CN105566555B - 一种胰岛素抗体印迹聚合物及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种胰岛素抗体印迹聚合物及其制备方法、应用。本发明将印迹技术与磁性分离结合，应用于血清中胰岛素抗体ELISA检测中。该胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物，其具有以Fe3O4@SiO2磁性硅球载体为芯，胰岛素抗体分子印迹聚合物为壳的芯壳结构。本发明通过印迹聚合微球替代了传统的抗原，无需再进行包被和封闭过程，大大节约了检测时间。印迹聚合微球较传统抗原稳定，对于环境耐受性高，制备和储存简单，成本低。本发明中使用的印迹聚合微球可反复使用，洗脱较为简单。96孔板也可以洗脱重复利用，避免了材料的浪费。为环境友好型产品。

Description

一种胰岛素抗体印迹聚合物及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种胰岛素抗体印迹聚合物及其制备方法、应用。
背景技术
胰岛素抗体是1型糖尿病一种重要标记物。胰岛素抗体可能系β细胞破坏所产生，因此胰岛素自身抗体的检测可作为自身免疫性β细胞损伤的标志，对于对糖尿病和低血糖的诊断、鉴别诊断及治疗具有非常重要的意义。因此，检测血清中抗胰岛素抗体可有助于糖尿病的及时发现。
现有的血清中抗胰岛素抗体的检测都是采用试剂盒进行检测。该方法方便有效，试剂盒具体包含用于检测血清蛋白中抗胰岛素抗体的所有试剂和对照液，包括载体、抗原或抗体、酶底物、阴性对照品和阳性对照品、结合物以及标本的稀释液、洗涤液、酶反应终止液。目前，在检测血清中抗胰岛素抗体的抗原须经包被封闭，耗时费力，使用繁琐。抗原一般成本较高且不能重复利用。导致Elisa试剂盒的成本提高。因此，提供一种操作简便、节省检测时间、成本低的检测工具及方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种胰岛素抗体印迹聚合物及其制备方法、应用。本发明将印迹技术与磁性分离结合，应用于血清中胰岛素抗体ELISA检测中。本发明通过印迹聚合微球替代了传统的抗原，无需再进行包被和封闭过程，大大节约了检测时间。印迹聚合微球较传统抗原稳定，对于环境耐受性高，制备和储存简单，成本低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物，其具有以Fe3O4@SiO2磁性硅球载体为芯，胰岛素抗体分子印迹聚合物为壳的芯壳结构。
分子印迹技术是一种可以合成特异性捕获模板分子的聚合物的一门技术。主要原理是：通过共价键、氢键、静电作用、疏水作用等作用，将该分子与可聚合的功能单体进行组装，并于交联剂共聚反应。反应结束洗脱模板分子即可在聚合物形成与印迹分子的形状、大小、电荷分布具有互补性的印迹孔腔。因此，制备的分子印迹聚合物对印迹分子具有良好的选择性。基于分子印迹技术的高选择性、吸附能力强和磁性纳米粒子的比表面积大，在磁场作用下容易分离等优点。
在本发明的一些具体实施方案中，所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物，所述Fe3O4@SiO2磁性硅球载体为在Fe3O4纳米颗粒表面包裹硅壳后制得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物，所述胰岛素抗体分子印迹聚合物以胰岛素抗体为模板分子，甲基丙烯酸和/或丙烯酰胺为功能单体，通过交联剂和引发剂发生聚合反应后，洗脱所述模板分子制得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物，所述Fe3O4@SiO2磁性硅球载体与所述模板分子的质量比为(55～65)：11；所述模板分子、所述功能单体的质量比为1：(2～3)；所述功能单体包括甲基丙烯酸和丙烯酰胺时，所述甲基丙烯酸和丙烯酰胺的质量比为(1～2)：1；
所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，所述引发剂为水溶性常温引发剂，所述水溶性常温引发剂包括亚硫酸氢钠/过硫酸铵体系或亚硫酸亚铁/过硫酸铵体系。
本发明还提供了所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备获得Fe3O4纳米颗粒；
步骤2：在所述Fe3O4纳米颗粒表面包裹硅壳，制备获得Fe3O4@SiO2磁性硅球载体；
步骤3：将所述Fe3O4@SiO2磁性硅球载体、功能单体、模板分子、交联剂混合，通过引发剂引发聚合；再经洗脱液将模板分子洗脱，制备获得胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述胰岛素抗体分子印迹聚合物以胰岛素抗体为模板分子，甲基丙烯酸和/或丙烯酰胺为功能单体，通过交联剂和引发剂发生聚合反应后，洗脱所述模板分子制得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述Fe3O4@SiO2磁性硅球载体与所述模板分子的质量比为(55～65)：11；所述模板分子、所述功能单体的质量比为1：(2～3)；所述功能单体包括甲基丙烯酸和丙烯酰胺时，所述甲基丙烯酸和丙烯酰胺的质量比为(1～2)：1；
所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，所述引发剂为水溶性常温引发剂，所述水溶性常温引发剂包括亚硫酸氢钠/过硫酸铵体系或亚硫酸亚铁/过硫酸铵体系。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述洗脱液包括去离子水、36％(w/w)的NaCl溶液、10％(w/v)SDS溶液、10％(v/v)的醋酸溶液。
