CN111206050A - 过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法。NK细胞分离与激活，构建hACE2过表达载体，电转将hACE2过表达载体转进NK细胞，采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞，即得过表达hACE2基因的NK细胞制剂。本发明首先确定了能够实现特异性、高效识别新冠状病毒和SARS病毒靶位点的人hACE2基因序列，而后通过质粒电转染的方法导入NK细胞，利用免疫磁珠筛选hACE2阳性细胞群及测序鉴定，获得过表达hACE2基因的NK细胞。本发明过表达hACE2基因的NK细胞制剂的生产，大大提升了NK细胞消除以hACE2为受体的病毒能力。

Description

过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法。
背景技术
NK细胞来源于骨髓造血干细胞，其发育成熟依赖于骨髓及胸腺微环境，其表面标志主要有CD3、CD56、CD16等。通常情况下，体内的NK细胞多处于休眠状态，信号因子激活后，NK细胞无须抗原刺激和MHC的限制可非特异直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用，构成了机体第一道免疫杀伤防线。NK细胞在体外和动物实验中均已验证对多种突发病毒感染疾病有很好的抑制和消除能力，包括SARS、H5N1、埃博拉、登革热以及HIV等。
ACE2是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的关键分子，也是包括肺泡上皮细胞在内的多种人体细胞表面表达的重要分子之一。2003年，hACE2被鉴定为SARS冠状病毒的功能性受体。hACE2分子也是ncov-2019病毒感染的关键分子，通过结合hACE2分子有可能影响ncov-2019病毒感染人体细胞的过程。
目前，亟需提供一种可以与新冠状病毒、SARS病毒等各种病毒结合，进而杀死病毒，提高对病毒的清除效率的过表达hACE2基因的NK细胞制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，制得的过表达hACE2基因的NK细胞制剂能让NK细胞更精准的与包括新冠状病毒、SARS病毒在内的可以与hACE2蛋白结合的各种病毒进行结合，进而杀死病毒，大大提高对病毒的清除效率。
本发明所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)NK细胞分离与激活
NK细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；
(2)构建hACE2过表达载体
①引物设计和合成：根据hACE2 mRNA序列设计引物；
②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；
③采用RT-PCR扩增hACE2基因；
④将hACE2基因与pEGFP-N1质粒片段连接得到hACE2过表达载体pEGFP-N1-hACE2；
(3)电转将hACE2过表达载体转进NK细胞
NK细胞中加入电转液和hACE2过表达载体进行电转，电转结束后，继续培养，收集细胞；
(4)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞
电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离，分离所得hACE2阳性NK细胞扩大培养，即得过表达hACE2基因的NK细胞制剂。
步骤(2)中所述的引物如下：
ACE2F：5’-catgaagcctatgtcaagctcttcctggctcc-3’
ACE2R：5’-catggaattcctaaaaggaggtctgaacatc-3’。
步骤(3)中所述的电转液组成如下，以体积百分比计：
无钙镁PBS 90％
无血清培养基RPMI 1640 10％；
以无钙镁PBS和无血清培养基RPMI 1640的总体积为100％计，EDTA加入量为30g/L，蔗糖加入量为200mmol/L。
步骤(3)中所述的电转液的制备方法是将无钙镁PBS与无血清培养基RPMI 1640混合，然后加入EDTA和蔗糖，溶解后再过滤除菌，即得。
步骤(3)中所述的继续培养时间为48-72h。
步骤(4)中所述的电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是电转结束后收集的细胞用PBS清洗两次，带有hACE2抗体的磁珠结合表达hACE2的NK细胞，分离得到hACE2阳性NK细胞。
步骤(4)中所述的电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离具体是收集含有不超过6×106个细胞的200μl悬液，按1∶20体积比加入兔抗人hACE2抗体，4℃冰箱孵育1h；之后按照20μl小鼠抗兔IgG1磁珠对应80μl细胞悬液比例，4℃冰箱孵育15min，PBS缓冲液清洗2次后制备1ml细胞悬液备用；将PBS缓冲液湿润后的MS分选柱子放入分选器中，加入制备好的细胞悬液，hACE2阳性的NK细胞会通过物理磁场力吸附在分选柱子中，hACE2阴性NK细胞会直接流出分选柱子。分离所得的hACE2阳性NK细胞扩大培养，可以直接应用，也可以液氮冻存备用。
本发明采用磁珠筛选所需的可用于新冠状病毒、SARS等识别hACE2蛋白的病毒病的预防和治疗的NK细胞。
