CN108164662A - 一种特异性吸附牛血红蛋白的分子印迹磁性纳米颗粒 - Google Patents

一种特异性吸附牛血红蛋白的分子印迹磁性纳米颗粒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性吸附牛血红蛋白的分子印迹磁性纳米颗粒，属于生化分离技术领域。本发明制备了一种具有特异性吸附目标蛋白能力的分子印迹功能化磁性纳米颗粒。该颗粒对于牛血红蛋白的吸附分离条件温和、反应简单快速，可实现在蛋白质混合溶液中对目标蛋白——牛血红蛋白的特异性吸附，为蛋白质的分离与纯化研究奠定良好的基础。

Description

一种特异性吸附牛血红蛋白的分子印迹磁性纳米颗粒
技术领域
本发明涉及一种特异性吸附牛血红蛋白的分子印迹磁性纳米颗粒，属于生化分离技术领域。
背景技术
分子印迹是基质与目标分子在分子大小、形态构象、三维结构、活性基团等方面存在互补配对的现象。分子印迹技术(Molecularly ImprintedTechnology,MIT)以目标分子作为模板，将具有与目标分子互补结构的功能化聚合物单体与模板分子结合，并加入交联剂进行聚合反应，反应完成后将模板分子洗脱下来，形成一种具有固定空穴大小和形状以及有确定排列功能团的分子印迹聚合物。分子印迹技术最广泛的应用是在小分子物质的识别和分离中，如固相萃取、抗生素检测、毒素检测以及药物释放等领域。
分子印迹聚合物有多种制备方法。目前已研究过的有溶液本体聚合法、悬浮聚合法、乳液聚合法、种子膨胀聚合法、沉淀聚合法以及表面印迹技术。目前，表面分子印迹技术由于传质阻力小、印迹效率高、吸附速率快等特点而越来越受到关注。表面分子印迹技术是指在固体载体表面印迹上分子聚合物的方法，它有两种基本形式，一种是在载体内部的孔隙表面，如介孔材料；一种是在球形小颗粒表面，如二氧化硅颗粒、石墨烯颗粒、Fe3O4磁性纳米颗粒等。这些表面分子印迹材料都具有高印迹效率的特点，但是，大部分却由于具有亲水基团、沉降过程繁杂而分离效率不高。而结合了磁感应性与表面分子印迹聚合物的分子印迹Fe3O4磁性纳米颗粒不仅实现了高选择性、高吸附性，还实现了基质与溶液体系的有效快速分离，从而有利于目标分子的获取。
虽然蛋白质分子量大、结构复杂、构象易变，但是，将分子印迹技术应用于蛋白质的识别、吸附、分离和富集等方面的研究近年来越来越受到关注。
发明内容
本发明制备了一种具有特异性吸附目标蛋白能力的分子印迹功能化磁性纳米颗粒。该颗粒对于牛血红蛋白的吸附分离条件温和、反应简单快速，可实现在蛋白质混合溶液中对目标蛋白——牛血红蛋白的特异性吸附，为蛋白质的分离与纯化研究奠定良好的基础。
所述具有特异性吸附目标蛋白能力的分子印迹功能化磁性纳米颗粒的制备方法包括一步法制备硅烷化丙烯酸功能化Fe3O4磁性纳米颗粒(Fe3O4@SiO2-AA)、制备分子印迹磁颗粒(MMIPs)。
所述一步法制备硅烷化丙烯酸功能化Fe3O4@SiO2-AA颗粒，包括以下步骤：
(1)制备Fe3O4磁性纳米颗粒
具体地，称取FeSO4·7H2O与FeCl3·6H2O，加入去离子水和无水乙醇(二者体积比为5：1)，通入氮气，搅拌反应一段时间后，加入氨水调整pH为10-11，溶液瞬间由棕红色变为黑色，继续熟化反应，得到Fe3O4磁性纳米颗粒沉淀物；
(2)Fe3O4磁性纳米颗粒的硅烷化丙烯酸功能化修饰
具体地，将熟化后的反应体系温度降为28～30℃，逐滴加入TEOS进行硅烷化修饰，搅拌反应1-3h；将硅烷化修饰后的反应溶液置于外加磁场中，除去上清反应液，将磁颗粒用去离子水清洗数遍后，加入乙醇和丙烯酸(AAm)，通入氮气，并水浴搅拌反应2-5h；反应完成后，将功能化修饰后的磁性纳米颗粒置于外加磁场进行分离，清洗后于真空中浓缩干燥。
进一步地，整个反应过程中需维持氮气氛围，以免Fe3O4被氧化。
在本发明一种实施方式中，将熟化后的反应体系温度降为30℃，逐滴加入5％的TEOS乙醇溶液(TEOS乙醇溶液与制备Fe3O4磁性纳米颗粒时所用去离子水的体积比为1：10)进行硅烷化修饰，搅拌反应1-3h；将硅烷化修饰后的反应溶液置于外加磁场中，除去上清反应液，将磁颗粒用去离子水清洗数遍后，加入一定量乙醇使磁颗粒的浓度为0.3％-0.4％(g/100mL)，加入一定量丙烯酸(AAm)使其浓度为2.5％-3.5％(g/100mL)，通入氮气，置于30℃水浴中，保持机械搅拌900r/min，反应2-5h；反应完成后，将功能化修饰后的磁性纳米颗粒置于外加磁场进行分离，分别用去离子水和乙醇清洗三遍，于真空中浓缩干燥。
所述制备分子印迹磁颗粒(MMIP)，包括以下步骤：
(3)向经过硅烷化丙烯酸功能化修饰得到的Fe3O4@SiO2-AA颗粒中，依次加入一定量的功能单体甲基丙烯酸和衣康酸，交联剂亚甲基双丙烯酰胺和PBS缓冲溶液，超声振荡混合一段时间后，加入一定量的牛血红蛋白作为印迹模板，混合均匀；
