CN111087464A

CN111087464A - 一种具有功能结构的重组人源iii型胶原蛋白及其表达方法

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Publication number: CN111087464A
Application number: CN201911384531.4A
Authority: CN
Inventors: 徐兰举; 齐磊; 刘鑫; 申翠美; 杜亚东
Original assignee: Hebei Naco Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hebei Naco Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-28
Filing date: 2019-12-28
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2039-12-28
Also published as: CN111087464B

Abstract

本发明涉及一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白及其原核表达方法，所述的人源III型胶原蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示，通过与基因序列为SEQ ID NO:4的羟化酶Hy726共同表达，得到具有三级螺旋结构的重组人源III型胶原蛋白，该蛋白具有更好的稳定性和功能性，更能媲美天然人源III型胶原蛋白生物活性。

Description

一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白及其表达方法

技术领域

本发明属于优化编码基因技术领域，具体地涉及一种具有功能结构重组人源III型胶原蛋白及其原核表达方法。

背景技术

体胶原蛋白又称胶原，是一种糖蛋白，III型胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成的三股螺旋状。一级结构分析表明，其多肽链很长的区段序列是由GLy-x-y氨基酸序列重复而成。其中，x通常为脯氨酸，y通常为羟脯氨酸和羟赖氨酸，这种三肽重复序列对胶原蛋白的结构起着很大的作用，特别是成纤维胶原的胶原域是由长而不中断的三股螺旋组成。羟脯氨酸和羟赖氨酸在其他蛋白质中很少见，羟脯氨酸羟基能参与链间的氢键形成，促进三螺旋结构的形成，提高胶原蛋白的稳定性和功能性，对稳定胶原蛋白三螺旋结构并保证其在体温下的热稳定性至关重要。

胶原蛋白现已被广泛应用于化妆品、医疗器械等领域，用于实现对组织的修复、再生。胶原蛋白的三股螺旋结构对于其实现组织修复功能起着至关重要的作用，同时三股螺旋结构的胶原蛋白比单链的多肽序列要稳定。传统的胶原蛋白主要通过提取的方式从动物组织中获得。然而，动物组织中提取的胶原蛋白存在感染疯牛病等传染性病毒的风险。

现有技术中，虽然对III型人源胶原蛋白的重组技术进行了一些报道，例如CN110194795A公开了一种重组人源胶原蛋白及其应用，选取了人源三型蛋白保守区域的一段序列并将其重复8次，将设计得到的序列重组构建原核表达载体pET22b中，经过诱导表达，最终得到了能够在大肠杆菌中高效表达的，可溶于水的重组人源胶原蛋白。CN103122027A公开了一种重组人源胶原蛋白及其生产方法，结构为单链结构，基本重复单元为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段。尚未有对于重组人源胶原蛋白的功能性三维螺旋结构的技术报道。

有鉴于此，发明一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白的表达方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够提高稳定性的具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白，并同时提供其高效的原核表达方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明一方面提供了一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白，其具有三级结构，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了一种参与上述胶原蛋白表达的羟化酶Hy726基因，其核苷酸序列为为SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种包含所述人源III型胶原蛋白的编码基因和羟化酶Hy726基因的重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230。

本发明还提供了一种含有所述重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明最后一方面提供了一种所述具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白原核表达方法，具体包括如下步骤：

（1）基因设计和合成

依据人源III型胶原蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:1和巨型病毒 4-脯氨酸羟化酶氨基酸序列SEQ ID NO:2，反向设计基因序列，进行密码子优化，得到人源III型胶原蛋白的编码基因序列SEQ ID NO:3和羟化酶Hy726基因序列SEQ ID NO:4，进而根据SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示基因序列，分别进行全基因合成；

（2）重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建：

a）将所述人源III型胶原蛋白的编码基因SEQ ID NO:3插入到表达载体PET30a（+）的酶切位点NdeI和XhoI之间，通过热激方法转化到宿主菌E.coli DH5α中，挑取阳性克隆，采用质粒快速提取试剂盒提取质粒，得到重组表达载体pET30-1230；

b）以合成的羟化酶Hy726的原核表达载体pUC-Hy726作为模版，利用高保真PCR技术扩增克隆Hy726片段，PCR产物纯化后以Nco I和BamH I双酶切，得到片段Hy726(N-B)，Nco I和BamH I双酶切pACYCDeut 1空载体，得到片段pACYCDuet 1(N-B)，连接Hy726(N-B)和pACYCDuet 1(N-B) ，连接物转化入感受态细菌，提取质粒，得到载体pACYCDeut 1-Hy762；

c）将重组表达载体pET30-1230和载体pACYCDeut 1-Hy762分别以Nde I 和Xho I双酶切，得到外源片段1230(N-X)和载体骨架pACYCDuet 1-Hy726(N-X) ，连接体系转化DH5α感受态细菌，提取得到重组质粒pACYCDuet 1-Hy726-1230；

