离清洗3次,最后分散在30mL PBS缓冲液中;加入450mg 1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌30min,再加入450mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和540mg BSA,反应过夜,用PBS缓冲液洗涤数次并分散在PBS缓冲液中;加入过量的胶体金溶液,室温搅拌过夜,磁分离或离心分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤3次,最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中;
5)Fe3O4@Au表面羧基化:取90mg Fe3O4@Au纳米粒子并进行磁分离,用超纯水洗涤3次,最后分散在超纯水中;加入900mg 3-巯基丙酸(MPA),用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至10,室温下搅拌14h,磁分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤3次,最后分散在0.01MPBS(pH7.4)中;
6)Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备:取90mg表面羧基化的Fe3O4@Au磁性纳米粒子(Fe3O4@Au/MPA)溶液,加入450mg EDC,搅拌0.5h;再加入450mg NHS,搅拌1.5h;然后加入300mg次氮基三乙酸(NTA)(溶解在0.01M pH为7.4的PBS溶液中),在室温下搅拌过夜,反应结束后磁分离,用超纯水洗涤3次,并分散在超纯水中;最后加入过量1M NiCl2溶液,反应2h,用PBS缓冲液洗涤3次,最后分散在PBS(pH=7.4,20mM PBS,500mM NaCl,5mM咪唑)中;
实施例4
上述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+采用如下方法制备而成,包括如下步骤:
1)溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子:1.156g六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、4.517g醋酸铵(NH4AC)、1.156g柠檬酸三钠溶于60mL乙二醇,加热至170℃时保持1h;冷却至室温后,将溶液转移到反应釜中,在200℃反应15h;反应结束后进行磁分离,用无水乙醇和水交替洗涤4次,最后分散在无水乙醇中;
2)Fe3O4纳米粒子的表面改性:①取1.96g马来酸酐(顺丁烯二酸酐)置于10mL圆底烧瓶中,冰水浴的条件下逐滴加入3.4mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),放入转子搅拌,待反应物变成白色固体,APTES-COOH即停止反应。②取含90mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和16mL的0.898g/mL氨水加入到100mL无水乙醇中,分散均匀后置于40℃的水浴锅反应;加入270μL的0.93g/mL正硅酸四乙酯(TEOS),反应2h;加入300mg APTES-COOH,再反应7h后结束反应,磁分离或离心分离,用去离子水洗涤3次,最后分散在超纯水中;
3)Au纳米粒子的制备:将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜,再用超纯水清洗;将配置质量体积比为0.01%HAuCl4溶液置于200mL的三口烧瓶中,在冷凝回流下将溶液加热至沸腾;快速加入2mL新配置的质量体积比为1%柠檬酸三钠溶液,反应10min去除热源继续搅拌15min,得到酒红色的溶液即为胶体金溶液,4℃保存待用;
4)Fe3O4@Au纳米粒子的制备:取含20mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液,用10mL pH7.4的PBS缓冲液磁分离清洗4次,最后分散在10mL PBS缓冲液中;加入200mg 1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌30min,再加入145mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和120mg乙酰胺(BSA),反应过夜,用PBS缓冲液洗涤数次并分散在PBS缓冲液中;加入过量的胶体金溶液,室温搅拌过夜,磁分离或离心分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤3次,最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中;
5)Fe3O4@Au表面羧基化:取20mg Fe3O4@Au纳米粒子并进行磁分离,用超纯水洗涤3次,最后分散在超纯水中;加入400mg 3-巯基丙酸(MPA),用0.1mol/.L NaOH溶液调节pH至10,室温下搅拌14h,磁分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤5次,最后分散在0.01M PBS(pH7.4)中;
6)Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备:取20mg表面羧基化的Fe3O4@Au磁性纳米粒子(Fe3O4@Au/MPA)溶液,加入200mg EDC,搅拌0.5h;再加入100mg NHS,搅拌1.5h;然后加入15mg次氮基三乙酸(NTA)(溶解在0.01M PH为7.4的PBS溶液中),在室温下搅拌过夜,反应结束后磁分离,用超纯水洗涤3次,并分散在超纯水中;最后加入过量1M NiCl2溶液,反应3h,用PBS缓冲液洗涤3次,最后分散在PBS(pH=7.4,20mM PBS,500mM NaCl,5mM咪唑)中。