在本发明的一种实施方式中，向经过硅烷化丙烯酸功能化修饰得到的Fe3O4@SiO2-AA颗粒中，依次加入一定量的功能单体甲基丙烯酸(MAA)和衣康酸(IA)，交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)和PBS缓冲溶液，使得相对于PBS缓冲液，Fe3O4@SiO2-AA颗粒的浓度为0.25％-0.35％，MAA的浓度为0.3％-0.4％，IA的浓度为0.025％-0.125％，N’N-MBA的浓度为0.06％-0.12％，超声振荡混合后，加入浓度为0.025％-0.075％的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。
(4)将步骤(3)得到的反应体系振荡混匀后，通入氮气除去O2，加入APS和TEMED作为引发剂引发反应，反应结束后，倾去反应液，洗脱磁颗粒上的印迹模板，可得到分子印迹磁颗粒(MMIP)。
在本发明的一种实施方式中，将步骤(3)得到的反应体系置于25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2，加入相对于PBS缓冲液0.06％-0.08％APS和0.06％-0.08％TEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应10-14h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰，即可得到分子印迹磁颗粒(MMIP)。
本发明还提供了应用所述分子印迹功能化磁颗粒对牛血红蛋白进行特异性识别、吸附的方法，将MMIP与含有牛血红蛋白的溶液混合均匀后，振荡吸附至平衡，再用2％SDS与吸附了蛋白质的磁颗粒振荡洗脱至平衡，使磁颗粒吸附上的蛋白质溶解于洗脱液中。
有益效果：
本发明制备了一种可特异性吸附牛血红蛋白的分子印迹磁性纳米颗粒，为蛋白质的特异性吸附与分离提供了一种新途径。
裸露的Fe3O4磁纳米颗粒表面功能基团种类单一，且易被氧化，不利于分子印迹聚合物的合成。在Fe3O4磁纳米颗粒表面修饰上不同种类的功能团，将提高分子印迹聚合物在颗粒表面生成的效率和稳定性，同时提升颗粒对模板蛋白的识别和吸附能力。许多研究报道中对Fe3O4磁纳米颗粒的功能团修饰方法通常分多步实现，本发明为提高修饰效率、简化修饰过程，采用了有效的一步合成法对Fe3O4磁纳米颗粒进行了硅烷基、羧基以及丙烯基的修饰。在已合成的功能化磁颗粒表面，通过更高效的方法在更短的时间内合成了具有蛋白质特异性识别性能的分子印迹聚合层。该分子印迹磁性纳米颗粒可以快速、高效、特异性地识别和吸附目标蛋白质牛血红蛋白，将其从混合蛋白质溶液中分离出来。这为蛋白质的纯化与分离研究提供了良好的研究基础。
附图说明
图1为Fe3O4@SiO2-AA和MMIP磁性纳米材料的傅里叶红外谱图。
图2为Fe3O4@SiO2-AA在Fe3O4颗粒的傅里叶红外谱图。
图3为MMIP与NMIP颗粒对牛血红蛋白的特异性吸附验证；(A)吸附后上清液的电泳图，其中，条带1为OVA、BSA和BHb混合溶液被吸附前的溶液，条带2为OVA溶液，条带3为BHb溶液，条带4为BSA溶液，条带5和条带7均为MMIPs吸附后的混合蛋白质溶液上清液，条带6和条带8为NMIPs吸附后的混合蛋白质溶液上清液。(B)洗脱后上清液的电泳图。其中，条带1为OVA、BSA和BHb混合溶液被吸附前的溶液，条带2为OVA溶液，条带3为BHb溶液，条带4为BSA溶液，条带5和条带7均为吸附混合蛋白的MMIPs洗脱后的上清液，条带6和条带8为吸附混合蛋白的NMIPs洗脱后的上清液。
具体实施方式
磁性纳米材料对牛血红蛋白的吸附量采用(1)式进行计算：
式中：
q—MMIP磁性纳米材料对牛血红蛋白的吸附量，mg/g；
V—溶液的体积，mL；
C0—溶液中牛血红蛋白的初始浓度，mg/mL；
C1—吸附后上清液中牛血红蛋白的浓度，mg/mL；
m—MMIP磁纳米材料的质量，g。
实施例1 不对Fe3O4磁性纳米颗粒进行硅烷化丙烯酸功能化修饰
分别称取FeSO4·7H2O(0.8008g)与FeCl3·6H2O(1.1677g)于四口烧瓶中，加入200mL去离子水和40mL无水乙醇，通入氮气。反应体系置于60℃水浴环境中，使用机械搅拌器以900r/min的转速搅拌0.5h，以除去反应体系中的氧气。随后加入25％氨水5mL，使体系pH为10-11，溶液瞬间由棕红色变为黑色，熟化反应10min后真空干燥。
取60mg生成的Fe3O4颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和25mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μLAPS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为78.3mg蛋白/g磁材料。
