CN104844768A - 一种核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的制备方法及其应用，制备方法是：采用改进的水热法制备Fe₃O₄纳米颗粒，利用沉淀聚合法合成带有识别位点及辅助识别聚合物链的复合微球载体，将上述载体与模板分子蛋白，功能单体，辅助单体及交联剂进行预组装、聚合和交联，再进一步洗脱模板分子蛋白得到具有核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球；制备的印迹微球表面有对目标蛋白分子识别位点和辅助识别聚合物链存在，增加了识别的比表面积，提高了印迹特异性和高效性，且具有可通过外界磁场分离的特性及通过温度控制对目标蛋白的结合与脱附，将其应用于分离复杂生物体系中的目标蛋白，选择专一性好，分离速度快，操作简单，为复杂生物体系中蛋白质的分离富集提供了一种新的可行性方法。

Description

一种核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的制备方法及其在蛋白分离纯化中的应用，属于高分子化学和蛋白质工程技术领域。

背景技术

分子印迹技术是以某一特定目标分子为模板，制备针对该分子具有特异性选择作用的高分子化合物—分子印迹聚合物(MIPs)的技术。分子印迹聚合物上的特定识别位点和空间结构与模板分子相匹配，可特异性的吸附模板分子，因此分子印迹技术被称为“人工锁技术”。分子印迹技术已广泛应用于生物传感，催化，分离，药物释放以及固相萃取等领域中。尽管目前小分子印迹技术发展蓬勃，但是蛋白质等生物大分子印迹技术仍面临众多挑战。

蛋白质构象复杂，且具有一定的生物活性，溶于水，在非温和条件下，容易失活，导致空间结构变化。分子量大，难洗脱。因此在蛋白质分子印迹聚合物的制备过程中，克服上述困难尤为重要和迫切。

表面印迹技术即在载体上制备分子印迹膜的技术，有利于模板分子的洗脱和重新识别。目前应用较普遍的载体有硅球、纳米管、纳米线。由于蛋白质的水溶性使得分子印迹聚合反应需在水相中进行。因此载体必须在水相中有较好的分散性。蛋白质印迹相关研究中硅球使用较为广泛，但是制备的分子印迹膜对目标蛋白吸附量和特异性较低。因此在载体表面合成更多的识别位点和辅助识别聚合物链可有效提高对目标蛋白的选择性吸附；并且使载体上带有的与模板蛋白相反电荷，可促进预组装过程中，载体与模板的结合。

磁性MIPs能在外界磁场的作用下，能从复杂体系中迅速分离，因此国内外对其应用研究较为活跃。但磁性Fe₃O₄纳米颗粒容易团聚，且容易氧化。传统的制备方法和储存方法应进一步改进。

温敏性聚合物是一种能根据温度变化而改变收缩或溶胀的智能材料，其中温敏单体N-异丙基丙烯酰胺应用较为广泛。其临界温度为32℃～34℃，高于该温度，聚合物呈收缩状态，低于该温度，呈膨胀状态。可通过调节外界温度调节聚合物体积，进而实现对目标分子的捕捉或释放。国内外研究工作中，国内外热衷于对蛋白分子印迹中温敏材料的开发，但具体合成温度范围和洗脱温度范围并未明确探究。

目前为止，识别孔腔底部含吸引模板分子位点，且表面含一定的排斥模板分子位点的温敏性磁性蛋白质印迹微球国内外鲜有报道。

发明内容

针对现有的分子印迹技术分离蛋白的方法存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种通过简单工艺制备表面具有温敏性分子印迹膜，可通过控制温度变化来选择性从生物体系中分离目标蛋白的，且可通过磁性分离的具有核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的方法。

本发明的另一个目的是在于提供所述印迹微球在分离蛋白技术上的应用，印迹微球在较高温度下可选择性吸附目标蛋白，在较低温下释放，特异性好，可以采用磁场分离，使用方便高效，为复杂生物体系中目标蛋白质的富集分离提供了新的可行性技术方法。

为了解决现有技术中的缺陷，本发明提供了一种核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：通过有机溶剂-水热法制备Fe₃O₄纳米颗粒；

步骤二：以4-乙烯基吡啶为聚合单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，通过沉淀聚合法，在Fe₃O₄纳米颗粒表面修饰一层4-乙烯基吡啶聚合物膜，得到含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体；

步骤三：将含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体、N-异丙基丙烯酰胺，甲基丙烯酸，模板分子蛋白，交联剂加入到中性PBS缓冲液中进行预组装后，通过引发剂引发聚合，在35℃～39℃温度下进行聚合反应；

步骤四：将步骤三的聚合产物，在20℃～30℃温度下，通过振荡洗脱模板分子蛋白，即得具有核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球。

