CN111471715A - 一种腺病毒载体及其构建方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体包含CXCR4启动子序列或与其至少有80％同源性的序列，和位于所述CXCR4启动子序列下游的人sTRAIL基因序列或与其至少有80％同源性的序列。本发明通过构建CXCR4启动子启动sTRAIL表达的顺反子片段插入腺病毒系统中，此种结构有利于借助CXCR4启动子在乳腺癌细胞中的转录活性调控sTRAIL蛋白的表达，随着腺病毒的复制在肿瘤局部富集sTRAIL蛋白，通过腺病毒的旁观者效应克服肿瘤细胞对sTRAIL的耐受，增强本系统对CXCR4(+)乳腺癌细胞的杀伤作用，进而促进对乳腺癌转移的治疗，并减少对周围正常组织细胞的损伤。

Description

一种腺病毒载体及其构建方法和用途
技术领域
本发明涉及基因治疗领域，特别涉及一种腺病毒载体及其构建方法和用途。
背景技术
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年升高。据调查，近年来，乳腺癌已跃居江西省城市女性居民发病首位，严重威胁着我省乃至全国女性的健康。
尽管目前乳腺癌的预后已得到了很大改善，但乳腺癌发生远处转移的现象仍较为常见。据报道，在接受治疗的早期乳腺癌患者中，20％～50％在5年内会发生远处转移，其中肺转移是乳腺癌最常见的转移部位之一。一旦发生转移，患者的5年生存率仅有大约25％。目前的临床治疗策略对乳腺癌转移的治疗效果不佳，主要是因为缺乏对乳腺癌转移灶的选择性。虽然近年发展的针对HER2的赫赛汀和针对雌激素受体的靶向治疗方案对原发肿瘤具有良好的疗效，但对于转移病灶的疗效却不甚理想，主要是因为上述靶向药物半衰期短，在乳腺癌尤其是乳腺癌的转移病灶局部难以维持有效的治疗浓度，并且临床上均已发现了针对上述药物的耐药现象。因此，寻找新的靶向治疗乳腺癌转移病灶的方案迫在眉睫。
基因治疗是一类新兴的在转录水平实现靶向特异性的治疗方法，其中腺病毒载体由于不需要整合至宿主基因组、具有较好的安全性，且在复制过程中具有溶细胞作用，已成为肿瘤基因治疗中最常用的载体之一。
趋化因子受体CXCR4[Chemokine(C-X-C motif)Receptor 4]是一类G蛋白偶联七次跨膜受体，是近年来发现的在肿瘤细胞中呈特异性高表达的蛋白之一，它与多种肿瘤尤其是乳腺癌的转移密切相关。CXCL12是目前已知的唯一能与CXCR4结合并激活它的天然趋化因子，CXCR4/CXCL12所构成的生物轴系统在生命过程的许多方面均发挥了作用，并与肿瘤的发生、发展、转移及HUMSCs的归巢等密切相关。多项临床研究荟萃分析发现，CXCR4表达水平高的乳腺癌组织具有淋巴结转移比例高、高度分化、进展快等恶性特征，使其成为乳腺癌转移治疗的一个潜在靶点。对类乳腺癌干细胞进行流式分析也发现CD44+CD24-亚群细胞CXCR4的表达更高，并因此具有更强的侵袭性。由此，靶向CXCR4的治疗方案不仅有助于乳腺癌转移的治疗，对于清除乳腺癌干细胞可能也具有积极的意义。
TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)为Ⅱ型跨膜蛋白，是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的一员，能在即使p53突变的情况下，通过激活肿瘤细胞表面的死亡受体而诱导其凋亡，它的特点是可特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有影响，其诱导凋亡的活性主要依赖于TRAIL与功能性死亡受体DR4、DR5的结合后激活细胞内的凋亡信号途径。sTRAIL则是TRAIL分子水解后的胞外区片段，它具有和膜结合型TRAIL相类似的选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，且sTRAIL分子量小，更适于进行基因工程改造，上述特性使得sTRAIL分子成为肿瘤靶向治疗中理想的治疗性蛋白之一。
sTRAIL虽然具有良好的肿瘤选择性，但仍有部分肿瘤细胞对sTRAIL表现耐受，具体表现在乳腺癌方面为：sTRAIL虽可有效诱导乳腺癌高转移细胞MDA-MB-231细胞凋亡，但部分乳腺癌细胞如MDA-MB-361，MCF-7等对sTRAIL诱导的凋亡并不敏感。因此，需要寻找到一种方法来发挥sTRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中sTRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的作用弱并且会产生耐受的问题，提供了一种腺病毒载体及其构建方法和用途。
本发明提供的技术方案为：
一种腺病毒载体，所述腺病毒载体包含CXCR4启动子序列或与其至少有80％同源性的序列，和位于所述CXCR4启动子序列下游的人sTRAIL基因序列或与其至少有80％同源性的序列。
在本发明的一个实施方式中，所述CXCR4启动子序列如SEQ ID No.1所示。
在本发明的一个实施方式中，所述人sTRAIL基因序列如SEQ ID No.2所示。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述腺病毒载体还可以包括：
a)增强复制的基因；
b)自杀基因或增强细胞杀伤的干扰核酸；
c)使细胞对细胞凋亡或用其他药物治疗更敏感的基因；
d)用于调节肿瘤微环境的基因；和/或
