CN109758989A - 一种用于纯化组氨酸标记蛋白质的纳米磁珠的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备方法；以海藻酸钠，FeCl₃·6H₂O,NaAc·3H₂O和PEG为原料，乙二醇和去离子水为溶剂，通过溶剂热法反应生成单分散的海藻酸钠/Fe₃O₄磁性纳米磁珠，随后纳米磁珠进一步和新加入的海藻酸钠通过环氧氯丙烷交联反应及活化，再引入亚氨基二乙酸(IDA)螯合剂，从而得到与金属镍或钴离子高效螯合的水中稳定的磁性纳米磁珠，实现对组氨酸标签蛋白质高效，快速，简单，低廉的分离纯化。本发明操作简单快速、稳定、成本低，合成的纳米磁珠比表面积大，在水相中稳定不易团聚沉淀，大大地提高了纯化组氨酸标签蛋白质的效率，可用于实现大批量的工业生产。

Description

一种用于纯化组氨酸标记蛋白质的纳米磁珠的制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备方法。

背景技术

目前，组氨酸标签蛋白质的纯化方法主要以琼脂糖或葡聚糖微球作为固相载体，通过化学交联将螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)或者氨三乙酸(NTA)固定在微球表面，然后将微球填充柱子，通过亲和层析柱的方式去纯化组氨酸标签蛋白质。但这种柱式纯化方式有几方面的缺陷：1.上样液要求比较高，上样前必须去掉细胞碎片和杂质以免堵塞柱子。2.需要控制上样速度，以免柱子压力过大，造成坍塌。

磁性微球是近年发展起来的新型功能材料，在无外加磁场时分散于溶液中，当有外加磁场时则有较强的磁响应性。基于这个性质，磁性琼脂糖微球被合成及表面功能化，并通过磁性分离来纯化组氨酸标签蛋白质。但由于磁性琼脂糖微球一般在几十到几百微米，容易团聚，在水相中不稳定，易沉淀，比表面积小，和目标蛋白质接触时间短，这样往往需要大量的磁性微球才能纯化到一定量的目标蛋白，此外琼脂糖制备复杂，价格昂贵，这些都大大提高了产品的成本，影响了纯化效率。

通过对现有专利文献的检索发现，申请号为201610163717.7的中国发明专利申请公开了一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用；其以平均水合粒径为100～400nm的Fe₃O₄磁性纳米粒为核，采用MPS表面修饰使其表面富含双键，通过PAA包覆得到平均水合粒径为100～600nm的多羧基结构磁性纳米粒子，然后进一步偶联NTA-Ni²⁺得到具有快速磁场响应性的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺。该发明制得的复合磁性纳米粒子可在纳米尺度上控制包覆层的厚度，制得的复合磁性纳米粒子尺寸分布均匀，具有较高的富集和分离纯化组氨酸标签蛋白质的能力，对组氨酸标签蛋白质的纯化效率可高达40～70μg/mg复合磁性纳米粒子，且可重复使用。然而，此专利合成过程步骤繁多复杂，并且NTA反应效率低(丙烯酸在EDC和NHS的作用下很难和NTA反应)，很难接到磁珠表面，此外整个过程所需反应物多，价格昂贵，如果EDC,NHS，NTA等，反应成本高。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种新型的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠，所述纳米磁珠是外壳为IDA功能化交联海藻酸钠，内核为Fe₃O₄纳米颗粒的核壳结构。

优选的，所述纳米磁珠是粒径为100～200纳米的单分散颗粒。

优选的，所述外壳上海藻酸钠的羧基和表面修饰的IDA螯合剂螯合了金属镍或钴离子。本发明利用海藻酸钠羧基和镍离子结合去纯化组氨酸标记的蛋白质。

第二方面，本发明涉及一种所述的纳米磁珠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

S1、以海藻酸钠、FeCl₃·6H₂O、NaAc·3H₂O和PEG为原料，乙二醇和去离子水为溶剂，通过溶剂热反应生成Fe₃O₄纳米颗粒；

S2、所述Fe₃O₄纳米颗粒和海藻酸钠通过环氧氯丙烷交联反应及活化，得到环氧基改性海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠；