本发明的核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的制备方法还包括以下优选方案：

优选的方案，先将FeCl₃·6H₂O溶于乙二醇中得到前驱体溶液，在前驱体溶液中加入醋酸钠和分散剂后，置于反应釜中，在195～205℃温度下进行有机溶剂-水热反应，得到Fe₃O₄纳米颗粒。优选的方案能得到颗粒均匀，且分散性好的的Fe₃O₄纳米颗粒。优选的分散剂为聚乙二醇600。

优选的方案，步骤二中将4-乙烯基吡啶、Fe₃O₄纳米颗粒和二甲基丙烯酸乙二醇酯分散在溶剂中，通过引发剂引发聚合后，在55～65℃温度下进行聚合反应，聚合反应完成后，通过磁场分离，得到含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体；其中，4-乙烯基吡啶、Fe₃O₄纳米颗粒和二甲基丙烯酸乙二醇酯的质量比为45～55:150～250:400。优选的方案更有利于在Fe₃O₄纳米颗粒表面原位聚合生成一层均匀聚合物膜，使识别位点和辅助识别聚合物链在载体表面随机相对均匀地分布。

优选的方案，含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体、模板分子蛋白、N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和交联剂的质量比为38～42:5～7:10～12:1～3:1。优选的质量比例能使功能单体和聚合单体及交联剂之间形成更完整的交联网络状聚合物膜，将模板分子蛋白固定在含有识别和辅助识别位点聚合物链的磁性微球载体表面。

优选的方案，交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。

优选的方案，所述的PBS缓冲液浓度为0.1mol/L，pH为7.0。

优选的方案，含有识别和辅助识别位点聚合物链的磁性微球载体与PBS缓冲液的用量比为150mg～300mg/10mL。

优选的方案，所述的预组装是在温度为35℃～39℃的条件下进预组装5～8h。

优选的方案，步骤二中的沉淀聚合进行的时间为20～28h。

优选的方案，步骤二中的引发剂为偶氮二异丁腈。

优选的方案，步骤三中的聚合反应进行的时间为20～28h。

优选的方案，步骤三中聚合反应采用的引发剂是N,N,N',N'-四甲基二乙胺/过硫酸铵。

优选的方案，所述的洗脱是在温度为20℃～30℃的条件下，依次通过去离子水、质量百分比浓度为36％的NaCl溶液,、质量体积比为1:10g/L的SDS溶液、体积百分比浓度为10％的醋酸溶液振荡洗脱，将模板分子蛋白洗脱出来。

优选的方案，模板分子蛋白为牛血清白蛋白。最优选的洗脱温度为25℃。

本发明还提供了所述的制备方法制得的核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球分子印迹微球的应用，应用于从含有目标蛋白的复杂生物体系中选择性富集分离出目标蛋白。

优选的应用方法，核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球分子印迹微球在35℃～39℃温度下吸附目标蛋白，在20℃～30℃温度下脱附目标蛋白。优选的方案中采用目标蛋白作为模板分子蛋白制备出具有核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球，制得的具有核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球对目标蛋白分子具有选择性吸附能力。

相对现有技术，本发明的有益技术效果：1、通过改进的水热法制备具有超顺磁性的Fe₃O₄纳米颗粒，制备的颗粒粒径均匀，分散性好、不易团聚；Fe₃O₄纳米颗粒的引入使具有核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球具有磁性，可以通过磁场分离，分离快速彻底。2、利用共沉淀方法在Fe₃O₄颗粒表面合成一层具有识别和辅助识别位点聚合物链薄膜，保护了Fe₃O₄不易被氧化，同时亲水性的吡啶基团有利于载体在水溶液中的分散；在预组装过程中，载体上的吡啶基作为吸电子基团，有效的吸引牛血清白蛋白(中性溶液中带负电荷)，载体上的聚合物链及辅助识别位点促进了目标蛋白与载体的预组装，N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸与载体，模板分子蛋白之间的预组装有利于下一步聚合反应。3、温敏性单体的加入，制得的印迹分子可以通过控制外界温度控制聚合物的溶胀收缩状态，从而控制吸附和解吸附过程；辅助单体甲基丙烯酸的加入，提供负电荷，减少了聚合物微球表面的非特异性吸附；与之前的分子印迹聚合物相比，该聚合物微球吸附量大，特异性高，选择性好。特别是采用牛血清白蛋白制备作为模板分子蛋白制备的核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球在胎牛血清中能快速分离富集牛血清白蛋白。

