CN102532408B - 一种温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法，用水热法合成粒径为200nm的磁性纳米球；通过凝胶-溶胶法在上述磁性纳米球表面包覆一层厚度为20nm的硅层；将包硅的磁性纳米球、功能单体、模板分子和交联剂加入到Tris-HCl缓冲液中，得到反应液；将上述反应液在一定温度下进行聚合反应，得到聚合物；用洗脱液洗脱上述聚合物，即可制得温敏型磁性蛋白质印迹纳米球。本发明的优点是：该温敏型磁性蛋白质印迹纳米球将分子印迹的专一识别性、磁性纳米球在外界磁场下迅速分离的特性和温敏材料的温度响应性相结合，制备过程简单、条件温和、价格低廉，为复杂生物体系中高丰度蛋白质组分的选择性去除和富集提供了一种新的可行性方法。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质组分的制备技术，特别是一种温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法。
背景技术
目前，蛋白质组学(proteomics)的研究受到了广泛的关注。蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，从更为深入的一个层次上去认识生命活动的规律。研究蛋白质结构和功能间的相互关系以及在不同生理、病理条件下蛋白质表达的差异，称为功能蛋白组学(mctional proteomics)研究。功能蛋白质组学的研究可以帮助我们认识基因的功能，发掘与特定生理、病理条件相关的蛋白质，构建蛋白质的功能网络等。早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式(expressionprofile)，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。具有重要功能的低丰度蛋白质、蛋白质翻译后修饰、以及蛋白质-蛋白质相互作用等功能蛋白质组学的研究都已越来越成为蛋白质组学研究的重要部分。在目前功能基因尚不很清楚的情况下，发现功能蛋白有重要的意义。
从组织和细胞中直接提取的蛋白质，以人类细胞为例，种类高达上万种，其中有高丰度蛋白质和低丰度蛋白质，高丰度蛋白质与低丰度蛋白质在浓度范围上可以相差六个数量级甚至更高，样品中低丰度蛋白质含量太少，低于一般仪器的最低检测限，造成低丰度蛋白质难以检测。但是，实际情况是，在生物体中承担重要生命活动的蛋白质往往都是低丰度蛋白质，然而，低丰度蛋白质极低的含量给后续的分析和检测带来困难，限制了人们对它们的研究和认识，这一困难是目前已有的分离富集技术均无能为力的，要解决这个问题必须有新的思路。
分子印迹技术，是制备对特定目标分子(也称模板分子、印迹分子)具有特异预定选择性的高分子化合物——分子印迹聚合物的技术。分子印迹技术的原理：模板分子与功能单体在合适的分散介质中依靠相互作用力，形成可逆结合的复合物；再加入交联剂，在光、热、电场等作用以及引发剂和致孔剂辅助下形成既具有一定刚性又具有一定柔性的多孔三维立体功能材料，将模板分子有规律的包在其中；合成后，用一定方法把模板分子去除，即可获得与模板分子互补的，有特异识别功能的三维孔穴，该孔穴可特异性识别模板分子。一般地，带有多功能基团的小模板分子(相对分子质量≤1000)能获得亲和性和特异性都较高的分子印迹聚合物。尽管目前分子印迹技术蓬勃发展，但是具有重要作用的功能蛋白质印迹研究却仍处于起步阶段。
磁性分离技术是依据物质的磁性差异，在磁场作用力的驱动下，把磁性组分从非磁性组分混合物中分离出来的一种分离技术。由于生物体系中的绝大多数生物分子都是无磁性的，为了给欲分离的目标生物分子赋予磁性，需要预先制备一种磁性载体颗粒作为运载工具，借助于磁性分离装置，对目标生物分子进行负载、运载、卸载等分离操作，从而实现目标生物分子的磁性分离过程。磁性分离载体可通过共聚、表面改性等化学反应在粒子表面引入多种功能基团(-OH、-COOH、-CHO、-NH2等)，也可以通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生物活性物质；同时由于其具有磁性，可在外加磁场的作用下方便快速地分离和富集，这给目标生物产品的分离带来了革命性的发展，从而受到人们的广泛关注和研究。
