CN103435762B - 一种富含硼酯的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种可用于分离糖蛋白的核壳式磁性复合微球的制备方法及应用。本发明核壳式磁性复合微球的核为磁性四氧化三铁纳米粒子团簇,壳为交联的富含羧基的聚合物网络,然后羧基和氨基苯硼酯酰胺化反应进行表面修饰,通过表面固定的大量硼酯可以在生理条件下快速分离富集糖蛋白。首先制备柠檬酸钠稳定的磁性纳米粒子团簇,接着采用溶胶凝胶法,使磁簇表面修饰上活性的乙烯基官能团,然后通过回流沉淀聚合制备得到高磁响应性单分散的表面富含羧基的核壳式磁性聚合物复合微球,再用氨基苯硼酯与羧基进行酰胺化反应修饰上大量硼酯基团,最后进行糖蛋白的分离富集。本发明方法简单,过程可控,分离纯化糖蛋白的效率较高且能在生理条件下分离富集。
Description
技术领域
本发明属于纳米功能材料技术领域,具体涉及一种富含硼酯的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用。
背景技术
近年来,有机-无机杂化复合微球,尤其是磁性复合微球正受到人们的广泛关注。由于磁性高分子微球同时具有无机磁性材料的磁响应性和有机高分子的表面可修饰性,可以在外加磁场下方便、快速、高效的分离目标生物分子。因此,在蛋白分离纯化、细胞分离、磁共振检测和磁靶向载药等生物医学领域具有广泛的应用前景。
目前,通过乳液聚合方法(包括传统的乳液聚合、无皂乳液聚合、微乳液聚合和细乳液聚合)可以制备出不同结构的磁性聚合物复合微球。但是乳液聚合对于结构以及磁含量的控制相对较差。要获得结构较好、磁含量可控的复合微球,通常需要借助过渡层(如二氧化硅),但是包覆中间的二氧化硅层会降低整个微球的磁饱和强度。另外由于乳液聚合大多采用过硫酸钾等带电水溶性引发剂,反应结束后往往使微球带上相应的电荷,会一定程度上影响后续的应用。并且该方法常常需要共聚疏水性单体,这会使得表面官能团密度下降。为了解决这一问题,回流沉淀聚合可以不用借助过渡层,直接在磁性纳米粒子表面包覆聚合物壳层,可以用不带电的油溶性引发剂,并且无需共聚其他单体,表面官能团密度较大。该方法简便易行,成本低廉,开发利用回流沉淀法直接包覆聚合物壳层是十分必要的。
蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要的影响。目前,一半以上癌症的生物标志物是糖基化蛋白,因而糖蛋白质组学成为备受关注的研究热点,而从复杂的生物样品体系中富集糖蛋白/糖肽是蛋白质糖基化研究的重点和难点。目前常用的分离糖蛋白或糖肽的方法大多采用凝集素亲和法,肼化学法,亲水富集法和硼酸富集的方法。但是,凝集素法只能针对某些特定的糖型,对于很多的糖蛋白并不适合,且凝集素价格昂贵。而用肼化学法富集糖蛋白/糖肽必须要先将糖上的邻位羟基氧化成醛基,然后肼再和该氧化后的醛基反应,该过程复杂且只能适用于N糖的富集,有一定的局限性。亲水富集法利用糖蛋白/糖肽比其他蛋白或肽有更好的亲水性,从而与材料亲水相互作用,利用亲水性的材料可以将糖蛋白/糖肽从有机相中富集出来,并在水相里洗脱。但是,该富集方法特异性不好,因为该作用不是传统的化学键作用,其他非糖蛋白可能也有亲水性较好的容易被富集出来,并且它的回收率也不高。硼酸富集是一种较好的富集方法,利用硼酸在碱性条件下和糖蛋白上的邻羟基形成五元环,然后在酸性条件该五元环又能够解开,这是一种化学作用,所以其选择性较好。但是,这个富集会带来一定的非特异吸附,因为硼酸自身是疏水的,接到材料上会使得材料有一定的疏水性,从而导致富集时疏水性的非糖蛋白可能会被吸附。另外,该富集是在碱性条件下进行的,而人体内环境是偏中性的,要将人体内最原始的糖蛋白富集出来,碱性富集往往会使一些在该条件下不稳定的糖蛋白发生分解或变性,并不能富集得到人体内最原始的糖蛋白标志物。因此,开发一种可以在生理条件进行原位富集的亲水性好的材料是很有必要的,若能将其与磁性载体结合实现快速富集分离,必能解决目前糖蛋白富集上遇到的种种问题。
发明内容
本发明的目的在于提出一种制备过程简单、高效,磁含量高,能较大量特异性富集糖蛋白的富含硼酯的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用。