附图说明

【图1】为本发明制备核壳结构温敏性磁性蛋白质印迹微球的流程示意图；

【图2】为Fe₃O₄(A)、载体(B)、和印迹微球(C)的扫描电镜图，Fe₃O₄(D)和印迹微球(E)的透射电镜图；

【图3】为印迹微球(MIMPs)与非印迹微球(NIMPs)的恒温吸附图；前者的吸附量明显高于后者，且吸附速度较快；

【图4】为印迹微球(MIMPs)与非印迹微球(NIMPs)的动态吸附图：该印迹微球在前20min内吸附速度迅速增快并达到最大值随后速度降低，50min达到吸附平衡；非印迹聚合微球吸附速率较前者慢，最大吸附量较低；

【图5】为印迹微球(MIMPs)与非印迹微球(NIMPs)在不同的蛋白溶液中的吸附效果：依次为牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，牛血红蛋白(BHb)，溶菌酶(Lyz)。可见印迹微球在牛血清白蛋白(BSA)的吸附量最高，印迹效率最高；

【图6】为与印迹微球(MIMPs)与非印迹微球(NIMPs)在胎牛血清溶液中的应用：条带1，3为稀释的胎牛血清，2、4分别为经印迹微球(MIMPs)与非印迹微球(NIMPs)吸附过的胎牛血清溶液；可见条带2中66.2KDa处变浅，而条带4无明显变化，直观的表现出MIMPs对牛血清白蛋白的吸附作用。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1

核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的制备：

1.36g FeCl₃·6H₂O加入40mL乙二醇中搅拌形成均一黄色溶液，加入3.6g醋酸钠和0.1g聚乙二醇600在50℃继续搅拌30min，将获得的溶液置于反应釜中，200℃下反应8h。自然冷却后，水洗至中性，干燥得到上述Fe₃O₄颗粒。

50mg 4-乙烯基吡啶溶于10mL的无水乙腈，超声处理混合均匀，依次加入200mg Fe₃O₄，396mg二甲基丙烯酸乙二醇酯机械搅拌，加入偶氮二异丁腈，氮气保护下60℃反应24h。外界磁场分离得黑色固体，乙醇洗涤2-3次，干燥制得含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体。

牛血清白蛋白30mg，N-异丙基丙烯酰56.5mg,甲基丙烯酸10mg及N,N-亚甲基双丙烯酰胺5mg，溶于10mL PBS溶液(0.1mol/L,pH＝7.0)，加入200mg磁性微球载体，35℃下预组装6h。

5mg过硫酸铵及5μL N,N,N',N'-四甲基二乙胺依次加入上述溶液，氮气保护机械搅拌，35℃反应24h。

依次用去离子水，NaCl溶液(36％,w/w),SDS溶液(10％,w/v),醋酸溶液(10％,v/v)在25℃振荡洗脱上述聚合物。即得核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球。

实施例2

核壳结构的温敏性磁性非印迹微球的制备：

1.36g FeCl₃·6H₂O加入40mL乙二醇中搅拌形成均一黄色溶液，加入3.6g醋酸钠和0.1g聚乙二醇600在50℃继续搅拌30min，将获得的溶液置于反应釜中，200℃下反应8h。自然冷却后，水洗至中性，干燥得到上述Fe₃O₄颗粒。

50mg 4-乙烯基吡啶溶于10mL的无水乙腈，超声处理混合均匀，依次加入200mg Fe₃O₄，396mg二甲基丙烯酸乙二醇酯机械搅拌，加入偶氮二异丁腈，氮气保护下60℃反应24h。外界磁场分离得黑色固体，乙醇洗涤2-3次，干燥制得含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体。

N-异丙基丙烯酰56.5mg,甲基丙烯酸10mg及N,N-亚甲基双丙烯酰胺5mg，溶于10mL PBS溶液(0.1mol/L,pH＝7.0)，加入200mg磁性微球载体，35℃下预组装6h。

5mg过硫酸铵及5μL N,N,N',N'-四甲基二乙胺依次加入上述溶液，氮气保护机械搅拌，35℃反应24h。

依次用去离子水，NaCl溶液(36％,w/w),SDS溶液(10％,w/v),醋酸溶液(10％,v/v)在25℃振荡洗脱上述聚合物。即得核壳结构的温敏性磁性非印迹微球。

实施例3

下面通过实验进一步说明本发明制备的核壳结构的温敏性磁性蛋白印迹聚合微球具有较高的吸附量及吸附速度，较好的特异性，选择性及实用性。

以实施例1制备的核壳结构的温敏性磁性非印迹微球进行应用试验：

取10份10mg的印迹微球(非印迹微球)分别加入到10mL PBS缓冲液(0.1Mm,pH 7.0)中35℃孵化5h，然后将孵化过的蛋白印迹微球(非印迹微球)磁分离，分别加入到10mL含有(0.2–2mg mL^-1)牛血清白蛋白的PBS缓冲液(0.1Mm,pH 7.0)，35℃振荡24h。磁分离，用紫外分光仪测吸附后溶液的吸光度。计算得到吸附量。如图三所示，蛋白印迹聚合微球吸附量高达79.2mg/g，高于非印迹微球吸附量(38.1mg/g)，说明该蛋白印迹聚合微球的特异性较好(印迹常数为2.08)。