S3、步骤S2得到的磁性纳米磁珠表面引入亚氨基二乙酸螯合剂分子，得到IDA改性的纳米磁珠。

优选的，步骤S1中，步骤S1中，每0.1～2毫升去离子水对应海藻酸钠(MW:2000～40000)0.1～1克、FeCl₃·6H₂O 0.05～1克、NaAc·3H₂O 0.05～3克和PEG(MW:300～6000)0.1～2毫升；所述溶剂热反应的反应温度为100～250℃，反应时间为2～48个小时。在具体实施例中，海藻酸钠可选用阿拉丁生化科技股份有限公司生产的海藻酸钠。

优选的，步骤S2包括：

以去离子水和二甲基亚砜为溶剂，Fe₃O₄纳米颗粒、海藻酸钠、氢氧化钠，以及交联剂环氧氯丙烷在50～80℃条件下反应2～8小时，得到海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠；

以去离子水和二甲基亚砜为溶剂，所述海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠、氢氧化钠和环氧氯丙烷在40～50℃条件下反应2～4小时，得到所述环氧基改性海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠。

优选的，每2毫升环氧氯丙烷对应Fe₃O₄纳米颗粒0.5～2克、海藻酸钠0.5～2克、氢氧化钠0.1～1克。

优选的，每1～3毫升环氧氯丙烷对应海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠1～5克、氢氧化钠0.08～0.8克。

优选的，步骤S3中，引入亚氨基二乙酸螯合剂分子是通过以去离子水和二甲基亚砜为溶剂，步骤S2得到的磁性纳米磁珠与亚氨基二乙酸、无水碳酸钠和氢氧化钠在25～50℃条件下反应12～24小时来实现的。

优选的，每2～5克步骤S2得到的磁性纳米磁珠对应亚氨基二乙酸6～20克、无水碳酸钠5～18克、氢氧化钠0.08～1克。

优选的，步骤S3还包括IDA改性的纳米磁珠与浓度为0.1～2mol/L的硫酸镍或硫酸钴溶液在20～60℃下孵育0.5～3小时，磁性分离去上清，得到螯合镍或钴金属离子的纳米磁珠的步骤。

优选的，每20毫升硫酸镍或硫酸钴溶液对应IDA改性的纳米磁珠2～5克。

第三方面，本发明还涉及一种所述的纳米磁珠在纯化组氨酸标签蛋白质中的用途。

第四方面，本发明还涉及一种应用所述的纳米磁珠纯化组氨酸标签蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A1、将螯合镍或钴金属离子的所述纳米磁珠，磁性分离去上清，再用细胞裂解缓冲液洗涤磁珠除去未结合的金属离子；

A2、将裂解的细胞液与磁珠在4±1℃混合孵育15～90分钟，收集磁珠；

A3、洗涤液洗涤磁珠除去杂蛋白；

A4、洗脱液洗脱磁珠上的组氨酸标签蛋白质。

优选的，所述方法还包括用SDS-PAGE电泳和BCA法检测裂解细胞液、洗涤液、洗脱液中的组氨酸标签蛋白的纯度与纯化量的步骤。

优选的，所述细胞裂解缓冲液的组成包括：500mM NaCl,50mM NaH₂PO₄,20mM咪唑，pH7.4；洗涤液的组成包括：500mM NaCl,50mM NaH₂PO₄,70mM咪唑，pH7.4；洗脱液的组成包括：500mM NaCl,50mM NaH₂PO₄,500mM咪唑，pH7.4。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明采用具有快速磁场响应性的纳米磁珠为固相载体，在其表面包被带有羧酸基团的海藻酸钠和IDA螯合分子，这些分子可以和镍、钴等金属离子高效的螯合，从而实现对可溶性组氨酸标签蛋白的快速、高效、简单地纯化与分离。

2、本发明具有操作简单、稳定、耗时短、成本低的特点，所合成的纳米磁珠比表面积大，不易团聚，在水相中稳定不易沉淀，大大地提高了纯化组氨酸标签蛋白质的效率，可用于实现大批量的工业生产。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为纳米磁珠分离纯化目标蛋白质得到的SDS-PAGE图；其中，Lane 1：蛋白质分子量标记物；Lane 2:纳米磁珠进行分离前；Lane 3:纳米磁珠进行分离后；Lane 4:第一次洗涤；Lane 5：第二次洗涤；Lane 6：第一次洗脱液；Lane 7：第二次洗脱液；Lane 8,9,10,11:重复使用2次的洗脱液；