（3）转化体BL21(DE3) / pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建

将重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230通过热激转化入感受态细胞BL21(DE3)，筛选获得重组基因工程菌；

（4）诱导表达

将获得的重组基因工程菌接入M9培养基中，37℃培养过夜，再以2%的接种量接种到M9培养基中，23℃培养14h，加入终浓度为0.05mM IPTG进行诱导表达，继续培养12h，离心收集菌体。

作为本发明的一些实施方案，还包括步骤（5）蛋白纯化：使用磁珠对重组蛋白进行纯化。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

(1)本发明采用基因工程手段获得III型胶原蛋白，避免了动物组织提取胶原蛋白所存在的传播疯牛病等病毒的风险。

(2)本发明获得了具有三螺旋结构的胶原蛋白，其结构与人III型胶原蛋白更相似，具有更好的生物活性。

(5)相对于单链结构胶原蛋白，本发明获得了具有三螺旋结构的胶原蛋白更稳定，便于后期美容、医疗器械等产品的开发和保存。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1 本发明的Hy726（N-X）的电泳图，图中：1、Hy726（N-X）；2、Marker（DL 2000）；

图2 本发明pACYCDeut 1-Hy762的双酶切鉴定结果图，图中：1、Marker（15K）；2、pACYCDeut 1-Hy762双酶切产物；3、pACYCDeut 1-Hy762双酶切产物；

图3本发明的载体骨架pACYCDuet 1-Hy726(N-X)和外源片段1230(N-X)的鉴定结果图，图中：1、Marker（15K）；2、空白；3、pACYCDeut 1-Hy726（N-X）；4、空白；5、pET30-1230（N-X）；

图4本发明的Nde I单酶切pACYCDuet 1-Hy726-1230鉴定结果图，图中：1、Marker（15K）；2、1#质粒未酶切；3、1#质粒Nde I酶切；4、2#质粒未酶切；5、2#质粒Nde I酶切；6、3#质粒未酶切；7、3#质粒Nde I酶切；8、4#质粒未酶切；9、4#质粒Nde I酶切；

图5本发明的pACYCDuet 1-Hy726-1230的双酶切和单酶切鉴定结果图，图中1、Marker（15K）；2、1#重组子Nde I和Xho I双酶切的质粒； 3、1#重组子未酶切质粒；4、2#重组子NdeI和Xho I双酶切的质粒； 5、2#重组子未酶切质粒；6、1#重组子Nde I单酶切的质粒；7、2#重组子Nde I单酶切的质粒；

图6为发明的pACYCDuet 1-Hy726-1230的诱导表达WB结果图，图中：从左至右，三个泳道依次为1为pET-1230菌株表达的蛋白样品、2为pACYCDuet 1-Hy726-1230的1#菌株表达的蛋白样品、3为pACYCDuet 1-Hy726-1230的2#菌株表达的蛋白样品。

图7为发明的pACYCDuet 1-Hy726-1230的诱导表达考马斯亮蓝染色结果图，图中三个泳道依次为1为pET-1230菌株表达的蛋白样品、2为pACYCDuet 1-Hy726-1230的1#菌株表达的蛋白样品、3为pACYCDuet 1-Hy726-1230的2#菌株表达的蛋白样品。

图8为本发明的人源III型胶原蛋白的诱导和纯化验证图，图中，1、未诱导；2、诱导；3、Marker；4、未纯化；5、纯化。

图9为本发明的人源III型胶原蛋白的电镜图；

图10 本发明的重组表达载体pET30-1230图谱；

图11 本发明的重组表达载体pET30-1230的双酶切鉴定结果图，图中：1 Marker（15K）；2、1#重组表达载体pET30-1230；3、Nde I和Xho I双酶切1#重组表达载体；4、2#重组表达载体pET30-1230；5、为Nde I和Xho I双酶切2#重组表达载体；6、DL 2000。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。

