CN103897123A - 一种表面富含镍离子的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种可用于分离组氨酸蛋白的核壳式磁性复合微球的制备方法及应用。核壳式磁性复合微球的核为磁性四氧化三铁纳米粒子团簇，壳为交联的富含咪唑基团的聚合物网络，咪唑基团和镍离子螯合使微球表面固定上大量的镍离子，通过固定的镍离子与组氨酸中咪唑基团的相互作用在中性条件快速分离天然组氨酸蛋白或含六个组氨酸标记的重组蛋白。首先制备柠檬酸钠稳定的磁性纳米粒子团簇，接着采用溶胶凝胶法，使磁簇表面修饰上活性的乙烯基官能团，然后通过回流沉淀聚合制备得到高磁响应性单分散的表面富含咪唑基团的核壳式磁性聚合物复合微球，再通过富电子的咪唑去络合缺电子的镍离子，最后进行组氨酸蛋白的富集或去除。本发明方法简单，过程可控，分离纯化组氨酸蛋白的效率高，且可实现多次循环使用，应用前景良好。

Description

一种表面富含镍离子的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于纳米功能材料技术领域，具体涉及一种表面富含镍离子的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用。

背景技术

近年来，有机-无机杂化复合微球，尤其是磁性复合微球正受到人们的广泛关注。由于磁性高分子微球同时具有有机高分子的表面可修饰性和无机磁性材料的磁响应性，可以在外加磁场下方便、快速、高效的分离目标生物分子。因此，在蛋白分离纯化、细胞分离、磁共振成像和磁靶向载药等生物医学领域具有广泛的应用前景。

目前，通过乳液聚合方法可以制备出不同结构的磁性聚合物复合微球。但是乳液聚合对于结构以及磁含量的控制相对较差，且对单体选择性高。要获得结构较好、磁含量可控的复合微球，通常需要借助过渡层（如二氧化硅），但是包覆中间的二氧化硅层会降低整个微球的磁饱和强度。另外由于乳液聚合大多采用过硫酸钾等带电水溶性引发剂，反应结束后往往使微球带上相应的电荷，会一定程度上影响后续的应用。并且该方法常常需要共聚疏水性单体，这会使得表面官能团密度下降。为了解决这一问题，回流沉淀聚合可以不用借助过渡层，直接在磁性纳米粒子表面包覆聚合物壳层，可以用不带电的油溶性引发剂，并且无需共聚其他单体，表面官能团密度较大。该方法简便易行，成本低廉，开发利用回流沉淀法直接包覆聚合物壳层是十分必要的。

磁性载体固定金属离子亲和色谱分离法是从生物混合体系中分离出高纯度的目标生物分子的方法，它将亲和配基偶联在磁性分离载体表面，在磁场定向控制下，通过亲和吸附、清洗和解吸等操作步骤，实现目标蛋白的分离纯化。磁性载体固定金属离子亲和色谱分离法具有分离速度快、选择性好、载体不易污染、回收率高等显著优势，在生物产品大规模分离纯化方面具有重要的发展潜力。近年常用来富集组氨酸蛋白的金属离子是镍离子或者铜离子，而用来固定这些离子的配体通常是氨三乙酸或者亚氨基二乙酸，但作为配体前者价格较为昂贵，而后者效果相比前者络合镍离子的能力较差，开发一种新型的效果较好且成本低廉的配体用于固定金属离子是很有必要的。这里我们用乙烯基咪唑作为单体，通过回流沉淀制备表面富含咪唑基团的壳层，然后通过咪唑基团作为配体来络合镍离子。相比以前的后修饰上配体而言，该方法能将一整个壳层的配体直接包覆于磁簇上再螯合镍离子，官能团密度大大增加，可实现高选择性地分离纯化组氨酸蛋白。

组氨酸蛋白最常见的是血液中的血红蛋白和血清蛋白，这两种高丰度蛋白在动物体内大量存在。而目前很多癌症的生物标志物都是低丰度蛋白，由于大量高丰度蛋白的存在，这些低丰度的蛋白信号常常会被掩盖，所以先把高丰度蛋白去除有利于低丰度蛋白的分析和检测。该类微球能高效去除高丰度蛋白，意义重大。6个组氨酸标记的蛋白是目前最为常见的重组蛋白之一，这些蛋白通常是有功能性的，比如重组纤维素酶，对纤维素水解意义重大，而这些蛋白在自然界中含量极微，要获得相对大量的蛋白必须通过大肠杆菌等表达，但是表达出来的蛋白需要从复杂的体系中纯化出来，就需要某种材料来达成这个富集分离的目标，所以开发这样一种新型的表面富含镍离子的核壳结构微球对于高丰度组氨酸蛋白的去除和低丰度组氨酸标记蛋白的富集分离都有着巨大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提出一种制备时间短，过程简单高效，磁含量高，能大量特异性富集组氨酸蛋白的富含镍离子的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用。