本发明针对背景技术中所存在的问题,提出了无需过渡层直接制备以无机磁性纳米晶团簇为核,聚丙烯酸为壳层的核壳式磁性复合微球的制备方法,并进一步进行酰胺化反应接上功能基团硼酯,由于该功能基团硼酯比之前报道过的硼酸有更好的亲水性,且其富集时所需要的pH较低,能实现生理条件下有效的糖蛋白分离富集。
本发明提出的富含硼酯的核壳式磁性复合微球的制备方法,具体步骤为:
1、首先,以六水合三氯化铁、醋酸盐和柠檬酸盐为原料制备柠檬酸钠稳定的磁性纳米粒子团簇(简称磁簇);
2、接着,使用溶胶凝胶法对磁簇表面进行修饰,使其表面带上活性的乙烯基官能团;
3、然后,以表面含有乙烯基的磁簇为种子,通过回流沉淀聚合的方法在磁簇表面包覆一层致密的含羧基聚合物的交联网络,得到以磁簇为核、含羧基聚合物网络为壳的磁性聚合物复合微球。
4、再利用氨基苯硼酯与前述表面富含羧基的核壳式复合微球进行酰胺化反应,使其表面具有硼酯官能团。
5、最后用该表面富含硼酯的磁性微球,进行分离纯化糖蛋白的实验。
进一步,本发明提出的富含硼酯的核壳式磁性复合微球的制备方法,所述核壳式磁性复合微球的核为磁性四氧化三铁纳米粒子团簇,壳为交联的富含羧基的聚合物网络,然后羧基和氨基苯硼酯酰胺化反应进行表面修饰,通过表面固定的大量硼酯可以在生理条件下快速分离富集糖蛋白;具体步骤如下:
(1).将1~20g六水合三氯化铁、1~50g醋酸盐和0.1~20g柠檬酸盐溶解在20~500mL乙二醇中,在100~200℃下机械搅拌0.5~5h,然后置于含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中,将反应釜放置于100~300℃的烘箱中10~50h,取出,用自来水使其冷却至室温;用磁铁分离出产物磁簇,并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物,最后将产物磁簇分散在无水乙醇中,备用;
(2).将步骤(1)得到的磁簇100mg-3g、20~400mL无水乙醇、5~100mL去离子水、0.5~10mL氨水以及0.2~10g带双键的硅烷偶联剂加入三口烧瓶中,在反应温度为50~100℃下机械搅拌10~40h,使磁簇表面修饰上活性的乙烯基官能团;反应结束后,用磁分离得到表面修饰有乙烯基的磁簇,并用无水乙醇除去过量的硅烷偶联剂;然后放入真空烘箱进行干燥;
(3).将步骤(2)得到的25~500mg得到的表面修饰有乙烯基的磁簇、0.1~5mL侧链带羧基的烯类单体、2mg~5g N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、1~80mg 2,2-偶氮二异丁腈以及溶剂20~400ml乙腈加入50~1000ml单口烧瓶中,超声使其混合均匀;将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上;从室温升温到沸腾状态,然后控制反应在90~150℃保持1~5h;反应结束后用磁分离,并用无水乙醇进行洗涤,得到表面带羧基的磁性复合微球;
(4).将0.1~10 g 氨基苯硼酯溶于100~2000 mL水中,然后加入0.1~10 g 氢氧化物调节体系pH值为8~13,取步骤(3)得到的表面带羧基的磁性复合微球加入到该溶液中,超声分散,之后加入0.1~10g EDC, 于20~120℃反应10~30 h。反应结束后用磁分离,并用去离子水进行洗涤,即得所需产品。
本发明中,步骤(1)中所述的醋酸盐可为醋酸钠、醋酸钾、醋酸锂、醋酸镁或醋酸铵中的一种,所述的柠檬酸盐可为柠檬酸或柠檬酸钠中的一种。
本发明中,步骤(2)中所述带双键的硅烷偶联剂为KH570。
本发明中,步骤(3)中所述侧链带羧基的烯类单体为丙烯酸、甲基丙烯酸或丁烯酸等含有羧基的烯类单体中的一种或其中的几种。
本发明中,步骤(3)中所述侧链带羧基的烯类单体及N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的浓度之和为0.001 wt%到10 wt%。
本发明中,步骤(3)中所述N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的用量与N, N’-亚甲基双丙烯酰胺用量和侧链带羧基的烯类单体用量总和的百分比值为大于等于20 wt %。
本发明中,步骤(4)中所述氢氧化物为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化锂或氨水中的一种。
