CN111286511B - 一种生产人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白方法和应用 - Google Patents
一种生产人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种利用植物细胞同时生产人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白的方法，通过基因柔性融合的方法，将密码子经过人为优化的人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白基因序列，通过改造的柔性序列进行连接，创造出全新的融合基因序列，并将之连接到转基因植物载体上，转化农杆菌，获得农杆菌属EHA 105 TEF‑ubi，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2018013。利用该专利菌株，实现了TEF融合基因在植物细胞中高效表达，表达后的人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白，彼此独立，共同存在于细胞中且互不影响，具有各自的生物学活性。该方法生产的产品，具有皮肤修复，美白抗皱等功能，可广泛应用于护肤品中。同时，含有方法生产的蛋白，对表皮细胞具有修复功能，可应用于如溃疡，烫伤等辅助治疗。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用基因枪法转移基因以及基因融合方法的重组TEF融合蛋白，及其制备方法和在美容及医学方面的应用。
背景技术
随着基因工程技术的发展，一些具有生物活性的小分子多肽受到高度重视。人表皮生长因子(human epidermal growth factor, hEGF)，又称尿印胃素，是由53个氨基酸组成的小分子多肽，分子量约为6000道而顿，等电点约为4.6，分子内有三对二硫键，因而对酸、碱、热等理化因素均较稳定。hEGF具有广泛的生物学效应，能极强地促进各种表皮组织生长，在医学上己用于烧烫伤、溃疡、各类创伤、消炎镇痛以及角膜损伤等的治疗。hEGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢，在化妆品领域也有很宽广的应用前景，添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。
灵芝，多孔菌科真菌灵芝的子实体，具有补气安神、止咳平喘、延年益寿的功效。而灵芝免疫调节蛋白是与植物凝集素和免疫球蛋白的结构和免疫功能相似的一类小分子蛋白质。具有抗癌、调节免疫系统、抗衰老、美白等功效。
LZ-8是发现最早的真菌免疫调节蛋白，其结构与功能的研究也比较透彻。此基因在植物中表达不会受到太多的限制，其表达量相对较高，重组真菌免疫调节蛋白也具有生物活性，为其植物基因工程的研究和大规模的生产应用开辟了新路径。
在专利检索中，见有一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法（申请号：201510985414.9）和含表皮生长因子的化妆水（申请号：201810349325.9），在文献检索中，也查有关于人表皮生长因子的研究。文献和专利中，未见有关于人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白融合体的应用，其他研究不一定同时具有医学及美容的功效。
基因融合是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因。基因融合技术已在生物医学研究领域中得到愈来愈广泛的应用：在结构生物学领域，构建的重组融合蛋白可以增加可溶性蛋白的表达，有利于蛋白的纯化，也可用于体外实验，研究蛋白的功能和活性；在生物工程领域中可以用于筛选和生产抗体、多功能酶工程、特定功能的蛋白（特异性靶基因的蛋白）。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种融合蛋白基因TEF，其序列为SEQ ID NO.1所示。该基因具有普遍适用性，且特异性强、表达的重组蛋白量高，且更具有活性。
本发明另一个目的是在于提供了一种含有融合蛋白基因TEF的重组农杆菌基因工程菌，申请人于2018年1月9日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，1月25日监测完毕，菌株合格。保藏地址：中国武汉，武汉大学，分类命名：Agrobacterium sp. EHA 105TEF-ubi，农杆菌属EHA 105 TEF-ubi, 保藏编号：CCTCC NO: M2018013，通过上述方法获得了一种基因工程菌株农杆菌属EHA 105 TEF-ubi。