实施例1 基因设计和合成

（1）基因设计：

根据人源III型胶原蛋白氨基酸序列（UniProtKB/Swiss-Prot: P02461.4），SEQ IDNO：1：

MYDSYDVKSGVAVGGLAGYPGPPGPPPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESPGGRPGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGAPGPMGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGQPGPPGPPGTAGFPGSPGAKGEVGPAGSPGSNGAPGQRGEPGPQGHAGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGPRGPVGPSGPPGKDGTSGHPGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYHHHHHH

利用在线设计工具Jcat（http://www.jcat.de/）反向设计基因序列，针对宿主大肠杆菌表达所需的优选密码子，在设计过程中去除NdeI和XhoI酶切位点，有利后期基因操作，优化后的基因序列为SEQ ID NO:3所示，该序列与原始基因序列(NCBI Reference Sequence:NM_000090.3)相比：大肠杆菌稀有密码子从野生型的29个降低到了1个，有利于宿主菌大肠杆菌高效表达该基因。

优化后的基因序列为SEQ ID NO:3如下所示：

ATGTACGACTCTTACGACGTTAAATCTGGTGTTGCTGTTGGTGGTCTGGCTGGTTACCCGGGTCCGCCGGGTCCGCCGCCGGGTCCGGCTGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTACCTCTGGTCACCCGGGTTCTCCGGGTTCTCCGGGTTACCAGGGTCCGCCGGGTGAACCGGGTCAGGCTGGTCCGTCTGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTGCTATCGGTCCGTCTGGTCCGGCTGGTAAAGACGGTGAATCTCCGGGTGGTCGTCCGGGTCGTCCGGGTGAACGTGGTCTGCCGGGTCCGCCGGGTATCAAAGGTCCGGCGGGTATACCGGGCTTCCCGGGTATGAAGGGTCACCGTGGTTTCGACGGTCGTAACGGTGAAAAAGGTGAAACCGGTGCTCCGGGTCTGAAAGGTGAAAACGGTCTGCCGGGTGAAAACGGTGCTCCGGGTCCGATGGGTCCGCGTGGTGCTCCGGGTGAACGTGGTCGTCCGGGTCTGCCGGGTGCTGCTGGTGCTCGTGGTAACGACGGTGCTCGTGGTTCTGACGGTCAGCCGGGTCCGCCGGGTCCGCCAGGTACTGCTGGCTTCCCGGGTTCTCCAGGTGCTAAAGGTGAAGTTGGTCCGGCTGGTTCTCCGGGTTCTAACGGTGCTCCGGGTCAGCGTGGTGAACCGGGTCCGCAGGGTCACGCTGGTCCGCCGGGTCCGGTTGGTCCGGCTGGTAAATCTGGTGACCGTGGTGAATCTGGTCCGGCTGGTCCGGCTGGTGCTCCGGGTCCGGCTGGTTCTCGTGGTGCTCCGGGTCCGCAGGGTCCGCGTGGTGACAAAGGTGAAACCGGTGAACGTGGTGCTGCTGGTATCAAAGGTCACCGTGGTTTCCCGGGTAACCCGGGTGCTCCGGGTTCTCCGGGTCCGGCTGGTCAGCAGGGTGCTATCGGTTCTCCGGGTCCGGCTGGTCCGCGTGGTCCGGTTGGTCCGTCTGGTCCGCCGGGTAAAGACGGTACCTCTGGTCACCCGGGTCCGATCGGTCCGCCGGGTCCGCGTGGTAACCGTGGTGAACGTGGTTCTGAAGGTTCTCCGGGTCACCCGGGTCAGCCGGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTGCTCCGGGTCCGTGCTGCGGTGGTGTTGGTGCTGCTGCTATCGCTGGTATCGGTGGTGAAAAAGCTGGTGGTTTCGCTCCGTACTACCACCACCACCACCACCAC。

根据巨型病毒 4-脯氨酸羟化酶氨基酸序列（SEQ ID NO：2）：

MKTVTIITIIVVIIVVILIIMVLSKSCVSHFRNVGSLNSRDVNLKDDFSYANIDDPYNKPFVLNNLINPTKCQEIMQFANGKLFDSQVLSGTDKNIRNSQQMWISKNNPMVKPIFENICRQFNVPFDNAEDLQVVRYLPNQYYNEHHDSCCDSSKQCSEFIERGGQRILTVLIYLNNEFSDGHTYFPNLNQKFKPKTGDALVFYPLANNSNKCHPYSLHAGMPVTSGEKWIANLWFRERKFS。

