CN114480292B - 利用shRNA沉默人Tim-3基因构建CAR-T细胞的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用shRNA沉默人Tim‑3基因构建靶向ROR1的CAR‑T细胞的方法及其应用，本发明方法制备的HKP55 CAR‑T细胞能应用于癌症的治疗。本发明通过设计3种不同的小发卡RNA（shRNA）序列特异性的靶向Tim‑3基因，通过筛选获得沉默效果最好的shRNA‑3序列。因此，将shRNA‑3序列与靶向ROR1的CAR序列共转导入T细胞，制备出Tim‑3基因沉默的ROR1 CAR‑T（HKP55 CAR‑T）细胞。HKP55 CAR‑T细胞的Tim‑3表达水平极大的降低，与ROR1 CAR‑T（HKP69 CAR‑T）细胞相比较，Tim‑3基因的沉默显著增强了ROR1 CAR‑T细胞对高表达Galectin‑9的靶细胞的体外杀伤以及靶细胞依赖的细胞增殖。因此，HKP55 CAR‑T细胞能够克服复杂的免疫抑制性的肿瘤微环境，持续增殖并发挥抗肿瘤效应功能。

Description

利用shRNA沉默人Tim-3基因构建CAR-T细胞的方法及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学和分子生物学领域，特别涉及CAR-T细胞。
背景技术
目前，嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞治疗是近些年发展起来的一种靶向免疫细胞新疗法。CAR-T细胞在恶性血液肿瘤中取得了令人瞩目的成就，但是在实体肿瘤中的疗效仍然不够理想。其中一个主要原因在于实体肿瘤的免疫抑制性微环境及肿瘤细胞本身的免疫逃逸机制导致CAR-T细胞功能紊乱，无法发挥抗肿瘤免疫应答，但国内对通用CAR-T的研究与应用尚处于初步阶段。
T淋巴细胞免疫球蛋白粘蛋白3（T cell immunoglobulin and mucin-domaincontaining-3， Tim-3）是一种跨膜蛋白，由Havcr2编码。最早发现于能够分泌IFN-γ的CD4+和CD8+效应T细胞。现在发现Tim-3在多种免疫细胞，如：B细胞、DC细胞、NK细胞、巨噬细胞中广泛表达。多项研究表明，Tim-3是抑制性免疫检验点分子，与其重要的配体之一Galectin-9相互作用可介导T细胞应答抑制和功能损伤，从而表现出耗竭状态。
发明内容
目前研究显示CAR-T细胞在体外活化和扩增过程中观察到Tim-3免疫检验点分子的表达水平显著提升。因此，CAR-T细胞进入含有大量肿瘤细胞来源的Galectin-9蛋白的肿瘤微环境中，其增殖能力和抗肿瘤应答能力将很大程度受到限制。
本发明中，通过设计3种不同的小发卡RNA（shRNA）序列特异性的靶向Tim-3基因，通过筛选获得沉默效果最好的shRNA-3序列。因此，将shRNA-3序列与靶向ROR1的CAR序列共转导入T细胞，制备出Tim-3基因沉默的ROR1 CAR-T（HKP55 CAR-T）细胞。HKP55 CAR-T细胞的Tim-3表达水平极大的降低，与ROR1 CAR-T（HKP69 CAR-T）细胞相比较，Tim-3基因的沉默显著增强了ROR1 CAR-T细胞对高表达Galectin-9的靶细胞的体外杀伤以及靶细胞依赖的细胞增殖。因此，HKP55 CAR-T细胞能够克服复杂的免疫抑制性的肿瘤微环境，持续增殖并发挥抗肿瘤效应功能。
需要说明的是本发明权利要求书中记载的方法在人体外进行，要保护的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法及其应用和本发明方法制备的HKP55 CAR-T细胞作为为癌症治疗药物这一用途，保护范围不包含任何疾病的治疗方法。
本发明提供了一种利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，通过设计小发卡RNA序列特异性的靶向Tim-3基因，筛选获得具有沉默效果的小发卡RNA序列，具有沉默效果的小发卡RNA序列与靶向ROR1的CAR序列共转导入T细胞，制备出Tim-3沉默的ROR1 CAR-T。
根据上述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，本发明通过设计小发卡RNA序列特异性的靶向Tim-3基因设计3种不同的小发卡RNA，先对Tim-3基因沉默的siRNA序列设计和合成如下序列：
Tim3-siRNA-1 序列如SEQ ID No.1：GGAGCCTGTCCTGTGTTTGAATT；
Tim3-siRNA-2 序列如SEQ ID No.2：GCCTCCCTGATATAAATCTAATT；
Tim3-siRNA-3 序列如SEQ ID No.3：GCAACCATCAGAATAGGCATCTACA。