本发明最后一个目的是在于提供了一种含有融合蛋白基因TEF的重组农杆菌基因工程菌在制备人体美容方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
1. 获得水稻密码子优化的TEF基因。
为了使重组蛋白在水稻愈伤细胞中获得较高的表达，采用了水稻偏爱的遗传密码子，从美国生物技术信息中心（NCBI）基因库里获得了成熟的人表皮生长因子和灵芝免疫调节基因序列信息及其所对应的氨基酸序列，由DNA分析软件（Gene Runner）将上述基因的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，人工合成TEF基因，记为TEF,其序列为SEQ NO.2所示的核苷酸序列。
2. TEF融合基因导入转基因载体，构建植物转基因载体并转化农杆菌。
将上述目的片段TEF与转基因载体ACT（本实验室留存）通过BamHI酶切位点相联（T4 DNA连接酶(NEB公司购买)，16 ℃，连接12 h，转化大肠杆菌TP10感受态细胞中，经PCR鉴定正反向。将插入正确的TAT-sVP7-ACT导入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105。
一种重组农杆菌基因工程菌株，其特征在于，该菌株为重组基因工程菌株Agrobacterium sp. EHA 105 TEF-ubi，农杆菌属EHA 105 TEF-ubi, CCTCC NO:M2018013。
该菌株有以下特征，最适生长温度为26 ℃，菌落边缘整齐，表面湿润、光滑、呈白色不透明。培养基：YEB培养基配方：1 L溶液中，蛋白胨：5.0 g；酵母提取物：1.0 g；牛肉膏：5.0 g；蔗糖：5.0 g；MgSO4·7H2O：0.5 g；再加入16.0 g Agar(琼脂)。其培养基的最适pH7.2，培养温度25-31 ℃，但最适培养温度28 ℃，卡那霉素抗性，好氧性菌株。
一种含有融合蛋白基因TEF的重组农杆菌基因工程菌在制备人体美容方面的应用，其应用过程是。
利用农杆菌介导的转化方法，经共培养和抗性筛选，获得大量的转基因水稻愈伤细胞系，再经继代，GUS显色和PCR分子鉴定，获得了26个水稻转基因愈伤细胞系。从每个水稻愈伤细胞系中取出一部分材料，利用蛋白质检测技术——酶联免疫（ELISA）试剂盒（武汉博士德公司）检测技术，筛选高表达重组TEF的转基因愈伤细胞系。
高表达重组TEF的水稻转基因愈伤细胞系，经NB和N6培养基进行交替培养，收获水稻转基因愈伤细胞，经冻干机冻干，即为美容产品，可以直接或拌水敷皮肤，人体皮肤吸收后，促进细胞的新陈代谢，产生了活力，达到美容的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点。
1. 本发明利用基因工程的方法，利用水稻愈伤组织细胞作为载体，借助植物转基因的技术，实现在水稻愈伤组织细胞中高效表达人表皮生长因子与Lz-8的融合蛋白，并加以直接利用，供美容与医学使用，从而简化了重组蛋白的纯化工序，克服了因表达体系不同而引起的蛋白糖苷化修饰的不同。
2. 本发明提供的TEF融合蛋白，可用于生产护肤品，具有皮肤修复、美白抗皱等功能，还可用于医学治疗，如皮肤烧伤、肠胃修复等。该重组融合蛋白，不仅特异性好，表达量高，并且使用方便，实用性强，成本低，可高效规模化制备，具有广阔的应用前景。
3. 本项目的生产的重组融合蛋白，适用范围广泛，使用时混合，水溶，加入，无需防腐剂，使用安全方便，且活性强，可以常温存放，减少了需低温存放和低温运输的烦琐和费用。区别于一般的重组融合蛋白，需人工注射或添加防腐剂，使用不方便和不安全。
本发明的创新点。
1. 将人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白基因进行融合，有意识的基因合成和创造新型基因。
2. 人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白之间是柔性连接，彼此之间保持空间构型，相互之间不受影响。
3. 植物表达的外源蛋白，可以常温保存，活性强。
4. 常温分别保存，使用时，混合，水溶，加入，无需防腐剂。
5. 既可以用于生产护肤品具有皮肤修复、美白抗皱的功能，也可在医学上的应用如溃疡，烫伤，免疫系统紊乱等的治疗。
附图说明
图1为TEF基因的合成电泳示意图。
图1中：M，DL2000分子标准；1，TDS与EF序列片段；2，LZ-8与TAT基因融合的片段；3，TEF（即TDS-EF-LZ-8-TAT ）融合片段。
图2为TEF的转基因载体TEF-ubi的构建。
图2中：M，DL5000分子标准；1，TEF基因片段；2，TEF-ubi质粒经BamHI酶切。