本发明还提供了所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物或所述制备方法制得的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物在制备检测胰岛素抗体的制剂或检测工具中的应用。
作为优选，检测工具可以为试剂盒。
本发明提供了一种胰岛素抗体检测试剂盒，包括所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物或所述制备方法制得的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物。
本发明还提供了一种胰岛素抗体的检测方法，取所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物或所述制备方法制得的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物与待测样本混合孵育，再与二抗混合孵育，加入显色液显色，终止反应，检测，获得所述待测样本中胰岛素抗体的含量。
在本发明的一些具体实施方案中，所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物与待测样本混合孵育的温度为37℃，时间为1～1.5h。
在本发明的另一些具体实施方案中，所述二抗为抗胰岛素抗体，所述在于二抗混合孵育的温度为37℃，时间为40～50min。
在本发明的另一些具体实施方案中，所述显色液包括显色液A和显色液B；其中显色液A包括十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲；所述十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲的质量比为(60～62)：17:1混合；所述显色液B包括乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜，所述乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜的质量比为1：(7～7.5)：(1.4～1.5)：(37～38)；所述显色的时间为10～15min。
在本发明的另一些具体实施方案中，所述检测可以为ELISA检测。本领域常规的检测方法均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
本发明提供了一种胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物，其具有以Fe3O4@SiO2磁性硅球载体为芯，胰岛素抗体分子印迹聚合物为壳的芯壳结构。本发明通过印迹聚合微球替代了传统的抗原，无需再进行包被和封闭过程，大大节约了检测时间。印迹聚合微球较传统抗原稳定，对于环境耐受性高，制备和储存简单，成本低。本发明中使用的印迹聚合微球可反复使用，洗脱较为简单。96孔板也可以洗脱重复利用，避免了材料的浪费。为环境友好型产品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明提供的磁性印迹聚合物的透射电镜图；胰岛素抗体印迹聚合物的组成结构为球状结构，Fe3O4为核心，经SiO2包裹为磁性硅球，外面合成一层聚丙烯酰胺-甲基丙烯酸膜；在该聚合物表面含有大量的印迹孔腔，可以特异性的识别胰岛素抗体；
图2示本发明提供的磁性印迹聚合物的红外吸收图谱；表明各阶段产物的主要成分；其中，线1示Fe3O4，线2示包硅，即Fe3O4@SiO2；线3示修饰，即Fe3O4@SiO2@C＝O；线4示包裹聚合物，即MIP——胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物。
具体实施方式
本发明公开了一种胰岛素抗体印迹聚合物及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的胰岛素抗体印迹聚合物的制备包括以下步骤：
磁印迹聚合物的制备：通过共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒；通过溶胶-凝胶法在在Fe3O4纳米颗粒表面包裹硅壳，制备磁性硅球载体。将磁珠载体、丙烯酰胺，甲基丙烯酸，模板分子蛋白，交联剂加入到中性PBS缓冲液中混合，通过引发剂引发聚合。聚合物经去离子水、质量百分比浓度为36％的NaCl溶液,、10％SDS溶液、体积百分比浓度为10％的醋酸溶液将模板分子蛋白洗脱出来制备胰岛素抗体印迹聚合物。所述的磁珠载体、模板分子蛋白的质量比为(55～65):11，模板蛋白、丙烯酰胺、甲基丙烯酸的1：(1～2)：1。
以下为本发明的胰岛素抗体印记聚合物应用于ELISA检测方法中的描述：
将制备的胰岛素抗体印迹聚合物与待检测样本混合加入96孔板，37℃反应1h以上。洗板，甩干后加入二抗，37℃反应40min以上。然后加入显色液显色10～15min后，加入终止液终止。显色液由A液和B液按1：1混合制备，A液为十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲按60～62：17:1配置，B液为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜按照1：7～7.5：1.4～1.5：37～38。