图2是本发明的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的扫描电镜图；

图3是本发明的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的动态光散射纳米激光粒度测定示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种新型的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备及应用方法，

磁珠的制备方法包括以下步骤：

第一步，将反应物0.5克海藻酸钠、0.5克FeCl₃·6H₂O、1.5克NaAc·3H₂O、1毫升PEG(MW:300～6000)和1毫升去离子水混合于20毫升乙二醇溶剂中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，将上述溶液转入50毫升反应釜中，在180℃条件下反应25个小时，冷却至室温后，将反应产物移到50毫升离心管里，用去离子水清洗后，用磁铁收集，真空干燥保存，得到黑色的Fe₃O₄纳米颗粒。

第二步，在纳米颗粒表面包被上交联的海藻酸钠：1克的Fe₃O₄纳米颗粒，1.2克海藻酸钠，0.5克氢氧化钠，2毫升的环氧氯丙烷在20毫升去离子水和二甲基亚砜混合溶剂(v/v＝1:0.5)中，65℃条件下反应5小时，然后无水乙醇和去离子水洗涤多次，得到海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠。

第三步，对磁珠进行表面改性处理得到环氧基改性的纳米磁珠：将3克海藻酸钠包被的纳米磁珠，0.4克氢氧化钠和2毫升环氧氯丙烷在30毫升去离子水和二甲基亚砜混合溶剂(v/v＝1:0.5)中，45℃条件下反应3小时，然后无水乙醇和去离子水洗涤多次，得到环氧基改性的纳米磁珠。

第四步，在磁珠表面引入亚氨基二乙酸(IDA)螯合剂分子：将3.5克环氧基改性的纳米磁珠与12克亚氨基二乙酸，12克无水碳酸钠和0.5克氢氧化钠在18毫升去离子水和二甲基亚砜混合溶剂(v/v＝1:0.5)中，37℃条件下反应18小时，然后去离子水洗涤多次，得到IDA改性的纳米磁珠。

第五步，纳米磁珠螯合镍或钴金属离子：3.5克IDA改性的纳米磁珠与20毫升浓度为1mol/L的硫酸镍或硫酸钴溶液在常温下孵育1.5小时，在磁性分离去上清后，得到螯合镍或钴金属离子的纳米磁珠。

本实施例制得的纳米磁珠用于纯化可溶性的组氨酸标签蛋白质时，纯化方法包括以下步骤：

一、将镍或钴金属离子与磁珠螯合，磁性分离去上清，再用细胞裂解缓冲液(细胞裂解缓冲液：500mM NaCl,50mM NaH₂PO₄,20mM咪唑，pH7.4)洗涤磁珠两次除去未结合的金属离子。

二、每40毫升含有组氨酸标签蛋白质的裂解细胞液与0.1～0.5毫升(本实施例中实际选用0.3毫升)100％体积的磁珠在4℃混合孵育半小时，再用磁力架收集磁珠，收集时间为1～2分钟(本实施例中选用1.5分钟)。

三、160毫升洗涤液(洗涤液:500mM NaCl,50mM NaH₂PO₄,70mM咪唑，pH7.4)洗涤磁珠2-4次(本实施例中选择3次)除去杂蛋白。

四、洗脱液(洗脱液:500mM NaCl,50mM NaH₂PO₄,500mM咪唑，pH7.4)洗脱磁珠上的可溶性组氨酸标签蛋白质，洗脱2-6次(本实施例中选择4次)，每次用1或2毫升洗脱液。

五、用SDS-PAGE电泳和BCA法检测裂解细胞液、洗涤液、洗脱液中的组氨酸标签蛋白的纯度与纯化量。由于不同蛋白质表达量的不同，经BCA法检测得到的纳米磁珠纯化可溶性组氨酸标签蛋白质的纯化效率为5～30毫克/毫升100％磁珠。

