CN111304254A - 过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法。中性粒细胞分离与激活，构建hACE2慢病毒表达载体，慢病毒包装，病毒颗粒侵染中性粒细胞，采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞，即得过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂。本发明制得的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂具有以下优点：一、竞争性的结合病毒，防止病毒对机体关键组织中细胞的侵害杀灭；二、与病毒结合后可以招募其他中性粒细胞或免疫细胞，协同杀死病毒；三、本身结合病毒后可以吞噬病毒或利用NTEs网络杀灭病毒；从而大大提高对病毒的清除效率，进而加快恢复机体免疫力。

Description

过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法。
背景技术
中性粒细胞是固有免疫系统的重要组成部分，在控制和清除病毒、细菌感染中起着关键性作用。活化的上皮细胞和受伤组织驻留的巨噬细胞释放趋化因子，将中性粒细胞募集到细菌或病毒感染部位。除了经典的吞噬、脱颗粒和呼吸爆发等机制，中性粒细胞还可以释放中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil Extracellular Traps,NTEs)捕获细菌、真菌和病毒，并分泌可溶性介质如AMP，水解酶和促炎症细胞因子以进一步促进病原体的清除。NTEs是中性粒细胞核内组分释放到胞外空间形成的，由解聚的染色体网状结构和镶嵌的颗粒蛋白等多种细胞质蛋白组成。
病毒进入动物体内，一般尚无特效药物治疗，主要依靠动物机体自身的免疫能力清除它，其中中性粒细胞的主要功能之一就是清除病毒，而在实际病例中往往感染者体内会出现中性粒细胞数量降低的情况，影响到机体免疫能力，因此适量分离培养中性粒细胞后，回输患者可以弥补机体该类细胞的下降。中性粒细胞输血已被广泛应用于威胁严重中性粒细胞减少症患者生命的病毒、细菌和真菌感染治疗。
ACE2是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的关键分子，也是包括肺泡上皮细胞在内的多种人体细胞表面表达的重要分子之一。2003年，hACE2被鉴定为SARS冠状病毒的功能性受体。hACE2分子也是ncov-2019病毒感染的关键分子，通过结合hACE2分子有可能影响ncov-2019病毒感染人体细胞的过程。
目前，亟需提供一种可以与新冠状病毒、SARS病毒等各种病毒结合，进而吞噬或杀死病毒以屏蔽病毒侵染机体关键组织，且提高对病毒的清除效率的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，制得的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂可以与新冠状病毒、SARS病毒等各种病毒结合，进而吞噬或杀死病毒以屏蔽病毒侵染机体关键组织，且提高对病毒的清除效率，进而加快恢复机体免疫力。
本发明所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)中性粒细胞分离与激活
中性粒细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；
(2)构建hACE2慢病毒表达载体
①引物设计和合成：根据hACE2 mRNA序列设计引物；
②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；
③采用RT-PCR扩增hACE2基因；
④将hACE2基因与慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP连接得到hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2；
(3)慢病毒包装
hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2和包装质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HEK293T细胞，转染后收集病毒颗粒；
(4)病毒颗粒侵染中性粒细胞
用病毒颗粒侵染中性粒细胞，继续培养，收集细胞；
(5)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞
病毒颗粒侵染后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离，分离所得hACE2阳性中性粒细胞扩大培养，即得过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂。
步骤(2)中所述的引物如下：
ACE2F：5’-catggctagcatgtcaagctcttcctggctcc-3’
ACE2R：5’-catgggatccctaaaaggaggtctgaacatc-3’。
步骤(3)中所述的包装质粒为pMD2.G、pMDL-G/P-RRE和pRSV-REV的混合质粒。
所述的pMD2.G、pMDL-G/P-RRE和pRSV-REV的摩尔比为3：5：2。
步骤(3)中所述的转染时间为48-60h。
步骤(4)中所述的继续培养时间为48-72h。