利用本发明制备方法获得的磁性聚合物复合微球应用于分离富集糖蛋白方面,效果优良。
本发明制备得到的磁性聚合物复合微球,粒径分布均一,结构规整,并且具有高磁响应性以及表面可修饰的特性。表面经过进一步的修饰以后,能在生理条件下分离纯化糖蛋白,分离能力良好(富集容量为93.9 μg蛋白/mg磁珠)。因此,该磁性核壳式复合微球是一种非常有应用前景的生物磁性分离材料。
目前磁性复合微球主要存在粒径分布不均一、磁含量低、表面缺乏足够的活性官能团等问题。本发明通过回流沉淀聚合制备得到的具有核壳结构的磁性复合微球,具有以下特点:(1) 粒径分布均一,结构规整;(2) 磁性复合微球的磁含量高;(3) 核壳式磁性复合微球的表面富含功能的硼酯基团;(4) 核壳式磁性复合微球的制备过程简单、高效;(5)该微球亲水性好并可用于生理条件下分离富集糖蛋白,效果优良,有利于工业化生产。
附图说明
图1为实施例2中壳层厚度为30 nm左右,交联度为20%的核壳式Fe3O4/PAA-AOPB微球的透射电镜照片。
图2为实施例4磁性材料富集糖蛋白前后跑出的电泳图。其中泳道1为标准分子量的条带,2为富集前的糖蛋白HRP,3为富集后的上清液,4为洗脱液。
图3为实施例5磁性材料富集糖蛋白的循环实验。其中泳道5为标准分子量的条带,6-11分别为磁性粒子循环使用6次每次对应的洗脱液。
图4为实施例6磁性材料从复杂模型蛋白中富集糖蛋白前后跑出的电泳图,富集条件pH=9;泳道12为标准分子量的条带,泳道13为富集前的混合蛋白 (BSA + HRP + β-casein + MYO), 泳道14为经Fe3O4/PAA-AOPB富集后的混合蛋白(BSA + HRP + β-casein +MYO) 上清液, 泳道15为用富集液洗涤后,泳道16为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液;泳道17为经Fe3O4/PAA富集后的混合蛋白(BSA + HRP + β-casein + MYO)上清液, 泳道18为用富集液洗涤后,泳道19为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液。
图5为实施例6磁性材料从复杂模型蛋白中富集糖蛋白前后跑出的电泳图,富集条件pH=7.4。泳道20为标准分子量的条带,泳道21为富集前的混合蛋白 (BSA + HRP + β-casein + MYO), 泳道22为经Fe3O4/PAA-AOPB富集后的混合蛋白(BSA + HRP + β-casein +MYO) 上清液, 泳道23为用富集液洗涤后,泳道24为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液;泳道25为经Fe3O4/PAA富集后的混合蛋白(BSA + HRP + β-casein + MYO)上清液, 泳道26为用富集液洗涤后,泳道27为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液。
图6 磁性粒子从复杂的大肠杆菌裂解液中分离糖蛋白的电泳图。泳道28为标准分子量的条带,泳道29为富集前的混合蛋白 (大肠杆菌裂解液+HRP), 30为经Fe3O4/PAA-AOPB富集后的混合蛋白上清液, 泳道31为用富集液洗涤后,泳道32为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液;泳道33为经Fe3O4/PAA富集后的混合蛋白(大肠杆菌裂解液+HRP)上清液, 泳道34为用富集液洗涤后,泳道35为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液。
图7 磁性粒子从复杂的胎牛血清体系中分离糖蛋白的电泳图。泳道36为标准分子量的条带,泳道37为富集前的混合蛋白 (胎牛血清+HRP), 泳道38为经Fe3O4/PAA-AOPB富集后的混合蛋白, 泳道39为用富集液洗涤后,泳道40为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液;泳道41为经Fe3O4/PAA富集后的混合蛋白(胎牛血清+HRP)上清液, 泳道42为用富集液洗涤后,泳道43为用酸性溶液洗脱后得到的洗脱液。