在一些方案中，上述Tim-3基因沉默的siRNA序列的对照为Tim3-siRNA-NC序列如SEQ ID No.4：TTTGTACTACACAAAAGTACTG。
在一些方案中，上述方法筛选获得Tim3-siRNA-3 序列如SEQ ID No.3：GCAACCATCAGAATAGGCATCTACA。
在一些方案中，上述具有沉默效果的小发卡RNA序列为Tim-3-shRNA-3 序列如SEQID No.5：
TGCAACCATCAGAATAGGCATCTACATTCAAGAGATGTAGATGCCTATTCTGATGGTTGCTTTTTT。
在一些方案中，上述方法还包括根据所述Tim-3-shRNA-3 序列设计合成阴性对照Tim-3-shRNA-NC 序列如SEQ ID No.6：
TGGAAAGTTATTAGGTCTACCGTAGATTCAAGAGATCTACGGTAGACCTAATAACTTTCCTTTTTT。
在一些方案中，上述利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法步骤为：
步骤1. Tim-3基因沉默的siRNA序列设计和合成获得Tim3-siRNA-1 、Tim3-siRNA-2 、Tim3-siRNA-3及空白Tim3-siRNA-NC；
步骤2. 筛选对Tim-3基因沉默效率最高的siRNA，获得Tim3-siRNA-3；
步骤3. 构建pLL3.7-Tim-3-shRNA慢病毒转移载体
根据所述步骤2的siRNA沉默效率筛选结果，选择Tim-3-siRNA -3序列进行shRNA序列的设计并合成Tim-3-shRNA-3，同时设计合成阴性对照Tim-3-shRNA-NC；
步骤4. Lenti-TIM3-shRNA-NC和Lenti-TIM3-shRNA-3重组慢病毒制备；
步骤5.重组慢病毒对Tim-3基因沉默效率验证；
步骤6. pLL3.7-TIM3-shRNA-3-ROR1 CAR重组质粒构建（方法同步骤3）
步骤7. CAR-T细胞制备。
在一些方案中，上述步骤7获得HKP69 CAR-T和HKP55 CAR-T细胞，其中HKP55 CAR-T细胞Tim-3表达水平显著低于HKP69 CAR-T细胞，HKP55 CAR-T细胞为制备出沉默Tim-3基因表达的靶向ROR1抗原的 CAR-T细胞。
本发明还提供上述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法应用于制备克服复杂的免疫抑制性的肿瘤微环境，持续增殖并发挥抗肿瘤效应功能的CAR-T细胞。
本发明利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法制备的HKP55 CAR-T细胞作为癌症治疗药物的应用。
附图说明
图1：本发明Tim-3蛋白表达水平的检测图；
图2：pLL3.7-TIM3- shRNA-3和pLL3.7-TIM3- shRNA-NC质粒酶切验证；
图3：lenti-shRNA-TIM3感染的293A-Tim-3细胞中Tim-3蛋白的表达情况 ；
图4：EcoRI/NheI双酶切pLL3.7-TIM3-shRNA-3质粒后电泳图 ；
图5： EcoRI/NheI双酶切ROR1 CAR片段后电泳图 ；
图6： pLL3.7-TIM3-shRNA-3-ROR1CAR质粒酶切验证；
图7： HKP69和HKP55重组慢病毒感染的CAR阳性T细胞表面Tim-3表达水平；
图8：培养上清中IL-2的释放水平 ；
图9：培养上清中IFN-的释放水平 ；
图10：HKP55 CAR-T细胞对靶细胞的裂解；
图11：培养上清中IL-2的释放水平；
图12：培养上清中IFN-的释放水平；
图13：靶细胞依赖的细胞增殖检测，其中a图为细胞增殖流式检测，b图显示HKP55和HKP69细胞平均荧光强度。
实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
1.Tim-3基因沉默的siRNA序列设计和合成。
根据BLOCK-iTTMRNAi Designer对Tim-3编码序列设计siRNA (表1)。靶向序列进行BLAST（NCBI）非同源性查询，显示无其它同源序列。把设计好的序列送至苏州金唯智生物科技有限公司进行siRNA合成。
2.筛选对Tim-3基因沉默效率最高的siRNA。
1）siRNA转染
a）为了验证四种不同siRNA靶向沉默Tim-3基因的效率，我们构建了稳定表达Tim-3-EGFP融合蛋白的293A细胞，命名为293A-Tim-3。转染前一天将293A-Tim3细胞按3×104/孔接种至24孔板，置于5% CO2，37℃培养箱中孵育过夜；
