CN106834263A - 一种核壳式磁性高分子纳米颗粒在酶的固定化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核壳式磁性高分子纳米颗粒在酶的固定化中的应用，属于生物工程技术领域；该磁性纳米颗粒为核壳式结构，其核为磁性四氧化三铁纳米微球，壳为交联的富含镍离子的聚合物网络，本发明通过核壳式磁性高分子纳米颗粒对β‑葡萄糖苷酶（BG）进行固定化研究，通过热稳定性、储存稳定性和重复利用实验验证了该纳米颗粒作为一种固定化材料的用途；本发明中利用磁性生物高分子纳米颗粒与带组氨酸标签酶的结合力是共价键，结合牢固；该纳米颗粒固定酶后可显著提高酶的稳定性，同时因其具有高的磁感应性，可将其从反应产物中分离并重复利用，从而提高了产物的纯度和酶的利用率。

Description

一种核壳式磁性高分子纳米颗粒在酶的固定化中的应用
技术领域
本发明涉及一种核壳式磁性高分子纳米颗粒在酶的固定化中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
酶是活细胞体内产生的具有高度专一性和催化活性的蛋白质，是一种常见的生物催化剂，酶促反应具有对底物专一性强、催化效率高、反应条件温和等优点，其催化效率可高达106-1013，这使得酶在生产、生活中被应用广泛。
然而酶在实际应用中还存在着很多不足，首先，酶由蛋白质组成，其高级结构对热、强酸、强碱、有机溶剂均不稳定，在反应中容易失活；其次，纯酶价格通常较昂贵，实际应用中多使用复合酶；再者，游离酶在使用过程中存在耗酶量大、难分离、难以重复使用、反应周期长、易造成产品污染等缺点，这些因素严重限制了酶在工业生产中的广泛应用。因此，提高酶在使用过程中的利用率是推广酶在大规模生产中应用的关键。
20世纪60年代出现的固定化酶技术克服了游离酶的上述不足，酶的固定化是采用有机或无机固体材料作为载体，将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。与游离酶相比，固定化酶在使用过程中稳定性较高，而且固定化酶与反应液可以通过简单的过滤离心等方法进行分离，有利于产物的纯化和酶的多次使用，反应条件容易控制，可实现连续自动化生产，降低成本，更有利于在工业中的大规模生产。
目前已建立了各种各样的固定化方法，依据酶的性质及用途，一般可分为吸附法、交联法，载体结合法和包埋法。但这四种方法各自都存在缺点，吸附法通常有物理吸附法和离子吸附法，该方法的缺点是酶与载体的相互作用较弱，结合不牢，酶极易从载体表面上脱落。交联法中常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用。载体结合法反应条件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损。包埋法只适用于小分子底物和产物的酶催化反应，只有小分子反应底物或产物，才可以通过高分子聚合物进行扩散。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的技术缺陷，针对已被报道的一种核壳式磁性高分子纳米颗粒（申请号 201410089968.6，申请公布号 CN 103897123 A），提供其在固定化酶领域中的新用途。
本发明选取了一个带组氨酸标签的酶--β-葡萄糖苷酶（BG）进行固定化研究，通过热稳定性、储存稳定性（依赖时间、温度）和重复利用实验验证了该纳米颗粒作为一种固定化材料的可行性。
本发明的有益效果：
本发明中利用的磁性生物高分子纳米颗粒（Fe3O4/PMG/IDA-Ni2+）与带组氨酸标签酶的结合力是共价键，结合牢固；其次纳米颗粒与酶的固定化处理条件温和，与游离酶相比，固定化后酶的活性不受影响；更重要的是该纳米颗粒固定酶后可显著提高酶的稳定性，同时因其具有高的磁感应性，可将其从反应产物中分离并重复利用，从而提高了产物的纯度和酶的利用率。解决了现有技术中提到的游离酶在实际应用中的众多不足，从而极大的推动了酶在大规模生产中的利用。
本发明通过对带组氨酸标签的β-葡萄糖苷酶进行固定化，并将固定化BG和游离BG就动力学参数、热稳定性和储存稳定性进行比较；BG经固定化后其催化活性并未发生大的改变（游离BG为14.0 S-1*mM-1，固定化BG为13.5 S-1*mM-1）。在热稳定性和储存稳定性上，固定化BG更是表现出比游离BG高的活性，当处理温度达到60℃时，固定化BG仍保持原酶活性的75%，而游离BG活性几乎为零；在4℃和25℃下储存的剩余活性都高于游离BG的。固定化BG重复利用11次后仍维持原酶活性的70%，固定化BG的可重复利用解决了背景技术中提到的游离酶在实际应用中的众多不足，从而极大的推动了酶在大规模生产中的利用。
另一方面，该材料因具有良好的磁导向性以及生物相容性等特点，可将该纳米颗粒作为一种药物、抗体递呈载体，使其携带药物、抗体通过磁场作用定向作用于肿瘤。
附图说明
图1为纳米颗粒与BG固定化最适条件的确定。