具体实施方式
实施例1:壳层厚度为10nm左右,交联度为20 %的核壳式Fe3O4/PAA-AOPB微球的制备,具体步骤如下:
(1)、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备
将1.3g六水合三氯化铁(FeCl3•6H2O),3.8g醋酸铵(NH4Ac),0.4g柠檬酸钠溶解在70mL乙二醇中后,加入150mL三口烧瓶中,然后升温到170℃,搅拌反应1h后,将烧瓶中液体转入容量为100mL的含有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,再将反应釜放入200℃的烘箱反应16h后取出,用自来水使其冷却至室温。用磁分离分离出产物,并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物,最后将产物分散在无水乙醇中备用。
(2)、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰
将以上得到的磁簇、40 ml无水乙醇、10 ml去离子水、1.5 ml氨水以及0.6 g硅烷偶联剂KH 570加入150ml三口烧瓶中,升温到70℃,反应24 h后,磁分离得到产物并用无水乙醇洗涤除去过量的硅烷偶联剂。然后放入真空烘箱进行干燥。
(3)、核壳式Fe3O4/PAA的制备
将以上干燥后得到的产物取约100 mg和80 ml乙腈一起加入200 ml单口烧瓶中分散,再加入200 μL丙烯酸、50 mg N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、5 mg 2,2-偶氮二异丁腈,使其溶解在反应体系中。然后将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上。从室温升温到沸腾状态,控制在110℃反应1 h。反应结束后磁分离得到产物,并用无水乙醇进行洗涤,最终得到壳层厚度为10 nm左右的Fe3O4/PAA微球。
(4)、修饰氨基苯硼酯的反应
将30 mg 氨基苯硼酯溶于25 mL水中,然后加入数滴0.1 M的氢氧化钠溶液调节体系pH为9,取之前制备的表面带羧基的磁性复合微球50 mg加入到该溶液中,超声分散,之后加入60 mg EDC, 于室温反应12 h。反应结束后用磁分离,并用去离子水进行洗涤。
实施例2:壳层厚度为30 nm左右,交联度为20%的核壳式Fe3O4/PAA-AOPB微球的制备(透射电镜照片见图1)
1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1步骤(1)中所述。
2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1步骤(20中所述。
3、核壳式Fe3O4/PAA的制备同实施例1步骤(3)中所述。所不同的是丙烯酸、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、2,2-偶氮二异丁腈的用量分别为400 μL、100 mg、10 mg。
4、修饰氨基苯硼酯的反应同实施例1步骤(4)中所述。
实施例3:壳层厚度为50nm左右,交联度为20%的核壳式Fe3O4/PAA-AOPB微球的制备
1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1步骤(1)中所述。
2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1步骤(2)中所述。
3、核壳式Fe3O4/PAA的制备同实施例1步骤(3)中所述。所不同的是丙烯酸、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、2,2-偶氮二异丁腈的用量分别为600 μL、150 mg、15 mg。
4、修饰氨基苯硼酯的反应同实施例步骤(4)中所述。
实施例4:利用壳层厚度为30 nm交联度为20%的磁性复合微球Fe3O4/PAA-AOPB进行富集糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)的实验
