CN114272903A - 用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法，包括磁性颗粒的制备步骤、Fe₃O₄磁性颗粒油酸修饰步骤、用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备步骤；还公开了一种应用磁性微球提取血液中糖化血红蛋白的方法，其中磁性微球由用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法制得，包括全血样本裂解步骤、磁性微球吸附糖化血红蛋白步骤、洗脱糖化血红蛋白步骤。本发明的工艺流程简单，可操作性强，无污染，成本低廉，易于工业大批量生产，得到的磁性微球具有良好的生物相容性，提取过程操作简单，蛋白载量大，提取得到的糖化血红蛋白纯度高。

Description

用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及提取磁性微球领域，尤其涉及一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法及应用。

背景技术

目前在糖化血红蛋白中提取磁性微球的工艺流程复杂，成本昂贵，不适用于工业大批量生产，且得到的磁性微球生物相容性相对较差，蛋白载量低、提取得到的糖化血红蛋白纯度不高的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺流程简单、可操作性强、无污染，成本低廉、易于工业大批量生产、得到的磁性微球具有良好的生物相容性、提取过程操作简单、蛋白载量大、提取得到的糖化血红蛋白纯度高的用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法：包括如下步骤，

S1）磁性颗粒的制备步骤

称取无水三氯化铁，聚乙二醇2000，在乙二醇中搅拌至溶解，再向其中加入三水合乙酸钠，继续搅拌，将溶解好的液体转移至水热釜中持续加热，反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤，真空干燥得到Fe₃O₄磁性颗粒；

S2）Fe₃O₄磁性颗粒螯合修饰步骤

向反应瓶中加入S1）步骤得到的Fe₃O₄磁性颗粒、蒸馏水，超声分散后，于水浴中快速搅拌，然后加入螯合试剂，并继续搅拌，反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤磁性颗粒，真空干燥得到螯合试剂修饰的Fe₃O₄磁性颗粒；

S3）用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备步骤

向反应瓶中依次加入S2）步骤得到的螯合试剂修饰的Fe₃O₄磁性颗粒、表面活性剂、交联剂、功能化单体、蒸馏水，超声溶解分散后将反应瓶转至水浴中搅拌，然后向其中加入引发剂，继续搅拌，反应结束后分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤产物，真空干燥得到用于提取糖化血红蛋白的磁性微球。

优选地，在S1）步骤中，持续加热的温度为250℃，加热时长为8h。

优选地，在S1）步骤、S2）步骤中，均用蒸馏水和无水乙醇洗涤三遍。

优选地，Fe₃O₄磁性颗粒的粒径为300 nm-800 nm。

优选地，在S1）步骤中的真空干燥的温度是60℃（±10℃），时间是6h（±2h）；在S2）步骤、S3）步骤中的真空干燥的温度是60℃（±10℃），时间是3h（±1h）。

优选地，在S2）步骤中，螯合试剂可以是：油酸、十一烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸中的一种或多种。

优选地，在S3）步骤中，表面活性剂可以是：十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、壬基酚聚氧乙烯醚、吐温20中的一种或者多种。

优选地，在S3）步骤中，交联剂和功能化单体可以是：对二乙烯基苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、苯乙烯、4-乙烯基苯硼酸中的一种或多种。

优选地，在S3）步骤中，引发剂可以是：过氧化苯甲酰、偶氮二异丁氰、叔丁基过氧化氢、过硫酸铵、过硫酸钾中的一种或几种。

一种应用磁性微球提取血液中糖化血红蛋白的方法，其中磁性微球由上述的制备方法制得，包括如下步骤，

S1）全血样本裂解步骤

在离心管中加入10μL全血样本和2 mL去离子水，于混匀器上混匀；以释放血红细胞中的血红蛋白及糖化血红蛋白。

S2）磁性微球吸附糖化血红蛋白步骤

向离心管中加入2 mg 上述的磁性微球，于混匀器上混匀；以促进磁性微球吸附糖化血红蛋白。

S3）洗脱糖化血红蛋白步骤

将离心管放置于磁分离器中，静置，待吸清后弃去上清，用磷酸盐缓冲液或 Tris-HCl缓冲液洗涤磁性微球并弃去，使用磷酸盐缓冲液成本低，对环境污染小，最后取山梨醇缓冲液重悬磁性微球，进行震荡、磁吸，保留上清液，得到纯化好的糖化血红蛋白样品，并于4℃中保存，待用；山梨醇缓冲液可以对吸附在磁性微球上的糖化血红蛋白进行有效的洗脱，且无其它可替代物质，震荡可以使磁性微球与山梨醇缓冲液充分接触，更快的洗脱。磁吸是通过磁场，将磁性微球吸引至离心管一侧，方便取出上清液。