本发明针对背景技术中所存在的问题，提出了无需过渡层直接制备以磁簇为核，聚乙烯基咪唑为壳层的核壳式磁性复合微球的制备方法，并进一步进行镍离子的络合，由于镍离子和组氨酸中的咪唑基团有很强的配位络合作用，且表面纯净无杂质，都是镍离子，所以能高效循环的富集组氨酸蛋白。本发明提出的富含镍离子的核壳式磁性复合微球的制备方法，具体步骤为： 

1、首先，以六水合三氯化铁、醋酸盐和柠檬酸盐为原料制备柠檬酸钠稳定的磁性纳米粒子团簇（简称磁簇）；

2、接着，使用溶胶凝胶法对磁簇表面进行修饰，使其表面带上活性的乙烯基官能团；

3、然后，以表面含有乙烯基的磁簇为种子，通过回流沉淀聚合的方法在磁簇表面包覆一层致密的含咪唑基团的聚合物交联网络，得到以磁簇为核、含咪唑基团的聚合物网络为壳的磁性聚合物复合微球；

4、再利用六水合氯化镍与前述表面富含咪唑基团的核壳式复合微球进行镍离子的络合，使其表面具有大量镍离子；

5、最后用该表面富含镍离子的磁性微球，进行富集分离组氨酸蛋白的实验。

本发明提出的富含镍离子的核壳式磁性复合微球的制备方法，所述核壳式磁性复合微球的核为磁性四氧化三铁纳米粒子团簇，壳为交联的富含咪唑基团的聚合物网络，镍离子和咪唑基团络合反应进行表面修饰，通过表面固定的大量镍离子可以快速分离组氨酸蛋白；具体步骤如下： 

(1) 将1~30g六水合三氯化铁、1~60g醋酸盐和0.1~20g柠檬酸盐溶解在20~500mL乙二醇中，在100~200℃下机械搅拌0.5~5h，然后置于含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，将该釜放置于100~300℃的烘箱中反应10~50h，取出，用自来水使其冷却至室温；用磁铁分离出产物磁簇，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物磁簇分散在无水乙醇中，备用；

(2) 将步骤(1)得到的100mg~5g磁簇、20~400mL无水乙醇、5~100mL去离子水、0.5~20mL氨水以及0.2~20g带双键的硅烷偶联剂加入三口烧瓶中，在反应温度为50~150℃下机械搅拌10~50h，使磁簇表面修饰上活性的乙烯基官能团；反应结束后，用磁分离得到表面修饰有乙烯基的磁簇，并用无水乙醇除去过量的硅烷偶联剂；然后放入真空烘箱进行干燥；

(3) 将步骤(2)得到的25~500mg得到的表面修饰有乙烯基的磁簇、0.1~10mL侧链带咪唑基团的烯类单体、2mg~5g N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、1~100mg 2,2-偶氮二异丁腈以及溶剂20~400ml乙腈加入50~1000ml单口烧瓶中，超声使其混合均匀；将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上；从室温升温到沸腾状态，然后控制反应在90~160℃保持0.1~5h；反应结束后用磁分离，并用无水乙醇进行洗涤，得到表面带咪唑基团的磁性复合微球；所述的侧链带咪唑基团的烯类单体为乙烯基咪唑；

(4) 将步骤(3)得到的核壳结构磁性复合微球加到浓度为10-1000 mg/mL 的10-200 mL 镍盐溶液中，超声分散，在室温下搅拌反应1-24 h。反应结束后，用去离子水反复清洗微球，将微球保存在去离子水中备用。所述的镍盐为氯化镍、硫酸镍、乙酸镍或硝酸镍中的一种。

本发明中，步骤(1)中所述的醋酸盐可为醋酸钠、醋酸锂、醋酸钾、醋酸铵或醋酸镁中的一种，所述的柠檬酸盐可为柠檬酸或柠檬酸钠中的一种。

本发明中，步骤(2)中所述带双键的硅烷偶联剂为KH570。

本发明中，步骤(3)中所述侧链带咪唑基团的烯类单体及N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的浓度之和为0.001 wt%到10 wt%。