温敏性水凝胶的温敏性是指凝胶能响应温度的变化而收缩或溶胀，且在最低临界溶液温度附近，体积往往发生很大的变化。N-异丙基丙烯酰胺的最低临界溶液温度在32℃～34℃，接近于人体的体温水平，是研究最多的一种温敏性水凝胶。N-异丙基丙烯酰胺大分子链上同时具有亲水性的酰胺基和疏水性的异丙基。当温度低于最低临界溶液温度时，其表现为以酰胺基为主的亲水模式；当温度高于最低临界溶液温度时，其表现为以异丙基为主的疏水模式。通过调节温度，可以实现对目标物的有效分离和提纯。
迄今为止，温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法在国内外鲜有报道，在理论上和方法上均属于创新性研究。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术分析，提供一种温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法，该制备方法制备过程简单、条件温和、价格低廉、选择性高，为复杂生物体系中高丰度蛋白质组分的选择性去除和富集提供了一种新的可行性方法。
本发明的技术方案：
一种温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法，步骤如下：
1)用水热法合成粒径为200nm的磁性纳米球；
2)通过凝胶-溶胶法在上述磁性纳米球表面包覆一层厚度为20nm的硅层；
3)将包硅的磁性纳米球、功能单体、模板分子和交联剂加入到Tris-HCl缓冲液中，得到反应液；
4)将上述反应液在一定温度下进行聚合反应，得到聚合物；
5)用洗脱液洗脱上述聚合物，即可制得温敏型磁性蛋白质印迹纳米球。
所述水热法合成磁性纳米球的方法是，将1.35g氯化铁、3.6g乙酸钠和35mL乙二醇置于反应釜中，200℃条件下反应6h，固液用磁铁分离后，将液体倾倒出来，固体产物用超纯水洗涤至中性，真空干燥。
所述凝胶-溶胶法在磁性纳米球表面包覆硅层的方法是，将200mg磁性纳米球、80mL乙醇、30mL超纯水、3mL氨水和2mL四乙氧基硅烷置于三口瓶中，常温下反应24h，固液用磁铁分离后，将液体倾倒出来，固体产物用超纯水洗涤至中性，真空干燥。
所述功能单体为N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺的质量比为3-10∶1∶1；交联剂为N，N-亚甲基双丙烯酰胺；模板分子为牛血清蛋白质。
所述包硅磁性纳米球与Tris-HCl缓冲液的用量比为500mg/30mL。
所述功能单体、模板分子和交联剂在缓冲液中的重量百分比浓度分别为：26.43％、11.90％和2.14％。
所述聚合反应的温度为50℃，聚合时间为24h。
所述洗脱液为氯化钠，其浓度为1mol/L，洗脱时间为4h。
一种所述温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的应用，用于复杂生物体系中高丰度蛋白质组分的选择性去除和富集。
本发明的优点是：
1)采用水热法合成粒径约为200nm的磁性纳米球，粒径均一，分散度高，超顺磁性。作为载体，在外磁场作用下，可5s内实现固液快速分离，高效省时；2)采用凝胶-溶胶法使磁性纳米球表面均匀包覆一层厚度约20nm的硅层，不仅可以使载体有很好的生物相容性，而且包硅磁性纳米球表面的硅羟基有利于实现载体的进一步接枝；3)采用表面分子印迹技术，使所得聚合物对特定的模板蛋白有专一的特定选择性；4)引入了温敏型功能单体——N-异丙基丙烯酰胺，使所得磁性蛋白质印迹纳米球可以通过温度的改变来实现对特定蛋白质的吸附和解吸；5)与现有的去除和富集牛血清蛋白质的方法相比较，本发明材料成本低廉，合成过程简便，仅需约5个小时就可以实现对实际样品中牛血清蛋白质的选择性去除和富集。
附图说明
图1为采用水热法合成粒径为200nm的磁性纳米球的透射电镜图。
图2为采用凝胶-溶胶法制得的硅层厚度为20nm的包硅磁性纳米球的透射电镜图。
图3为表面分子印迹技术制得的温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的透射电镜图。