10mg的印迹微球(非印迹聚合微球)加入到10mL PBS缓冲液(0.1Mm,pH 7.0)中35℃孵化5h，然后将孵化过的蛋白印迹聚合微球(非印迹聚合微球)磁分离，加入到10mL含有(0.8mg mL^-1)牛血清白蛋白的PBS缓冲液(0.1Mm,pH 7.0)，不同时间取样，测其吸附量。如图四所示，蛋白印迹微球的吸附速率较快，在前20min内吸附速度迅速增快并达到最大值随后速度降低，50min达到吸附平衡。非印迹聚合微球吸附速率较前者慢，最大吸附量较低。

为研究实施例一中印迹微球的选择性，选取与牛血清白蛋白分子量或等电点值相近的蛋白质：OVA、BHb、Lyz作为对照蛋白。取四份10mg印迹微球(非印迹聚合微球)加入到10mL PBS缓冲液(0.1Mm,pH 7.0)中35℃孵化5h，然后将孵化过的蛋白印迹聚合微球(非印迹聚合微球)磁分离，分别加入到含OVA、BHb、Lyz的PBS缓冲液(0.1Mm,pH 7.0)，35℃振荡24h,检测计算分子印迹聚合微球对不同蛋白的吸附量。如图五所示，该分子印迹聚合微球对模板蛋白牛血清白蛋白的吸附量大，特异性和选择性高。

为进一步测试实施例1中印迹微球的实用性，将10mg印迹微球加入到10ml稀释后的胎牛血清溶液内，35℃振荡24h，通过电泳，观测吸附前后胎牛血清溶液内牛血清白蛋白的含量变化。如图六所示，经印迹微球吸附后，66.2KDa处颜色变浅，直观表现出牛血清白蛋白量减少。证实该印迹聚合微球可应用于复杂的生物环境内蛋白质的分离富集。

Claims (10)

1.一种核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：通过有机溶剂-水热法制备Fe₃O₄纳米颗粒；

步骤二：以4-乙烯基吡啶为聚合单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，通过沉淀聚合法，在Fe₃O₄纳米颗粒表面修饰一层4-乙烯基吡啶聚合物膜，得到含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体；

步骤三：将含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体、N-异丙基丙烯酰胺，甲基丙烯酸，模板分子蛋白，交联剂加入到中性PBS缓冲液中进行预组装后，通过引发剂引发聚合，在35℃～39℃温度下进行聚合反应；

步骤四：将步骤三的聚合产物，在20℃～30℃温度下，通过振荡洗脱模板分子蛋白，即得具有核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，先将FeCl₃·6H₂O溶于乙二醇中得到前驱体溶液，在前驱体溶液中加入醋酸钠和分散剂后，置于反应釜中，在195～205℃温度下进行有机溶剂-水热反应，得到Fe₃O₄纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中将4-乙烯基吡啶、Fe₃O₄纳米颗粒和二甲基丙烯酸乙二醇酯分散在溶剂中，通过引发剂引发聚合后，在55～65℃温度下进行聚合反应，聚合反应完成后，通过磁场分离，得到含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体；其中，4-乙烯基吡啶、Fe₃O₄纳米颗粒和二甲基丙烯酸乙二醇酯的质量比为45～55:150～250:400。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体、模板分子蛋白、N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸和交联剂的质量比为38～42:5～7:10～12:1～3:1，所述的交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的PBS缓冲液浓度为0.1mol/L，pH为7.0，含有识别位点和辅助识别聚合物链的磁性微球载体与PBS缓冲液的用量比为150mg～300mg/10mL。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的预组装是在温度为35℃～39℃的条件下进预组装5～8h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中的沉淀聚合进行的时间为20～28h；步骤三中的聚合反应进行的时间为20～28h；步骤三聚合反应采用的引发剂是N,N,N',N'-四甲基二乙胺/过硫酸铵。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的洗脱是在温度为20℃～30℃的条件下，依次通过去离子水、质量百分比浓度为36％的NaCl溶液,、质量体积比为1:10g/L的SDS溶液、体积百分比浓度为10％的醋酸溶液振荡洗脱，将模板分子蛋白洗脱出来。

9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球分子印迹微球的应用，其特征在于，应用于从含有目标蛋白的复杂生物体系中选择性富集分离出目标蛋白。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球分子印迹微球在35℃～39℃温度下吸附目标蛋白，在20℃～30℃温度下脱附目标蛋白。