本发明提供的胰岛素抗体印迹聚合物及其制备方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：胰岛素抗体磁性分子印迹材料的制备
胰岛素抗体磁性分子印迹材料的制备：采用共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，2.08gFeCl2·4H2O，3.2073g FeCl3溶于100mL无菌水，通氮气，将溶液加热至70℃，加入12mL氨水溶液(质量分数为28％)。搅拌反应30min，待产物冷却后，借助外界磁场除去上清液，用无菌水、乙醇多次洗涤黑色产物，得到超顺磁性的Fe3O4纳米颗粒，干燥后加入160mL乙醇和40mL水，加入8mL氨水(质量分数是为28％)及2mL TEOS。搅拌反应10h，磁分离后用无菌水、乙醇洗涤。干燥。
称取30mg胰岛素抗体，50mg丙烯酰胺，30mg甲基丙烯酸及10mg MBA，300mg Fe3O4@SiO2磁性硅球载体，依次溶于10mL PBS溶液(0.1M,pH＝7.0)，搅拌均匀后，通氮气，机械搅拌下依次将5mg APS及5μL TEMED加入上述溶液。反应24h。待产物冷却后，磁分离，依次用去离子水，NaCl溶液(26.5％,w/w),SDS溶液(10％,w/v),醋酸溶液(10％,v/v)振荡洗脱上述聚合物。得到磁性蛋白质印迹聚合微球。产物共计约300mg。
实施例2：胰岛素抗体磁性分子印迹材料的制备
胰岛素抗体磁性分子印迹材料的制备：采用共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，2.08gFeCl2·4H2O，3.2073g FeCl3溶于100mL无菌水，通氮气，将溶液加热至70℃，加入12mL氨水溶液(质量分数为28％)。搅拌反应30min，待产物冷却后，借助外界磁场除去上清液，用无菌水、乙醇多次洗涤黑色产物，得到超顺磁性的Fe3O4纳米颗粒，干燥后加入160mL乙醇和40mL水，加入8mL氨水(质量分数是为28％)及2mL TEOS。搅拌反应10h，磁分离后用无菌水、乙醇洗涤。干燥。
称取40mg胰岛素抗体，40mg丙烯酰胺，40mg甲基丙烯酸及10mg MBA，200mg Fe3O4@SiO2磁性硅球载体，依次溶于10mL PBS溶液(0.1M,pH＝7.0)，搅拌均匀后，通氮气，机械搅拌下依次将5mg APS及5μL TEMED加入上述溶液。反应24h。待产物冷却后，磁分离，依次用去离子水，NaCl溶液(36％,w/w),SDS溶液(10％,w/v),醋酸溶液(10％,v/v)振荡洗脱上述聚合物。得到磁性蛋白质印迹聚合微球。产物共计约200mg。
实施例3：胰岛素抗体磁性分子印迹材料的制备
胰岛素抗体磁性分子印迹材料的制备：采用共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，2.08gFeCl2·4H2O，3.2073g FeCl3溶于100mL无菌水，通氮气，将溶液加热至70℃，加入12mL氨水溶液(质量分数为28％)。搅拌反应30min，待产物冷却后，借助外界磁场除去上清液，用无菌水、乙醇多次洗涤黑色产物，得到超顺磁性的Fe3O4纳米颗粒，干燥后加入160mL乙醇和40mL水，加入8mL氨水(质量分数是为28％)及2mL TEOS。搅拌反应10h，磁分离后用无菌水、乙醇洗涤。干燥。
称取50mg胰岛素抗体，101.5mg丙烯酰胺，50.8mg甲基丙烯酸及10mg MBA，300mgFe3O4@SiO2磁性硅球载体，依次溶于10mL PBS溶液(0.1M,pH＝7.0)，搅拌均匀后，通氮气，机械搅拌下依次将5mg APS及5μL TEMED加入上述溶液。反应24h。待产物冷却后，磁分离，依次用去离子水，NaCl溶液(36％,w/w),SDS溶液(10％,w/v),醋酸溶液(10％,v/v)振荡洗脱上述聚合物。得到磁性蛋白质印迹聚合微球。产物共计约200mg。
实施例4：胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物ELISA检测方法的应用
实验组：
1、预处理：首先，将实施例1制备的胰岛素抗体磁性分子印迹用水混匀，浓度约为100mg/mL。每孔加入50μL的混合液。共计8孔备用。
其次，取免疫过的小鼠一只，尾部取20μL血液，加入490mL生理盐水中。离心3000r，10min取上清。供检测备用。
2、检测：将上清分别稀释1000/10000/100000/1000000倍后，加入上述酶联板中。每一样品重复加两孔，100μL/孔。37℃反应1h。
磁分离洗净甩干，加入二抗反应，100μL/孔。37℃反应1h。
显色液A包括十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲；十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲的质量比为60：17:1混合；
显色液B包括乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜，所述乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜的质量比为1：7：1.5：37.5；
显色A液和B液按1：1混合后加入100μL/孔，显色15min。
加入1M硫酸终止反应，在酶标仪上读数，计算生物样本中胰岛素抗体的量。对照组：传统的ELISA间接测定法，用抗原——胰岛素，经过包被、封闭、上述方法进行检测。
如表1，该印迹聚合物应用于Elisa试剂盒中，表现出对被印迹蛋白具有较高的选择性。