图3为TEF在不同水稻愈伤细胞株系中的Western blot检测。
图3中：M，蛋白分子标准；C1，LZ-8原核融合蛋白；C0，转空载体的水稻愈伤细胞系提取的总蛋白与LZ-8抗体的Western blot；1-7，转TEF的水稻愈伤细胞系提取的总蛋白与LZ-8抗体的Western blot。
图4为TEF融合表达蛋白的植物材料使用效果。
a, 使用前； b, 使用后。
具体实施方式
本实验中所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W. 拉塞尔等主编。
实施例1：融合基因TEF的制备。
1）从美国生物技术信息中心（NCBI）基因库里获得了的表皮生长因子EF（GenBank:M26695.1）和LZ-8 （GenBank：M58032.1）所对应的编码基因核苷酸序列信息，由DNA分析软件（Gene Runner）将EF和LZ-8基因的编码基因核苷酸序列信息转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，同时，将TDS与密码子优化后的EF进行融合成新基因，记为TGF；将密码子优化后的LZ-8与TAT进行融合成新基因，分别将序列信息送至南京金斯瑞生物科技公司进行人工合成。经密码子优化后的融合基因的核苷酸序列改变了23.5%，遗传密码改变了74.5%。
2）TGF与LZ-8的柔性融合。
PCR反应的总体积为50 μl。PCR扩增条件为：热启动（94 ℃，5 min），继续进行35个循环，每一循环的程序为94 ℃，30 sec；56 ℃，30 sec；72 ℃，30 sec，最后一个延伸反应（72 ℃，5 min）。取扩增产物5 μl在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后，紫外灯下观察，拍照。扩增产物用PCR纯化试剂盒纯化。
实施例2：TEF融合基因导入转基因载体，构建植物转基因载体。
将上述目的片段TEF与实验室保存的转基因载体ubi，通过BamHI酶切位点相联，T4DNA连接酶(NEB公司购买)，16 ℃，连接12 h，转化大肠杆菌TP10感受态细胞中，经PCR鉴定正反向。将插入正确的TEF-ubi导入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105。
实施例3：构建植物转基因载体导入农杆菌。
将鉴定方向正确的TEF-ubi通过电激转化到农杆菌EHA105。电击议的实验参数为：2.5 KV，电泳冲25 µF，电阻400欧。
实施例4：农杆菌与水稻愈伤组织细胞进行共培养、筛选和继代。
A．愈伤组织的诱导。
1. 剥去种子的外颖、内颖，选择成熟饱满的水稻世锦B(SJB种子，装入50 ml离心管。
2. 蒸馏水30 ml清洗3次，70%乙醇浸泡2 min，蒸馏水清洗3次，再用0.15% HgCl2浸泡15-20 min，同时100 rpm振荡。
3. 在无菌台打开离心管，倒出HgCl2，用无菌水清洗种子4、5次后，把种子倒在灭菌的滤纸，放置约1 h。
4. 将种子置入N6固体培养基（10粒/25 ml/瓶），种胚朝上或接触培养基，28 ℃，暗培养4周。
5. 观察诱导的愈伤，把淡黄色、致密的胚性愈伤与小盾牌分离后，转入新的N6，继代培养2周。
B．前培养。
选择致密、相对干燥的胚性愈伤转移至新的N6培养基上，28 ℃下暗培养2 d。
C．农杆菌的培养和悬浮。
1. 将适量农杆菌涂布接种在含有相应抗生素的LB固体培养基上，对于EHA105，28℃下暗培养36 h即可。
2. 向50 ml离心管加入30 ml 1/2 N6和适量的AS。然后，取灭菌小勺刮取农杆菌，用勺背面将菌体贴在管壁轻轻拍散，使细菌悬液的OD600达到0.8～1.0。
D．感染和共培养。
1. 感染：把经过前培养的愈伤集中至一个平皿，一次性转入菌液中，轻轻转动管子使菌液均匀分布，感染时间约15－25 min。
2. 共培养：将菌液倒出，把愈伤在无菌滤纸上放置2 h，保证菌液被吸干，接至1/2N6AS中，20 ℃，暗培养1.5-2 d。
E．农杆菌的去除。
1. 将共培养的愈伤装入50 ml离心管，用无菌水清洗3次以上，至液体比较清亮。
2. 最后一次倒出无菌水，加入含有头孢霉素（500 mg/L）的 N6液体培养基，于100rpm下，振荡15-20 min，重复2-3次。
将愈伤倒在无菌滤纸上吸干2 h以上。
F．愈伤组织的筛选。
1. 将干燥愈伤转入含有头孢霉素（250 mg/L ）的N6培养基中，28 ℃暗培养7-10d。
2. 将没有被农杆菌污染的愈伤转入含有头孢霉素（250 mg/L ）和潮霉素（50 mg/L）的N6培养基中（对于超量表达载体）或含有头孢霉素（250 mg/L ）和G418（25 mg/L）的N6培养基中（对于转基因沉默载体），28 ℃暗培养15～20 d。