S4）电泳检测提取的糖化血红蛋白纯度步骤

取5μL 提取的糖化血红蛋白样品在SDS-PAGE电泳中上样，检测样本蛋白纯度。

优选地，S3）步骤中，用0.01-0.1 mol/L磷酸盐洗涤磁性微球两遍并弃去。

与已有技术相比，本发明一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法以及一种应用磁性微球提取血液中糖化血红蛋白的方法的有益效果体现在：工艺流程简单，可操作性强，无污染，成本低廉，易于工业大批量生产。得到的磁性微球具有良好的生物相容性，提取过程操作简单，蛋白载量大，提取得到的糖化血红蛋白纯度高等特点。

附图说明

图1为本专利提取糖化血红蛋白与A、B公司的对比效果。

1：Marker；2 ：A公司产品提取糖化血红蛋白结果；3： B公司产品提取糖化血红蛋白结果；4：本专利磁性微球提取糖化血红蛋白结果。

具体实施方式

以下是本发明用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法的具体实施例，结合图1对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例一

一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法，包括如下步骤：

S1）300 nm Fe₃O₄磁性颗粒的制备步骤

称取14g无水三氯化铁，50g聚乙二醇2000，在500mL乙二醇中搅拌至溶解，在向其中加入7g三水合乙酸钠，继续搅拌。将溶解好的液体转移至1L水热釜中，于250℃加热8小时。反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤三遍，60℃真空干燥6小时，得到粒径为300 nm Fe₃O₄磁性颗粒。

S2） 300nm Fe₃O₄磁性颗粒油酸修饰步骤

向反应瓶中加入10g S1）步骤得到的Fe₃O₄磁性颗粒， 20 mL蒸馏水，超声分散后，于80℃水浴中快速搅拌30分钟，然后向其中加入20g油酸，并继续快速搅拌60分钟。反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤磁性颗粒三遍，60℃真空干燥3小时，得到油酸修饰的Fe₃O₄磁性颗粒。

S3）用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备步骤

向反应瓶中依次加入S2）步骤得到的油酸修饰的Fe₃O₄磁性颗粒10g，十二烷基磺酸钠1g，二乙烯基苯1g，4-乙烯基苯硼酸5g，蒸馏水50mL，超声溶解分散后将反应瓶转至80℃水浴中搅拌30分钟，然后向其中加入0.5g过硫酸钾，继续搅拌24小时。反应结束后分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤产物，60℃真空干燥3小时，得到用于提取糖化血红蛋白的磁性微球。

实施例二，一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法，

S1）500 nm Fe₃O₄磁性颗粒的制备步骤

称取10g无水三氯化铁，30g聚乙二醇2000，在500mL乙二醇中搅拌至溶解，在向其中加入5g三水合乙酸钠，继续搅拌。将溶解好的液体转移至1L水热釜中，于250℃加热10小时。反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤三遍，60℃真空干燥6小时，得到粒径为500 nm Fe₃O₄磁性颗粒。

S2） 500nm Fe₃O₄磁性颗粒十一烯酸修饰步骤

向反应瓶中加入10g S1）步骤得到的Fe₃O₄磁性颗粒， 20 mL蒸馏水，超声分散后，于50℃水浴中快速搅拌60分钟，然后向其中加入10g十一烯酸，并继续快速搅拌60分钟。反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤磁性颗粒三遍，60℃真空干燥2小时，得到十一烯酸修饰的Fe₃O₄磁性颗粒。

S3）用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备步骤

向反应瓶中依次加入 S2）步骤得到的十一烯酸修饰的Fe₃O₄磁性颗粒10g，十六烷基三甲基溴化铵2g，乙二醇二甲基丙烯酸酯0.5g，4-乙烯基苯硼酸3g，蒸馏水50mL，超声溶解分散后将反应瓶转至80℃水浴中搅拌30分钟，然后向其中加入0.5g过硫酸铵，继续搅拌24小时。反应结束后分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤产物，60℃真空干燥3小时，得到用于提取糖化血红蛋白的磁性微球。

实施例三，一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法，

S1）800 nm Fe₃O₄磁性颗粒的制备步骤

称取15g无水三氯化铁，10g聚乙二醇2000，在300mL乙二醇中搅拌至溶解，在向其中加入3g三水合乙酸钠，继续搅拌。将溶解好的液体转移至1L水热釜中，于250℃加热12小时。反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤三遍，60℃真空干燥6小时，得到粒径为800 nm Fe₃O₄磁性颗粒。

S2） 800nm Fe₃O₄磁性颗粒丙烯酸修饰步骤

向反应瓶中加入10g步骤S1）得到的Fe₃O₄磁性颗粒， 20 mL蒸馏水，超声分散后，于50℃水浴中快速搅拌80分钟，然后向其中加入30g丙烯酸，并继续快速搅拌70分钟。反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤磁性颗粒三遍，60℃真空干燥5小时，得到丙烯酸修饰的Fe₃O₄磁性颗粒。