实施例5
上述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+采用如下方法制备而成,包括如下步骤:
1)溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子:1.156g六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、2.891g醋酸铵(NH4AC)、0.6453g柠檬酸三钠溶于60mL乙二醇,加热至170℃时保持1h;冷却至室温后,将溶液转移到反应釜中,在200℃反应13h;反应结束后进行磁分离,用无水乙醇和水交替洗涤3次,最后分散在无水乙醇中。
2)Fe3O4纳米粒子的表面改性:①取1.96g马来酸酐(顺丁烯二酸酐)置于10mL圆底烧瓶中,冰水浴的条件下逐滴加入3.4mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),放入转子搅拌,待反应物变成白色固体,APTES-COOH即停止反应。②取含90mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和3mL的0.898g/mL氨水加入到100mL无水乙醇中,分散均匀后置于40℃的水浴锅反应;加入9.7μL的0.93g/mL正硅酸四乙酯(TEOS),反应2h;加入300mg APTES-COOH,再反应7h后结束反应,磁分离或离心分离,用去离子水洗涤3次,最后分散在超纯水中;
3)Au纳米粒子的制备:将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜,再用超纯水清洗;将配置质量体积比为0.01%HAuCl4溶液置于200mL的三口烧瓶中,在冷凝回流下将溶液加热至沸腾;快速加入2mL新配置的质量体积比为1%柠檬酸三钠溶液,反应10min去除热源继续搅拌15min,得到酒红色的溶液即为胶体金溶液,4℃保存待用;
4)Fe3O4@Au纳米粒子的制备:取含90mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液,用30mL pH7.4的PBS缓冲液磁分离清洗3次,最后分散在30mL PBS缓冲液中;加入225mg 1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌30min,再加入225mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和900mgBSA,反应过夜,用PBS缓冲液洗涤数次并分散在PBS缓冲液中;加入过量的胶体金溶液,室温搅拌过夜,磁分离或离心分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤3次,最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中;
5)Fe3O4@Au表面羧基化:取90mg Fe3O4@Au纳米粒子并进行磁分离,用超纯水洗涤3次,最后分散在超纯水中;加入700mg 3-巯基丙酸(MPA),用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至10,室温下搅拌14h,磁分离,用0.01M PBS(pH7.4)洗涤4次,最后分散在0.01M PBS(pH7.4)中;
6)Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备:取90mg表面羧基化的Fe3O4@Au磁性纳米粒子(Fe3O4@Au/MPA)溶液,加入700mg EDC,搅拌0.5h;再加入800mg NHS,搅拌1.5h;然后加入350mg次氮基三乙酸(NTA)(溶解在0.01M pH为7.4的PBS溶液中),在室温下搅拌过夜,反应结束后磁分离,用超纯水洗涤3次,并分散在超纯水中;最后加入过量1M NiCl2溶液,反应4h,用PBS缓冲液洗涤3次,最后分散在PBS(pH=7.4,20mM PBS,500mM NaCl,5mM咪唑)中。
下述实施例6~8均为Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用。
实施例6
取含2mg Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的结合缓冲液,加入50μL绿色荧光组氨酸标签蛋白质的结合缓冲液(1mg/mL),在冰水浴中搅拌孵育4h,磁分离,取上清液;结合蛋白质的复合磁性纳米粒子分别采用250mM、500nM、1M、2M咪唑洗脱液(pH=8.0,20mMPBS)进行梯度洗脱,每种浓度的咪唑洗脱液均洗涤2次,取上清液;将全部上清液进行荧光分析和SDS-PAGE分析。
图7为复合磁性纳米粒子分离纯化绿色荧光组氨酸标签蛋白质(His-tagged GFP)的SDS-PAGE图。从图7可以看出,His-tagged GFP的平均分子量为60kDa,His-tagged GFP与复合磁性纳米粒子结合后的上清液没有条带,经过浓度梯度洗脱后均出现明显的条带,说明Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+对His-tagged GFP具有很强的结合能力。图8为His-tagged GFP荧光标准曲线,根据此标准曲线计算的复合磁性纳米粒子与蛋白质结合后的上清液及进行浓度梯度洗脱的蛋白质浓度见表1。结果表明,Fe3O4@Au/NTA-Ni2+对His-tagged GFP的结合率高达92.3%。