3. 将愈伤转入仅含有潮霉素（50 mg/L）的N6培养基中（对于超量表达载体）或含有G418（50 mg/L）的N6培养基中（对于转基因沉默载体），28 ℃暗培养15～20 d。
4. 再一次将愈伤转入仅含有潮霉素（50 mg/L）的N6培养基中（对于超量表达载体）或含有G418（50 mg/L）的N6培养基中（对于转基因沉默载体），28 ℃暗培养15～20 d。
实施例5：外源融合蛋白的表达量检测和高表达水稻愈伤组织细胞系筛选。
取每个水稻愈伤组织细胞系中的部分组织块，采用ELISA试剂盒（从武汉博士德生物工程公司购买）进行外源融合蛋白量的测定。
转基因的水稻愈伤细胞系经继代后，取0.1 g的水稻愈伤材料，用100 ul的蛋白提取液提取，取20 ul的上样在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过蛋白质印迹转膜并进行Westernblot，可检测到LZ-8带，后经酶联免疫检测，其表达量为1.54%。
最终获得了一种高表达重组TEF的水稻转基因愈伤细胞系。
实施例6：水稻转基因愈伤组织的扩大培养和胚性改良。
选取高表达TEF融合蛋白的水稻愈伤组织细胞系进行扩大培养，为改善其胚性，采用N6和NB培养基交替进行继代。即是将高表达TEF融合蛋白的水稻愈伤组织细胞系先继代在N6培养基上，等愈伤生长14 d后，再将其在NB上进行继代培养；再等愈伤生长14 d后，又用N6培养基上进行继代，依此类推，这样可以有效地改善了愈伤组织细胞的胚性和愈伤组织细胞状态。
实施例7：转基因水稻愈伤的加工。
将采集的水稻转基因愈伤，放在培养皿中进行冷冻干燥。
实施例8：TEF的生物学活性研究。
Balb/c3T3细胞（购于南京三生生物技术有限公司）用含10%小牛血清（购于Invitrogen生物科技有限公司）的DMEM培养基（完全培养基）（购于Invitrogen生物科技有限公司）传代培养，用完全培养基稀释至5×104/ml，以每孔100 ul加入到96孔细胞培养板中，37°C培养24 h，用含1 %小牛血清的DMEM培养基（基础培养基）饥饿培养12 h，加入系列稀释的含纯化的hEGF样品和hEGF标准品的培养基（每个浓度水平做4个重复）（购于Sigma公司），37 °C继续培养48 h，加10ul的CCK-8（购于北京拜尔迪诊断技术有限公司）溶液，37 °C作用2 h后测定600 nm波长的吸收度值（0D）。结果显示重组的hEGF与标准品活性相当。
实施例9：转基因水稻愈伤直接用于人体美容。
利用农杆菌介导的转化方法，经共培养和抗性筛选，获得大量的转基因水稻愈伤细胞系，再经继代，GUS显色和PCR分子鉴定，获得了26个水稻转基因愈伤细胞系。从每个水稻愈伤细胞系中取出一部分材料，利用蛋白质检测技术——酶联免疫（ELISA）试剂盒（武汉博士德公司）检测技术，筛选高表达重组TEF的转基因愈伤细胞系。
高表达重组TEF的水稻转基因愈伤细胞系，经NB和N6培养基进行交替培养，收获水稻转基因愈伤细胞，经冻干机冻干，即为美容产品，可以直接或拌水敷皮肤，人体皮肤吸收后，促进细胞的新陈代谢，产生了活力，可舒缓肌肤，具有卓效的强韧修护功效，可强韧皮肤屏障，并且可以淡化细纹干纹，恢复肌肤弹性，以达到美容的效果。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 一种生产人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白方法和应用
<141> 2019-12-20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 627
<212> DNA
<213> 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
<400> 1
ggatccgcct gcagctcgaa gaagtccaag cactgcggcg gcagcggcag cggcagcgcc 60
aactccgact cggagtgccc actcagccac gacggctact gcctgcacga cggagtctgc 120
atgtacatcg aggcactgga caagtacgcg tgcaactgcg tggtcggcta catcggagag 180
cgctgccagt accgagacct caagtggtgg gagctccgtc aactgttgaa ttttgacctt 240
cttaagcttg cgggagacgt cgagtccaac cctgggcctt ccgacactgc cttgatcttc 300