1、首先称取1 mg Fe3O4/PAA-AOPB磁性粒子,用100 μL缓冲溶液I (10 mM PBS,pH=7.4)洗涤两次。
2、接着加入500 μL (40 µg/mL)糖蛋白,在室温下孵育10分钟。
3、然后磁分离收集上清液,加入100 μL 缓冲溶液I洗涤两次。
4、最后用10 μL 缓冲溶液II (50% AN含1 % TFA) 进行洗脱,取 10 μL原液,10 μL上清液和10 μL洗脱液,烘干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer,跑电泳(见图2)。
实施例5:磁性粒子循环用于糖蛋白HRP的分离实验
1、首先称取1 mg Fe3O4/PAA-AOPB磁性粒子,用100 μL缓冲溶液I (10 mM PBS, pH=7.4)洗涤两次。
2、接着加入5 μL(1 mg/mL)糖蛋白和95 μL缓冲溶液I在室温下孵育10分钟。
3、然后磁分离除去上清液,用50 μL 缓冲溶液II (50% AN含1 % TFA) 进行洗脱。
4、取洗脱后的磁性粒子,重复步骤2-3共6次,分别将这6次的洗脱液烘干,各加入10 μL溴酚蓝loading buffer,跑电泳(见图3)。
实施例6:磁性粒子在复杂的模型蛋白中分离纯化糖蛋白(富集条件pH=9)
1、首先称取1 mg Fe3O4/PAA-AOPB或1 mg Fe3O4/PAA磁性粒子,用100 μL缓冲溶液I (50 mM NH4HCO3溶液,pH=9)洗涤两次。
2、接着加入5 µg BSA, 5 µg MYO, 5 µg β-casein和5 µg糖蛋白HRP,加缓冲溶液I至100 μL,在室温下孵育10分钟。
3、然后磁分离收集上清液,加入100 μL 缓冲溶液I洗涤两次。
4、最后用50 μL 缓冲溶液II (50% AN含1 % TFA) 进行洗脱。将原液,上清液,第二次洗涤液和洗脱液烘干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer,跑电泳(见图4)。
实施例7:磁性粒子在复杂的模型蛋白中分离纯化糖蛋白(富集条件pH=7.4)
1、首先称取1 mg Fe3O4/PAA-AOPB或1 mg Fe3O4/PAA磁性粒子,用100 μL缓冲溶液I (10 mM PBS,pH=7.4)洗涤两次。
2、接着加入5 µg BSA, 5 µg MYO, 5 µg β-casein和5 µg糖蛋白HRP,在室温下孵育10分钟。
3、然后磁分离收集上清液,加入100 μL 缓冲溶液I洗涤两次。
4、最后用50 μL 缓冲溶液II (50% AN含1 % TFA) 进行洗脱。将原液,上清液,第二次洗涤液和洗脱液烘干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer,跑电泳(见图5)。
实施例8:磁性粒子在复杂的大肠杆菌裂解液体系中分离糖蛋白HRP
1、首先称取1 mg Fe3O4/PAA-AOPB或1 mg Fe3O4/PAA磁性粒子,用100 μL缓冲溶液I (10 mM PBS,pH=7.4)洗涤两次。
2、接着分别加入40 μL细菌裂解液和5 µg糖蛋白HRP的混合物,加缓冲溶液I至100μL,在室温下孵育10分钟。
3、然后磁分离收集上清液,加入100 μL 缓冲溶液I洗涤两次。
4、最后用50 μL 缓冲溶液II (50% AN含1 % TFA) 进行洗脱。将原液,上清液,第二次洗涤液和洗脱液冻干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer,跑电泳(见图6)。
实施例9:磁性粒子在复杂的胎牛血清体系中分离糖蛋白HRP
1、首先称取1 mg Fe3O4/PAA-AOPB或1 mg Fe3O4/PAA磁性粒子,用100 μL缓冲溶液I (10 mM PBS,pH=7.4)洗涤两次。
2、接着分别加入5 μL胎牛血清和5 µg糖蛋白HRP的混合物,加缓冲溶液I至100 μL,在室温下孵育10分钟。
3、然后磁分离收集上清液,加入100 μL 缓冲溶液I洗涤两次。
4、最后用50 μL 缓冲溶液II (50% AN含1 % TFA) 进行洗脱。将原液,上清液,第二次洗涤液和洗脱液冻干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer,跑电泳(见图7)。