本发明提供一种适用于哺乳动物细胞表达并能镶嵌于细胞膜的hACE2基因表达载体及相应hACE2表达阳性NK细胞的生产制备方法。本发明分离培养对数生长期的NK细胞，而后克隆人hACE2全基因，链接入哺乳动物细胞表达载体pEGFP-N1，转入NK细胞，通过磁珠筛选方法获得hACE2基因表达阳性的NK细胞。本发明的hACE2阳性NK细胞可以竞争性结合识别hACE2蛋白的病毒，结合后不经保护机体细胞免于病毒损伤，还能提高NK细胞清除病毒的能力，为进一步研究该细胞在新冠状病毒和SARS方面的治疗和预防奠定了基础。
本发明的有益效果如下：
hACE2基因自然条件下不表达于NK细胞，本发明提供了一种过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法。冠状病毒类会借助hACE2膜蛋白侵染其他功能细胞而造成疾病，作为机体免疫的第一道防线的NK细胞在自然条件下不会被侵染，而能杀灭病毒。将hACE2蛋白过表达于NK细胞膜后，NK细胞更有利于捕获病毒并消灭它，会极大地避免病毒对机体功能细胞的侵染。
本发明首先确定了能够实现特异性、高效识别新冠状病毒和SARS病毒靶位点的人hACE2基因序列，而后通过质粒电转染的方法导入NK细胞，利用免疫磁珠筛选hACE2阳性细胞群及测序鉴定，获得过表达hACE2基因的NK细胞。本发明过表达hACE2基因的NK细胞制剂的生产，大大提升了NK细胞消除以hACE2为受体的病毒能力。
附图说明
图1是A549细胞总RNA电泳图。
图2是hACE2基因PCR电泳图。
图3是hACE2过表达载体示意图。
图4是NK细胞上的hACE2蛋白定位图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1
(1)NK细胞分离与激活
NK细胞培养：按照赛业生物NK细胞激活培养试剂盒(HUXNK-9006A)操作说明进行，获得对数生长期的NK细胞备用。
(2)构建hACE2过表达载体
①引物设计和合成
根据ncbi报道的人hACE2 mRNA序列，序列号为AY623811。用DNAstar软件设计针对hACE2编码区的上下游引物，在hACE2基因N-端和C-端分别引入Hind III和EcoRI限制性酶切位点，并在两端添加4个保护碱基catg。hACE2的正向引物ACE2F：5’-catgaagcctatgtcaagctcttcctggctcc-3’，反向引物ACE2R：5’-catggaattcctaaaaggaggtctgaacatc-3’，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
②总RNA的提取
收集足量的生长状态良好的人肺癌细胞A549细胞，根据Invitogen Trizol试剂盒说明书提取细胞的总RNA，加入1mL Trizol试剂，反复吹打，待细胞彻底消化后，转入1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，反复颠倒数次，室温放置3min；4℃12000g离心15min；上清转移至新的1.5mL离心管中，加入500μL乙醇，混匀，室温放置10min；4℃12000g离心10min；去除上清，加入1mL75％乙醇，颠倒混匀；4℃7500g离心5min；弃上清，待残留的乙醇挥发完全后，加入100μL 1％DEPC水溶解总RNA。用核酸电泳法和紫外分光光度计检测其A260/A280的比值，以考察提取的总RNA的完整性和纯度。提取的总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳检测显示3条RNA条带，即28S、18S、5S，见图1。其核酸紫外分光光度计检测A260/A280的比值<2.0。该实验结果证实提取总RNA完整性较好，且纯度较高。
③采用RT-PCR扩增hACE2基因
根据天根生化RT-PCR试剂盒使用说明，取1μg提取的总RNA进行反转录。利用设计的特异性引物在最佳扩增条件下进行PCR扩增，条件如下：以反转录产物cDNA为模板，PCR条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，扩增30个循环，72℃补平10min。扩增得到的hACE2片段为一条明亮的DNA条带，大小为2200bp，见图2。
④hACE2过表达载体的获得
将扩增后的hACE2目的条带，进行凝胶回收后，用Hind III和EcoR I对该目的基因和pEGFP-N1质粒进行双酶切。用凝胶回收试剂盒回收后，通过T4 DNA连接酶4℃条件下将目的基因和载体pEGFP-N1的双酶切产物连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，将转化子涂布到带有Kana抗性的LB平板上。在涂布带有pEGFP-N1-hACE2重组子质粒的E.coli DH5ɑ平板上长出许多的菌落，从而获得适合在哺乳动物细胞内表达的hACE2过表达载体pEGFP-N1-hACE2，见图3。
(3)电转将hACE2过表达载体转进细胞
收集NK细胞用PBS清洗一遍，加入电转液400μl(配方：无钙镁PBS 90％(V/V)，EDTA30g/L，无血清培养基RPMI 1640 10％(V/V)，蔗糖200mmol/L)重悬至终浓度5-10×106cell/ml，然后加入pEGFP-N1-hACE2重组子质粒至终浓度为40μg/ml。0.4cm电击杯，280V电压，电击20ms。电转染结束后加入预热的RPMI-1640全培养基置于二氧化碳培养箱中继续培养，48小时后，收集细胞。
(4)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞
收集含有不超过6×106个细胞的200μl悬液，按1∶20体积比加入兔抗人hACE2抗体，4℃冰箱孵育1h；之后按照20μl小鼠抗兔IgG1磁珠对应80μl细胞悬液比例，4℃冰箱孵育15min，PBS缓冲液清洗2次后制备1ml细胞悬液备用；将PBS缓冲液湿润后的MS分选柱子放入分选器中，加入制备好的细胞悬液，hACE2阳性的NK细胞会通过物理磁场力吸附在分选柱子中，hACE2阴性NK细胞会直接流出分选柱子。分离所得的hACE2阳性NK细胞扩大培养，可以直接应用，也可以液氮冻存备用。
(5)hACE2在NK细胞上的表达定位观察
hACE2阳性NK细胞悬液1×106个1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞。加入300μL4％多聚甲醛，室温下固定30min。吸取多聚甲醛，PBS洗涤3次，每次洗涤时间不少于5min，加入300μL渗透液(含有1％Trition-X100、5％山羊血清的PBS)，37℃放置30min。吸取渗透液，PBS洗涤3次，每次洗涤时间不少于5min，加入300μL封闭液(含有5％山羊血清的PBS)。37℃放置1h。吸取封闭液，PBS洗涤细胞3次，每次洗涤不少于5min。将按抗体说明书稀释的兔抗人hACE2抗体，每孔加入300μL，孵育细胞4℃过夜。吸取一抗，PBS洗涤3次，每孔中加入300μL按一定比例稀释(1:10000)的兔抗鼠IgG-Cy3的二抗，37℃孵育1h。吸取二抗，PBS洗涤3次，每次洗涤时间不少于5min，加入适量抗荧光猝灭封片液，在奥林巴斯荧光显微镜下进行观察拍照，结果见图4。
序列表
<110> 王清路，许晓松
<120> 过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
catgaagcct atgtcaagct cttcctggct cc 32
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
catggaattc ctaaaaggag gtctgaacat c 31

Claims (7)

1.一种过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)NK细胞分离与激活
NK细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；
(2)构建hACE2过表达载体
①引物设计和合成：根据hACE2 mRNA序列设计引物；
②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；
③采用RT-PCR扩增hACE2基因；
④将hACE2基因与pEGFP-N1质粒片段连接得到hACE2过表达载体pEGFP-N1-hACE2；
(3)电转将hACE2过表达载体转进NK细胞
NK细胞中加入电转液和hACE2过表达载体进行电转，电转结束后，继续培养，收集细胞；
(4)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞
电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离，分离所得hACE2阳性NK细胞扩大培养，即得过表达hACE2基因的NK细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的引物如下：
ACE2F：5’-catgaagcctatgtcaagctcttcctggctcc-3’
ACE2R：5’-catggaattcctaaaaggaggtctgaacatc-3’。
3.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的电转液组成如下，以体积百分比计：
无钙镁PBS 90％
无血清培养基RPMI 1640 10％；
以无钙镁PBS和无血清培养基RPMI 1640的总体积为100％计，EDTA加入量为30g/L，蔗糖加入量为200mmol/L。
4.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的电转液的制备方法是将无钙镁PBS与无血清培养基RPMI 1640混合，然后加入EDTA和蔗糖，溶解后再过滤除菌，即得。
5.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的继续培养时间为48-72h。
6.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是电转结束后收集的细胞用PBS清洗两次，带有hACE2抗体的磁珠结合表达hACE2的NK细胞，分离得到hACE2阳性NK细胞。
7.根据权利要求6所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是收集含有不超过6×106个细胞的200μl悬液，按1∶20体积比加入兔抗人hACE2抗体，4℃冰箱孵育1h；之后按照20μl小鼠抗兔IgG1磁珠对应80μl细胞悬液比例，4℃冰箱孵育15min，PBS缓冲液清洗2次后制备1ml细胞悬液备用；将PBS缓冲液湿润后的MS分选柱子放入分选器中，加入制备好的细胞悬液，hACE2阳性的NK细胞会通过物理磁场力吸附在分选柱子中，hACE2阴性NK细胞会直接流出分选柱子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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