WO2021213421A1 - 融合蛋白分子及其制备方法和用途 - Google Patents

融合蛋白分子及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2021213421A1
WO2021213421A1 PCT/CN2021/088598 CN2021088598W WO2021213421A1 WO 2021213421 A1 WO2021213421 A1 WO 2021213421A1 CN 2021088598 W CN2021088598 W CN 2021088598W WO 2021213421 A1 WO2021213421 A1 WO 2021213421A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
fusion protein
ace2
seq
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/CN2021/088598
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
杨选明
张晓卿
韩萍
王海勇
李范林
徐艳芹
李民
Original Assignee
上海交通大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 上海交通大学 filed Critical 上海交通大学
Publication of WO2021213421A1 publication Critical patent/WO2021213421A1/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本申请提供了一种融合蛋白分子及其制备方法和用途，具体而言，本申请提供了融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和靶向部分，其中所述靶向部分能够特异性结合活化T细胞的因子；本申请还提供了融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和嵌合抗原受体(CAR)功能结构，其中所述嵌合抗原受体功能结构包括跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。本申请还提供了上述融合蛋白的制备方法及其单独，或者与细胞因子或其融合蛋白联合在制备治疗冠状病毒所引起的疾病的药物中的用途。

Description

融合蛋白分子及其制备方法和用途 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种融合蛋白分子及其制备方法和用途。
背景技术
冠状病毒在病毒分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。目前，已经鉴定出7种可感染人类的冠状病毒，其中SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2可引起严重急性呼吸综合征，并且总病死率相对较高。SARS-CoV-2和SARS-CoV冠状病毒感染没有病毒特异的治疗方案，也没有疫苗可以预防接种。瑞德西韦等候选药物的临床试验结果也尚未披露。SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒感染造成的免疫损伤常采用激素治疗，但副作用较大。
因此亟需开发有效且安全可靠的冠状病毒所引起的疾病的治疗手段。
发明内容
本申请提供了一种融合蛋白分子及其制备方法和用途，具体而言，本申请提供了融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段(例如人ACE2的第1-740位氨基酸)和靶向部分，其中所述靶向部分能够特异性结合活化T细胞的因子；本申请还提供了融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段(例如人ACE2的第1-740位氨基酸)和嵌合抗原受体(CAR)功能结构，其中所述嵌合抗原受体功能结构包括跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。本申请还提供了上述融合蛋白的制备方法，以及上述融合蛋白单独，或者与细胞因子或其融合蛋白联合制备治疗冠状病毒所引起的疾病的药物的用途。本申请所提供的融合蛋白分子，和/或与所述细胞因子或其融合蛋白联合，可以达到至少下述之一的效果：(1)有效地预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病；(2)针对冠状病毒的靶向性高，毒副作用小；(3)能够抑制冠状病毒所引起的(例如感染所引起)的组织损伤和/或临床损伤，还可以进一步修复受损伤的组织；(4)阻断冠状病毒的感染；和/或(5)可以被快速地大规模量产，可满足治疗冠状病毒所引起的疾病所需的时效性。
一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和靶向部分，其中所述S蛋白包括冠状病毒的S蛋白，所述靶向部分能够特异性结合活化T细胞的 因子。
在某些实施方式中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段与所述靶向部分直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段包含ACE2蛋白的胞外结构域。
在某些实施方式中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段来源于人。
在某些实施方式中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述活化T细胞的因子选自下组：CD3和CD28。
在某些实施方式中，所述靶向部分包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab') 2，F(ab) 2，dAb，分离的互补决定区CDR，Fv和scFv。
在某些实施方式中，所述靶向部分为scFv。
在某些实施方式中，所述靶向部分包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述间接连接包括通过连接子连接。
在某些实施方式中，所述连接子为肽连接子。
在某些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO:3，27-32中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供一种融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和嵌合抗原受体(CAR)功能结构，其中所述S蛋白包括冠状病毒的S蛋白，所述嵌合抗原受体功能结构包括跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段与所述嵌合抗原受体功能结构直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段包含ACE2蛋白的胞外结构域。
在某些实施方式中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段来源于人。
在某些实施方式中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、 CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含源自选自下述蛋白的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体功能结构还包括铰链区。
在某些实施方式中，所述铰链区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体功能结构包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白，还包括细胞因子。
在某些实施方式中，所述细胞因子位于所述融合蛋白的C端。
在某些实施方式中，所述细胞因子与所述嵌合抗原受体功能结构直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述细胞因子包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供一种载体，其包含本申请所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供一种细胞，其表达本申请所述的融合蛋白，和/或包含本申请所述的核酸分子，和/或包含本申请所述的载体。
在某些实施方式中，所述细胞选自下组：间充质干细胞和T细胞。
另一方面，本申请提供一种制备本申请所述的融合蛋白的方法，其包括以下的步骤：培养本申请所述的细胞。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供一种本申请所述的融合蛋白在制备药物中的用途，其中所述药物用于预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病。
在某些实施方式中，所述冠状病毒包括SARS-CoV和SARS-CoV-2。
另一方面，本申请提供一种药物产品，其包括包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白，和细胞因子或其融合蛋白，其中所述S蛋白包括冠状病毒的S蛋白。
在某些实施方式中，所述包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白包括本申请 所述的融合蛋白。
在某些实施方式中，所述包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白包括ACE2-Fc融合蛋白，所述ACE2-Fc融合蛋白包括ACE2蛋白的胞外结构域与其直接或间接连接的IgG的Fc区域。