图1为纳米磁珠分离纯化目标蛋白质得到的SDS-PAGE图；由图1可知，lane 6-11的洗脱液中只得到了组氨酸标记的目的蛋白质，而且几次重复纯化效果没有区别，由此可知，本纳米磁珠的分离纯化效果非常好，纯化条带单一，得到的目的蛋白质纯度高。

并且，由图2可知，该磁珠是具有核壳结构的纳米球，其粒径为100～200纳米；通过动态光散射纳米激光粒度仪测定磁珠直径如图3所示，磁珠水合直径在230纳米，并且磁珠在24小时内没有团聚，PDI值在0.005～0.01之间，一直是单分散存在。

实施例2

本实施例涉及一种新型的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备及应用方法，

磁珠的制备方法包括以下步骤：

第一步，将反应物0.1克海藻酸钠、0.05克FeCl₃·6H₂O、0.05克NaAc·3H₂O、0.1毫升PEG(MW:300～6000)和0.1毫升去离子水混合于20毫升乙二醇溶剂中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，将上述溶液转入50毫升反应釜中，在100℃条件下反应48个小时，冷却至室温后，将反应产物移到50毫升离心管里，用去离子水清洗后，用磁铁收集，真空干燥保存，得到黑色的Fe₃O₄纳米颗粒。

第二步，在纳米颗粒表面包被上交联的海藻酸钠：0.5克的Fe₃O₄纳米颗粒，0.5克海藻酸钠，0.1克氢氧化钠，2毫升的环氧氯丙烷在20毫升去离子水和二甲基亚砜混合溶剂(v/v＝1:0.1)中，50℃条件下反应8小时，然后无水乙醇和去离子水洗涤多次，得到海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠。

第三步，对磁珠进行表面改性处理得到环氧基改性的纳米磁珠：将1克海藻酸钠包被的纳米磁珠，0.08克氢氧化钠和1毫升环氧氯丙烷在30毫升去离子水和二甲基亚砜混合溶剂(v/v＝1:0.1)中，40℃条件下反应4小时，然后无水乙醇和去离子水洗涤多次，得到环氧基改性的纳米磁珠。

第四步，在磁珠表面引入亚氨基二乙酸(IDA)螯合剂分子：将2克环氧基改性的纳米磁珠与6克亚氨基二乙酸，5克无水碳酸钠和0.08克氢氧化钠在18毫升去离子水和二甲基亚砜混合溶剂(v/v＝1:0.1)中，25℃条件下反应24小时，然后去离子水洗涤多次，得到IDA改性的纳米磁珠。

第五步，纳米磁珠螯合镍或钴金属离子：2克IDA改性的纳米磁珠与20毫升浓度为0.1mol/L的硫酸镍或硫酸钴溶液在常温下孵育3小时，在磁性分离去上清后，得到螯合镍或钴金属离子的纳米磁珠。

本实施例制得的纳米磁珠用于纯化可溶性的组氨酸标签蛋白质时，纯化方法通实施例1，经BCA法检测得到的纳米磁珠纯化可溶性组氨酸标签蛋白质的纯化效率为5～20毫克/毫升100％磁珠。

实施例3

本实施例涉及一种新型的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备及应用方法，

磁珠的制备方法包括以下步骤：

第一步，将反应物1克海藻酸钠、1克FeCl₃·6H₂O、3克NaAc·3H₂O、2毫升PEG(MW:300～6000)和2毫升去离子水混合于20毫升乙二醇溶剂中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，将上述溶液转入50毫升反应釜中，在250℃条件下反应2个小时，冷却至室温后，将反应产物移到50毫升离心管里，用去离子水清洗后，用磁铁收集，真空干燥保存，得到黑色的Fe₃O₄纳米颗粒。

第二步，在纳米颗粒表面包被上交联的海藻酸钠：2克的Fe₃O₄纳米颗粒，2克海藻酸钠，1克氢氧化钠，2毫升的环氧氯丙烷在20毫升去离子水和二甲基亚砜混合溶剂(v/v＝1:1)中，80℃条件下反应2小时，然后无水乙醇和去离子水洗涤多次，得到海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠。

第三步，对磁珠进行表面改性处理得到环氧基改性的纳米磁珠：将5克海藻酸钠包被的纳米磁珠，0.8克氢氧化钠和3毫升环氧氯丙烷在30毫升去离子水和二甲基亚砜混合溶剂(v/v＝1:1)中，50℃条件下反应2小时，然后无水乙醇和去离子水洗涤多次，得到环氧基改性的纳米磁珠。