Claims (8)
1.一种富含硼酯的核壳式磁性复合微球的制备方法,其特征在于所述核壳式磁性复合微球的核为磁性四氧化三铁纳米粒子团簇,壳为交联的富含羧基的聚合物网络,然后羧基和氨基苯硼酯酰胺化反应进行表面修饰,通过表面固定的大量硼酯可以在生理条件下快速分离富集糖蛋白;具体步骤如下:
(1).将1~20g六水合三氯化铁、1~50g醋酸盐和0.1~20g柠檬酸盐溶解在20~500mL乙二醇中,在100~200℃下机械搅拌0.5~5h,然后置于含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中,将反应釜放置于100~300℃的烘箱中10~50h,取出,用自来水使其冷却至室温;用磁铁分离出产物磁簇,并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物,最后将产物磁簇分散在无水乙醇中,备用;
(2).将步骤(1)得到的磁簇100mg-3g、20~400mL无水乙醇、5~100mL去离子水、0.5~10mL氨水以及0.2~10g带双键的硅烷偶联剂加入三口烧瓶中,在反应温度为50~100℃下机械搅拌10~40h,使磁簇表面修饰上活性的乙烯基官能团;反应结束后,用磁分离得到表面修饰有乙烯基的磁簇,并用无水乙醇除去过量的硅烷偶联剂;然后放入真空烘箱进行干燥;
(3).将步骤(2)得到的25~500mg得到的表面修饰有乙烯基的磁簇、0.1~5mL侧链带羧基的烯类单体、2mg~5g N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、1~80mg 2,2-偶氮二异丁腈以及溶剂20~400ml乙腈加入50~1000ml单口烧瓶中,超声使其混合均匀;将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上;从室温升温到沸腾状态,然后控制反应在90~150℃保持1~5h;反应结束后用磁分离,并用无水乙醇进行洗涤,得到表面带羧基的磁性复合微球;
(4).将0.1~10 g 氨基苯硼酯溶于100~2000 mL水中,然后加入0.1~10 g 氢氧化物调节体系pH值为8~13,取步骤(3)得到的表面带羧基的磁性复合微球加入到该溶液中,超声分散,之后加入0.1~10g EDC, 于20~120℃反应10~30 h;反应结束后用磁分离,并用去离子水进行洗涤,即得所需产品。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)中所述的醋酸盐可为醋酸钠、醋酸钾、醋酸锂、醋酸镁或醋酸铵中的一种,所述的柠檬酸盐为柠檬酸钠。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(2)中所述带双键的硅烷偶联剂为KH570。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(3)中所述的侧链带羧基的烯类单体为丙烯酸、甲基丙烯酸或丁烯酸中的一种或其中的几种。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(3)中所述侧链带羧基的烯类单体及N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的浓度之和为0.001 wt%到10 wt%。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(3)中所述的N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的用量与N, N’-亚甲基双丙烯酰胺用量和侧链带羧基的烯类单体用量总和的百分比值为大于等于20 wt %。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(4)中所述的氢氧化物为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化锂或氨水中的一种。
8.一种如权利要求1所述制备方法获得的磁性聚合物复合微球在分离富集糖蛋白方面的应用。
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