步骤(5)中所述的病毒颗粒侵染后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是病毒颗粒侵染后收集的细胞用PBS清洗两次，带有hACE2抗体的磁珠结合表达hACE2的中性粒细胞，分离得到hACE2阳性中性粒细胞。
步骤(5)中所述的病毒颗粒侵染后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是收集含有不超过6×106个细胞的200μl悬液，按1∶20体积比加入兔抗人hACE2抗体，4℃冰箱孵育1h；之后按照20μl小鼠抗兔IgG1磁珠对应80μl细胞悬液比例，4℃冰箱孵育15min，PBS缓冲液清洗2次后制备1ml细胞悬液备用；将PBS缓冲液湿润后的MS分选柱子放入分选器中，加入制备好的细胞悬液，hACE2阳性的中性粒细胞会通过物理磁场力吸附在分选柱子中，hACE2阴性中性粒细胞会直接流出分选柱子。分离所得的hACE2阳性中性粒细胞扩大培养，可以直接应用，也可以液氮冻存备用。
本发明采用磁珠筛选所需的可用于新冠状病毒、SARS等识别hACE2蛋白的病毒病的预防和治疗的中性粒细胞。
本发明提供一种适用于哺乳动物细胞表达并能镶嵌于细胞膜的hACE2基因表达载体及相应hACE2表达阳性中性粒细胞的生产制备方法。本发明分离培养对数生长期的中性粒细胞，而后克隆人hACE2全基因，连接入慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，转入HEK293T中进行慢病毒包装并侵染中性粒细胞，通过磁珠筛选方法获得hACE2基因表达阳性的中性粒细胞。本发明的hACE2阳性中性粒细胞可以竞争性结合识别hACE2蛋白的病毒，结合后不经保护机体细胞免于病毒损伤，还能提高中性粒细胞清除病毒的能力，为进一步研究该细胞在新冠状病毒和SARS方面的治疗和预防奠定了基础。
本发明的有益效果如下：
hACE2基因自然条件下不表达于中性粒细胞，本发明提供了一种过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法。冠状病毒类会借助hACE2膜蛋白侵染其他功能细胞而造成疾病，作为机体免疫的第一道防线的中性粒细胞在自然条件下不会被侵染，而能杀灭病毒。将hACE2蛋白过表达于中性粒细胞膜后，中性粒细胞更有利于捕获病毒并消灭它，会极大的避免病毒对机体功能细胞的侵染。
本发明首先确定了能够实现特异性、高效识别新冠状病毒和SARS病毒靶位点的人hACE2基因序列，而后通过慢病毒侵染的方法导入中性粒细胞，利用免疫磁珠筛选hACE2阳性细胞群及测序鉴定，获得过表达hACE2基因的中性粒细胞。本发明过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的生产，大大提升了中性粒细胞消除以hACE2为受体的病毒能力。
本发明制得的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂具有以下优点：一、竞争性的结合病毒，防止病毒对机体关键组织中细胞的侵害杀灭；二、与病毒结合后可以招募其他中性粒细胞或免疫细胞，协同杀死病毒；三、本身结合病毒后可以吞噬病毒或利用NTEs网络杀灭病毒；从而大大提高对病毒的清除效率，进而加快恢复机体免疫力。
附图说明
图1是hACE2基因PCR电泳图。
图2是hACE2慢病毒表达载体示意图。
图3是hACE2阳性中性粒细胞基因组PCR图。
图4是中性粒细胞上的hACE2蛋白定位图。
图5是hACE2阳性中性粒细胞中hACE2蛋白表达的western blot图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1
(1)中性粒细胞分离与培养
按照北京索莱宝科技有限公司人外周血中性粒细胞分离液试剂盒(P9040)使用说明，分离纯化中性粒细胞，然后转移到含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于5％CO2浓度的培养箱中于37℃培养，获得对数生长期的中性粒细胞备用。
(2)构建hACE2慢病毒表达载体
①引物设计和合成
根据ncbi报道的人hACE2 mRNA序列，序列号为AY623811。用DNAstar软件设计针对hACE2编码区的上下游引物，在hACE2基因N-端和C-端分别引入Nhe I和BamH I限制性酶切位点，并在两端添加4个保护碱基catg。hACE2的正向引物ACE2F：5’-catggctagcatgtcaagctcttcctggctcc-3’，反向引物ACE2R：5’-catgggatccctaaaaggaggtctgaacatc-3’，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
②总RNA的提取
收集足量的生长状态良好的人肺癌细胞A549细胞，根据Invitogen Trizol试剂盒说明书提取细胞的总RNA，加入1mL Trizol试剂，反复吹打，待细胞彻底消化后，转入1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，反复颠倒数次，室温放置3min；4℃12000g离心15min；上清转移至新的1.5mL离心管中，加入500μL乙醇，混匀，室温放置10min；4℃12000g离心10min；去除上清，加入1mL75％乙醇，颠倒混匀；4℃7500g离心5min；弃上清，待残留的乙醇挥发完全后，加入100μL 1％DEPC水溶解总RNA。
③采用RT-PCR扩增hACE2基因
根据天根生化RT-PCR试剂盒使用说明，取1μg提取的总RNA进行反转录。利用设计的特异性引物在最佳扩增条件下进行PCR扩增，条件如下：以反转录产物cDNA为模板，PCR条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，扩增30个循环，72℃补平10min。扩增得到的hACE2片段为一条明亮的DNA条带，大小为2200bp，见图1。