第四步，在磁珠表面引入亚氨基二乙酸(IDA)螯合剂分子：将5克环氧基改性的纳米磁珠与20克亚氨基二乙酸，18克无水碳酸钠和1克氢氧化钠在18毫升去离子水和二甲基亚砜混合溶剂(v/v＝1:1)中，50℃条件下反应12小时，然后去离子水洗涤多次，得到IDA改性的纳米磁珠。

第五步，纳米磁珠螯合镍或钴金属离子：5克IDA改性的纳米磁珠与20毫升浓度为2mol/L的硫酸镍或硫酸钴溶液在常温下孵育0.5小时，在磁性分离去上清后，得到螯合镍或钴金属离子的纳米磁珠。

本实施例制得的纳米磁珠用于纯化可溶性的组氨酸标签蛋白质时，纯化方法通实施例1，经BCA法检测得到的纳米磁珠纯化可溶性组氨酸标签蛋白质的纯化效率为10～50毫克/毫升100％磁珠。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠，其特征在于，所述纳米磁珠是外壳为IDA功能化交联海藻酸钠，内核为Fe₃O₄纳米颗粒的核壳结构。

2.根据权利要求1所述的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠，其特征在于，所述纳米磁珠是粒径为100～200纳米的单分散颗粒。

3.根据权利要求1所述的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠，其特征在于，所述外壳上海藻酸钠的羧基和表面修饰的IDA螯合剂螯合了金属镍离子或钴离子。

4.一种根据权利要求1所述的用于纯化组氨酸标签蛋白质的纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

S1、以海藻酸钠、FeCl₃·6H₂O、NaAc·3H₂O和PEG为原料，乙二醇和去离子水为溶剂，通过溶剂热反应生成Fe₃O₄纳米颗粒；

S2、所述Fe₃O₄纳米颗粒和海藻酸钠通过环氧氯丙烷交联反应及活化，得到环氧基改性海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠；

S3、步骤S2得到的磁性纳米磁珠表面引入亚氨基二乙酸螯合剂分子，得到IDA改性的纳米磁珠，即所述纳米磁珠。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，每0.1～2毫升去离子水对应海藻酸钠0.1～1克、FeCl₃·6H₂O 0.05～1克、NaAc·3H₂O 0.05～3克和PEG 0.1～2毫升；所述溶剂热反应的反应温度为100～250℃，反应时间为2～48个小时。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2包括：

以去离子水和二甲基亚砜为溶剂，Fe₃O₄纳米颗粒、海藻酸钠、氢氧化钠，以及交联剂环氧氯丙烷在50～80℃条件下反应2～8小时，得到海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠；

以去离子水和二甲基亚砜为溶剂，所述海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠、氢氧化钠和环氧氯丙烷在40～50℃条件下反应2～4小时，得到所述环氧基改性海藻酸钠包被的核壳结构的磁性纳米磁珠。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，引入亚氨基二乙酸螯合剂分子是通过以去离子水和二甲基亚砜为溶剂，步骤S2得到的磁性纳米磁珠与亚氨基二乙酸、无水碳酸钠和氢氧化钠在25～50℃条件下反应12～24小时来实现的。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3还包括IDA改性的纳米磁珠与浓度为0.1～2mol/L的硫酸镍或硫酸钴溶液在20～60℃下孵育0.5～3小时，磁性分离去上清，得到螯合镍或钴金属离子的纳米磁珠的步骤。

9.一种根据权利要求1所述的纳米磁珠在纯化组氨酸标签蛋白质中的用途。

10.一种应用根据权利要求1所述的纳米磁珠纯化组氨酸标签蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A1、将螯合镍或钴金属离子的所述纳米磁珠，磁性分离去上清，再用细胞裂解缓冲液洗涤磁珠除去未结合的金属离子；

A2、将裂解的细胞液与磁珠在4±1℃混合孵育15～90分钟，收集磁珠；

A3、洗涤液洗涤磁珠除去杂蛋白；

A4、洗脱液洗脱磁珠上的组氨酸标签蛋白质。