表1对应荧光标准曲线的His-tagged GFP浓度
实施例7
取含1mg Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的结合缓冲液,加入30μL绿色荧光组氨酸标签蛋白质的结合缓冲液(1mg/mL),在冰水浴中搅拌孵育2h,磁分离,取上清液;结合蛋白质的复合磁性纳米粒子分别采用250mM、500nM、1M、2M咪唑洗脱液(pH=8.0,20mMPBS)进行梯度洗脱,每种浓度的咪唑洗脱液均洗涤2次,取上清液;将全部上清液进行荧光分析和SDS-PAGE分析。结果表明,Fe3O4@Au/NTA-Ni2+对His-tagged GFP的结合率高达91.8%。
实施例8
取含5mg Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的结合缓冲液,加入100μL绿色荧光组氨酸标签蛋白质的结合缓冲液(1mg/mL),在冰水浴中搅拌孵育6h,磁分离,取上清液;结合蛋白质的复合磁性纳米粒子分别采用250mM、500nM、1M、2M咪唑洗脱液(pH=8.0,20mMPBS)进行梯度洗脱,每种浓度的咪唑洗脱液均洗涤2次,取上清液;将全部上清液进行荧光分析和SDS-PAGE分析。结果表明,Fe3O4@Au/NTA-Ni2+对His-tagged GFP的结合率高达96.0%。
实施例9:Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+分离纯化蛋白质溶液
取含50mg Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的结合缓冲液,加入高表达组氨酸标签蛋白质溶液10mL,在冰水浴中搅拌孵育4h,磁分离,取上清液;结合蛋白质的复合磁性纳米粒子分别采用250mM、500nM、1M、2M咪唑洗脱液进行梯度洗脱,其中咪唑洗脱液含pH=8.0的20mMPBS,每种浓度的洗脱液均洗涤2次,取上清液;将全部溶液进行SDS-PAGE分析和蛋白质浓度测定。
图9为Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+用于分离纯化蛋白质溶液的SDS-PAGE图。图9结果表明,目标蛋白质的平均分子量为116kDa,其与复合磁性纳米粒子结合后的上清液没有条带,经过浓度梯度洗脱后均出现明显的条带,说明Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+对目标蛋白质具有很强的结合能力。图10为利用NANODROP 2000c紫外分光光度计(Thermo,U.S.A)对上清液及洗脱液中蛋白质浓度进行测定的结果,结果表明Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+对目标蛋白质的结合率高达91.4%。
实施例10:循环利用情况分析
将实施例9中解吸附后的复合磁性纳米粒子分散于超纯水中,加入过量1M NiCl2溶液,反应4h,用结合缓冲液洗涤3次,最后分散在结合缓冲液(20mM PBS、500mM NaCl、5mM,pH7.4)中,重复上述分离纯化蛋白质实验步骤。
图11为循环利用Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+分离纯化蛋白质溶液的SDS-PAGE图。从图11可以看出,Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+循环使用6次后仍具有较好的分离纯化效果,说明该复合磁性纳米粒子循环使用率高。
Claims (10)
1.一种复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+,其特征在于:所述复合磁性纳米粒子是由磁性Fe3O4纳米粒子为核,通过TEOS和APTES-COOH使其表面羧基化,加入BSA通过酰胺键的形成进一步使Fe3O4纳米粒子表面巯基化,再加入金纳米粒子利用二硫键自组装形成结构密实的核壳磁性Fe3O4@Au纳米粒子,采用MPA修饰使其表面富含羧基,最后与NTA-Ni2+偶联得到,所述复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的分子结构式如下式一所示:
其中:所述的TEOS为正硅酸四乙酯,所述的APTES-COOH为羧基化的氨丙基三乙氧基硅烷,所述MPA为3-巯基丙酸,所述的BSA为牛血清白蛋白,所述的NTA为次氮基三乙酸。
2.根据权利要求1所述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+,其特征在于:所述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的平均水合粒径为100nm~1000nm,平均Zeta电位为0~-25mv。
3.一种根据权利要求1或2所述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子:将六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、醋酸铵、柠檬酸三钠溶于乙二醇中,加热至170℃时保持1h,冷却至室温,将溶液转移到反应釜中200℃反应8~16h,进行磁分离,用无水乙醇和水交替洗涤3~4次后分散在无水乙醇中;
所述FeCl3·6H2O、醋酸铵、柠檬酸三钠质量比为1︰2~5︰0.2~1;