④hACE2慢病毒表达载体的获得
将扩增后的hACE2目的条带，进行凝胶回收后，用Nhe I和BamH I对该目的基因和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒进行双酶切。用凝胶回收试剂盒回收后，通过T4 DNA连接酶4℃条件下将目的基因和载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的双酶切产物连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，将转化子涂布到带有Amp抗性的LB平板上。在涂布带有pCDH-hACE2重组子质粒的E.coli DH5ɑ平板上长出许多的菌落，从而获得适合在哺乳动物细胞内表达的hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2，见图2。
(3)慢病毒的包装
汇合度达到80％的包装细胞HEK293T传代于10mm细胞培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃、5％CO2条件下培养，待细胞汇合度达到50％-60％时，更换新鲜含血清培养基，继续培养2h后，将hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2以及3种包装质粒pMD2.G、pMDL-G/P-RRE、pRSV-REV通过磷酸钙沉淀法共转染HEK293T细胞。24h更换新鲜培养基，并在荧光显微镜下观察HEK293T细胞的GFP表达情况，48h后收集上清，3000g、4℃离心15分钟去除细胞碎片。收集的上清加入PEG-itTMVirus Precipitation Solution 4℃沉淀过夜，1500g、4℃离心30分钟收集病毒颗粒沉淀用以感染中性粒细胞。
(4)慢病毒侵染中性粒细胞
将分离的中性粒细胞进行培养活化至对数生长期并铺于6孔板，向6孔板中加入病毒上清与polybrene(6μg/mL)孵育过夜。次日，离心清洗中性粒细胞3次后，加入含10％胎牛血清的RPMI 1640新鲜培养基扩增中性粒细胞。继续培养48h后，荧光显微镜下观察GFP表达情况，确定大部分中性粒细胞被慢病毒感染。
(5)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞
收集含有不超过6×106个细胞的200μl悬液，按1∶20体积比加入兔抗人hACE2抗体，4℃冰箱孵育1h；之后按照20μl小鼠抗兔IgG1磁珠对应80μl细胞悬液比例，4℃冰箱孵育15min，PBS缓冲液清洗2次后制备1ml细胞悬液备用；将PBS缓冲液湿润后的MS分选柱子放入分选器中，加入制备好的细胞悬液，hACE2阳性的中性粒细胞会通过物理磁场力吸附在分选柱子中，hACE2阴性中性粒细胞会直接流出分选柱子。分离所得的hACE2阳性中性粒细胞扩大培养，并提取基因组用hACE2的正向引物ACE2F：5’-catggctagcatgtcaagctcttcctggctcc-3’，反向引物ACE2R：5’-catgggatccctaaaaggaggtctgaacatc-3’进行PCR分析，结果如图3，说明该基因已经整合进中性粒细胞基因组，该阳性细胞可以直接应用，也可以液氮冻存备用。
(6)hACE2在中性粒细胞上的表达定位观察
hACE2阳性中性粒细胞悬液1×106个1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞。加入300μL4％多聚甲醛，室温下固定30min。吸取多聚甲醛，PBS洗涤3次，每次洗涤时间不少于5min，加入300μL渗透液(含有1％Trition-X100、5％山羊血清的PBS)，37℃放置30min。吸取渗透液，PBS洗涤3次，每次洗涤时间不少于5min，加入300μL封闭液(含有5％山羊血清的PBS)。37℃放置1h。吸取封闭液，PBS洗涤细胞3次，每次洗涤不少于5min。将按抗体说明书稀释的兔抗人hACE2抗体，每孔加入300μL，孵育细胞4℃过夜。吸取一抗，PBS洗涤3次，每孔中加入300μL按一定比例稀释(1:10000)的兔抗鼠IgG-Cy3的二抗，37℃孵育1h。吸取二抗，PBS洗涤3次，每次洗涤时间不少于5min，加入适量抗荧光猝灭封片液，在奥林巴斯荧光显微镜下进行观察拍照，结果见图4。
(7)hACE2在中性粒细胞中持续表达观察
将hACE2阳性中性粒细胞扩增繁殖后，分别在第1、3、5、7天收集细胞，提取总蛋白，进行western blotting分析hACE2基因在细胞内的表达情况，以β-actin做内参蛋白，结果如图5所示，该细胞中hACE2基因持续表达，说明该基因已经被慢病毒整合进中性粒细胞基因组。
本发明中通过慢病毒介导获得过表达hACE2的中性粒细胞的生产时间短，耗资少，且能够结合以hACE2蛋白为靶点的病毒，起到保护机体其他组织细胞的作用，同时还能吞噬或杀灭病毒，所以本发明所构建的过表达人hACE2基因的中性粒细胞群为一新型免疫细胞制剂，可用于以hACE2蛋白为靶点的病毒患者的防治。
序列表
<110> 齐鲁医药学院
<120> 过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
catggctagc atgtcaagct cttcctggct cc 32
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
catgggatcc ctaaaaggag gtctgaacat c 31