e)报告基因。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述腺病毒载体为溶瘤腺病毒载体，更优选地，上述溶瘤腺病毒载体为用于杀灭乳腺癌细胞的腺病毒载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述腺病毒载体的构建方法，将所述CXCR4启动子序列或与其至少有80％同源性的序列，和人sTRAIL基因序列或与其至少有80％同源性的序列按顺序插入腺病毒骨架质粒中，经包装、纯化后得到所述腺病毒载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种组合物，所述组合物包含上述腺病毒载体，以及药学上可接受的载体。
上述腺病毒载体可以被变化成任意合适的形式，例如，包装成病毒颗粒的形式。这些都视为包含在本发明的保护范围之内。其给药方式也可以为任意合适的方式，例如，注射剂，如瘤内注射、静脉注射等。所述药学上可接受的载体中还可以包括常规的添加剂，如，赋形剂、稳定剂、防腐剂等。
本发明的另一个方面，是提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述腺病毒载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞包含上述腺病毒载体。
所述细胞可以为哺乳动物细胞。所述细胞可以是分离的细胞，它们不存在于活体动物中。哺乳动物细胞可以为包括来自人、小鼠、大鼠、仓鼠、猴子、兔子、驴、马、绵羊、牛和猿的任何器官或组织的细胞。优选地，所述细胞是人细胞。所述细胞可以是原代或永生化细胞。
本发明的另一个方面，是提供了腺病毒载体、上述组合物、上述核酸分子或上述细胞在制备治疗乳腺癌的药物中用途，优选地，所述乳腺癌为转移性乳腺癌。
本发明的有益效果为：
本发明通过构建CXCR4启动子启动sTRAIL表达的顺反子片段插入腺病毒系统中，此种结构有利于借助CXCR4启动子在乳腺癌细胞中的转录活性调控sTRAIL蛋白的表达，随着腺病毒的复制在肿瘤局部富集sTRAIL蛋白，通过腺病毒的旁观者效应克服肿瘤细胞对sTRAIL的耐受，增强本系统对CXCR4(+)乳腺癌细胞的杀伤作用，进而促进对乳腺癌转移的治疗，并减少对周围正常组织细胞的损伤。
附图说明
图1为本发明实施例中的腺病毒载体的构建示意图；
图2为CXCR4启动子荧光素酶报告载体构建图，其中，A为载体构建示意图；B为GV238荧光素酶报告载体酶切电泳图；C为携带CXCR4启动子的GV238荧光素酶报告质粒阳性克隆鉴定结果图；D为阳性克隆质粒酶切鉴定结果图；阳性克隆经测序鉴定、比对，证实已连接上CXCR4启动子片段(-191～+88)；
图3为CXCR4启动子转录活性鉴定结果图，其中，A为CXCR4启动子在乳腺癌细胞MCF-7中的活性鉴定结果图；B为CXCR4启动子在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的活性鉴定结果图；C为CXCR4启动子在乳腺正常上皮细胞MCF10A中的活性鉴定结果图；上述图中SV40(猴空泡病毒40启动子)为阳性对照；
图4为CXCR4启动子驱动的腺病毒系统对乳腺癌细胞的杀伤活性结果图，其中，A为pAV-CXCR4promoter-sTRAIL-EGFP载体构建示意图；B为200MOI腺病毒感染乳腺癌细胞MDA-MB-231 48h后绿色荧光情况结果图；C为elisa检测腺病毒感染乳腺癌细胞48h后细胞上清sTRAIL的表达情况结果图；D为腺病毒空载体感染乳腺癌细胞72h后凋亡情况结果图；E为pAV-CXCR4promoter-sTRAIL-EGFP腺病毒载体感染乳腺癌细胞72h后凋亡情况结果图。
序列说明
SEQ ID No.1为本发明中CXCR4启动子的核酸序列；
SEQ ID No.2为本发明中人sTRAIL的DNA序列。
具体实施方式
本发明公开了一种腺病毒载体及其构建方法和用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：CXCR4启动子荧光素酶报告基因载体的构建
基因信息
基因名称：CXCR4(NM_003467-promoter(-191-88))
物种：Human
构建示意图如图2的A所示。
1.质粒提取及酶切
1)取冻存的GV238和测序正确T-PCXCR4菌液，以1：10的比例接种于10ml2-YT液体培养基(含氨苄青霉素)，37℃空气浴，并振摇过夜。
2)取3ml细菌培养物，12000rpm离心1分钟，尽量去除上清(分两次离心)。
3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液I(事先已加入RNaseA)，用移液器彻底悬浮细菌沉淀。
4)向离心管中加入250ul溶液II，温和地上下翻转6-8次充分裂解。
5)向离心管仲加入350ul溶液III，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10分钟，用移液器小心将上清转移到吸附柱中，不要吸出沉淀。
6)将吸附柱室温放置2分钟(加入上清)，12000rpm离心1分钟，将收集管中的废液再加入吸附柱，12000rpm再离心1分钟，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回离心管。
7)向吸附柱中加入700ul漂洗液(已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8)向吸附柱中加入500ul漂洗液(已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
9)12000rpm离心2分钟，将吸附柱敞口置于室温数分钟。
10)将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50ul经65℃水浴预热的无菌去离子水，室温放置5分钟，12000rpm离心1分钟。