本发明中，步骤(3)中所述的N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的用量与N, N’-亚甲基双丙烯酰胺用量和侧链带咪唑基团的烯类单体用量总和的百分比值为大于等于10 wt %。

利用本发明制备方法获得的磁性聚合物复合微球应用于分离富集组氨酸蛋白方面，效果优良。

本发明制备得到的磁性聚合物复合微球，粒径分布均一，结构规整，并且具有高磁响应性以及表面可修饰的特性。表面经过进一步的修饰以后，能在中性条件下分离纯化组氨酸蛋白，分离能力良好（富集容量为284 μg蛋白/mg磁珠）。因此，该磁性核壳式复合微球是一种非常有应用前景的生物磁性分离材料。

目前磁性复合微球主要存在粒径分布不均一、磁含量低、表面缺乏足够的活性官能团等问题。本发明通过回流沉淀聚合制备得到的具有核壳结构的磁性复合微球，具有以下特点：(1) 粒径分布均一，结构规整；(2) 磁性复合微球的磁含量高；(3) 核壳式磁性复合微球的表面富含镍离子；(4) 核壳式磁性复合微球的制备时间短，过程简单、高效；(5) 该微球可用于中性条件下分离富集组氨酸蛋白，且能多次循环使用，效果优良，有利于工业化生产。

附图说明

图1为实施例2中壳层厚度为80 nm左右，交联度为20%的核壳式Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺微球的透射电镜照片；

图2为实施例6中磁性材料富集组氨酸标记蛋白前后跑出的电泳图。其中泳道M为标准分子量的条带，1为富集前的组氨酸标记重组蛋白，2为富集后的上清液，3为洗脱液；

图3为实施例7中磁性材料从复杂模型蛋白中富集组氨酸标记重组蛋白前后跑出的电泳图。其中泳道M为标准分子量的条带，4为富集前的混合蛋白 (HRP + Cyt c + His), 5为经Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺富集后的混合蛋白上清液，6为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液；

图4为实施例8中磁性材料从复杂的大肠杆菌裂解液中分离组氨酸标记重组蛋白的电泳图。泳道M为标准分子量的条带，7为富集前的大肠杆菌裂解液, 8为经Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺富集后的上清液, 9为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液；

图5为实施例9中磁性材料从复杂模型蛋白中富集含组氨酸蛋白BSA及BHb前后跑出的电泳图。泳道M为标准分子量的条带，10为富集前的混合蛋白 (BSA + HRP + MYO + BHb), 11为经Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺富集后的混合蛋白上清液, 12为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液；

图6为实施例10中磁性粒子除去复杂的胎牛血清体系中的BSA前后的电泳图。泳道M为标准分子量的条带，13为去除BSA前的胎牛血清, 14为经Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺去除BSA后的胎牛血清上清, 15为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液，16为经Fe₃O₄/PMG-IDA-Ni²⁺去除BSA后的胎牛血清上清，17为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液；

图7为实施例11中磁性粒子循环用于组氨酸标记重组蛋白的分离富集实验。泳道M为标准分子量的条带，18为组氨酸标记蛋白被富集前的原液，19-25为Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺循环富集使用7次每一次用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液；

图8为实施例12中磁性粒子循环用于组氨酸蛋白BSA的分离富集实验。泳道M为标准分子量的条带，26为BSA被富集前的原液，27-33为Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺循环富集使用7次每一次用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液。

具体实施方式

实施例1：壳层厚度为10 nm左右，交联度为10 %的核壳式Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺微球的制备

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备

将1.3g六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂O），3.8g醋酸铵（NH₄Ac），0.4g柠檬酸钠溶解在70mL乙二醇中后，加入150mL三口烧瓶中，然后升温到170℃，搅拌反应1h后，将烧瓶中液体转入容量为100mL的含有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，再将反应釜放入200℃的烘箱反应16h后取出，用自来水使其冷却至室温。用磁分离分离出产物，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物分散在无水乙醇中备用；

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰

将以上得到的300mg磁簇、40mL无水乙醇、10mL去离子水、1.5mL氨水以及0.6 g硅烷偶联剂KH 570加入150mL三口烧瓶中，升温到70℃，反应24 h后，磁分离得到产物并用无水乙醇洗涤除去过量的硅烷偶联剂。然后放入真空烘箱进行干燥；