在某些实施方式中，所述细胞因子或其融合蛋白包括促进型细胞因子或其融合蛋白，和/或，抑制型细胞因子或其融合蛋白，其中所述促进型细胞因子包括IL-22，和/或，所述抑制型细胞因子包括IL-6。
在某些实施方式中，所述促进型细胞因子或其融合蛋白包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抑制型细胞因子或其融合蛋白包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供一种本申请所述的药物产品在制备预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述病毒包括SARS-CoV和/或SARS-CoV-2。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2-Fc)结构示意图。
图2A-2B显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2-Fc)与SARS-CoV-2S蛋白结合结果。
图3显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2-Fc)对SARS-CoV-2假病毒感染的阻断结果。
图4显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2-BITE)结构示意图。
图5显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2-BITE)与SARS-CoV-2 S蛋白和CD3结合结果。
图6显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2-BITE)对SARS-CoV-2阳性细胞的杀伤结果。
图7显示的是本申请所述促进型细胞因子融合蛋白结构示意图。
图8显示的是本申请所述促进型细胞因子融合蛋白促进COLO 205细胞的增值。
图9显示的是本申请所述促进型细胞因子融合蛋白促进COLO 205的划痕修复。
图10显示的是本申请所述抑制型细胞因子融合蛋白结构示意图。
图11显示的是本申请所述抑制型细胞因子融合蛋白对IL-6信号的阻断结果。
图12显示的是利用MSC表达本申请所述融合蛋白(ACE2-Fc)的蛋白分泌测定结果。
图13显示的是利用MSC表达本申请所述融合蛋白(ACE2-BITE)的蛋白分泌测定结果。
图14显示的是利用MSC表达本申请所述促进型细胞因子融合蛋白的蛋白分泌测定结果。
图15显示的是利用MSC表达本申请所述抑制型细胞因子融合蛋白的蛋白分泌测定结果。
图16显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2 BBZ)对SARS-CoV2 S蛋白阳性细胞的杀伤结果。
图17显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2 BBZ)被S蛋白阳性细胞特异激活释放IFNγ。
图18显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2-Fc)不影响小鼠的体重。
图19显示的是本申请所述的融合蛋白(ACE2-Fc)不造成小鼠组织损伤。
图20显示的是本申请所述的融合蛋白(ACE2-Fc)在小鼠体内的药代动力学分析。
图21显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2 BBZ-IL-22-Fc)分泌表达IL-22-Fc。
图22显示的是本申请所述融合蛋白(ACE2 BBZ-IL-22-Fc)对SARS-CoV2 S蛋白阳性细胞的杀伤结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“活化T细胞的因子”通常是指能够活化T细胞的分子。在本申请中，所述活化T细胞的因子可以包括T细胞活化第一信号，和/或T细胞活化第二信号。所述T细 胞活化第一信号可以包括CD3。例如，CD3分子可以与TCR形成TCR-CD3复合体，参与把TCR与抗原结合后产生的活化信号传递到T细胞内，从而诱导T细胞活化。所述T细胞活化第二信号可以包括CD28。例如，CD28可以与抗原呈递细胞上的配体B7结合形成B7-CD28复合体来发挥共刺激作用。例如，CD3和CD28可以发挥协同地活化T细胞的作用。
在本申请中，术语“靶向部分”通常是指能够特异性识别并结合特定标志(例如抗原，又例如细胞表面标记物)的功能区域。在本申请中，所述靶向部分可以包括抗体(例如单克隆抗体)或其抗原结合片段。在本申请中，所述靶向部分可以是靶向所述活化T细胞的因子的抗体或其抗原结合片段。例如，所述靶向部分可以为CD3抗体或其抗原结合片段。又例如，所述靶向部分可以为CD28抗体或其抗原结合片段。
在本申请中，术语“冠状病毒的S蛋白”通常是指冠状蛋白的刺突蛋白(spike蛋白)。所述S蛋白可以组合成三聚体，其约含有1300个氨基酸。所述S蛋白可以属于第一类膜融合蛋白(Class I viral fusion protein)。所述S蛋白通常可以含有两个亚基(subunit)，S1和S2。S1主要包含有受体结合区(receptor binding domain RBD)，其可以负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件，包括一个内在的膜融合肽(fusion peptide)，两个7肽重复序列(heptad repeat，HR)，一个富含芳香族氨基酸的膜临近区域(membrane proximal external region，MPER)，以及跨膜区(transmembrane，TM)。S1蛋白可进一步分成两个区域(domain)，即N-端区域(N-terminal domain，NTD)和C-端区域(C-terminal domain，CTD)。S蛋白可以决定病毒(例如冠状病毒SARS-CoV-2)的宿主范围和特异性，也可以为宿主中和抗体的而重要作用位点，和/或疫苗设计的关键靶点。所述S蛋白可以为SARS-CoV-2的S蛋白，例如，其结构可以参见Daniel Wrapp等，Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation,Science。
在本申请中，术语“S蛋白的结合蛋白或其功能性片段”通常是指可以结合所述冠状病毒的S蛋白的蛋白，或者其功能性片段(例如，所述功能性片段仍可以保留结合所述冠状病毒的S蛋白的性质)。例如，所述S蛋白的结合蛋白可以包括血管紧张素转换酶II(Angiotensin converting enzyme II，ACE2)，氨基肽酶N(animo peptidase N，APN)，二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4,DPP4)，以及CEACAM1(carcino embryonic antigen-related cell adhesion molecule)。
在本申请中，术语“ACE2”通常是指血管紧张素转化酶II(Angiotensin-converting enzyme 2)或其功能片段。所述血管紧张素转化酶II可以催化血管紧张素I转化为血管紧张素-(1-9)或血管紧张素II转化为血管紧张素-(1-7)的外肽酶。所述ACE2可以包括N端的PD区(peptidase domain，肽酶结构域)和C端CLD区(Collectrin-like domain)。所述血管紧张素 转化酶II可以为SARS冠状病毒(SARS-CoV)或严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)的受体，例如，所述ACE2的胞外结构域(例如，所述ACE2的PD区)可以结合冠状病毒的S蛋白的RBD。人血管紧张素转化酶II在UniProt数据库的登录号为Q9BYF1。人ACE2基因可以包含18个外显子，参见Tipnis,S.R.,Hooper,N.M.,Hyde,R.,Karran,E.,Christie,G.,Turner,A.J.A human homolog of angiotensin-converting enzyme:cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase.J.Biol.Chem.275:33238-33243,2000的表1。在本申请中，所述ACE2蛋白的功能性片段可以包括所述完整ACE2蛋白的截短体或变体，只要所述功能性片段仍具备作为冠状病毒(例如SARS-CoV和/或SARS-CoV-2)受体的功能。
在本申请中，术语“ACE2-Fc融合蛋白”通常是指包含本申请所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段以及IgG抗体的Fc区域的融合蛋白。在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段与所述IgG抗体的Fc区域直接或间接连接。例如，所述IgG抗体的Fc区域可以位于所述ACE2-Fc融合蛋白的C端。在本申请中，所述IgG可以为IgG1，例如可以为人IgG1。
在本申请中，术语“冠状病毒”通常是指属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)中的病毒。所述冠状病毒为线性单股正链的RNA病毒。所述冠状病毒可以包括具有棘突的包膜。所述冠状病毒的基因组可以5’端具有甲基化的帽状结构，3’端具有poly(A)尾，基因组全长约为27-32kb。在本申请中，所述冠状病毒包括严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒，即Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，其是冠状病毒科乙型冠状病毒属的一个种。在本申请中，所述冠状病毒可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)、严重急性呼吸综合征(SARS)和/或新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