11)为了增加回收效率，离心管中的液体再加入吸附柱，12000rpm离心1分钟再洗脱一次。
质粒的双酶切：
将回收得到的pGL3-Basic和T-PCXCR4用XhoI和HindIII双酶切，37℃水浴4小时。
50μL反应体系
Figure BDA0002440069300000051
Figure BDA0002440069300000061
将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％)，切下目的片断进行DNA凝胶回收。回收的DNA片断置于-20℃保存，取少许进行连接。鉴定结果如图2的B所示。
2.化学合成的目的基因CXCR4启动子序列
CXCR4启动子序列如下或SEQ ID No.1所示。
GGTACCTCACTACCGACCACCCGCAAACAGCAGGGTCCCCTGGGCTTCCCAAGCCGCGCACCTCTCCGCCCCGCCCCTGCGCCCTCCTTCCTCGCGTCTGCCCCTCTCCCCCACCCCGCCTTCTCCCTCCCCGCCCCAGCGGCGCATGCGCCGCGCTCGGAGCGTGTTTTTATAAAAGTCCGGCCGCGGCCAGAAACTTCAGTTTGTTGGCTGCGGCAGCAGGTAGCAAAGTGACGCCGAGGGCCTGAGTGCTCCAGTAGCCACCGCATCTGGAGAACCAGCGGTCTCGAG
其中，5’端下划线为KpnI酶切位点，3’端下划线为XhoI酶切位点，红色标记为目的序列。
3.携带CXCR4启动子双荧光素酶报告载体PCXCR4-Luc质粒的构建
目的片段的双酶切：
将回收得到的GV238和P-CXCR4用XhoI和Kpn|双酶切，37℃水浴4小时。
50μL酶切反应体系
ddH<sub>2</sub>O 40.5μl
10X buffer 5μl
100×BSA 0.5μl
纯化的DNA质粒(1ug/μl) 2μl
KpnI(20U/μl) 1μl
XhoI(20U/μl) 1μl
Total 50μl
将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％)，切下目的片断进行DNA凝胶回收。
目的片段的胶回收：
将上述酶切产物置于1％琼脂糖凝胶中，以1×TAE为缓冲液进行水平电泳。于紫外光下从凝胶中切出300bp左右的条带，用DNA胶回收试剂盒进行回收：
1)将切下的琼脂糖凝胶块,放入1.5ml离心管中。
2)称量胶块重量，按每1mg琼脂糖加入3ul DR-ⅠBuffer的比例加入DR-ⅠBuffer，均匀混合后75℃水浴加热融化胶块，约6-10分钟，其间间断震摇，使琼脂糖凝胶完全融化。
3)再向上述胶块融化液中加入1/2体积量的DR-ⅡBuffer，均匀混合。将混合溶液移入吸附柱中，12000rpm/min离心1分钟；将收集管中的液体重新加入吸附柱，重复离心一次，弃收集管中滤液。
4)将500μL的Rinse A加入吸附柱中，12000rpm/min离心30秒，弃收集管中滤液。
5)将700μL的Rinse B加入吸附柱中，12000rpm/min离心30秒，弃收集管中滤液。
6)重复步骤5)，12,000rpm/min再离心2分钟。
7)将吸附柱安置于一个新的1.5ml离心管上，室温放置数分钟；在吸附柱膜的中央加入20ul去离子水，室温静置5分钟后，12000rpm离心1分钟洗脱DNA。
8)琼脂糖凝胶电泳，并贮存于-20℃。
回收的DNA片断置于-20℃保存，取少许进行连接。
目的质粒的连接、转化：
将回收产物连入GV238载体：
反应体系为10μL
Figure BDA0002440069300000071
4℃过夜。
连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞：
Figure BDA0002440069300000072
上述混合溶液冰浴5分钟后加入200ulDH5a感受态细胞，轻混匀，冰浴20分钟，再置于室温10分钟，用涂布棒将混合液涂布于氨苄青霉素抗性的2-YT细菌培养板上，37℃恒温培养过夜。
菌液PCR鉴定：
挑取培养板上生长的克隆分别置于1ml 2-YT液体培养基(含氨苄青霉素)中，37℃空气浴，并振摇2小时后取1ul菌液进行PCR反应：
反应体系：
Figure BDA0002440069300000081
菌落PCR反应条件：
以前面合成的CXCR4启动子基因片段为模板，以P1：GGTACCTCACTACCGACC；P2：CTCGAGGCCGCTGGTTCT为上下游引物(带下划线部分为KpnI/XhoI限制性内切酶位点)。
扩增体系：
Figure BDA0002440069300000082
扩增循环：
94℃变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟。再加入1ulTaqDNA聚合酶，继续72℃延伸20分钟，在扩增产物3’末端加A。
选取菌液PCR阳性菌落的菌液扩大至10ml 2-YT液体培养基(含氨苄青霉素)中，37℃空气浴，并振摇过夜。过夜培养后的菌液按1：1的比例加入细菌冻存液置于-80℃冰箱保存，并取少许送测序(invitrogen)。鉴定结果如图2的C和D所示。
阳性克隆质粒提取：
选取阳性菌落，37℃强烈振荡过夜，至OD600>1.0，离心菌液；采用质粒提取试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)提取。其操作步骤如下：
1)在细菌沉淀中加入100μl悬浮液，振荡至彻底悬浮。
2)加入150μl裂解液，立即温和颠倒离心管5-10次以混匀，室温静置4min。