具体实施方式
一种温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法，包括如下步骤：
1)用水热法合成粒径为200nm的磁性纳米球，方法是将1.35g氯化铁、3.6g乙酸钠和35mL乙二醇置于反应釜中，200℃条件下反应6h，固液用磁铁分离后，将液体倾倒出来，固体产物用超纯水洗涤至中性，真空干燥，图1为采用水热法合成粒径为200nm的磁性纳米球的透射电镜图；
2)通过凝胶-溶胶法在上述磁性纳米球表面包覆一层厚度为20nm的硅层，方法是将200mg磁性纳米球、80mL乙醇、30mL超纯水、3mL氨水和2mL四乙氧基硅烷置于三口瓶中，常温下反应24h，固液用磁铁分离后，将液体倾倒出来，固体产物用超纯水洗涤至中性，真空干燥，图2为采用凝胶-溶胶法制得的硅层厚度为20nm的包硅磁性纳米球的透射电镜图；
3)将500mg包硅磁性纳米球置于三口烧瓶中，加入30mL Tris-HCl，再加入200mgN-异丙基丙烯酰胺、5mg丙烯酰胺、17mgN-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺，18mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺和100mg牛血清蛋白质，得到反应液；
4)将上述反应液在50℃下，聚合24h，得到聚合物；
5)将上述聚合物用浓度为1mol/L为氯化钠为洗脱液，洗脱4h，即得温敏型磁性蛋白质印迹纳米球，图3为表面分子印迹技术制得的温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的透射电镜图。
所制得的温敏型磁性蛋白质印迹纳米球，可应用于复杂生物体系中高丰度蛋白质组分的选择性去除和富集。
Claims (5)
1.一种温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法，其特征在于步骤如下：
1）用水热法合成粒径为200nm的磁性纳米球；
2）通过凝胶-溶胶法在上述磁性纳米球表面包覆一层厚度为20nm的硅层；
3）将包硅的磁性纳米球、功能单体、模板分子和交联剂加入到Tris-HCl缓冲液中，得到反应液；
4）将上述反应液在一定温度下进行聚合反应，得到聚合物；
5）用洗脱液洗脱上述聚合物，即可制得温敏型磁性蛋白质印迹纳米球；
所述水热法合成磁性纳米球的方法是：将1.35g氯化铁、3.6g乙酸钠和35mL乙二醇置于反应釜中，200℃条件下反应6h，固液用磁铁分离后，将液体倾倒出来，固体产物用超纯水洗涤至中性，真空干燥；
所述功能单体为N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺的质量比为3-10:1:1，交联剂为N，N-亚甲基双丙烯酰胺， 模板分子为牛血清蛋白质；
所述聚合反应的温度为50℃，聚合时间为24h。
2.根据权利要求1所述温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法，其特征在于：所述凝胶-溶胶法在磁性纳米球表面包覆硅层的方法是，将200mg磁性纳米球、80mL乙醇、30mL超纯水、3mL氨水和2mL四乙氧基硅烷置于三口瓶中，常温下反应24h，固液用磁铁分离后，将液体倾倒出来，固体产物用超纯水洗涤至中性，真空干燥。
3.根据权利要求1所述温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法，其特征在于：所述包硅磁性纳米球与Tris-HCl缓冲液的用量比为500mg/30mL。
4.根据权利要求1所述温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法，其特征在于：所述功能单体、模板分子和交联剂在缓冲液中的重量百分比浓度分别为：26.43%、11.90%和2.14%。
5.根据权利要求1所述温敏型磁性蛋白质印迹纳米球的制备方法，其特征在于：所述洗脱液为氯化钠，其浓度为1mol/L，洗脱时间为4h。
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