aggctcgcct gggacgtgaa gaagctctcg ttcgactaca ccccgaactg gggccgcggc 360
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agcgacggct cgcagaaggt caacttcctc gagtacaact ccgggtatgg catagcggac 540
acgaacacga tccaggtgtt cgttgtcgac cccgacacca acaacgactt catcatcgcc 600
cagtggaact ctgagaaaga tgagcta 627
<210> 2
<211> 209
<212> PRT
<213> 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
<400> 2
Gly Ser Ala Cys Ser Ser Lys Lys Ser Lys His Cys Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Ala Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly
20 25 30
Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys
35 40 45
Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr
50 55 60
Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Ser Asp Thr
85 90 95
Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys Leu Ser Phe Asp
100 105 110
Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn Phe Ile Asp Thr
115 120 125
Val Thr Phe Pro Lys Val Leu Thr Asp Lys Ala Tyr Thr Tyr Arg Val
130 135 140
Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser Tyr Ala Val Glu
145 150 155 160
Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr Asn Ser Gly Tyr
165 170 175
Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val Val Asp Pro Asp
180 185 190
Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn Ser Glu Lys Asp Glu
195 200 205
Leu
Claims (6)
1.一种TEF融合基因，其特征在于，所述TEF融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的TEF融合基因编码的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3.含有权利要求1所述融合基因的重组农杆菌(Agrobacteriumsp.) EHA 105 TEF-ubi，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO: M2018013。
4.根据权利要求3所述的重组农杆菌(Agrobacteriumsp.) EHA 105 TEF-ubi，将重组农杆菌(Agrobacteriumsp.) EHA 105 TEF-ubi和植物愈伤细胞进行共培养和筛选，获得含有TEF融合基因的阳性植物细胞，并进行继代扩大培养，获得大量含重组蛋白的植物细胞，所述的植物细胞为水稻细胞。
5.根据权利要求4所述的重组农杆菌(Agrobacteriumsp.) EHA 105 TEF-ubi，含有TEF融合基因的阳性植物细胞能同时生产人表皮生长因子和灵芝免疫调节蛋白，人表皮生长因子和灵芝免疫调节蛋白在植物细胞内融合表达，表达后利用自身所带的切割肽序列，自主切割形成人表皮生长因子和灵芝免疫调节蛋白，各自具有自己的生物学活性。
6.权利要求2所述的重组蛋白在制备美容和化妆品中的应用。
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