3)加入150μl中和液，立即温和颠倒离心馆5-10次以混匀。
4)12000g-13000g离心10min，将上清液小心移入吸附柱，静置3min，离心15sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
5)在吸附柱中加入600μl 80％异丙醇，离心15sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复一次本操作。
6)离心1min，将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μlddH2O，室温静置1min后，离心1min，DNA液于-20℃保存备用。
实施例2：双荧光素酶报告基因检测实验
1.目的质粒(GV238-PCXCR4)细胞转染：
(1)取对数生长期的细胞，用无血清、无抗生素的RPMI 1640培养液洗涤两次，调整细胞浓度为3×105/ml，每孔500μl加入24孔板；
(2)将不同浓度的siRNA稀释于Opti-MEM1中(50μl/孔)，轻轻混匀，另外将合适浓度的脂质体Lipofectamine 2000稀释于Opti-MEM1中(50μl/孔)，混合后室温放置5min。5min后将脂质体和siRNA两两混合，轻轻混匀后室温放置20min；
(3)将100μl脂质体-siRNA复合物加入细胞中，摇动培养板轻轻混匀；
(4)37℃培养6-8h后，每孔加入500μl含20％FBS的RPMI 1640培养液；
在转染后的不同时间点收集细胞，进行下一步的检测。
2.荧光素酶报告基因检测：
萤火虫荧光素酶检测缓冲液临用前加入50×萤火虫荧光素酶检测底物，标记为萤火虫荧光素酶检测试剂；
Renilla荧光素酶检测缓冲液临用前加入100×Renilla荧光素酶检测底物，标记为Renilla荧光素酶检测试剂。
1)裂解细胞
对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后用1×PBS润洗2遍后加入细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后
用1×PBS润洗2遍后离心去上清后加入细胞裂解液。于振荡器上室温裂解20min以裂解充分。充分裂解后，10000-15000g离心3-5分钟，取上清用于测定。
2)荧光数值检测
将样本、萤火虫荧光素酶检测试剂、Renilla荧光素酶检测试剂平衡至室温后再进行以下操作：
a)每孔加入100ul裂解上清。
b)每孔加入100ul萤火虫荧光素酶检测试剂，加入20ul样本，用移液器轻柔吹打混匀后读数；以细胞裂解液为空白对照。
c)每孔加入100ul Renilla荧光素酶检测试剂，使用酶标仪震荡混匀后读数。
3)计算荧光比值
在以Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU。根据得到的比值来比较不同样本间目的报告基因的激活程度。
3.结果：
如图2所示，经阳性克隆经测序鉴定、比对，证实已连接上CXCR4启动子片段(-191～+88)。如图3所示，CXCR4启动子转录活性在肿瘤细胞中与阳性对照相当，在正常细胞中与阴性对照相当。
实施例3：腺病毒载体的构建与包装
构建示意图如图1所示。
1.人sTRAIL片段克隆与鉴定
外周血淋巴细胞(PBL)的分离及刺激培养：
1)采正常人外周静脉血约10ml，经抗凝处理后，按1:1的体积比加入淋巴细胞分离液，静置20分钟，1500rpm离心15分钟，用吸管小心吸取白膜层相，尽量不要将其它层面的细胞或液体吸入。
2)将上面收集到的淋巴细胞用PBS洗涤两遍后，以含10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养2天，同时加入IL-2(1000U/ml)刺激细胞。
人外周血淋巴细胞cDNA文库的建立：
提取总RNA：所有用具均经0.1％DEPC水浸泡过夜并高温消毒，液体试剂由消毒后的0.1％DEPC去离子水配置。
1)离心收集5×106经过IL-2刺激的单个核细胞，1-2ml冰冷无菌PBS洗细胞二次。
2)在细胞沉淀中加入1ml Trizol剧烈吹打，室温放置5分钟。
3)加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀，室温静置2-3分钟。
4)12000rpm 4℃离心15分钟。
5)取上清，尽量不要吸取中间的环状白膜，加入500ul异丙醇，混均，-20℃过夜。
6)12000rpm 4℃离心15分钟。
7)弃上清，沉淀加入75％乙醇1ml洗涤，离心12000rpm，5分钟，4℃，洗两次。
8)弃上清，空气中晾干RNA。
9)加入40 ul DEPC水溶解，长期保存在-80℃。
逆转录体系40ul，按常规说明书。
2.人可溶性TRAIL(114aa-281aa)片断的PCR扩增
首先以IL-2刺激48小时的人外周血单个核细胞cDNA文库为模板，扩增出人sTRAIL片断(114-281)，序列如下或如SEQ ID No.2所示：
Figure BDA0002440069300000111
长度为536bp，黑体为与分泌信号与异亮氨酸拉链融合基序列的接头序列，斜体下划线为限制性内切酶NotI和XbaI的识别位点。
然后再以DNA互相“搭桥”拼接的方法，用4条长引物合成分泌信号与异亮氨酸拉链融合基，序列为：
Figure BDA0002440069300000112
Figure BDA0002440069300000121
长度为209bp，斜体下划线为限制性内切酶HindIII的识别位点，斜体为分泌信号序列，下划线为异亮氨酸拉链序列，黑体为与人sTRAIL序列的接头序列。