图2为实施例6中游离和固定化BG之间热稳定性的比较结果。
图3为实施例7中游离和固定化BG依赖时间和温度的储存稳定性比较结果。
图4为实施例8中固定化BG的重复利用实验结果。
具体实施方式
实施例1：Fe3O4/PMG/IDA−Ni2+纳米颗粒的制备
（1）通过改良的溶剂热反应，以六水三氯化铁、醋酸氨和二水柠檬酸三钠为原料合成粒径大小约为200nm的Fe3O4纳米微球。
（2）用MPS修饰Fe3O4纳米微球，使其表面带上乙烯官能团。
（3）利用GMA，通过蒸馏沉淀聚合法在Fe3O4/MPS纳米颗粒表面添加一层富含环氧环的壳。
（4）通过IDA将Fe3O4/PMG表面的环氧环打开，形成Fe3O4/PMG/IDA纳米颗粒。
（5）最后利用六水氯化镍与表面富含咪唑基团的Fe3O4/PMG/IDA纳米颗粒进行络合，形成最终的表面富含镍离子的磁性纳米颗粒，用于酶的固定化实验。
实施例2：OD410对催化产物4-硝基酚（p-NP）的标准曲线的绘制
（1）制备浓度为50mM的p-NP母液：称取0.03478g 4-硝基酚（p-NP）标准品，加入3mL50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液使其溶解，最后定容到5mL。
（2）将50mM的p-NP母液稀释成浓度为500μM的p-NP：取30μL 50mM的p-NP母液，然后加入2.97mL 50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液。
（3）绘制p-NP标准曲线：纵坐标为不同浓度的p-NP溶液，横坐标为不同浓度p-NP在410nm下各自的吸收值（OD410）。需浓度分别为0、1、2.5、7.5、20、50、100、200、250μM的p-NP，按反应体系为500μL计算， 500μM的p-NP加入的体积分别是0、1、2.5、7.5、20、50、100、200、250μL，则50 mM pH5.5 NaAc-HAc缓冲液加入的体积为500、499、497.5、492.5、480、450、300、300、250μL。因p-NP在碱性环境中呈现黄色，所以加入500μL 1M Na2CO3混匀，最后取200μL反应液在410nm下检测，并绘制OD410对浓度的标准曲线。
（4）后面实施例中计算酶活，均需将OD410数值带入p-NP标准曲线，从而得到催化产物的量。
实施例3：BG酶活的测定方法
（1）制备浓度为50 mM的底物p-NPG：称取0.1506g p-NPG固体粉末，加入8mL灭菌水使其完全溶解，最后定容到10mL，存于4℃备用。
（2）取40μL浓度为50mM的底物p-NPG与一定体积的50 mM pH5.5 NaAc-HAc缓冲液于40℃水浴预热10min。
（3）加入一定量的BG，保证总体积为500μL，在40℃中反应10min。
（4）加入500μL 1M Na2CO3终止反应，最后取200μL反应液测定OD410。
（5）将OD410带入实施例2中的标准曲线（X轴）中，对应得出Y轴数值，即为产物p-NP的浓度（C）。
（6）酶的活性（U）定义为单位时间（min）内每毫克酶催化反应产生的产物的摩尔数。
C p-NP:产物p-NP的浓度；V reaction：反应的总体积；t reaction:酶与底物反应的时间；m:加入的酶量。
实施例4： BG固定化条件的确定
（1）固定化条件的确定过程中涉及三个主要因素，给酶量、孵育温度和孵育时间。通常让其中一个成为变量，然后将各变量中最好的选出组成一个最适的条件。给酶量范围是20-180μg 纯BG，孵育温度4-70℃，孵育时间是10-75min。
（2）称取0.01mg Fe3O4/PMG/IDA−Ni2+纳米颗粒，用5mL 50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液将其悬浮成均一悬浊液。然后根据三个影响因素需要的数量准备1.5mL EP管，每个管中取100μL Fe3O4/PMG/IDA−Ni2+（0.2mg），用50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液清洗几次，然后去除缓冲液。
（3）首先设定孵育温度为4℃，孵育时间30min，让纳米颗粒与不同量的纯BG旋转孵育。移除多余上清，用Tris-HCl缓冲液洗涤EP管壁和纳米颗粒，随后将得到的固定化BG进行酶活检测，绘制给酶量对酶活的曲线,得到给酶量在120μg时酶活达到最大值（见图1A）。
（4）设定给酶量为120μg，孵育时间30min，让纳米颗粒与BG在不同温度下孵育。然后移除多余上清，用Tris-HCl缓冲液洗涤EP管壁和纳米颗粒，随后将得到的固定化BG进行酶活检测，绘制孵育温度对酶活的曲线,得到孵育温度在25℃时酶活达到最大值（见图1B）。
（5）设定给酶量为120μg，孵育温度为4℃，让纳米颗粒与BG孵育不同的时间。然后移除多余上清，用Tris-HCl缓冲液洗涤EP管壁和纳米颗粒，随后将得到的固定化BG进行酶活检测，绘制孵育时间对酶活的曲线,得到孵育时间达到30min时酶活达到最大值（见图1C）。