利用在线设计工具Jcat（http://www.jcat.de/）反向设计基因序列，针对宿主大肠杆菌表达所需的优选密码子，在设计过程中去除Nco I和BamH I酶切位点，有利后期基因操作，优化上述设计的基因序列为SEQ ID NO:4序列，该序列与原始基因序列(NCBIReference Sequence: NM_000090.3)相比：大肠杆菌稀有密码子从野生型的49个降低到了0个，有利于宿主菌大肠杆菌高效表达该基因。

优化后的羟化酶Hy726为SEQ ID NO:4如下所示：

ATGAAAACCGTTACCATCATCACCATCATCGTTGTTATCATCGTTGTTATCCTGATCATCATGGTTCTGTCTAAATCTTGCGTTTCTCACTTCCGTAACGTTGGTTCTCTGAACTCTCGTGACGTTAACCTGAAAGACGACTTCTCTTACGCTAACATCGACGACCCGTACAACAAACCGTTCGTTCTGAACAACCTGATCAACCCGACCAAATGCCAGGAAATCATGCAGTTCGCTAACGGTAAACTGTTCGACTCTCAGGTTCTGTCTGGTACCGACAAAAACATCCGTAACTCTCAGCAGATGTGGATCTCTAAAAACAACCCGATGGTTAAACCGATCTTCGAAAACATCTGCCGTCAGTTCAACGTTCCGTTCGACAACGCTGAAGACCTGCAGGTTGTTCGTTACCTGCCGAACCAGTACTACAACGAACACCACGACTCTTGCTGCGACTCTTCTAAACAGTGCTCTGAATTCATCGAACGTGGTGGTCAGCGTATCCTGACCGTTCTGATCTACCTGAACAACGAATTCTCTGACGGTCACACCTACTTCCCGAACCTGAACCAGAAATTCAAACCGAAAACCGGTGACGCTCTGGTTTTCTACCCGCTGGCTAACAACTCTAACAAATGCCACCCGTACTCTCTGCACGCTGGTATGCCGGTTACCTCTGGTGAAAAATGGATCGCTAACCTGTGGTTCCGTGAACGTAAATTCTCT。

（2）基因合成：

根据SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:3所示基因序列，交由金斯瑞生物科技股份有限公司分别进行全基因合成。

实施例2 表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建

（1）以实施例1得到的羟化酶Hy726的原核表达载体pUC-Hy726作为模版，利用高保真PCR技术扩增克隆Hy726片段，PCR产物纯化后以Nco I和Xho I双酶切扩增得到的Hy726片段，切胶回收Hy726（N-X），电泳分离结果见图1。

PCR扩增体系如下（以50μL为例）：

ddH2O 19.0μL

2 × pfu Buffer 25.0μL

Hy762 上游引物 2.0μL

Hy762 下游引物 2.0μL

模板 2.0μL（约5ng）

步骤如下：

94℃ 3 min

94℃ 30 sec

55℃ 30 sec

72℃ 1 min 40 sec

72℃ 3 min

35个循环。

PCR产物纯化后以Nco I和BamH I双酶切，酶切产物切胶回收（条带大小约720bp），所得片段称为Hy726(N-B)，Nco I和BamH I双酶切pACYCDeut 1空载体，纯化回收载体骨架（约4000bp），所得片段称为pACYCDuet 1(N-B)（约4000bp）。连接Hy726(N-B)和pACYCDuet 1(N-B)，连接产物转化感受态细菌，涂布氯霉素抗性平板，挑取两个菌落摇菌提取质粒，以Nco I和BamH I双酶切鉴定，见图2。结果显示，这两个质粒都是正确重组子，测序结果表明其Hy762序列均正确。

（2）对实施例1获得的基因SEQ ID NO:2片段使用NdeI和XhoI 双酶切，酶切体系如下：酶切体系50μL，SEQ ID NO:2片段5μL（2μg），NdeI和XhoI酶各1μL，缓冲液5μL，灭菌双蒸水补足50μL，37℃保温4h。采用相同的体系酶切质粒PET30a（+）。通过酶切得到线性片段，采用DNA凝胶回收试剂盒纯化得到目的片段，使用T4连接酶对所得片段进行连接反应，连接体系如下：T4 DNA连接酶1μL，1230酶切片段3μL，PET30a（+）酶切片段2μL，连接缓冲液1μL，灭菌双蒸水补足10μL。16℃保温4h。将保温后的产物，通过热激方法转化到宿主菌E.coli DH5α中，涂布到LB培养抗性平板，37℃保温过夜。随机挑取阳性克隆，进行LB液体培养基，37℃，220rpm培养过夜。采用质粒快速提取试剂盒提取质粒，即得到所构建的质粒PET30（+），见图10和图11。