表1 胰岛素抗体磁性分子印迹材料仿生ELISA检测小鼠血清结果及与传统方法对比
用胰岛素抗体磁性分子印迹材料仿生ELISA检测小鼠血清的结果及比传统方法测得数值低0.037，误差仅为1.11％，与传统检测方法相比，可以重复使用。
实施例5：胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物ELISA检测方法的应用
实验组：
1、预处理：首先，将实施例2制备的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物用水混匀，浓度约为100mg/mL。每孔加入50μL的混合液。共计8孔备用。
其次，取免疫过的小鼠一只，尾部取20μL血液，加入490mL生理盐水中。离心3000r，10min取上清。供检测备用。
2、检测：将上清分别稀释1000/10000/100000/1000000倍后，加入上述酶联板中。每一样品重复加两孔，100μL/孔。37℃反应1h。
磁分离洗净甩干，加入二抗反应，100μL/孔。37℃反应40min。
显色液A包括十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲；十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲的质量比为62：17:1混合；
显色液B包括乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜，所述乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜的质量比为1：7.5：1.4：37；
显色A液和B液按1：1混合后加入100μL/孔，显色10min。
加入1M硫酸终止反应，在酶标仪上读数，计算生物样本中胰岛素抗体的量。
对照组：传统的ELISA间接测定法，用抗原——胰岛素，经过包被、封闭、上述方法进行检测。
如表2，该印迹聚合物应用于Elisa试剂盒中，表现出对被印迹蛋白具有较高的选择性。
表2 胰岛素抗体磁性分子印迹材料仿生ELISA检测小鼠血清结果及与传统方法对比
用胰岛素抗体磁性分子印迹材料仿生ELISA检测小鼠血清的结果及比传统方法测得数值更为稳定，同一样本检查结果偏差较小。
实施例6：胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物ELISA检测方法的应用
实验组：
1、预处理：首先，将实施例3制备的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物用水混匀，浓度约为100mg/mL。每孔加入50μL的混合液。共计8孔备用。
其次，取免疫过的小鼠一只，尾部取20μL血液，加入490mL生理盐水中。
离心3000r，10min取上清。供检测备用。
2、检测：将上清分别稀释1000/10000/100000/1000000倍后，加入上述酶联板中。每一样品重复加两孔，100μL/孔。37℃反应1h。
磁分离洗净甩干，加入二抗反应，100μL/孔。37℃反应1h。
显色液A包括十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲；十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲的质量比为61：17:1混合；
显色液B包括乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜，所述乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜的质量比为1：7.3：1.45：38；
显色A液和B液按1：1混合后加入100μL/孔，显色12min。
加入1M硫酸终止反应，在酶标仪上读数，计算生物样本中胰岛素抗体的量。
对照组：传统的ELISA间接测定法，用抗原——胰岛素，经过包被、封闭、上述方法进行检测。
如表3，该印迹聚合物应用于Elisa试剂盒中，表现出对被印迹蛋白具有较高的选择性。
表3 胰岛素抗体磁性分子印迹材料仿生ELISA检测小鼠血清结果及与传统方法对比
用胰岛素抗体磁性分子印迹材料仿生ELISA检测小鼠血清的结果及比传统方法测得数值较为稳定，且可以反复利用。
实施例7：胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物应用于ELISA检测抗体重复性评价
首先，实施例1制备的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物用水混匀，浓度约为100mg/mL。每孔加50μL的混合液共计8孔备用。
将小鼠上清分别稀释103/104/105/106倍后，加入上述酶联板中。每一品重复加两孔，100μL/孔。37℃反应1h。加入上述酶联板，每一样品复加两孔，100μL/孔。37℃反应1h。
磁分离洗净甩干，加入二抗反应，100μL/孔。37℃反应1h。
显色液A包括十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲；十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲的质量比为60：17:1混合；
显色液B包括乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜，所述乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜的质量比为1：7：1.5：37.5；