以上面获得的人单个核细胞cDNA文库为模板，以P3：GCGAGAGGGAA GTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG；P4：ATCG TCTAGA GCGGCCGC TTAGCCAACTAAAAAGGCCCC为上下游引物(带下划线部分为XbaI和NotI限制性内切酶位点，斜体是与P10反向互补序列)。
扩增体系：
Figure BDA0002440069300000122
扩增循环：
94℃变性5分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟。
扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后切下544bp大小的条带用凝胶DNA回收试剂盒进行回收，方法同实施例1。回收的DNA片断置于-20℃保存备用。通过酶切电泳后鉴定无误。
3.pGL3-sTRAIL质粒的构建：
将测序正确的T-sTRAIL质粒和pGL3-Basic质粒，用HindIII和XbaI进行双酶切，37℃水浴4小时。
将双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对T-sTRAIL质粒切胶回收小片断，对pGL3-Basic质粒切胶回收大片断。
连接反应：
反应体系为10μL(pGL3-Basic片断与sTRAIL片断摩尔比控制在1：5-10之间)
连接产物转化大肠杆菌DH5a(氨苄青霉素抗性)，挑取克隆做菌液PCR，阳性的克隆菌培养过夜，小提质粒方法同实施例1。
用获得的质粒进一步酶切鉴定。鉴定结果构建无误。
4.pGL3-PCXCR4-sTRAIL质粒的构建
将鉴定正确的pGL3-sTRAIL质粒和上述测序正确的T-PCXCR4质粒，用HindIII和XhoI进行双酶切，37℃水浴4小时。将双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对T-PCXCR4质粒切胶回收小片断，对线性的pGL3-sTRAIL质粒切胶回收。
连接反应：
反应体系为10μL(pGL3-Basic片断与sTRAIL片断摩尔比控制在1：5-10之间)
连接产物转化大肠杆菌DH5a(氨苄青霉素抗性)，挑取克隆做菌液PCR，阳性的克隆菌培养过夜，小提质粒方法同实施例1。
用获得的质粒进一步酶切鉴定。鉴定结果构建无误。
5.pADPCXCR4-sTRAIL(without poly(A))质粒的构建
将鉴定正确的pGL3-PCXCR4-sTRAIL质粒和腺病毒穿梭质粒pAdTrack，用XhoI和NotI进行双酶切，37℃水浴4小时。将双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对pGL3-PCXCR4-sTRAIL质粒切胶回收小片断，对线性的pAdTrack质粒切胶回收。
连接反应：
反应体系为10μL(pAdTrack片断与PCXCR4-sTRAIL片断摩尔比控制在1：5-10之间)。连接产物转化大肠杆菌DH5a(卡那青霉素抗性)，挑取克隆做菌液PCR(引物选择P4和P9)，阳性的克隆菌培养过夜，小提质粒方法同实施例1。
用获得的质粒进一步酶切鉴定。鉴定结果构建无误。
5.T-poly(A)质粒的构建
以上pAdTrack为模板，以P11：GGGG GCGGCCGC TGGAGTTCGTGACCG CCGC；P12：GGGGGGTACC CGCGTTAAGATACATTGATGAG上下游引物(带下划线部分为NotI和KpnI限制性内切酶位点)。
扩增体系：
Figure BDA0002440069300000131
Figure BDA0002440069300000141
扩增循环：
94℃变性5分钟；94℃变性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃延伸10分钟。再加入1ulTaqDNA聚合酶，继续72℃延伸20分钟，在扩增产物3’末端加A。
扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后切下340bp大小的条带用凝胶DNA回收试剂盒进行回收，方法同2.3.5。回收的DNA片断置于-20℃保存备用。
将回收的片断与pMD19-T simple载体相连，连接反应之后，转化大肠杆菌DH5a(氨苄青霉素抗性)，挑取菌落做菌液PCR，鉴定阳性的克隆保存在-80℃并送测序，具体方法同实施例1。
送去测序鉴定，poly(A)序列应为：
GGGGGCGGCCGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGGGTACCCCCC
鉴定无误。
6.pADPCXCR4-sTRAIL质粒的构建
将测序正确的T-Poly(A)质粒和鉴定正确的pADPCXCR4-sTRAIL(without poly(A))质粒，用NotI-HF和KpnI-HF进行双酶切，37℃水浴4小时。将双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对T-Poly(A)质粒切胶回收小片断，对线性的pADPCXCR4-sTRAIL(without poly(A))质粒切胶回收。
连接反应：
反应体系为10μL(pAdTrack片断与PCXCR4-sTRAIL片断摩尔比控制在1：5-10之间)。连接产物转化大肠杆菌DH5a(卡那青霉素抗性)，挑取克隆小量提取质粒，方法同实施例1。
用获得的质粒酶切鉴定。鉴定结果构建无误。
至此穿梭质粒pADPCXCR4-sTRAIL构建完毕。
7.细菌内同源重组