在本申请中，术语“SARS-CoV”通常是指SARS冠状病毒，即严重急性呼吸道综合征冠状病毒(英文全称为Severe acute respiratory syndrome coronavirus)，其属于冠状病毒科(Coronaviridae)乙型冠状病毒属(Betacoronavirus)沙贝病毒亚属(Sarbecovirus)。
在本申请中，术语“SARS-CoV-2”通常是指严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型，英文全称为Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2。SARS-CoV-2属于冠状病毒科(Coronaviridae)乙型冠状病毒属(Betacoronavirus)沙贝病毒亚属(Sarbecovirus)。SARS-CoV-2是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒。SARS-CoV-2可以引发新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。在本申请中，所述SARS-CoV-2可以包括S蛋白(刺突蛋白，spike蛋白)。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体(CAR)功能结构”通常是指嵌合抗原受体中除靶向部分以外的结构部分。例如，所述嵌合抗原受体功能结构可以包括胞内信号传导结构域、共刺激结构域和/或跨膜结构域。在本申请中，所述嵌合抗原受体功能结构还可以包括铰链区。在本申请中，所述嵌合抗原受体功能结构及其中的各个部分所发挥的功能可以与所述嵌合抗原受体中的胞内信号传导结构域、共刺激结构域和/或跨膜结构域，以及铰链区的功能相一致或类似。例如，所述嵌合抗原受体功能结构可以将信号传导至细胞内。例如，所述嵌合抗原受体功能结构可以提供给免疫共刺激分子。例如，所述嵌合抗原受体功能结构可以与所述胞内信号传导结构域共同发挥传递信号的作用。
在本申请中，术语“胞内信号传导结构域”通常是指位于细胞内部能够转导信号的结构域。在本申请中，所述胞内信号传导信号域可以将信号传导至细胞内。例如，所述胞内信号传导结构域是所述嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域。
在本申请中，术语“共刺激结构域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。
在本申请中，术语“跨膜结构域”通常是指穿过细胞膜的结构域(Transmembrane Domain)。在本申请中，所述跨膜结构域可以与细胞内信号转导结构域相连接，起到传递信号的作用。
在本申请中，术语“细胞因子”通常可以包括白细胞介素、干扰素、趋化因子、造血生长因子，肿瘤坏死因子和/或转化生长因子。一般来说，它们是低分子量蛋白质，其可调节免疫系统的细胞的成熟、活化、增殖和分化。
在本申请中，术语“药物产品”通常是指含有一个以上活性成分的药物。在本申请中，所述药物产品可以指联用的药物(例如，联用的一个以上活性成分可以同时，也可以具备先后顺序施用，所述一个以上活性成分可以被分装在不同的容器中)，也可以指药物组合物(例如，所述一个药物成分可以为混合物，也可以被分装在相同的容器中)。在本申请中，所述一个以上活性成分可以包括本申请所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白，也可以包括本申请所述的细胞因子或其融合蛋白。例如，所述细胞因子可以包括促进型细胞因子和/或抑制型细胞因子。
在本申请中，术语“促进型细胞因子”通常是指能够促进炎症反应消除和/或降低的细胞因子(例如细胞因子、细胞因子的受体、和/或特异性结合所述细胞因子或细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段)。在本申请中，所述炎症反应可以因感染冠状病毒所造成。所述炎症反应可以包括由防御性反应产生的红肿、发热、疼痛、组织损伤等症状。本申请中，所述促进型细胞因子可以降低所述炎症反应(例如，可以促进组织修复)，例如，其可以包括IL-22。
在本申请中，术语“抑制型细胞因子”通常是指抑制炎症反应(例如，本申请所述的炎症反应)消除和/或降低的细胞因子(例如细胞因子、细胞因子的受体、和/或特异性结合所述细胞因子或细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段)。例如，所述炎症反应可以包括细胞因子风暴(例如，所述细胞因子风暴可以包括体液中多种细胞因子，例如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8，迅速大量产生)。在本申请中，所述抑制型细胞因子可以包括能够抑制所述细胞因子风暴的细胞因子，或者特异性结合所述细胞因子或细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段。在本申请中，所述抑制型细胞因子可以包括IL-6、IL-10和/或TNF。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
融合蛋白
一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和靶向部分，其中所述S蛋白包括冠状病毒的S蛋白，所述靶向部分能够特异性结合活化T细胞的因子。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以与所述靶向部分直接或间接连接。在本申请中，所述间接连接可以包括通过连接子连接。在本申请中，所述连接子可以为肽连接子。例如，所述连接子可以包含SEQ ID NO:3，27-32中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述连接子可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以位于所述融合蛋白的N端。在本申请中，所述靶向部分可以位于所述融合蛋白的C端。
例如，在所述融合蛋白中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的C端可以与所述靶向部分的N端直接或间接连接。例如，ACE2蛋白或其片段(例如，ACE2蛋白的胞外结构域)的C端可以与所述靶向部分的N端直接或间接连接。
在本申请中，所述融合蛋白可以自N端依次包括所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段、所述连接子和所述靶向部分。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以包含ACE2蛋白的胞外结构域。 例如，所述S蛋白的结合蛋白可以包括ACE2蛋白。又例如，所述S蛋白的结合蛋白的功能性片段可以包括ACE2蛋白的胞外结构域。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以来源于人。例如，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以为人ACE2蛋白或其功能性片段(例如，所述功能可以包括保留与所述S蛋白识别和/或结合的能力)。例如，所述ACE2蛋白的功能性片段可以为人ACE2蛋白的胞外结构域。例如，所述ACE2蛋白的功能性可以包含人ACE2蛋白第1-740位氨基酸的氨基酸序列。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述活化T细胞的因子可以选自下组：CD3和CD28。例如，所述活化T细胞的因子可以为CD3。
在本申请中，所述靶向部分可以包括抗体或其抗原结合片段。例如，所述靶向部分可以为IgG型抗体，也可以为抗原结合片段。例如，所述抗原结合片段可以选自下组：Fab，Fab’，F(ab')2，F(ab)2，dAb，分离的互补决定区CDR，Fv和scFv。例如，所述靶向部分可以为scFv。
在本申请中，所述靶向部分可以为CD3抗体或其抗原结合片段。例如，所述靶向部分可以为CD3scFv。在本申请中，所述靶向部分可以为OKT3(CAT#:TAB-0416CL-S(P))。
在本申请中，所述靶向部分可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白还可以包含识别标签。例如，所述识别标签可以位于所述融合蛋白的C端。例如，所述识别标签可以与所述靶向部分的C端直接或间接连接。在本申请中，所述识别标签可以包括HIS标签，例如，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:26所示。
在本申请中，所述融合蛋白可以自N端依次包括所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段、所述连接子、所述靶向部分和所述识别标签。
在本申请中，所述融合蛋白可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供一种融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和嵌合抗原受体(CAR)功能结构，其中所述S蛋白包括冠状病毒的S蛋白，所述嵌合抗原受体功能结构包括跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以包含ACE2蛋白的胞外结构域。例如，所述S蛋白的结合蛋白可以包括ACE2蛋白。又例如，所述S蛋白的结合蛋白的功能性片段可以包括ACE2蛋白的胞外结构域。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以来源于人。例如，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以为人ACE2蛋白或其功能性片段(例如，所述功能可以包括保留与所述S蛋白识别和/或结合的能力)。例如，所述ACE2蛋白的功能性片段可以为人ACE2蛋白的胞外结构域。例如，所述ACE2蛋白的功能性可以包含人ACE2蛋白第1-740位氨基酸的氨基酸序列。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以来源于人。