（3）pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建

将步骤（1）中得到pACYCDuet 1-Hy726质粒和步骤（2）中构建的质粒pET30-1230质粒均以Nde I 和Xho I双酶切，分别切胶回收载体骨架pACYCDuet 1-Hy726(N-X)和外源片段1230(N-X)，见图3。连接pACYCDuet 1-Hy726(N-X)和1230(N-X)，连接体系转化DH5α感受态细菌；挑取4个菌落，提取质粒，分别记为1#、2#、3#和4#，以Nde I 单酶切鉴定，结果如图4所示，酶切后片段位置符合预期，为正确重组子。即得到重组质粒pACYCDuet 1-Hy726-1230。

实施例3 BL21(DE3) / pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建

本实施例参照J.萨姆布鲁克等，《分子克隆试验指南第三版》方法），具体如下：挑取大肠杆菌BL21（DE3）单菌落到LB试管接种后在37℃振荡过夜培养；在含50mL LB的三角瓶中加入0.5mL的过夜培养液，37℃剧烈振荡培养约2h使菌体长到对数前期；.无菌条件下将细菌转移到用冰预冷的50mL聚丙烯管中，冰上放置10min；4℃，4000rpm离心，倒出上清，将管倒置，使残余液尽量流出；加入6mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀，放置冰上30min；4℃，3000rpm离心，倒出上清，将管倒置，使残余液尽量流出；加入1.2mL用冰预冷的0.1mol/LCaCl₂重悬沉淀（若要制备于-70°C保存备用的感受态细胞，则加入含有20%甘油的0.1mol/LCaCl₂悬浮菌体），4℃放置5~24h后转化；吸200μL感受态细胞悬液，加DNA（体积<10μL, DNA<50ng）轻轻混匀，冰上放置30min；42℃水浴静止热激90S，立即放入冰上冷却；加入500μL液体LB培养液，混匀，放入37℃摇床低速摇动复苏45min（也可加LB后直接放入37℃水浴复苏1h，中间振荡管子使细胞悬浮）；吸取转化的细胞涂布加有抗生素的平板上，放于37℃培养箱中倒置培养，生长出的菌落即为转化体BL21(DE3) / pACYCDuet 1-Hy726-1230。挑选2个菌落，记为1#重组子和2#重组子，提取的重组质粒进行双酶切和单酶切方法鉴定，结果见图5。

实施例4 转化体BL21(DE3) / pACYCDuet 1-Hy726-1230的诱导表达

挑取单菌落于含50μg/ mL Kan的LB液体培养基中，37℃ 200rpm培养过夜后成为活化种子，再以2%的接种量接种到M9培养基中，装液量为50mL/250mL， 23℃，200rpm培养14h，加入终浓度为0.05mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，继续培养12h，离心收集菌体。

M9培养基的配置方法如下：

（1)配制1M的MgSO₄: MgSO₄·7H₂O 2.46g 加双蒸水10mL溶解，高压灭菌备用；

（2)配制1M的CaCl₂: CaCl₂·6H₂O 2.191g 加双蒸水10mL溶解，高压灭菌备用；

（3)配制5×M9盐溶液：Na₂PO₄·7H₂O 12.8g；KH₂PO₄ 3.0g；NaCl 0.5g；NH₄Cl 1.0g；加双蒸水200mL溶解，121度灭菌15min；

（4）配制20%的葡萄糖溶液：4g葡萄糖加双蒸水20mL溶解，0.22μM滤器过滤除菌；

（5）无菌操作配制M9培养基：5×M9盐溶液 200mL；1M的MgSO₄ 2mL；20%的葡萄糖溶液20mL；1M的CaCl₂ 0.1mL；加灭菌双蒸水至1000mL。

实施例5蛋白纯化

使用BeaverBeads™ His-tag Protein Purification磁珠纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化。

（1）样品处理：表达细胞用适量的 Binding Buffer 稀释，加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM 的PMSF），重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴 30 min，以降解核酸。

（2）磁珠预处理：（a）将海狸磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取 5mL 磁珠悬液于15 mL 离心管中，进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下离心管。（b）加入 5 mL Binding Buffer 到上述装有磁珠的离心管中，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮；进行磁性分离，移去上清液。重复洗涤2次。