制备含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞：
1.将含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183冻存液接种于2-YT固体培养基(含链霉素和氨苄青霉素)，于37℃培养过夜。
2.挑取一个单菌落接种于5mL2-YT液体培养基(含链霉素和氨苄青霉素)，37℃空气浴，200rpm振摇培养过夜。
3.将500ul过夜培养的菌液倒入装有50mL 2-YT(含链霉素和氨苄青霉素)的三角烧瓶中，37℃空气浴，200rpm振摇培养至OD600为0.4-0.6。
4.菌液冰浴5分钟，4000rpm4℃离心10分钟收集菌体，将菌体重新悬浮于1/20体积(2.5mL)的4℃预冷TSB液。冰浴10分钟后，直接用于转化，每次转化尽量使用新鲜的感受态细胞。
用线性pADPCXCR4-sTRAIL质粒转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞：
线性pAdPCXCR4-sTRAIL质粒 20μL
Solution A 20μL
无菌去离子水 60μL
上述混合溶液冰浴5分钟后加入200ul含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞(新鲜的)，轻混匀，冰浴20分钟，再置于室温10分钟，用涂布棒将混合液涂布于卡那霉素抗性的2-YT细菌固体培养基上，37℃恒温培养过夜。
8.重组腺病毒质粒的鉴定
从上面所述的固体培养基上挑选数个体积最小的卡那霉素抗性菌落，接种于10mL含有卡那霉素的2-YT液体培养基内，37℃空气浴振荡培养过夜。小量提取质粒方法同上，1％琼脂糖凝胶电泳。根据质粒大小初步鉴定，选取近40Kb大小的质粒，用PCR及PacI酶切的方法鉴定重组子。
PacI酶切反应条件如下：
Figure BDA0002440069300000151
去离子水至补足20μL，37℃水浴4小时，1％琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。正确的重组子命名为pADPCXCR4-sTRAIL。
PCR反应引物及条件:
PCR反应体系：
Figure BDA0002440069300000161
PCR扩增程序：
Figure BDA0002440069300000162
将鉴定正确的重组子质粒取20ng转化大肠杆菌DH5a，方法同2.3.5，挑取阳性单克隆菌落，于10ml2-YT液体培养基(含卡那霉素)37℃振摇过夜，保存于-80℃。
9.腺病毒包装流程
1.准备材料：
腺病毒表达质粒(线性化)；Opti-MEM；lipofectine2000；细胞培养基
2.包装步骤
1)转染前一天接293A细胞到六孔板内，37℃，5％CO2培养至60％～70％融合度；
2)转染前换成1ml新鲜的细胞完全培养基；
3)取两支EP管，分别加入Opti-MEM，其中一管加入腺病毒表达质粒，轻轻颠倒混匀；另一管加入lipofectine2000，轻轻颠倒混匀，室温静置，孵育5min；
4)将上述两管溶液混合，轻轻颠倒混匀，室温静置，孵育20min；
5)将混合液加入到细胞中，37℃，5％CO2培养过夜；
6)转染16h后，换成新鲜的完全培养基；
7)每天观察细胞，看是否出现病变，期间2～3天换一次液。
3.收集粗毒
1)当大部分细胞病变时，拍照，收集细胞和上清，吸管轻轻吹打细胞即可脱落；
2)-80℃冻存，定义该初次包装好的病毒代数为P0。
4.腺病毒的扩增与收集
1)接种HEK293A细胞到T175培养瓶；
2)第二天把T175里的培养上清换成新鲜培养液，将P0反复冻融三次以裂解细胞，释放病毒，4℃，2000g离心10min，每瓶加入一定量的P0代病毒液，轻微晃动混匀，37℃，5％CO2培养2d；
3)待大部分细胞出现病变，收集细胞和培养上清，4℃，1100r离心5min；
4)弃上清，细胞沉淀用HBSS重悬；
5)反复冻融裂解细胞、释放病毒；
6)4℃，2000g离心15min；
7)小心吸取病毒上清液进行分装。
10.重组腺病毒的纯化(按照试剂盒说明)
1)向20ml上一步得到的第三代病毒液中，加入20ulBenzonase(试剂盒自带)。
2)混匀，37℃放置30分钟，目的是消化掉液体中的细胞的核酸。
3)将笑话完毕的病毒液放入Vivaclear Maxi管中500×g离心，直到所有的液体都流过膜。
4)收集流出液，边搅动边加入大约是流出液体积1/9的10×Loading Buffer。搅动的目的是防止局部渗透压过大，损害病毒。
5)用无菌去离子水稀释10×Washing Buffer为1×Washing Buffer，用5ml1×Washing Buffer平衡AdenoPACK 20Maxi离心柱，500×g离心5分钟。
6)将步骤4获得的液体加入平衡好的AdenoPACK 20Maxi离心柱，500×g离心至液体完全流过膜，弃掉流出液。
7)用18ml 1×Washing Buffer清洗离心柱，500×g离心5分钟，弃掉流出液。
8)重复步骤7
9)更换新的无菌收集管，向AdenoPACK20Maxi离心柱膜中央位置，悬空滴加1mlElution Buffer，500×g离心30秒，然后静置10分钟。500×g离心5分钟，收集洗脱液。
10)将洗脱液放入Vivaspin 20超滤离心管，再加入9ml无菌PBS，800×g离心至滤膜上侧约有1ml液体。再加入9ml无菌PBS，800×g离心至滤膜上侧约有1ml液体。
11)用移液器将滤膜上侧液体轻轻吹打数次，吸出回收，分装后置于-80℃保存。
11.重组腺病毒滴度的测定