例如，所述ACE2蛋白可以为完整的人ACE2蛋白。在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以与所述嵌合抗原受体功能结构直接或间接连接。例如，ACE2蛋白或其片段(例如，ACE2蛋白的胞外结构域)的C端可以与所述靶向部分的N端直接或间接连接。在本申请中，所述间接连接可以包括通过连接子连接。在本申请中，所述连接子可以为肽连接子。例如，所述连接子可以包含SEQ ID NO:3，27-32中任一项所示的氨基酸序列。在本申请中，所述连接子的N端可以与所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的C端连接，且所述连接子的C端可以与所述嵌合抗原受体功能结构的N端连接。
在本申请中，所述融合蛋白自N端起可以包括所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和所述嵌合抗原受体功能结构。
在本申请中，所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段可以位于所述嵌合抗原受体(CAR)功能结构的N端。在本申请中，所述嵌合抗原受体(CAR)功能结构可以位于所述融合蛋白的C端。例如，所述融合蛋白自N端起可以包括所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和所述嵌合抗原受体功能结构。
例如，在所述融合蛋白中，所述ACE2蛋白或其功能性片段的C端可以与所述嵌合抗原受体(CAR)功能结构的N端直接或间接连接。
在本申请中，在所述嵌合抗原受体(CAR)功能结构中，所述跨膜结构域可以位于所述嵌合抗原受体功能结构的N端。
在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以位于所述嵌合抗原受体功能的C端。
在本申请中，所述共刺激结构域可以位于所述跨膜结构域的C端。例如，所述跨膜结构域的C端可以与所述共刺激结构域的N端直接或间接连接。
在本申请中，所述共刺激结构域可以位于所述胞内信号传导结构域的N端。例如，所述共刺激结构域的C端可以与所述胞内信号传导结构域的N端直接或间接连接。
在本申请中，所述嵌合抗原受体功能结构可以自N端其包括所述跨膜结构域、所述共刺激结构域和所述胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述跨膜结构域可以包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在本申请中，所述跨膜结构域可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述共刺激结构域可以包含源自选自下述蛋白的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。
在本申请中，所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体功能结构还可以包括铰链区。所述铰链区可以位于所述嵌合抗原受体功能结构的N端。例如，所述铰链区的C端可以与所述跨膜结构域的N端直接或间接连接。在本申请中，所述嵌合抗原功能结构自N端起可以包括所述铰链区、所述跨膜结构域、所述共刺激结构域和所述胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述铰链区可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体功能结构可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白，还可以包括细胞因子。
在本申请中，所述细胞因子可以位于所述融合蛋白的C端。例如，所述细胞因子可以位于所述嵌合抗原受体功能结构的C端。例如，所述细胞因子可以与所述嵌合抗原受体功能结构直接或间接连接。例如，所述细胞因子的N端可以与所述嵌合抗原受体功能结构的C端直接或间接连接。例如，所述间接连接可以包括通过连接子连接。在本申请中，所述连接子可以为连接肽，所述连接肽可以包括SEQ ID NO:22-25中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述连接肽可以包括SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。在本申请中，所述连接肽的N端可以与所述嵌合抗原受体功能结构的C端连接，且所述连接肽的C端可以与所述细胞因子的N端连接。
在本申请中，所述融合蛋白自N端起可以包括所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段、所述嵌合抗原受体功能结构和所述细胞因子。又例如，所述融合蛋白自N端起可以包括所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段、所述嵌合抗原受体功能结构、所述连接肽和所述细胞因子。
在本申请中，所述细胞因子可以包括IL-22。在本申请中，所述细胞因子可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述的融合蛋白可以包含SEQ ID NO:10或EQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的融合蛋白。
在本申请中，所述核酸分子可以涵盖RNA以及单链和/或双链DNA。所述核酸分子可以是天然存在的，例如，在基因组、转录物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、质粒、粘粒、染色体、染色单体、或其它天然存在的核酸分子的背景中。所述核酸分子也可以是非天然存在的分子，例如重组DNA或RNA、人工染色体、工程化基因组、或其片段、或合成DNA、RNA、DNA/RNA杂合物，或者包括非天然存在的核苷酸或核苷。
另一方面，本申请提供一种载体，其包含本申请所述的核酸分子。
在本申请中，所述载体可以包括质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体和/或噬菌粒。所述载体可以含有一种或多种适合于用于鉴定和/或选择细胞的标志物序列。
另一方面，本申请提供一种细胞，其表达本申请所述的融合蛋白，和/或包含本申请所述的核酸分子，和/或包含本申请所述的载体。
在本申请中，所述细胞可以包括原核细胞和/或真核细胞，例如，所述细胞可以为哺乳动物细胞，例如，所述细胞可以选自下组：间充质干细胞和T细胞。例如，所述细胞可以为间充质干细胞，例如，人间充质干细胞。
另一方面，本申请提供一种制备本申请所述的融合蛋白的方法，其包括以下的步骤：培养本申请所述的细胞。
例如，所述培养的条件可以为能够使所述细胞表达本申请所述的融合蛋白。所述培养的条件可以通过摸索本领域技术的常规的细胞培养条件得到，只要该条件能够获得具有正确构象和/或生物学活性的本申请所述融合蛋白即可。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供一种本申请所述的融合蛋白在制备药物中的用途，其中所述药物用于预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病。
本申请提供一种本申请所述的融合蛋白在制备预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病的药物中的用途。
本申请提供一种预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病的方法，其包括以下的步骤，向有需要的受试者施用本申请所述的融合蛋白。
在本申请中，所述冠状病毒可以包括SARS-CoV和SARS-CoV-2。
例如，所述疾病可以包括重症急性呼吸综合征(SARS)和/或新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。在本申请中，新型冠状病毒肺炎(COVID-19)可以指2019冠状病毒病(英文全称为coronavirus disease 2019)，其是由SARS-CoV-2引发的疾病。大多数COVID-19患者的表现以下呼吸道症状为主，常见临床表现包括发热、四肢乏力、干咳等症状。重症急性呼吸综合征(SARS)可以指由SARS-CoV引发的疾病。SARS通常以肌肉疼痛、头痛和发烧的全身症状为特征，并于2-14天内出现咳嗽、呼吸困难和肺炎等呼吸道症状。
药物产品和联用
另一方面，本申请提供一种药物产品，其包括包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白，和细胞因子或其融合蛋白，其中所述S蛋白包括冠状病毒的S蛋白。
在本申请中，所述包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白可以包括本申请所述的上述任意的融合蛋白。
在本申请中，所包含述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白可以包括ACE2-Fc融合蛋白，所述ACE2-Fc融合蛋白包括ACE2蛋白的胞外结构域与其直接或间接连接的IgG的Fc区域。
例如，所述ACE2蛋白的胞外结构域(例如人ACE2蛋白的胞外结构域)可以位于所述Fc区域的N端。例如，所述ACE2蛋白的胞外结构域(例如人ACE2蛋白的胞外结构域)的C端可以与所述Fc区域的N端直接或间接连接。
在本申请中，所述IgG可以为IgG1。例如，可以为人IgG1。
在本申请中，所述细胞因子或其融合蛋白可以包括促进型细胞因子或其融合蛋白，和/或，抑制型细胞因子或其融合蛋白，其中所述促进型细胞因子可以包括IL-22，和/或，所述抑制型细胞因子可以包括IL-6。