Claims (8)

1.一种过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)中性粒细胞分离与激活
中性粒细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；
(2)构建hACE2慢病毒表达载体
①引物设计和合成：根据hACE2 mRNA序列设计引物；
②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；
③采用RT-PCR扩增hACE2基因；
④将hACE2基因与慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP连接得到hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2；
(3)慢病毒包装
hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2和包装质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HEK293T细胞，转染后收集病毒颗粒；
(4)病毒颗粒侵染中性粒细胞
用病毒颗粒侵染中性粒细胞，继续培养，收集细胞；
(5)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞
病毒颗粒侵染后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离，分离所得hACE2阳性中性粒细胞扩大培养，即得过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的引物如下：
ACE2F：5’-catggctagcatgtcaagctcttcctggctcc-3’
ACE2R：5’-catgggatccctaaaaggaggtctgaacatc-3’。
3.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的包装质粒为pMD2.G、pMDL-G/P-RRE和pRSV-REV的混合质粒。
4.根据权利要求3所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于所述的pMD2.G、pMDL-G/P-RRE和pRSV-REV的摩尔比为3：5：2。
5.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的转染时间为48-60h。
6.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的继续培养时间为48-72h。
7.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的病毒颗粒侵染后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是病毒颗粒侵染后收集的细胞用PBS清洗两次，带有hACE2抗体的磁珠结合表达hACE2的中性粒细胞，分离得到hACE2阳性中性粒细胞。
8.根据权利要求7所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的病毒颗粒侵染后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是收集含有不超过6×106个细胞的200μl悬液，按1∶20体积比加入兔抗人hACE2抗体，4℃冰箱孵育1h；之后按照20μl小鼠抗兔IgG1磁珠对应80μl细胞悬液比例，4℃冰箱孵育15min，PBS缓冲液清洗2次后制备1ml细胞悬液备用；将PBS缓冲液湿润后的MS分选柱子放入分选器中，加入制备好的细胞悬液，hACE2阳性的中性粒细胞会通过物理磁场力吸附在分选柱子中，hACE2阴性中性粒细胞会直接流出分选柱子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112522205A (zh) * 2020-12-15 2021-03-19 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种过表达血管紧张素转换酶2的细胞系及其制备方法与应用
CN115029319A (zh) * 2022-06-02 2022-09-09 陕西慧康生物科技有限责任公司 一种人ace2过表达细胞株的构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017827A (zh) * 2014-04-04 2014-09-03 天津医科大学总医院 一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用
CN106191121A (zh) * 2016-08-03 2016-12-07 云南中烟工业有限责任公司 一种t1r2基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法
CN107916253A (zh) * 2017-11-01 2018-04-17 上海隆耀生物科技有限公司 一种表达人源免疫刺激因子light的间充质干细胞的制备方法及制得的msc‑l细胞

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017827A (zh) * 2014-04-04 2014-09-03 天津医科大学总医院 一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用
CN106191121A (zh) * 2016-08-03 2016-12-07 云南中烟工业有限责任公司 一种t1r2基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法
CN107916253A (zh) * 2017-11-01 2018-04-17 上海隆耀生物科技有限公司 一种表达人源免疫刺激因子light的间充质干细胞的制备方法及制得的msc‑l细胞

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENNETH E. BERNSTEIN ET AL.: "Angiotensin-converting enzyme in innate and adaptive immunit", 《NAT REV NEPHROL》 *
ZAKIR KHA ET AL.: "Angiotensin converting enzyme enhances the oxidative response and bactericidal activity of neutrophils", 《 BLOOD FIRST EDITION PAPER》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112522205A (zh) * 2020-12-15 2021-03-19 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种过表达血管紧张素转换酶2的细胞系及其制备方法与应用
CN115029319A (zh) * 2022-06-02 2022-09-09 陕西慧康生物科技有限责任公司 一种人ace2过表达细胞株的构建方法

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