用50％组织培养感染剂量法(TCID50)来测定腺病毒的滴度，方法参照AdEasySystem说明书。
1)用含2％胎牛血清的无抗生素高糖DMEM培养基准备大约20mL 293A细胞悬液，细胞密度为1×105/mL，用排枪加入2块96孔细胞培养板中，每孔100μL。
2)将纯化好的重组腺病毒储存液用含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基先稀释106倍，然后再按10倍梯度连续稀释10次，最终稀释倍数为107～1016。
3)接种了293A细胞的96孔板每排后两孔作为阴性对照(只加100μL含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基)，前10孔加同一稀释倍数的100μL的腺病毒稀释液，共10排；37℃，5％CO2培养箱常规培养10天。
4)倒置荧光显微镜下观察96孔板，有绿荧光蛋白表达或者出现CPE现象的记做阳性孔。阳性孔所在排的阴性对照必须生长良好，无CPE现象和绿荧光蛋白表达，另外方可认为有效103倍稀释度组10孔必须全部呈现阳性，而1012倍稀释组无1孔出现CPE现象这样方可认为是有效的滴度测定。
5)计算每一稀释度阳性孔占全部10孔的比率，按照公式T＝107+(S-1.2)计算滴度，其中S代表10个稀释度阳性比率之和，T代表重组腺病毒储存液的滴度，单位为PFU/ml。
最后计算出腺病毒的滴度：AdPCXCR4-sTRAIL的滴度约为2.78×1012PFU/ml；AdTrack的滴度约为6.31×1011。
实施例4：细胞凋亡检测
取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞，经腺病毒(pAV-EGFP或pAV-CXCR4promoter-sTRAIL-EGFP，如图4的A所示)感染后(如图4的B所示)，参照AnnexinⅤ/PI双染凋亡试剂盒操作说明书操作。收集细胞制成单细胞悬液，冰预冷的PBS洗两遍后，用100μl Binding Buffer将待测细胞的密度调整为5×105～1×106细胞悬液，5μl FITC-AnnexinⅤ标记液和5μl PI，轻轻混匀。避光室温染色15min，再补充400μl Binding Buffer重悬，流式细胞仪(BD,LSRⅡ)测定各组细胞发生凋亡的百分数。
实验结果如图4的D和E所示，由于腺病毒的旁观者效应，阴性对照组也有部分凋亡细胞，但试验组(PAdPCXCR4-sTRAIL)组乳腺癌细胞凋亡率更高(17.42％vs.30.66％)
实施例5：ELISA检测腺病毒感染乳腺癌细胞上清sTRAIL表达情况
1)取出整盒ELISA kit(保存于4℃冰箱)放在37℃培养箱预热0.5h至常温，将摇床温度调至31℃，转速为150转/min。
2)用已灭菌的MQ H2O，稀释10XHRP wash buffer至1X。
3)取出所需数量的wells，放在96孔底板上，板上可用数字标记好行列，避免出错，准备纸巾，铺8层左右，比底板略大即可。1X HRP wash buffer300ul/well，沿着孔壁缓慢加入，以免破坏杯底的抗体。加完后用手轻微震荡5s，迅速翻转，将液体甩入水池，再在纸巾上拍打，不能太轻，也不能太用力，杯底朝上，尽量将杯内所有液体倒干净，如上重复洗3遍，保证每孔湿润。此后每次加入液体均沿着杯壁缓慢加入，移液枪枪头不可接触杯内液体。加入不同样品时要及时更换移液枪枪头，加入相同液体时，可从不同方向沿杯壁加入，避免污染原管液体。
4)在空白和标准品的wells里，加入20ul Matrix solution。空白对照设置1孔即可，标准品为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625ng/ml六个wells。
5.)在标准品的wells里加入10ul Assay Buffer,在空白和样品的wells中，加入30ul Assay Buffer。
6)在标准品的wells里加入20ul标准品，在样品的wells中，加入20ul处理好的样品。
7)加入Detection Antibody 50ul/well，若孔内有气泡，可用注射器的针头轻轻戳破，但注意不要碰到杯内液体，避免不同孔内污染。盖上贴纸，用手轻轻震荡5s，略混匀，注意不要将液体弹到贴纸上。放入平板摇床，31℃(温度过低会降低反应速率)150转/min，反应2h
8)轻轻揭掉贴纸，防止杯内液体弹出粘在贴纸上，甩掉wells内的液体，并在纸巾上拍打，用1X wash buffer洗3次，300ul每次。最后一次要倒净杯内液体(否则背景很高)。
9)Enzyme solution 100ul/well,轻轻震荡混匀。盖上贴纸，放在平板摇床上，31℃150转/min，反应30min。
10)轻轻移除贴纸，甩掉wells内的液体，用1X wash buffer洗6次，300ul每次，洗完后用酒精喷湿的纸巾将wells的底部擦干净透明，不要留纸屑和水渍，以免影响后来酶标仪的读值。加入第6遍的wash butter后，先不倒掉，保证孔内湿润的情况下，到公共实验室开启酶标仪，确保其可用。再回实验室倒掉孔内液体，并拍打干净。
11)加入Substrate solution 100ul/well，轻轻震荡混匀，盖上贴纸，平放入不透明袋子中，注意平稳不让液体黏在贴纸上，放入在平板摇床上，31℃150转/min，反应15min(孔内液体会变蓝，标准品蓝色随浓度升高而逐渐升高)。(如果颜色过淡，可适当延长时间)。
12)加入Stop solution 100ul/well，明显可见到孔内液体由蓝色变为黄色。加完后轻轻震荡混匀，使其充分反应。在5min内用酶标仪分别在450nm及590nm波长下读吸光度(程序为事先设定好的)。