在本申请中，所述促进型细胞因子的融合蛋白可以促进组织修复(例如，可以促进因所述冠状病毒感染导致的炎症反应的组织损伤的修复)。在本申请中，所述促进型细胞因子的融合蛋白可以包括IL-22，例如，可以包括人IL-22。在本申请中，所述促进型细胞因子或其融合蛋白还可以包括IL22、TGF-β和/或PDGF。
在本申请中，所述促进型细胞因子的融合蛋白可以包括IL-22和其直接或间接连接的IgG的Fc区域。在本申请中，所述IgG可以为IgG1。例如，可以为人IgG1。
在本申请中，所述IL-22可以位于所述Fc区域的N端。例如，所述IL-22的C端可以与 所述Fc区域的N端直接或间接连接。
在本申请中，所述促进型细胞因子或其融合蛋白可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抑制型细胞因子或其融合蛋白可以抑制细胞因子风暴(例如，因感染所述冠状病毒导致的炎症反应的细胞因子风暴)。在本申请中，所述抑制型细胞因子的融合蛋白可以包括靶向IL-6受体的抗体或其抗原结合片段，例如，可以包括靶向人IL-6受体的抗体或其抗原结合片段。例如，可以包括靶向人IL-6受体的scFv。在本申请中，所述抑制型细胞因子或其融合蛋白还可以包括IL-10、TNF抗体、IL-6抗体和/或TNF受体-Ig。
在本申请中，所述抑制型细胞因子的融合蛋白可以包括所述靶向IL-6受体的抗体或其抗原结合片段(例如，可以为靶向人IL-6R的单链抗体，又例如，可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列)和其直接或间接连接的IgG的Fc区域。在本申请中，所述IgG可以为IgG1。例如，可以为人IgG1。
在本申请中，所述靶向IL-6受体的抗体或其抗原结合片段可以位于所述Fc区域的N端。例如，所述靶向IL-6受体的抗体或其抗原结合片段的C端可以与所述Fc区域的N端直接或间接连接。
在本申请中，所述抑制型细胞因子或其融合蛋白可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述药物产品可以为药物组合物。例如，所述包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白，和细胞因子或其融合蛋白(例如，所述抑制型细胞因子的融合蛋白和/或所述促进型细胞因子的融合蛋白)可以被置于同一容器中。又例如，所述包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白，和细胞因子或其融合蛋白(例如，所述抑制型细胞因子的融合蛋白和/或所述促进型细胞因子的融合蛋白)可以被置于不同的容器(例如包装)中。
另一方面，本申请提供一种本申请所述的药物产品在预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病中的用途。
本申请提供一种本申请所述的药物产品在制备预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病的药物中的用途。
本申请提供一种预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病的方法，其包括以下的步骤，向有需要的受试者施用本申请所述的药物产品。
在本申请中，所述病毒可以包括SARS-CoV和SARS-CoV-2。
例如，所述疾病可以包括重症急性呼吸综合征(SARS)和/或新型冠状病毒肺炎(COVID- 19)。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1 S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白(ACE2-Fc)的制备及功能
1.1生产ACE2-Fc
ACE2-Fc的结构可以参见图1。首先制备人工合成以下序列：ACE2 1-740(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，人IgG1 Fc区域(其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)，将以上两个序列连接后得到ACE2-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
通过XbaI和BamHI酶切位点将编码ACE2-Fc的核酸分子(其核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示)克隆到pCDH-MSCVEF载体。测序正确的克隆用NucleoBond Xtra Midi Plus EF试剂盒无内毒素大提，转染Lenti-X 293细胞，37℃、5％CO 2培养6天后收取上清，0.45μM过滤后，使用Protein A亲和纯化ACE2-Fc蛋白。
1.2 ACE2-Fc与SARS-CoV-2 S蛋白的结合
胰酶消化293-S蛋白细胞(该细胞表达SARS-CoV-2的S蛋白)，与200ng/ml的实施例1.1制备的ACE2-Fc共孵育25分钟，洗去一抗，加入Alexa
Figure PCTCN2021088598-appb-000001
647 AffiniPure F(ab') 2片段山羊抗人IgG,Fc片段特异性二抗染色，其结果如图2所示。
其中图2A表示仅添加二抗的结构，图2B表示添加二抗和ACE2-Fc的结果。结果说明，ACE2-Fc能够特异性地与SARS-CoV-2 S蛋白结合。
1.3 ACE2-Fc阻断SARS-CoV-2假病毒的感染
将pCDNA3.1-SARS-CoV-2-S蛋白(该质粒包含编码SARS-CoV-2的S蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示)，Gag/Pol，RSV-REV和pCDH-IRFP-Luc转染到Lenti-X 293细胞，48小时后收取上清，0.45μM过滤后，获得SARS-CoV-2假病毒。
胰酶消化293-ACE2细胞(该细胞表达人ACE2蛋白)接种到96孔板，将不同浓度的实施例1.1制备的ACE2-Fc与SARS-CoV-2假病毒37℃共孵育15分钟，再将孵育后的假病毒上清加入293-ACE2细胞，48小时后通过流式细胞分析IRFP的表达确定SARS-CoV-2假病毒的感染。其结果如图3所示。
结果显示，ACE2-Fc能够特异阻断SARS-CoV-2假病毒对人ACE2蛋白的感染。
实施例2 S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白(ACE2-BITE)的生产及功能
2.1.生产ACE2-BITE
ACE2-BITE的结构可以参见图4。首先人工合成以下序列：ACE2 1-740(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，连接子(其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)，OKT3scFv(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)和HIS标签(其氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示)，将以上序列顺次连接后得到ACE2-BITE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
通过XbaI和BamHI酶切位点将编码ACE2-BITE的核酸分子(其核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示)克隆到pCDH-MSCVEF载体。测序正确的克隆用NucleoBond Xtra Midi Plus EF试剂盒无内毒素大提，转染Lenti-X 293细胞，37℃、5％CO 2培养6天后收取上清，0.45μM过滤后，为ACE2-BITE转染上清，进一步使用镍柱亲和纯化ACE2-BITE蛋白。
2.2 ACE2-BITE与SARS-CoV-2 S蛋白的结合
将293-S蛋白单细胞悬液与实施例2.1制备的ACE2-BITE转染上清共孵育25分钟，洗去一抗，加入Alexa
Figure PCTCN2021088598-appb-000002
647 AffiniPure F(ab') 2片段山羊抗鼠IgG,Fab片段特异性二抗染色，其结果如图5所示，其中对照指不加入ACE2-BITE，只加入二抗的染色结果。
结果显示，所得ACE2-BITE能够特异地分别与SARS-CoV-2的S蛋白结合。
2.3ACE2-BITE杀伤SARS-CoV-2 S蛋白阳性细胞
胰酶消化293细胞和293-S蛋白细胞(该细胞表达SARS-CoV-2的S蛋白，可视为SARS-CoV-2 S蛋白阳性细胞)接种到96孔板，加入人T细胞，加入实施例2.1制备的ACE2-BITE转染上清，48小时后通过流式细胞分析293细胞和293-S蛋白细胞的细胞数量确定ACE2-BITE的杀伤作用。其结果如图6所示，其中对照指不加入ACE2-BITE的T细胞。
结果显示，所得ACE2-BITE能够特异杀伤SARS-CoV-2 S蛋白阳性细胞。
实施例3 促进型细胞因子融合蛋白(IL-22-Fc)的生产和功能
3.1 IL-22-Fc蛋白生产
IL-22-Fc的结构可以参见图7。首先人工合成以下序列：人IL-22(其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)，人IgG1 Fc区域(其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)，将以上两个序列连接后得到IL-22-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
通过XbaI和BamHI酶切位点将编码IL-22-Fc的核酸分子克隆到pCDH-MSCVEF载体。测序正确的克隆用NucleoBond Xtra Midi Plus EF试剂盒无内毒素大提，转染Lenti-X 293细胞，37℃、5％CO 2培养6天后收取上清，0.45μM过滤后，使用Protein A亲和纯化IL-22-Fc 蛋白。