2)Fe3O4纳米粒子的表面改性:将马来酸酐(顺丁烯二酸酐)置于圆底烧瓶中,在冰水浴条件下逐滴加入APTES,混匀搅拌,待反应物变成白色固体,即APTES-COOH则停止反应;将步骤1)制得的含Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和氨水加入到无水乙醇中,分散均匀后置于40℃的水浴锅反应,加入TEOS反应2~5h;加入APTES-COOH,继续反应6~9h后磁分离或离心分离,用去离子水洗涤3~4次后分散在超纯水中,得到表面改性的Fe3O4纳米粒子;
所述Fe3O4纳米粒子、氨水、TEOS和APTES-COOH的质量比为1︰10~200︰0.1~3︰1~10;
3)Au纳米粒子的制备:将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜,再用超纯水清洗;将HAuCl4溶液置于的烧瓶中,在冷凝回流下将溶液加热至沸腾;快速加入柠檬酸三钠溶液,反应数分钟后去除热源继续搅拌,得到酒红色的溶液即为胶体金溶液,4℃保存待用;
所述HAuCl4溶液的质量体积浓度为0.01%,柠檬酸三钠溶液的质量体积浓度为为1%;
4)Fe3O4@Au纳米粒子的制备:将步骤2)中制得的含表面改性的Fe3O4纳米粒子水溶液,用PBS缓冲液磁分离清洗3~5次,最后分散在PBS缓冲液中;加入EDC搅拌30min,再加入NHS和BSA,反应过夜,用PBS缓冲液洗涤数次并分散在PBS缓冲液中;加入过量的步骤3)中制得的胶体金溶液,室温搅拌过夜,磁分离或离心分离,用PBS缓冲液洗涤数次分散在PBS缓冲液中,得到Fe3O4@Au纳米粒子;
所述EDC为1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,NHS为N-羟基丁二酰亚胺;
所述PBS缓冲液浓度为0.01M,pH为7.4;
所述Fe3O4@SiO2-COOH、EDC、NHS和BSA的质量比为1︰2~10︰2~10︰2~10;
5)Fe3O4@Au表面羧基化:将步骤4)中制得Fe3O4@Au纳米粒子磁分离,并用超纯水洗涤3次,分散在超纯水中;加入MPA,用碱液调节pH至9~11,室温下搅拌过夜,磁分离或离心分离,用PBS缓冲液洗涤3~5次,最后分散在PBS缓冲液中,得到表面羧基化的Fe3O4@Au/MPA磁性纳米粒子;
所述碱液为0.1mol/L的NaOH或KOH溶液;
所述Fe3O4@Au纳米粒子和MPA质量比为1︰3~20;
6)Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备:向步骤5)中制得的表面羧基化的Fe3O4@Au磁性纳米粒子(Fe3O4@Au/MPA)溶液中加入EDC,搅拌0.5~1h;再加入NHS,搅拌0.5~1.5h;然后加入溶解在PBS缓冲液中的NTA,,在室温下搅拌过夜,反应结束后磁分离,用超纯水洗涤数次,并分散在超纯水中;最后加入过量NiCl2溶液,反应2~4h,用结合缓冲液洗涤3次,最后分散在结合缓冲液中,得到Fe3O4@Au/NTA-Ni2+的复合磁性纳米粒子;
所述NiCl2溶液溶度为1M;
所述结合缓冲液为含500mM NaCl和5mM咪唑的20mM PBS,pH为7.4。
所述Fe3O4@Au/MPA、EDC、NHS和NTA的质量比为1︰2~10︰2~10︰0.1~5。
4.根据权利要求3所述复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备方法,其特征在于:在所述步骤1)中在200℃下保持反应16h。
5.根据权利要求3所述复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备方法,其特征在于:所述步骤3)中快速加入2mL新配置的柠檬酸三钠溶液,反应10min去除热源继续搅拌15min反应。
6.根据权利要求3所述复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+的制备方法,其特征在于:所述步骤5)中反应液的pH调至10,室温下搅拌14h。
7.一种利用权利要求1或2所述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+快速分离纯化组氨酸标签蛋白质的方法,其特征在于,包括以下步骤:取含Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子的结合缓冲液,加入含组氨酸标签蛋白质溶液,在冰水浴中搅拌孵育2~6h,磁分离,取上清液;磁分离后的磁性纳米粒子采用浓度梯度洗脱,收集上清液;将全部上清液进行SDS-PAGE分析和蛋白质浓度测定;
所述Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+和组氨酸标签蛋白质的质量比为10~50︰1。
8.根据权利要求7所述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+快速分离纯化组氨酸标签蛋白质的方法,其特征在于:所述洗脱所用洗脱液为咪唑洗脱液,即在浓度为pH8.0、20mM的PBS中,咪唑浓度分别为250mM、500nM、1M、2M,每种浓度的洗脱液均洗涤2次。
9.根据权利要求7所述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+快速分离纯化组氨酸标签蛋白质的方法,其特征在于:所述组氨酸标签蛋白质为绿色荧光组氨酸标签蛋白质。
10.根据权利要求7所述的复合磁性纳米粒子Fe3O4@Au/MPA/NTA-Ni2+快速分离纯化组氨酸标签蛋白质的方法,其特征在于:所述分离纯化后的复合磁性纳米粒子的重复利用需要将分离纯化后的黑色磁性纳米粒子分散于超纯水中,加入过量NiCl2溶液反应,反应2~4h,用结合缓冲液洗涤3次,最后分散在结合缓冲液中。
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