（3）目标蛋白与磁珠结合：（a）用10 mL Binding Buffer 悬浮2g湿重的菌体，进行破碎和裂解之后，即为目标粗蛋白样品，加入到装有预处理磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡混匀器振荡15s。（b）将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合 20~30 min（如果需要，可以在 2~8℃ 的低温环境下，旋转混 1 h，防止目标蛋白降解）。（c）将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液至新的离心管中以备后续检测，从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。

（4）磁珠洗涤：（a）加入 10 mL Washing Buffer 到装有磁珠的离心管中，轻轻翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测。重复此步骤 1 次。（b）加入10 mL Washing Buffer 到装有磁珠的离心管，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移到新的离心管（避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白），磁性分离，移出上清液到清洗液收集管。

（5）目标蛋白洗脱：加入2-10 mL Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品，纯化结果见图8。

实验例1 SDS-PAGE蛋白胶检测

样品处理：收集实例3中制备的菌体，加入loading buffer 混合均匀，沸水浴10min，自然冷却，备用。选用金斯瑞SurePAGE™ 预制胶（4-12%）上样，在140 V 电压下电泳 45-55min直至溴酚蓝条带跑到凝胶底部。

考马斯亮蓝 R-250 使用微波炉染色：1) 配制染色液：在40% 乙醇和10% 醋酸溶液中溶解终浓度为0.1%（W/V）的考马斯亮蓝R250。2) 配制脱色液：将终浓度为10%（V/V）乙醇、7.5%（V/V）醋酸溶解在一起。3) 电泳完成后，撬开胶板取出凝胶，然后放入装有100 mL染色液的染色容器中。4) 盖上容器盖子并放入微波炉中用高热档位加热8min。为了避免危险，请注意不要让溶液沸腾。 5) 从微波炉中取出染色容器，放在脱色摇床上常温轻摇5min。6) 倒掉染色液并用去离子水小心清洗凝胶。7) 倒掉去离子水，并加入100 mL 脱色液。8) 盖上盖子，放入微波炉中用高热档位加热8min。9) 倒掉脱色液，加入新的脱色液，重复步骤8。10) 从微波炉中取出，放在脱色摇床上常温轻轻震荡至背景清晰。

结果如图7所示，显示各样本上样量基本一致。

实验例2 Western Blot验证

（1）使用 eBlot 快速湿转仪来进行蛋白转膜：1）用剪刀剪出与海绵大小相仿的滤纸 1张和 PVDF 膜 1 张，在 PVDF 膜一角用铅笔标记。2）用甲醇活化 PVDF 膜后，再用转移缓冲液将滤纸和 PVDF 膜浸泡。3）向托盘中加入转移缓冲液，放入海绵、PVDF 膜、滤纸和转膜夹。4）转膜夹的黑色板上先铺一块海绵，再铺滤纸和凝胶。对齐后用玻璃棒赶净气泡。5）用微量移液器取少量转移缓冲液放在凝胶后铺上 PVDF 膜，再铺滤纸和海绵。对齐后用玻璃棒赶净气泡。6）将转膜夹夹紧固定后，黑面对黑面放入转膜固定装置中。7）将转膜固定装置和装有冰块的冰盒放在转膜槽中。用转移缓冲液注满转移槽。8）接通电源，一般恒压100 V-110 V，1 h左右；小分子量的可以适当缩短时间；或者恒压 30 V， 4℃ 转膜过夜；或者恒流 300 mA，1 h左右。

（2）封闭及抗体孵育： 1）:关闭电源，打开转膜夹将 PVDF 膜取出，用双蒸水冲洗。2）将 PVDF 膜放在封闭液中，摇床上 37℃ 封闭 1 h。3）弃去封闭液，用 PBST 缓冲液洗涤，用一抗工作液孵育，摇床上 37℃ 孵育 1 h。 4）弃去一抗工作液，用 PBST 缓冲液洗涤，用二抗工作液孵育，摇床上 37℃ 孵育 1 h。 5）弃去二抗工作液，用 PBST 缓冲液洗涤。摇床上洗膜 4 次，每次 5 min。

（3）显影曝光：操作步骤如下：1）用平板纸吸去膜上残余液体，将 PVDF 膜平放。2）用微量移液器取等体积的 ECL 试剂中的 A 液和 B 液放在 EP 管仲恢复至室温。3）混合后均匀地加到膜上，避光反应 30-60 S。4）弃去 ECL 混合液置于暗盒中曝光显影，曝光时间控制在30 S左右。