3、核壳式Fe₃O₄/PVIM的制备

将以上干燥后得到的产物取约100 mg和80 mL乙腈一起加入200 mL单口烧瓶中分散，再加入450 μL乙烯基咪唑、50 mg N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、10 mg 2,2-偶氮二异丁腈，使其溶解在反应体系中。然后将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上。从室温升温到沸腾状态，控制在110℃反应10 min。反应结束后磁分离得到产物，并用无水乙醇进行洗涤，最终得到壳层厚度为10 nm左右的Fe₃O₄/PVIM微球；

4、络合镍离子的反应

将以上得到的核壳结构磁性复合微球加到浓度为100 mg/mL 的50 mL 镍盐溶液中，超声分散，在室温下搅拌反应1 h。反应结束后，用去离子水反复清洗微球，将微球保存在去离子水中备用。

实施例2：壳层厚度为80 nm左右，交联度为20%的核壳式Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺微球的制备（透射电镜照片见图1）；

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述；

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1-2中所述；

3、核壳式Fe₃O₄/PVIM的制备同实施例1-3中所述。所不同的是乙烯基咪唑、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、2,2-偶氮二异丁腈的用量分别为400 μL、100 mg、10 mg；

4、络合镍离子的反应同实施例1-4中所述。

实施例3：壳层厚度为80nm左右，交联度为40%的核壳式Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺微球的制备

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述；

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1-2中所述；

3、核壳式Fe₃O₄/PVIM的制备同实施例1-3中所述。所不同的是乙烯基咪唑、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、2,2-偶氮二异丁腈的用量分别为300 μL、200 mg、10 mg；

 4、络合镍离子的反应同实施例1-4中所述。

实施例4：壳层厚度为80nm左右，交联度为60%的核壳式Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺微球的制备

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述；

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1-2中所述；

3、核壳式Fe₃O₄/PVIM的制备同实施例1-3中所述。所不同的是乙烯基咪唑、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、2,2-偶氮二异丁腈的用量分别为200 μL、300 mg、10 mg；

 4、络合镍离子的反应同实施例1-4中所述。

实施例5：壳层厚度为80nm左右，交联度为80%的核壳式Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺微球的制备

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述；

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1-2中所述；

3、核壳式Fe₃O₄/PVIM的制备同实施例1-3中所述。所不同的是乙烯基咪唑、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、2,2-偶氮二异丁腈的用量分别为100 μL、400 mg、10 mg；

 4、络合镍离子的反应同实施例1-4中所述。

实施例6：利用壳层厚度为80 nm交联度为20%的磁性复合微球Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺进行富集6个组氨酸标记重组蛋白的实验

1、首先称取1 mg Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次；

2、接着加入500 μL (40 μg/mL)组氨酸标记蛋白，在室温下孵育30分钟；

3、然后磁分离收集上清液，加入100 μL去离子水洗涤两次；

4、最后用10 μL冰醋酸进行洗脱，取 10 μL原液，10 μL上清液和10 μL洗脱液，烘干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer，跑电泳（见图2）。

实施例7：磁性粒子在复杂的模型蛋白中分离纯化组氨酸标记的重组蛋白

1、首先称取1 mg Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次；

2、接着加入5 μg HRP, 5 μg Cyt c和5 μg组氨酸标记的重组蛋白，加去离子水至100 μL，在室温下孵育30分钟；

3、然后磁分离收集上清液，加入100 μL去离子水洗涤两次；

4、最后用50 μL 冰醋酸进行洗脱。将原液，上清液和洗脱液烘干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer，跑电泳（见图3）。

实施例8：磁性粒子在复杂的大肠杆菌裂解液体系中分离组氨酸标记的重组蛋白

1、首先称取1 mg Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次；

2、接着加入3 μL细菌裂解液和4 μg组氨酸标记的重组蛋白，加去离子水至100 μL，在室温下孵育30分钟；

3、然后磁分离收集上清液，加入100 μL去离子水洗涤两次；

4、最后用50 μL 冰醋酸进行洗脱。将原液，上清液和洗脱液烘干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer，跑电泳（见图4）。

实施例9：磁性粒子在复杂的模型蛋白中分离纯化牛血清蛋白BSA

1、首先称取1 mg Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次；

2、接着加入5 μg HRP, 5 μg MYO, 5 μg BHb和5 μg BSA，加去离子水至100 μL，在室温下孵育30分钟；

3、然后磁分离收集上清液，加入100 μL去离子水洗涤两次；

4、最后用50 μL 冰醋酸进行洗脱。将原液，上清液和洗脱液烘干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer，跑电泳（见图5）。