3.2 IL-22-Fc促进COLO 205细胞释放IL-10和划痕修复作用
将Colo 205细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)接种到96孔板，加入不同浓度实施例3.1制备的IL-22-Fc，48小时后通过ELISA检测IL-10的分泌释放。其结果如图8所示。
结果显示，所得IL-22-Fc具有生物活性，能够促进COLO 205细胞分泌IL-10。
将COLO 205细胞种到24-孔板，使用200μL移液枪头在细胞层上划痕，加入不同浓度实施例3.1制备的IL-22-Fc，72小时后显微镜拍照观察划痕修复。其结果如图9所示，其中对照指不加入所述IL-22-Fc。
结果显示，所得IL-22-Fc能够促进COLO 205细胞的划痕修复。
实施例4 抑制型细胞因子融合蛋白(IL-6R抗体-Fc)的生产和功能
4.1 IL-6R抗体-Fc蛋白生产
IL-6R抗体-Fc的结构可以参见图10。首先人工合成以下序列：IL-6R抗体(其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)，人IgG1 Fc区域(其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)，将以上两个序列连接后得到IL-6R抗体-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
通过XbaI和BamHI酶切位点将编码IL-6R抗体-Fc的核酸分子克隆到pCDH-MSCVEF载体。测序正确的克隆用NucleoBond Xtra Midi Plus EF试剂盒无内毒素大提，转染Lenti-X293细胞，37℃、5％CO 2培养6天后收取上清，0.45μM过滤后，使用Protein A亲和纯化IL-6R抗体-Fc蛋白。
4.2 IL-6R抗体-Fc对IL-6信号的阻断作用
将表达TF-1的细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)接种到96孔板，加入IL-6以及不同浓度的实施例4.1制备的IL-6R抗体-Fc，48小时后通过CCK-8试剂盒检测TF-1细胞的增殖，其结果如图11所示。
结果显示，IL-6R抗体-Fc能够阻断IL-6介导的TF-1细胞增殖。
实施例5 间充质干细胞MSC表达ACE2-Fc
将VSV-g(货号ab1874)，Gag/Pol(购自addgene，货号14887)，RSV-REV(购自addgene，货号12253)和pCDH-MSCVEF-ACE2-Fc(其包含编码ACE2-Fc的核酸分子)转染到Lenti-X 293细胞，48小时后收取上清，0.45μM过滤后，为ACE2-Fc病毒上清。
将MSC接种到6孔板，加入0.5mL ACE2-Fc病毒上清，加入凝聚胺至终浓度为10μg/ml, 24小时后换液，48小时后加入嘌呤霉素筛选，获得稳定表达ACE2-Fc的MSC细胞，4天后用ELISA检测上清中ACE2-Fc的含量。其结果如图12所示。
结果显示，所得MSC稳定细胞系能够持续表达ACE2-Fc。
实施例6 间充质干细胞MSC表达ACE2-BITE
将VSV-g，Gag/Pol，RSV-REV和pCDH-MSCVEF-ACE2-BITE(其包含编码ACE2-BITE c的核酸分子)转染到Lenti-X 293细胞，48小时后收取上清，0.45μM过滤后，为ACE2-BITE病毒上清。
将MSC接种到6孔板，加入0.5MLACE2-BITE病毒上清，加入凝聚胺至终浓度为10μg/ml,24小时后换液，48小时后加入嘌呤霉素筛选，获得稳定表达ACE2-BITE的MSC细胞，后用上清染色293-S蛋白细胞，洗去一抗，加入Alexa
Figure PCTCN2021088598-appb-000003
647 AffiniPure F(ab') 2片段山羊抗鼠IgG,Fab片段特异性二抗染色。其结果如图13所示。
结果显示，所得MSC稳定细胞系能够持续表达ACE2-BITE。
实施例7 间充质干细胞MSC表达IL-22-FC
将VSV-g，Gag/Pol，RSV-REV和pCDH-MSCVEF-IL-22-Fc(其包含编码IL-22-Fc的核酸分子)转染到Lenti-X 293细胞，48小时后收取上清，0.45μM过滤后，为IL-22-Fc病毒上清。
将MSC接种到6孔板，加入0.5mL IL-22-Fc病毒上清，加入凝聚胺至终浓度为10μg/ml，24小时后换液，48小时后加入嘌呤霉素筛选，获得稳定表达IL-22-Fc的MSC细胞，4天后ELISA检测上清中IL-22-Fc的含量。其结果如图14所示。
结果显示，所得MSC稳定细胞系能够持续表达IL-22-Fc。
实施例8 间充质干细胞MSC表达IL-6R抗体-Fc
将VSV-g，Gag/Pol，RSV-REV和pCDH-MSCVEF-IL-6R抗体-Fc(其包含编码IL-6R抗体-Fc的核酸分子)转染到Lenti-X 293细胞，48小时后收取上清，0.45μM过滤后，为IL-6R抗体-Fc病毒上清。
将MSC接种到6孔板，加入0.5mL IL-6R抗体-Fc病毒上清，加入凝聚胺至终浓度为10μg/ml，24小时后换液，48小时后加入嘌呤霉素筛选，获得稳定表达IL-6R抗体-Fc的MSC细胞，4天后ELISA检测上清中IL-6R抗体-Fc的含量。其结果如图15所示。
结果显示，所得MSC稳定细胞系能够持续表达IL-6R抗体-Fc。
实施例9 S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白(ACE2 BBZ)的生产和功能
9.1 ACE2 BBZ CAR-T的生产
人工合成以下序列：ACE2 1-740(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，BBZ(其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)连接得到ACE2 BBZ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
通过XbaI和BamHI酶切位点将编码ACE2 BBZ的核酸分子(其核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示)克隆到pCDH-MSCVEF载体。测序正确的克隆用NucleoBond Xtra Midi Plus EF试剂盒无内毒素大提，将VSV-g，Gag/Pol，RSV-REV和pCDH-MSCVEF-ACE2BBZ(其包含编码ACE2 BBZ的核酸分子)转染到Lenti-X 293细胞，48小时后收取上清，0.45μM过滤后，超速离心浓缩得到ACE2 BBZ病毒。
9.2 ACE2 BBZ CAR-T的功能
取实施例9.1制备所得的ACE2 BBZ病毒转染人T细胞，获得ACE2 BBZ CAR-T细胞，并以野生型人T细胞作为对照。将野生型人T细胞和ACE2 BBZ CAR-T细胞与293细胞和293-S蛋白细胞在37℃，5％CO 2条件下共培养，48小时后流式细胞仪检测293细胞和293-S蛋白细胞的存活情况，从而检测ACE2 BBZ的杀伤效果。其结果如图16所示。同时检测上清中T细胞活化分泌IFNγ的含量。其结果如图17所示。
结果显示，与野生型人T细胞相比，ACE2BBZ CAR-T细胞能选择性杀伤表达SARS-CoV-2 S蛋白的细胞。
实施例10 ACE2-Fc的小鼠体内药代动力学分析和副作用分析10.1 ACE2-Fc对小鼠的副作用分析
将实施例1.1中制备的ACE2-Fc蛋白(200μg)腹腔注射到C57BL/c小鼠，注射后7天，每天检测小鼠体重，结果如图18所示，同时以不进行所述注射的小鼠作为对照。于第7天取小鼠心，肝，脾，肺和肾脏组织，进行HE染色分析。结果如图19所示。
结果显示ACE2-FC(200μg)给药，对小鼠体重无影响，心，肝，脾，肺和肾脏组织无可见组织损伤。
ACE2-Fc的小鼠药代动力学分析
将实施例1.1中制备的ACE2-Fc蛋白(100μg)静脉注射到C57BL/c小鼠，注射后5分钟，30分钟，1小时，2小时，3小时，6小时，1天，2天，3天，5天，7天，分别取血获得血清，通过ELISA检测血清中的ACE2-Fc的含量。结果如图20所示。
结果显示单次ACE2-FC(100μg)给药，在小鼠体内能够存续大于七天，其半衰期约8.21 小时。
实施例11 S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白(ACE2 BBZ-IL-22-Fc)的生产和功能
11.1 ACE2 BBZ-IL22-Fc CAR-T的生产
人工合成以下序列：ACE2 1-740(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，BBZ(其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)，连接肽P2A(其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示)，IL-22-Fc连接得到ACE2 BBZ-IL-22-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
通过XbaI和BamHI酶切位点将编码ACE2 BBZ-IL-22-Fc的核酸分子克隆到pCDH-MSCVEF载体。测序正确的克隆用NucleoBond Xtra Midi Plus EF试剂盒无内毒素大提，将VSV-g，Gag/Pol，RSV-REV和pCDH-MSCVEF-ACE2BBZ-IL-22-Fc(其包含编码ACE2 BBZ-IL-22-Fc的核酸分子)转染到Lenti-X 293细胞，48小时后收取上清，0.45μM过滤后，超速离心浓缩得到ACE2 BBZ-IL-22-Fc病毒。同时取48小时后上清，ELISA检测IL-22-Fc表达，结果图21所示。
结果显示，ACE2 BBZ-IL-22-Fc转染细胞能分泌表达IL-22Fc。