Western blot结果如图6 所示，1230片段诱导表达的产物因被Hy726修饰而分子量增大，条带位置上移。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北纳科生物科技有限公司

<120> 一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白及其表达方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> 人源III型胶原蛋白

<400> 1

Met Tyr Asp Ser Tyr Asp Val Lys Ser Gly Val Ala Val Gly Gly Leu

1 5 10 15

Ala Gly Tyr Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro

20 25 30

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Ser Gly His Pro Gly Ser Pro

35 40 45

Gly Ser Pro Gly Tyr Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Gln Ala Gly

50 55 60

Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ile Gly Pro Ser Gly Pro

65 70 75 80

Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ser Pro Gly Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly

85 90 95

Glu Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ile Lys Gly Pro Ala Gly Ile

100 105 110

Pro Gly Phe Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Asp Gly Arg Asn

115 120 125

Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Pro Gly Leu Lys Gly Glu Asn Gly

130 135 140

Leu Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Ala

145 150 155 160

Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Arg

165 170 175

Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly

180 185 190

Pro Pro Gly Thr Ala Gly Phe Pro Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Glu

195 200 205

Val Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Ser Asn Gly Ala Pro Gly Gln Arg

210 215 220

Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly His Ala Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly

225 230 235 240

Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro

245 250 255

Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln

260 265 270

Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly

275 280 285

Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser

290 295 300

Pro Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly Ser Pro Gly Pro Ala

305 310 315 320

Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly

325 330 335

Thr Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn

340 345 350

Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro

355 360 365

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Val

370 375 380

Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly Gly Glu Lys Ala Gly Gly Phe

385 390 395 400

Ala Pro Tyr Tyr His His His His His His

405 410

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> 巨型病毒 4-脯氨酸羟化酶

<400> 2

Met Lys Thr Val Thr Ile Ile Thr Ile Ile Val Val Ile Ile Val Val

1 5 10 15

Ile Leu Ile Ile Met Val Leu Ser Lys Ser Cys Val Ser His Phe Arg

20 25 30

Asn Val Gly Ser Leu Asn Ser Arg Asp Val Asn Leu Lys Asp Asp Phe

35 40 45

Ser Tyr Ala Asn Ile Asp Asp Pro Tyr Asn Lys Pro Phe Val Leu Asn

50 55 60

Asn Leu Ile Asn Pro Thr Lys Cys Gln Glu Ile Met Gln Phe Ala Asn

65 70 75 80

Gly Lys Leu Phe Asp Ser Gln Val Leu Ser Gly Thr Asp Lys Asn Ile

85 90 95

Arg Asn Ser Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Asn Asn Pro Met Val Lys