实施例10：磁性粒子除去复杂的胎牛血清体系中的BSA

1、首先称取1 mg Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次；

2、接着加入1 μL胎牛血清，加去离子水至100 μL，在室温下孵育30分钟；

3、然后磁分离收集上清液，加入100 μL去离子水洗涤两次；

4、最后用50 μL冰醋酸进行洗脱。将原液，上清液和洗脱液冻干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer，跑电泳（见图6）。

实施例11：磁性粒子循环用于组氨酸标记蛋白的分离富集实验

1、首先称取1 mg Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次；

2、接着加入5 μL（1 mg/mL）组氨酸标记的重组蛋白，然后各加入95 μL去离子水，在室温下孵育30分钟；

3、然后磁分离除去上清液，用50 μL 冰醋酸进行洗脱；

4、取洗脱后的磁性粒子，重复步骤2-3共7次，每次富集前重新花5min络合Ni²⁺，然后分别将这7次的洗脱液烘干，各加入10 μL溴酚蓝loading buffer，跑电泳（见图7）。

实施例12：磁性粒子循环用于牛血清蛋白BSA的分离富集实验

1、首先称取1 mg Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次；

2、接着加入5 μL（1 mg/mL）牛血清蛋白BSA，然后各加入95 μL去离子水，在室温下孵育30分钟；

3、然后磁分离除去上清液，用50 μL 冰醋酸进行洗脱；

4、取洗脱后的磁性粒子，重复步骤2-3共7次，每次富集前重新花5min络合Ni²⁺，然后分别将这7次的洗脱液烘干，各加入10 μL溴酚蓝loading buffer，跑电泳（见图8）。

Claims (6)

1.一种富含镍离子的核壳式磁性复合微球的制备方法，其特征在于所述核壳式磁性复合微球的核为磁簇，壳为交联的富含咪唑基团的聚合物网络，咪唑基团用于固定镍离子，通过表面固定的镍离子可在中性条件下快速分离组氨酸蛋白；具体步骤如下： 

(1) 将1~30g六水合三氯化铁、1~60g醋酸盐和0.1~20g柠檬酸盐溶解在20~500mL乙二醇中，在100~200℃下机械搅拌0.5~5h，然后置于含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，将该釜放置于100~300℃的烘箱中反应10~50h，取出，用自来水使其冷却至室温；用磁铁分离出产物磁簇，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物磁簇分散在无水乙醇中，备用；

(2) 将步骤(1)得到的100mg~5g磁簇、20~400mL无水乙醇、5~100mL去离子水、0.5~20mL氨水以及0.2~20g带双键的硅烷偶联剂加入三口烧瓶中，在反应温度为50~150℃下机械搅拌10~50h，使磁簇表面修饰上活性的乙烯基官能团；反应结束后，用磁分离得到表面修饰有乙烯基的磁簇，并用无水乙醇除去过量的硅烷偶联剂；然后放入真空烘箱进行干燥；

(3) 将步骤(2)得到的25~500mg表面修饰有乙烯基的磁簇、0.1~10mL侧链带咪唑基团的烯类单体、2mg~5g N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、1~100mg 2,2-偶氮二异丁腈以及溶剂20~400ml乙腈加入50~1000ml单口烧瓶中，超声使其混合均匀；将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上；从室温升温到沸腾状态，然后控制反应在90~160℃保持0.1~5h；反应结束后用磁分离，并用无水乙醇进行洗涤，得到表面带咪唑基团的磁性复合微球；所述的侧链带咪唑基团的烯类单体为乙烯基咪唑；

(4) 将步骤(3)得到的核壳结构磁性复合微球加到浓度为10-1000 mg/mL 的10-200 mL 镍盐溶液中，超声分散，在室温下搅拌反应1-24 h；反应结束后，用去离子水反复清洗微球，将微球保存在去离子水中备用；所述的镍盐为氯化镍、硫酸镍、乙酸镍或硝酸镍中的一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的醋酸盐可为醋酸钠、醋酸锂、醋酸钾、醋酸铵或醋酸镁中的一种，所述的柠檬酸盐可为柠檬酸或柠檬酸钠中的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述带双键的硅烷偶联剂为KH570。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述侧链带咪唑基团的烯类单体及N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的浓度之和为0.001 wt%到10 wt%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的用量与N, N’-亚甲基双丙烯酰胺用量和侧链带咪唑基团的烯类单体用量总和的百分比值为大于等于10 wt %。

6.一种如权利要求1所述制备方法获得的表面富含镍离子的磁性聚合物复合微球在分离组氨酸蛋白方面具有广泛的应用。

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