实施例2 不对Fe3O4磁性纳米颗粒进行丙烯酸功能化修饰
分别称取FeSO4·7H2O(0.8008g)与的FeCl3·6H2O(1.1677g)于四口烧瓶中，加入200mL去离子水和40mL无水乙醇，通入氮气。反应体系置于60℃水浴环境中，使用机械搅拌器以900r/min的转速搅拌0.5h，以除去反应体系中的氧气。随后加入25％氨水5mL，使体系pH为10-11，溶液瞬间由棕红色变为黑色，熟化反应10min。
将熟化后的反应体系温度降为30℃，逐滴加入5％的TEOS乙醇溶液20mL进行硅烷化修饰，保持机械搅拌900r/min，反应2h后得到硅烷化修饰的磁颗粒Fe3O4@SiO2。将体系置于外加磁场中，取出Fe3O4@SiO2颗粒清洗数遍后真空干燥。
取60mg生成的Fe3O4@SiO2颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和25mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μLAPS(20％)和14μL TEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为72.5mg蛋白/g磁材料。
实施例3
分别称取FeSO4·7H2O(0.8008g)与FeCl3·6H2O(1.1677g)于四口烧瓶中，加入200mL去离子水和40mL无水乙醇，通入氮气。反应体系置于60℃水浴环境中，使用机械搅拌器以900r/min的转速搅拌0.5h，以除去反应体系中的氧气。随后加入25％氨水5mL，使体系pH为10-11，溶液瞬间由棕红色变为黑色，熟化反应10min。
将熟化后的反应体系温度降为30℃，逐滴加入5％的TEOS乙醇溶液20mL进行硅烷化修饰，保持机械搅拌900r/min，反应2h。
将硅烷化修饰后的反应溶液置于外加磁场中，除去上清反应液，将磁颗粒用去离子水清洗数遍后，加入160mL乙醇和5mL丙烯酸(AAm)，通入氮气，置于30℃水浴中，保持机械搅拌900r/min，反应2h。整个反应过程中需维持氮气氛围，以免Fe3O4被氧化。反应完成后，功能化修饰后的磁性纳米颗粒置于外加磁场分离出来，分别用去离子水和乙醇清洗三遍，于真空中浓缩干燥。
取60mg上述生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和25mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为126.4mg蛋白/g磁材料。
由实施例1-3可以看出，硅烷化修饰和丙烯酸修饰可以提高MMIP颗粒对与蛋白质的吸附能力。
实施例4
分别称取FeSO4·7H2O(0.8008g)与的FeCl3·6H2O(1.1677g)于四口烧瓶中，加入200mL去离子水和40mL无水乙醇，通入氮气。反应体系置于60℃水浴环境中，使用机械搅拌器以900r/min的转速搅拌0.5h，以除去反应体系中的氧气。随后加入25％氨水5mL，使体系pH为10-11，溶液瞬间由棕红色变为黑色，熟化反应10min。
将熟化后的反应体系温度降为30℃，逐滴加入5％的TEOS乙醇溶液20mL进行硅烷化修饰，保持机械搅拌900r/min，反应2h。
将硅烷化修饰后的反应溶液置于外加磁场中，除去上清反应液，将磁颗粒用去离子水清洗数遍后，加入160mL乙醇和5mL丙烯酸(AAm)，通入氮气，置于30℃水浴中，保持机械搅拌900r/min，反应2h。整个反应过程中需维持氮气氛围，以免Fe3O4被氧化。反应完成后，功能化修饰后的磁性纳米颗粒置于外加磁场分离出来，分别用去离子水和乙醇清洗三遍，于真空中浓缩干燥。将干燥后的样品进行FTIR测定如图1(a)所示。
实施例5
分别称取FeSO4·7H2O(0.8008g)与的FeCl3·6H2O(1.1677g)于四口烧瓶中，加入200mL去离子水和40mL无水乙醇，通入氮气。反应体系置于60℃水浴环境中，使用机械搅拌器以900r/min的转速搅拌0.5h，以除去反应体系中的氧气。随后加入25％氨水5mL，使体系pH为10-11，溶液瞬间由棕红色变为黑色，熟化反应10min。
将熟化后的反应体系温度降为30℃，逐滴加入5％的TEOS乙醇溶液20mL进行硅烷化修饰，保持机械搅拌900r/min，反应3h。
将硅烷化修饰后的反应溶液置于外加磁场中，除去上清反应液，将磁颗粒用去离子水清洗数遍后，加入160mL乙醇和5mL丙烯酸(AAm)，通入氮气，置于30℃水浴中，保持机械搅拌900r/min，反应2h。整个反应过程中需维持氮气氛围，以免Fe3O4被氧化。反应完成后，功能化修饰后的磁性纳米颗粒置于外加磁场分离出来，分别用去离子水和乙醇清洗三遍，于真空中浓缩干燥。将干燥后的样品进行FTIR测定如图1(b)所示。
实施例6