S3）用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备步骤

向反应瓶中依次加入步骤S2）得到的十一烯酸修饰的Fe₃O₄磁性颗粒10g，吐温202g，苯乙烯0.5g，4-乙烯基苯硼酸5g，蒸馏水50mL，超声溶解分散后将反应瓶转至80℃水浴中搅拌30分钟，然后向其中加入1g偶氮二异丁氰，继续搅拌24小时。反应结束后分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤产物，60℃真空干燥5小时，得到用于提取糖化血红蛋白的磁性微球。

用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法实验数据

以下是本发明一种应用磁性微球提取血液中糖化血红蛋白的方法的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

一种应用磁性微球提取血液中糖化血红蛋白的方法，其中磁性微球由上述制备方法制得，包括如下步骤：

S1）全血样本裂解步骤

在离心管中加入10μL全血样本和2 mL去离子水，于混匀器上混匀5分钟以释放血红细胞中的血红蛋白及糖化血红蛋白。

S2）磁性微球吸附糖化血红蛋白步骤

向离心管中加入2 mg 上述磁性微球，于混匀器上混匀20分钟以促进磁性微球吸附糖化血红蛋白。

S3）洗脱糖化血红蛋白步骤

将离心管放置于磁分离器中，静置2分钟，待吸清后弃去上清，用0.01mol/L磷酸盐洗涤磁性微球两遍并弃去。最后取1mL 0.1 M山梨醇缓冲液重悬磁性微球，震荡2分钟，磁吸，保留上清液，得到纯化好的糖化血红蛋白样品，于4℃中保存，待用。

S4） 电泳检测提取的糖化血红蛋白纯度

取5μL 提取的糖化血红蛋白样品在SDS-PAGE电泳中上样，检测样本蛋白纯度。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (7)

1.一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法：其特征在于：包括如下步骤，

S1）磁性颗粒的制备步骤

称取无水三氯化铁，聚乙二醇2000，在乙二醇中搅拌至溶解，再向其中加入三水合乙酸钠，继续搅拌，将溶解好的液体转移至水热釜中持续加热，反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤，真空干燥得到Fe₃O₄磁性颗粒；

S2）Fe₃O₄磁性颗粒油酸修饰步骤

向反应瓶中加入S1）步骤得到的Fe₃O₄磁性颗粒、蒸馏水，超声分散后，于水浴中快速搅拌，然后加入油酸，并继续搅拌，反应结束后，冷却至室温，分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤磁性颗粒，真空干燥得到油酸修饰的Fe₃O₄磁性颗粒；

S3）用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备步骤

向反应瓶中依次加入S2）步骤得到的油酸修饰的Fe₃O₄磁性颗粒、十二烷基磺酸钠、二乙烯基苯、4-乙烯基苯硼酸、蒸馏水，超声溶解分散后将反应瓶转至水浴中搅拌，然后向其中加入过硫酸钾，继续搅拌，反应结束后分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤产物，真空干燥得到用于提取糖化血红蛋白的磁性微球。

2.根据权利要求1所述的一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法步，其特征在于：在S1）步骤中，持续加热的温度为250℃，加热时长为8h。

3.根据权利要求1所述的一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法，其特征在于：在S1）步骤、S2）步骤中，均用蒸馏水和无水乙醇洗涤三遍。

4.根据权利要求1所述的一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法，其特征在于：Fe₃O₄磁性颗粒的粒径为300 nm-800 nm。

5.根据权利要求1所述的一种用于提取糖化血红蛋白的磁性微球的制备方法，其特征在于：

在S1）步骤中的真空干燥的温度是60℃（±10℃），时间是6h（±2h）；

在S2）步骤、S3）步骤中的真空干燥的温度是60℃（±10℃），时间是3h（±1h）。

6.一种应用磁性微球提取血液中糖化血红蛋白的方法，其特征在于：其中磁性微球由权利要求1-5中任意一项的制备方法制得，包括如下步骤，

S1）全血样本裂解步骤

在离心管中加入全血样本和去离子水，于混匀器上混匀；

S2）磁性微球吸附糖化血红蛋白步骤

向离心管中加入所述的磁性微球，于混匀器上混匀；

S3）洗脱糖化血红蛋白步骤

将离心管放置于磁分离器中，静置，待吸清后弃去上清，用磷酸盐或Tris-HCl缓冲液洗涤磁性微球并弃去，最后取山梨醇缓冲液重悬磁性微球，进行震荡、磁吸，保留上清液，得到纯化好的糖化血红蛋白样品，并于4℃中保存，待用；

S4）电泳检测提取的糖化血红蛋白纯度步骤

取提取的糖化血红蛋白样品在SDS-PAGE电泳中上样，检测样本蛋白纯度。

7.根据权利要求6所述的应用磁性微球提取血液中糖化血红蛋白的方法，其特征在于：S3）步骤中，用0.01-0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤磁性微球两遍并弃去。

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