显色A液和B液按1：1混合后加入100μL/孔，显色15min。
加入1M硫酸终止反应，在酶标仪上读数。将上述酶联板磁分离，洗净，分别用100mL10％SDS，100mL10％醋酸溶液，100mL纯水，洗净磁性印迹聚合物，干燥后重复上述实验3次，记录对比实验结果。
如表4，胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物可重复使用，检测效果良好。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。
表4 胰岛素抗体磁性分子印迹材料重复性检测结果
稀释倍数 103 103 104 104 105 105 106 阳性对照
第一次 3.32 3.341 1.39 1.421 0.51 0.482 0.06 3.295
第二次 3.247 3.308 1.305 1.397 0.483 0.477 0.11 3.258
第三次 3.203 3.245 1.237 1.365 0.475 0.474 0.09 3.19
胰岛素抗体磁性分子印迹材料循环使用检测同一样本，经三次循环后结果略微下降，约为0.075，但无显著差异(P＞0.05)，表明本发明提供的胰岛素抗体磁性分子印迹材料重复性好。
实施例8：胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物应用于ELISA检测抗体重复性评价
首先，实施例2制备的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物用水混匀，浓度约为100mg/mL。每孔加50μL的混合液共计8孔备用。
将小鼠上清分别稀释103/104/105/106倍后，加入上述酶联板中。每一品重复加两孔，100μL/孔。37℃反应1.5h。加入上述酶联板，每一样品复加两孔，100μL/孔。37℃反应1.5h。
磁分离洗净甩干，加入二抗反应，100μL/孔。37℃反应1h。
显色液A包括十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲；十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲的质量比为62：17:1混合；
显色液B包括乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜，所述乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜的质量比为1：7.5：1.4：38；
显色A液和B液按1：1混合后加入100μL/孔，显色10min。
加入1M硫酸终止反应，在酶标仪上读数。将上述酶联板磁分离，洗净，分别用100mL10％SDS，100mL10％醋酸溶液，100mL纯水，洗净磁性印迹聚合物，干燥后重复上述实验3次，记录对比实验结果。
如表5，胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物可重复使用，检测效果良好。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。
表5 胰岛素抗体磁性分子印迹材料重复性检测结果
稀释倍数 103 103 104 104 105 105 106 阳性对照
第一次 3.289 3.288 1.41 1.387 0.62 0.61 0.07 3.31
第二次 3.255 3.236 1.314 1.317 0.586 0.579 0.07 3.288
第三次 3.211 3.208 1.305 1.295 0.505 0.495 0.05 3.18
胰岛素抗体磁性分子印迹材料循环使用检测同一样本，经三次循环后结果略微下降，约为0.075，但无显著差异(P＞0.05)，表明本发明提供的胰岛素抗体磁性分子印迹材料重复性好。
实施例9：胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物应用于ELISA检测抗体重复性评价
首先，实施例3制备的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物用水混匀，浓度约为100mg/mL。每孔加50μL的混合液共计8孔备用。
将小鼠上清分别稀释103/104/105/106倍后，加入上述酶联板中。每一品重复加两孔，100μL/孔。37℃反应1h。加入上述酶联板，每一样品复加两孔，100μL/孔。37℃反应1h。
磁分离洗净甩干，加入二抗反应，100μL/孔。37℃反应1h。
显色液A包括十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲；十二水磷酸二氢钠、柠檬酸、过氧化脲的质量比为61：17:1混合；
显色液B包括乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜，所述乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、TMB、二甲基亚砜的质量比为1：7.3：1.45：37；
显色A液和B液按1：1混合后加入100μL/孔，显色12min。
加入1M硫酸终止反应，在酶标仪上读数。将上述酶联板磁分离，洗净，分别用100mL10％SDS，100mL10％醋酸溶液，100mL纯水，洗净磁性印迹聚合物，干燥后重复上述实验3次，记录对比实验结果。
如表6，胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物可重复使用，检测效果良好。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。