分别称取FeSO4·7H2O(0.8008g)与的FeCl3·6H2O(1.1677g)于四口烧瓶中，加入200mL去离子水和40mL无水乙醇，通入氮气。反应体系置于60℃水浴环境中，使用机械搅拌器以900r/min的转速搅拌0.5h，以除去反应体系中的氧气。随后加入25％氨水5mL，使体系pH为10-11，溶液瞬间由棕红色变为黑色，熟化反应10min。
将熟化后的反应体系温度降为30℃，逐滴加入5％的TEOS乙醇溶液20mL进行硅烷化修饰，保持机械搅拌900r/min，反应2h。
将硅烷化修饰后的反应溶液置于外加磁场中，除去上清反应液，将磁颗粒用去离子水清洗数遍后，加入160mL乙醇和5mL丙烯酸(AAm)，通入氮气，置于30℃水浴中，保持机械搅拌900r/min，反应4h。整个反应过程中需维持氮气氛围，以免Fe3O4被氧化。反应完成后，功能化修饰后的磁性纳米颗粒置于外加磁场分离出来，分别用去离子水和乙醇清洗三遍，于真空中浓缩干燥。将干燥后的样品进行FTIR测定如图1(c)所示。
结合图1，可以看出在上述实施例4和5中，加入TEOS乙醇溶液后的反应时间并不一致，实施例4、6中，加入丙烯酸后的反应时间不相同，但所得的Fe3O4@SiO2-AA颗粒红外检测光谱并没有较大的差异，说明TEOS加入反应体系2h便可在颗粒表面修饰上所需的硅烷基团，而丙烯酸在反应合成2h后也可在Fe3O4颗粒表面修饰上丙烯酸基团，且在反应达到一定时间时，颗粒表面修饰上的功能基团即可达到饱和。因此，后续实验均采用实施例4中的方法。
实施例7
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次加入60μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和10mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μL TEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰，所得沉淀物即为MMIP。由图2的傅里叶红外图谱可以看出，Fe3O4@SiO2-AA在Fe3O4颗粒的基础上已经成功在颗粒表面修饰了硅烷基团、丙烯基和羧基等功能基团，经过分子印迹后，MMIP表面增加了许多-C-H-基团和酰胺基团，说明了分子印迹聚合层的成功制备。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为91.8mg蛋白/g磁材料。
实施例8
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次加入70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和10mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为89.5mg蛋白/g磁材料。
实施例9
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次80μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和10mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为94.8mg蛋白/g磁材料。
实施例10
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和5mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为95.5mg蛋白/g磁材料。
实施例11
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和15mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为92.3mg蛋白/g磁材料。
实施例12
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和25mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为126.4mg蛋白/g磁材料。
实施例13
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和10mg衣康酸(IA)，24mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为120.8mg蛋白/g磁材料。
实施例14
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和10mg衣康酸(IA)，20mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为119.8mg蛋白/g磁材料。