11.2 ACE2 BBZ-IL-22-Fc CAR-T的功能
取实施例11.1制备所得的ACE2 BBZ-IL-22-Fc病毒转染人T细胞，获得ACE2 BBZ-IL-22-Fc CAR-T细胞，并以野生型人T细胞作为对照。将野生型人T细胞和ACE2 BBZ-IL-22-Fc CAR-T细胞与293细胞和293-S蛋白细胞在37℃，5％CO 2条件下共培养，48小时后流式细胞仪检测293细胞和293-S蛋白细胞的存活情况，从而检测ACE2 BBZ-IL-22-Fc的杀伤效果。其结果如图22所示。
结果显示，与野生型人T细胞相比，ACE2BBZ-IL-22-Fc CAR-T细胞能选择性杀伤表达SARS-CoV-2 S蛋白的细胞。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

Claims (49)

  1. 融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和靶向部分，其中所述S蛋白包括冠状病毒的S蛋白，所述靶向部分能够特异性结合活化T细胞的因子。
  2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段与所述靶向部分直接或间接连接。
  3. 根据权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，其中所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段包含ACE2蛋白的胞外结构域。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段来源于人。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述活化T细胞的因子选自下组：CD3和CD28。
  7. 根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述靶向部分包括抗体或其抗原结合片段。
  8. 根据权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab') 2，F(ab) 2，dAb，分离的互补决定区CDR，Fv和scFv。
  9. 根据权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述靶向部分为scFv。
  10. 根据权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
  11. 根据权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白，其中所述间接连接包括通过连接子连接。
  12. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述连接子为肽连接子。
  13. 根据权利要求11-12中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子包含SEQ ID NO:3，27-32中任一项所示的氨基酸序列。
  14. 根据权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
  15. 融合蛋白，其包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段和嵌合抗原受体(CAR)功能结构，其中所述S蛋白包括冠状病毒的S蛋白，所述嵌合抗原受体功能结构包括跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
  16. 根据权利要求15所述的融合蛋白，其中所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段与所述嵌合抗原受体功能结构直接或间接连接。
  17. 根据权利要求15-16中任一项所述的融合蛋白，其中所述S蛋白的结合蛋白或其功能性 片段包含ACE2蛋白的胞外结构域。
  18. 根据权利要求15-17中任一项所述的融合蛋白，其中所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段来源于人。
  19. 根据权利要求15-18中任一项所述的融合蛋白，其中所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
  20. 根据权利要求15-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述跨膜结构域包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
  21. 根据权利要求15-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
  22. 根据权利要求15-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述共刺激结构域包含源自选自下述蛋白的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。
  23. 根据权利要求15-22中任一项所述的融合蛋白，其中所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:
    6所示的氨基酸序列。
  24. 根据权利要求15-23中任一项所述的融合蛋白，其中所述胞内信号传导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
  25. 根据权利要求15-24中任一项所述的融合蛋白，其中所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
  26. 根据权利要求15-25中任一项所述的融合蛋白，其中所述嵌合抗原受体功能结构还包括铰链区。
  27. 根据权利要求26所述的融合蛋白，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
  28. 根据权利要求15-27中任一项所述的融合蛋白，其中所述嵌合抗原受体功能结构包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
  29. 根据权利要求15-28中任一项所述的融合蛋白，其还包括细胞因子。
  30. 根据权利要求29所述的融合蛋白，其中所述细胞因子位于所述融合蛋白的C端。
  31. 根据权利要求29-30中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞因子与所述嵌合抗原受体功能结构直接或间接连接。
  32. 根据权利要求29-31中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞因子包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
  33. 根据权利要求29-32中任一项所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
  34. 一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-33中任一项所述的融合蛋白。
  35. 载体，其包含权利要求34所述的核酸分子。
  36. 细胞，其表达权利要求1-33中任一项所述的融合蛋白，和/或包含权利要求34所述的核酸分子，和/或包含权利要求35所述的载体。
  37. 根据权利要求36所述的细胞，其中所述细胞选自下组：间充质干细胞和T细胞。
  38. 制备根据权利要求1-33中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括以下的步骤：培养权利要求36所述的细胞。
  39. 药物组合物，其包含权利要求1-33中任一项所述的融合蛋白。
  40. 权利要求1-33中任一项所述的融合蛋白在制备药物中的用途，其中所述药物用于预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病。
  41. 根据权利要求40所述的用途，其中所述冠状病毒包括SARS-CoV和SARS-CoV-2。
  42. 药物产品，其包括包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白，和细胞因子或其融合蛋白，其中所述S蛋白包括冠状病毒的S蛋白。
  43. 根据权利要求42，其中所述包含S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白包括权利要求1-33中任一项所述的融合蛋白。
  44. 根据权利要求42-43中任一项所述的药物产品，其中所述S蛋白的结合蛋白或其功能性片段的融合蛋白包含ACE2-Fc融合蛋白，所述ACE2-Fc融合蛋白包括ACE2蛋白的胞外结构域以及与其直接或间接连接的IgG的Fc区域。
  45. 根据权利要求42-44中任一项所述的药物产品，其中所述细胞因子或其融合蛋白包括促进型细胞因子或其融合蛋白，和/或，抑制型细胞因子或其融合蛋白，其中所述促进型细胞因子包括IL-22，和/或，所述抑制型细胞因子包括IL-6。
  46. 根据权利要求45所述的药物产品，其中所述促进型细胞因子或其融合蛋白包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
  47. 根据权利要求45-46中任一项所述的药物产品，其中所述抑制型细胞因子或其融合蛋白包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
  48. 根据权利要求42-47中任一项所述的药物产品在预防、缓解或治疗冠状病毒所引起的疾病中的用途。
  49. 根据权利要求48所述的用途，其中所述病毒包括SARS-CoV和SARS-CoV-2。