表6 胰岛素抗体磁性分子印迹材料重复性检测结果
稀释倍数 103 103 104 104 105 105 106 阳性对照
第一次 3.292 3.28 1.37 1.35 0.499 0.491 0.06 3.291
第二次 3.259 3.24 1.29 1.297 0.474 0.469 0.06 3.249
第三次 3.215 3.205 1.18 1.15 0.452 0.464 0.05 3.201
胰岛素抗体磁性分子印迹材料循环使用检测同一样本，经三次循环后结果略微下降，约为0.075，但无显著差异(P＞0.05)，表明本发明提供的胰岛素抗体磁性分子印迹材料重复性好。
实施例10检测时间及成本的比较
实验组：本发明实施例1～3提供的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物；
对照组：传统抗原；
试验方法：按照实施例4～6提供的检测方法进行检测；
结果见表7：
表7 检测时间及成本比较结果
本发明所提供的聚合物材料与传统的蛋白质相比较，该材料环境和耐受性好，可重复性使用，成本低，具有显著(P＜0.05)的优势。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物，其特征在于，其具有以Fe3O4@SiO2磁性硅球载体为芯，胰岛素抗体分子印迹聚合物为壳的芯壳结构；
其制备方法包括如下步骤：
步骤1：制备获得Fe3O4纳米颗粒；
步骤2：在所述Fe3O4纳米颗粒表面包裹硅壳，制备获得Fe3O4@SiO2磁性硅球载体；
步骤3：将所述Fe3O4@SiO2磁性硅球载体、功能单体、模板分子、交联剂混合，通过引发剂引发聚合；再经洗脱液将模板分子洗脱，制备获得胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物；
所述功能单体为丙烯酰胺和/或甲基丙烯酸；
所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺。
2.根据权利要求1所述的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物，其特征在于，所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物以胰岛素抗体为模板分子，甲基丙烯酸和/或丙烯酰胺为功能单体，通过交联剂和引发剂发生聚合反应后，洗脱所述模板分子制得。
3.根据权利要求1至2任一项所述的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物，其特征在于，所述Fe3O4@SiO2磁性硅球载体与所述模板分子的质量比为(55～65)：11；所述模板分子、所述功能单体的质量比为1：(2～3)；所述功能单体包括甲基丙烯酸和丙烯酰胺时，所述甲基丙烯酸和丙烯酰胺的质量比为(1～2)：1；
所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，所述引发剂为水溶性常温引发剂，所述水溶性常温引发剂包括亚硫酸氢钠/过硫酸铵体系或亚硫酸亚铁/过硫酸铵体系。
4.根据权利要求1至3任一项所述的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：制备获得Fe3O4纳米颗粒；
步骤2：在所述Fe3O4纳米颗粒表面包裹硅壳，制备获得Fe3O4@SiO2磁性硅球载体；
步骤3：将所述Fe3O4@SiO2磁性硅球载体、功能单体、模板分子、交联剂混合，通过引发剂引发聚合；再经洗脱液将模板分子洗脱，制备获得胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物以胰岛素抗体为模板分子，甲基丙烯酸和/或丙烯酰胺为功能单体，通过交联剂和引发剂发生聚合反应后，洗脱所述模板分子制得。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述Fe3O4@SiO2磁性硅球载体与所述模板分子的质量比为(55～65)：11；所述模板分子、所述功能单体的质量比为1：(2～3)；所述功能单体包括甲基丙烯酸和丙烯酰胺时，所述甲基丙烯酸和丙烯酰胺的质量比为(1～2)：1；
所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，所述引发剂为水溶性常温引发剂，所述水溶性常温引发剂包括亚硫酸氢钠/过硫酸铵体系或亚硫酸亚铁/过硫酸铵体系。
7.根据权利要求4至6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱液包括去离子水、36％(w/w)的NaCl溶液、10％(w/v)SDS溶液、10％(v/v)的醋酸溶液。
8.根据权利要求1至3任一项所述的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物或根据权利要求4至7任一项所述的制备方法制得的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物在制备检测胰岛素抗体的制剂或检测工具中的应用。
9.一种胰岛素抗体检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物或如权利要求4至7任一项所述的制备方法制得的胰岛素抗体磁性分子印迹聚合物。
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