实施例15
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和10mg衣康酸(IA)，24mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应12h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为122.0mg蛋白/g磁材料。
由实施例7-15可以看出，在60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒中，加入60-70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和5-25mg衣康酸(IA)，12-24mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)后，经过分子印迹制备的MMIP磁颗粒均可以等到较高的牛血红蛋白吸附量。由于不同的功能单体与交联剂配比得到的牛血红蛋白吸附量不尽相同，本发明选取所得牛血红蛋白吸附量最高的一组配比即实施例12中的配比方法作为后续使用方法。
实施例16
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和25mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应14h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。
除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的沉淀物MMIP加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为125.6mg蛋白/g磁材料。
实施例17
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和25mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应16h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为125.4mg蛋白/g磁材料。
实施例18
取60mg实施例4中生成的Fe3O4@SiO2-AA颗粒，依次70μL功能单体甲基丙烯酸(MAA)和25mg衣康酸(IA)，16mg交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)，和PBS缓冲溶液20mL(0.02M,pH7.00)，超声振荡混合10min后，加入一定量的牛血红蛋白(BHb)混合均匀。将反应体系25℃水浴振荡锅中振荡1h后，通入氮气10min以除去体系中的O2。加入70μL APS(20％)和14μLTEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应24h。反应结束后，除去反应液，用2％SDS-2％HAc溶液作为洗脱液振荡洗脱磁颗粒上的印迹模板BHb，直至上清液于406nm处检测不出BHb的特征吸收峰。除了不加模板蛋白质，无分子印迹模板蛋白的磁颗粒(NMIP)的制备与上述过程一致。
取5mg制得的MMIP沉淀物加入2mL 1.0mg/mL、pH7.0的牛血红蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡12h，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为126.6mg蛋白/g磁材料。
综合实施例12、16、17和18可以看出，分子印迹时间达到12h后，印迹时间的增加对蛋白质吸附量的影响不大，而采用12h作为分子印迹时间可以大幅缩短印迹所需时间，简化反应过程。
实施例19
将等量的MMIP与NMIP颗粒(5mg)分别与2mL 1.0mg/mL的卵白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)及牛血红蛋白(BHb)的混合溶液(PBS，0.02M，pH7.00)混合均匀后置于25℃摇床150r/min振荡吸附12h。取出吸附后的上清液。用2％SDS与吸附了蛋白质的磁颗粒于25℃摇床150r/min振荡洗脱12h，使磁颗粒吸附上的蛋白质溶解于洗脱液中。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法对吸附后上清液及洗脱后上清液进行电泳定性判断MIP颗粒对模板蛋白BHb的特异性吸附。特异性吸附性能如图3所示。