13)空白值为空白well的450读数减去590读数。其余wells的值为450读值减去590读值，再减去空白值。做出标准曲线后，再用所得公式计算样品中ghrelin的含量。
实验结果如图4的C所示，转染PAdPCXCR4-sTRAIL乳腺癌上清中可检测到sTRAIL蛋白表达，感染腺病毒的乳腺癌细胞培养5天后上清中sTRAIL浓度为12.613ng/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南昌大学第一附属医院
<120> 一种腺病毒载体及其构建方法和用途
<130> None
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 291
<212> DNA
<213> Human
<400> 1
ggtacctcac taccgaccac ccgcaaacag cagggtcccc tgggcttccc aagccgcgca 60
cctctccgcc ccgcccctgc gccctccttc ctcgcgtctg cccctctccc ccaccccgcc 120
ttctccctcc ccgccccagc ggcgcatgcg ccgcgctcgg agcgtgtttt tataaaagtc 180
cggccgcggc cagaaacttc agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga 240
gggcctgagt gctccagtag ccaccgcatc tggagaacca gcggtctcga g 291
<210> 2
<211> 536
<212> DNA
<213> Human
<400> 2
gcgagaggga agtgagagaa agaggtcctc agagagtagc agctcacata actgggacca 60
gaggaagaag caacacattg tcttctccaa actccaagaa tgaaaaggct ctgggccgca 120
aaataaactc ctgggaatca tcaaggagtg ggcattcatt cctgagcaac ttgcacttga 180
ggaatggtga actggtcatc catgaaaaag ggttttacta catctattcc caaacatact 240
ttcgatttca ggaggaaata aaagaaaaca caaagaacga caaacaaatg gtccaatata 300
tttacaaata cacaagttat cctgacccta tattgttgat gaaaagtgct agaaatagtt 360
gttggtctaa agatgcagaa tatggactct attccatcta tcaaggggga atatttgagc 420
ttaaggaaaa tgacagaatt tttgtttctg taacaaatga gcacttgata gacatggacc 480
atgaagccag ttttttcggg gcctttttag ttggctaagc ggccgctcta gacgat 536

Claims (10)

1.一种腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体包含CXCR4启动子序列或与其至少有80％同源性的序列，和位于所述CXCR4启动子序列下游的人sTRAIL基因序列或与其至少有80％同源性的序列。
2.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其特征在于，所述CXCR4启动子序列如SEQ IDNo.1所示。
3.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其特征在于，所述人sTRAIL基因序列如SEQ IDNo.2所示。
4.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体还包括：
a)增强复制的基因；
b)自杀基因或增强细胞杀伤的干扰核酸；
c)使细胞对细胞凋亡或用其他药物治疗更敏感的基因；
d)用于调节肿瘤微环境的基因；和/或
e)报告基因。
5.根据权利要求1-4任意一项中所述的腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体为溶瘤腺病毒载体，所述溶瘤腺病毒载体优选为用于杀灭乳腺癌细胞的腺病毒载体。
6.如权利要求1-5任意一项中所述的腺病毒载体的构建方法，其特征在于，将所述CXCR4启动子序列或与其至少有80％同源性的序列，和人sTRAIL基因序列或与其至少有80％同源性的序列按顺序插入腺病毒骨架质粒中，经包装、纯化后得到所述腺病毒载体。
7.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1-5任意一项中所述的腺病毒载体，以及药学上可接受的载体。
8.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-5任意一项中所述的腺病毒载体。
9.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1-5任意一项中所述的腺病毒载体。
10.如权利要求1-5任意一项中所述的腺病毒载体、如权利要求7所述的组合物、如权利要求8所述的核酸分子或如权利要求9所述的细胞在制备治疗乳腺癌的药物中用途，优选地，所述乳腺癌为转移性乳腺癌。
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