100 105 110

Pro Ile Phe Glu Asn Ile Cys Arg Gln Phe Asn Val Pro Phe Asp Asn

115 120 125

Ala Glu Asp Leu Gln Val Val Arg Tyr Leu Pro Asn Gln Tyr Tyr Asn

130 135 140

Glu His His Asp Ser Cys Cys Asp Ser Ser Lys Gln Cys Ser Glu Phe

145 150 155 160

Ile Glu Arg Gly Gly Gln Arg Ile Leu Thr Val Leu Ile Tyr Leu Asn

165 170 175

Asn Glu Phe Ser Asp Gly His Thr Tyr Phe Pro Asn Leu Asn Gln Lys

180 185 190

Phe Lys Pro Lys Thr Gly Asp Ala Leu Val Phe Tyr Pro Leu Ala Asn

195 200 205

Asn Ser Asn Lys Cys His Pro Tyr Ser Leu His Ala Gly Met Pro Val

210 215 220

Thr Ser Gly Glu Lys Trp Ile Ala Asn Leu Trp Phe Arg Glu Arg Lys

225 230 235 240

Phe Ser

<210> 3

<211> 1230

<212> DNA

<213> 优化基因序列

<400> 3

atgtacgact cttacgacgt taaatctggt gttgctgttg gtggtctggc tggttacccg 60

ggtccgccgg gtccgccgcc gggtccggct ggtccgccgg gtccgccggg tccgccgggt 120

acctctggtc acccgggttc tccgggttct ccgggttacc agggtccgcc gggtgaaccg 180

ggtcaggctg gtccgtctgg tccgccgggt ccgccgggtg ctatcggtcc gtctggtccg 240

gctggtaaag acggtgaatc tccgggtggt cgtccgggtc gtccgggtga acgtggtctg 300

ccgggtccgc cgggtatcaa aggtccggcg ggtataccgg gcttcccggg tatgaagggt 360

caccgtggtt tcgacggtcg taacggtgaa aaaggtgaaa ccggtgctcc gggtctgaaa 420

ggtgaaaacg gtctgccggg tgaaaacggt gctccgggtc cgatgggtcc gcgtggtgct 480

ccgggtgaac gtggtcgtcc gggtctgccg ggtgctgctg gtgctcgtgg taacgacggt 540

gctcgtggtt ctgacggtca gccgggtccg ccgggtccgc caggtactgc tggcttcccg 600

ggttctccag gtgctaaagg tgaagttggt ccggctggtt ctccgggttc taacggtgct 660

ccgggtcagc gtggtgaacc gggtccgcag ggtcacgctg gtccgccggg tccggttggt 720

ccggctggta aatctggtga ccgtggtgaa tctggtccgg ctggtccggc tggtgctccg 780

ggtccggctg gttctcgtgg tgctccgggt ccgcagggtc cgcgtggtga caaaggtgaa 840

accggtgaac gtggtgctgc tggtatcaaa ggtcaccgtg gtttcccggg taacccgggt 900

gctccgggtt ctccgggtcc ggctggtcag cagggtgcta tcggttctcc gggtccggct 960

ggtccgcgtg gtccggttgg tccgtctggt ccgccgggta aagacggtac ctctggtcac 1020

ccgggtccga tcggtccgcc gggtccgcgt ggtaaccgtg gtgaacgtgg ttctgaaggt 1080

tctccgggtc acccgggtca gccgggtccg ccgggtccgc cgggtgctcc gggtccgtgc 1140

tgcggtggtg ttggtgctgc tgctatcgct ggtatcggtg gtgaaaaagc tggtggtttc 1200

gctccgtact accaccacca ccaccaccac 1230

<210> 4

<211> 726

<212> DNA

<213> 羟化酶Hy726序列

<400> 4

atgaaaaccg ttaccatcat caccatcatc gttgttatca tcgttgttat cctgatcatc 60

atggttctgt ctaaatcttg cgtttctcac ttccgtaacg ttggttctct gaactctcgt 120

gacgttaacc tgaaagacga cttctcttac gctaacatcg acgacccgta caacaaaccg 180

ttcgttctga acaacctgat caacccgacc aaatgccagg aaatcatgca gttcgctaac 240

ggtaaactgt tcgactctca ggttctgtct ggtaccgaca aaaacatccg taactctcag 300

cagatgtgga tctctaaaaa caacccgatg gttaaaccga tcttcgaaaa catctgccgt 360

cagttcaacg ttccgttcga caacgctgaa gacctgcagg ttgttcgtta cctgccgaac 420

cagtactaca acgaacacca cgactcttgc tgcgactctt ctaaacagtg ctctgaattc 480

atcgaacgtg gtggtcagcg tatcctgacc gttctgatct acctgaacaa cgaattctct 540

gacggtcaca cctacttccc gaacctgaac cagaaattca aaccgaaaac cggtgacgct 600

ctggttttct acccgctggc taacaactct aacaaatgcc acccgtactc tctgcacgct 660

ggtatgccgg ttacctctgg tgaaaaatgg atcgctaacc tgtggttccg tgaacgtaaa 720

ttctct 726

Claims

1.一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白，其特征在于，其具有三级结构，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

2.一种参与如权利要求1所述的胶原蛋白表达的羟化酶Hy726基因，其特征在于，其核苷酸序列为为SEQ ID NO:4所示。

3.一种包含如权利要求1所述人源III型胶原蛋白的编码基因和如权利要求2所述的羟化酶Hy726基因的重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230。

4.一种含有如权利要求3所述重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.一种如权利要求1所述的具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白原核表达方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）基因设计和合成

（2）重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建：

c）将重组表达载体pET30-1230和载体pACYCDeut 1-Hy762分别以Nde I 和Xho I双酶切，得到外源片段1230(N-X)和载体骨架pACYCDuet 1-Hy726(N-X)，连接体系转化DH5α感受态细菌，提取得到重组质粒pACYCDuet 1-Hy726-1230；

（3）转化体BL21(DE3) / pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建

（4）诱导表达

6.根据权利要求5所述的具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白原核表达方法，其特征在于，还包括步骤（5）蛋白纯化：使用磁珠对重组蛋白进行纯化。