由图3(A)吸附后上清液的电泳图和图3(B)洗脱后上清液的电泳图，可以看出，MMIP颗粒吸附后的混合蛋白质上清液中，目标蛋白BHb的含量减少，对应条带颜色变浅，而杂蛋白OVA和BSA的条带无明显变化；对于从MMIP中洗脱得到的上清液，目标蛋白BHb的条带较为明显，而杂蛋白OVA和BSA的含量接近于零。相比而言，对照组NMIP吸附蛋白后的上清液以及洗脱后的上清液并无明显特异性。由此可以充分说明以牛血红蛋白为模板蛋白质制备的分子印迹磁性纳米颗粒MMIP具有对模板蛋白较强的特异性吸附能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备具有特异性吸附牛血红蛋白能力的分子印迹功能化磁性纳米颗粒的方法，其特征在于，包括一步法制备硅烷化丙烯酸功能化Fe3O4磁性纳米颗粒(Fe3O4@SiO2-AA)、制备分子印迹磁颗粒(MMIPs)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一步法制备硅烷化丙烯酸功能化Fe3O4@SiO2-AA颗粒，包括以下步骤：
(1)制备Fe3O4磁性纳米颗粒
(2)Fe3O4磁性纳米颗粒的硅烷化丙烯酸功能化修饰。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)，称取FeSO4·7H2O与FeCl3·6H2O，加入去离子水和无水乙醇，通入氮气，搅拌反应一段时间后，加入氨水调整pH为10-11，溶液瞬间由棕红色变为黑色，继续熟化反应，得到Fe3O4磁性纳米颗粒沉淀物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)，将熟化后的反应体系温度降为28～30℃，逐滴加入TEOS进行硅烷化修饰，搅拌反应1-3h；将硅烷化修饰后的反应溶液置于外加磁场中，除去上清反应液，将磁颗粒用去离子水清洗数遍后，加入乙醇和丙烯酸(AAm)，通入氮气，并水浴搅拌反应2-5h；反应完成后，将功能化修饰后的磁性纳米颗粒置于外加磁场进行分离，清洗后于真空中浓缩干燥。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，整个反应过程中需维持氮气氛围，以免Fe3O4被氧化。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将熟化后的反应体系温度降为30℃，逐滴加入5％的TEOS乙醇溶液进行硅烷化修饰，搅拌反应1-3h；将硅烷化修饰后的反应溶液置于外加磁场中，除去上清反应液，将磁颗粒用去离子水清洗数遍后，加入一定量乙醇使磁颗粒的浓度为0.3％-0.4％(g/100mL)，加入一定量丙烯酸(AAm)使其浓度为2.5％-3.5％(g/100mL)，通入氮气，置于30℃水浴中，保持机械搅拌900r/min，反应2-5h；反应完成后，将功能化修饰后的磁性纳米颗粒置于外加磁场进行分离，分别用去离子水和乙醇清洗三遍，于真空中浓缩干燥。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述制备分子印迹磁颗粒(MMIP)，包括以下步骤：
(3)向经过硅烷化丙烯酸功能化修饰得到的Fe3O4@SiO2-AA颗粒中，依次加入一定量的功能单体甲基丙烯酸和衣康酸，交联剂亚甲基双丙烯酰胺和PBS缓冲溶液，超声振荡混合一段时间后，加入一定量的牛血红蛋白作为印迹模板，混合均匀。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，向经过硅烷化丙烯酸功能化修饰得到的Fe3O4@SiO2-AA颗粒中，依次加入一定量的功能单体甲基丙烯酸(MAA)和衣康酸(IA)，交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N’N-MBA)和PBS缓冲溶液，使得相对于PBS缓冲液，Fe3O4@SiO2-AA颗粒的浓度为0.25％-0.35％，MAA的浓度为0.3％-0.4％(mL/100mL)，IA的浓度为0.025％-0.125％，N’N-MBA的浓度为0.06％-0.12％，超声振荡混合后，加入浓度为0.025％-0.075％的牛血红蛋白(BHb)混合均匀；
(4)将步骤(3)得到的反应体系振荡混匀后，通入氮气除去O2，加入APS和TEMED作为引发剂于25℃水浴振荡反应10-14h，反应结束后，倾去反应液，洗脱磁颗粒上的印迹模板，可得到分子印迹磁颗粒(MMIP)。
9.根据权利要求1～8任一所述方法制备得到的具有特异性吸附牛血红蛋白能力的分子印迹功能化磁性纳米颗粒。
10.权利要求9所述的具有特异性吸附牛血红蛋白能力的分子印迹功能化磁性纳米颗粒在特异性识别、吸附、分离牛血红蛋白中的应用。
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