PCT/CN2021/088598 2020-04-22 2021-04-21 融合蛋白分子及其制备方法和用途 WO2021213421A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010324085.4 2020-04-22
CN202010324085.4A CN113527510A (zh) 2020-04-22 2020-04-22 融合蛋白分子及其制备方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021213421A1 true WO2021213421A1 (zh) 2021-10-28

Family

ID=78094137

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2021/088598 WO2021213421A1 (zh) 2020-04-22 2021-04-21 融合蛋白分子及其制备方法和用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113527510A (zh)
WO (1) WO2021213421A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11434291B2 (en) 2019-05-14 2022-09-06 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
WO2022184854A2 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Formycon Ag Formulations of ace2 fc fusion proteins
EP4331571A1 (en) 2022-09-02 2024-03-06 Formycon AG Formulations of ace2-igm fusion proteins

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023144625A2 (en) * 2022-01-27 2023-08-03 The Chinese University Of Hong Kong Enhanced hace2-based neutralizing agents against sars-cov-2 infection
CN114591988B (zh) * 2022-03-30 2023-01-13 北京贝来生物科技有限公司 一种激活肿瘤免疫的基因修饰干细胞制备方法
CN114606219B (zh) * 2022-04-01 2023-10-31 北京大学 一种冠状病毒中和效应蛋白及其应用
CN114606218B (zh) * 2022-04-01 2023-10-27 北京大学 冠状病毒中和效应蛋白及其应用
CN115521928A (zh) * 2022-05-20 2022-12-27 中山大学·深圳 Ace2功能结构域肽段及其在制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物中的应用
CN116059348A (zh) * 2022-09-16 2023-05-05 四川大学华西医院 基于nkg2d的细胞接合器分子在清除衰老细胞中的应用
CN116023511B (zh) * 2023-02-03 2024-04-09 北京强本生物技术有限公司 一种融合蛋白及其在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHANGHAI LEI; WENYAN FU; KEWEN QIAN; TIAN LI; SHENG ZHANG; MIN DING; SHI HU: "Potent Neutralization of 2019 Novel Coronavirus by Recombinant ACE2-Ig", 3 February 2020 (2020-02-03), pages 1 - 11, XP055745522, Retrieved from the Internet <URL:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.01.929976v2.full.pdf> DOI: 10.1101/2020.02.01.929976 *
GIULIA FABOZZI, AMARENDRA PEGU, RICHARD A. KOUP, CONSTANTINOS PETROVAS: "Bispecific antibodies: Potential immunotherapies for HIV treatment", METHODS, vol. 154, 1 February 2019 (2019-02-01), NL, pages 118 - 124, XP055861234, ISSN: 1046-2023, DOI: 10.1016/j.ymeth.2018.10.010 *
VEDA SHEERSH BOORLA , RATUL CHOWDHURY , COSTAS D. MARANAS: "De novo design of high-affinity antibody variable regions (scFv) against the SARS-CoV-2 spike protein", BIORXIV, 11 April 2020 (2020-04-11), pages 1 - 13, XP055861231, DOI: 10.1101/2020.04.09.034868 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11434291B2 (en) 2019-05-14 2022-09-06 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
WO2022184854A2 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Formycon Ag Formulations of ace2 fc fusion proteins
EP4331571A1 (en) 2022-09-02 2024-03-06 Formycon AG Formulations of ace2-igm fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
CN113527510A (zh) 2021-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021213421A1 (zh) 融合蛋白分子及其制备方法和用途
JP2020096630A5 (zh)
WO2022007795A1 (zh) 一种嵌合受体及其应用
US20220340927A1 (en) Methods and compositions for the modification and delivery of lymphocytes
CN111925451B (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用
CN111944054A (zh) 抗bcma的car及其表达载体和应用
JP2019511246A (ja) 改変ｈｓｐ７０ドメインを有する抗原結合融合タンパク質
CN111944053B (zh) 抗bcma的car及其表达载体和应用
JP2022529380A (ja) キメラ抗原受容体構築物およびｃａｒ－ｔ細胞におけるそれらの使用
JP2001526241A (ja) Ｈｉｖ感染に対する感受性を低下させるための方法
WO2024056097A1 (zh) 基于nkg2d的细胞接合器分子在清除衰老细胞中的应用
CN108753773A (zh) 干扰IFN-gama表达的CD19-CAR-T细胞及其应用
JP2023515471A (ja) 抑制性キメラ受容体構造物
WO2011047631A1 (zh) 具有cd137l功能的蛋白或多肽及其基因和应用
WO2023131285A1 (zh) 靶向cldn18.2和msln的嵌合抗原受体及其用途
WO2023161846A1 (zh) 一种靶向gpc3嵌合抗原受体t细胞及其应用
WO2023024084A1 (zh) 一种嵌合抗原受体及其用途
US20240050567A1 (en) Modified immune effector cell and use thereof
EP2091972A1 (en) Multi-modal cancer therapy using viral hitch-hiking
WO2022116528A1 (zh) 环状rna、包含环状rna的疫苗及用于检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒
CN108753774A (zh) 干扰il-6表达的cd19-car-t细胞及其应用
JP7088902B2 (ja) キメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体タンパク質を発現するｔリンパ球
WO2020253879A1 (zh) 一种双特异性嵌合抗原受体
US20230364136A1 (en) T lymphocyte and applications thereof
WO2023125813A1 (zh) 抗间皮素纳米抗体嵌合抗原受体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21791861

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21791861

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1