（6）选取三个因素酶活达到最大值的点组成纳米颗粒与BG孵育的最佳条件，即给酶量为120μg，孵育温度4℃，孵育时间30min，在此条件下测得纳米颗粒的固载量达到60mg/g。
实施例5：游离和固定化BG的动力学参数比较
（1）按照实施例4的最佳固载条件获得足够量的固定化BG。
（2）按反应体系为500μL计算，取不同体积的50 mM的p-NPG，使终浓度分别为2、4、5、6、8、10、12、14、16mM，然后加入50 mM pH5.5 NaAc-HAc缓冲液于40℃水浴预热10min。
（3）加入等量的游离和固定化BG，在40℃中反应，反应的4和6min分别加入500μL1M Na2CO3终止，最后取200μL反应液测定OD410。
（4）反应速率（mol/L*min）的计算：
C6:反应6min时产物的浓度;C4反应4min时产物的浓度;△t：反应时间。
产物的浓度通过测定的OD410对应到实施例2中绘制的标准曲线中获得。
（5）底物浓度的倒数（X轴）对反应速率的倒数（Y轴）绘制Line weaver–Burk曲线，横坐标的截距等于Km倒数的负数，纵坐标截距等于最大反应速率Vmax的倒数，然后根据曲线横纵坐标截距和反应体系中酶的摩尔量计算出Km和Kcat（见表1），表1为该实施例中游离和固定化BG的动力学参数比较，表中Km反应酶与底物的亲和力，值越小，亲和力越大，固定化BG对底物的亲和力高于游离BG；Km/Kcat反应酶的催化效率，值越大，催化效率越大，固定化BG的催化效率略低于游离BG，但没有很大的差距，所以固定化BG仍能发挥良好的催化活性。
表1.游离和固定化BG的动力学参数比较
实施例6：游离和固定化BG之间热稳定性的比较
（1）按照实施例4的最佳固载条件获得足够量的固定化BG。
（2）将悬浮于50mM、 pH5.5 NaAC-HAc缓冲液中等量的游离和固定化BG在不同温度下（25-90℃）放置30分钟。
（3）按照实施例3测定酶活的方法检测。
（4）以最高点酶活作百分之百，其它酶活与最高点酶活作比值，绘制温度对相对酶活的曲线（见图3）。从图3中可以得出，经不同温度处理后固定化BG保持的活性基本高于游离BG。处理温度达到70℃时，固定化BG仍维持原酶活性的50%，而游离BG在温度为60℃时就基本丧失了酶活。
实施例7：游离和固定化BG依赖时间和温度的储存稳定性
（1）按照实施例4的最佳固载条件获得足够量的固定化BG。
（2）游离和固定化BG各准备两份，一份储存在4℃，另一份置于25℃中保存。
（3）在储存0、5、15、20天时取出相同量的BG按照实例3所述进行酶活检测。
（4）以最高点酶活作百分之百，其它酶活与最高点酶活作比值，绘制时间对相对酶活的曲线（见图3）。图3曲线证明了固定化BG在4℃和25℃下储存的剩余活性都高于游离BG的。
实施例8：固定化BG的重复利用
（1）按照实施例4的最佳固载条件获得足够量的固定化BG。
（2）按照实施例3测定酶活的方法检测。
（3）用磁铁沉降固定化BG，将剩余反应液移除，用50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液对沉降的固定化BG进行反复清洗，注意力度要小，以防BG从磁性纳米颗粒上脱落。
（4）将清洗后的固定化BG用一定体积的50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液悬浮，随后按照前述测定酶活的方法进行第二次酶活检测。
（5）重复步骤3和4，一次进行下去。
（6）以最高点酶活作百分之百，其它酶活与最高点酶活作比值，绘制次数对相对酶活的曲线（见图4）。固定化BG在重复利用11次后仍保持着70%的原酶活性。

Claims (7)

1.一种核壳式磁性高分子纳米颗粒Fe3O4/PMG/IDA−Ni2+在酶的固定化中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酶为带组氨酸标签的酶。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述酶为β-葡萄糖苷酶。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核壳式磁性高分子纳米颗粒在提高酶的稳定性，提高固定化酶产物的纯度和酶的利用率中的应用。
5.一种酶的固定化方法，其特征在于，所述方法是利用一种核壳式磁性高分子纳米颗粒Fe3O4/PMG/IDA−Ni2+完成。
6.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶包括一种核壳式磁性高分子纳米颗粒Fe3O4/PMG/IDA−Ni2+。
7.根据权利要求6所述的酶，其特征在于，所述固定化的酶为β-葡萄糖苷酶。
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