b）待细胞汇合度达70%左右开始转染。分别取27.5 pmol 的Tim3-siRNA-1、Tim3-siRNA-2、Tim3-siRNA-3、Tim3-siRNA-NC四种siRNA加至含50 ul jet PRIME buffer 的1.5ml离心管中，涡旋震荡10秒后离心使管壁液体沉入管底；
c）向步骤b) 1.5 ml离心管中每管加入2 ul jet PRIME@Regent（Polyplus，货号：21Y0910L3），涡旋震荡10 s后离心使管壁液体沉入管底，并室温孵育10 min；
d）将步骤c) 制备好的四种转染混合物滴加到前一天接种的24孔板细胞中，每孔终体积为0.5 ml；置于5% CO2，37℃培养箱中孵育；
e）4小时后，转染孔更换为含10% FBS的DMEM新鲜培养基，继续孵育48小时。
2）WB检测
a）收取步骤1）中四种siRNA转染的293-TIM3细胞，加入100 ul RIPA (solarbio，R0010)含1% NP-40 (XW0901645901，国药集团)和1%的PMSF(solarbio，R0010)的裂解液，涡旋混匀30 s，冰上放置20 min;
b）上述样品经过4℃，12000 rpm离心10 min后转移上清到新的离心管中；
c）加入6×protein loading至工作浓度(1×)，100 ℃加热6 min使蛋白变性，样品可直接用于SDS电泳或保存于-20℃冰箱备用。
d）分别取上述四种细胞裂解物各30 μL，加样至10% SDS-PAGE，120 V，90 min完成电泳；
e）通过350 mA恒流120 分钟，将SDS-PAGE中的蛋白转移到PVDF膜；
e）转膜后的PVDF膜放置于含5% 脱脂牛奶的封闭液中，4℃封闭过夜；
f）封闭后的PVDF膜剪成两份，再分别放入10 ml含TIM3抗体（3G11，来源自小鼠腹水纯化的抗体，1;5000稀释）和10 ml GAPDH抗体（货号为39-8600，Thermo fisher, 1:5000)），室温震荡孵育1h；
g）经一抗孵育的PVDF膜用TBST洗涤4次，每次5分钟；
h）洗涤后的PVDF膜放入10ml含辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗(中杉金桥，ZB-2305)，室温孵育50 min；
i）TBST洗涤3次，每次5 min;
j）加入ECL超敏显色液后，用天能的成像系统（上海天能科技有限公司，#Tanon-4600SF）拍照；
结果分析：293A-Tim-3细胞为稳定表达人TIM3-EGFP融合蛋白的稳转细胞系。Tim-3-EGFP融合蛋白分子量大小为100 kDa左右，由于Tim-3-siRNA靶向沉默Tim-3基因，因此可预测WB结果在100 kDa附近蛋白条带的亮度会相较于对照组降低。WB结果显示Tim-3-siRNA1/2/3可显著降低目的蛋白的表达，其中Tim-3-siRNA-3对目的基因的沉默效率最高（图1 Tim-3蛋白表达水平的检测）。
3.构建pLL3.7-Tim-3-shRNA慢病毒转移载体。
根据上述步骤2的siRNA沉默效率筛选结果，选择Tim-3-siRNA -3序列进行shRNA序列的设计并合成，同时设计合成阴性对照Tim-3-shRNA-NC。其序列信息如下所示（表2）
将表2中的TIM3-shRNA-3和TIM3-shRNA-NC序列送至苏州金唯智生物科技有限公司合成，并将合成的目的基因片段连接至pLL3.7-U6-EF1α-EGFP质粒（该质粒苏州恒康生命科学有限公司构建保存）从而获得重组质粒pLL3.7-Tim-3-shRNA-3和pLL3.7-Tim-3-shRNA-NC。
具体方法如下：
1） 酶切
骨架质粒线性化酶切：pLL3.7-U6-EF1α-EGFP质粒1 ug，加入1 ul限制性内切酶Hpa I （NEB，R0105S）和1 ul 限制性内切酶Xho I (NEB，R0146S)，5 ul CutSmart®Buffer （NEB），最后加入双蒸水使整个反应体积达到50 ul。样品置于37℃反应1小时;
2）线性化质粒和目的基因片段回收
·所需试剂
1×TAE： 4.84 g Tris (solarbio, #T8060-100g)、0.744 g Na2EDTA.2H2O (沪试，#10009717）、1.142 ml冰醋酸(国药, #10000218)充分溶解到适量ddH2O中，定容到1 L后使用。
琼脂糖 （Biowest，BY-R0100）
琼脂糖凝胶回收试剂盒：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根, #DP209-02)
DNA loading：6x DNA loading (全式金，#GH101)
·实验步骤
a．1%琼脂糖凝胶制备
称取0.5 g琼脂糖，加入50 mL 1×TAE溶液后混合均匀，微波炉中煮沸2 min后加入凝胶槽中进行冷凝；
b. 琼脂糖凝胶电泳
将线性化质粒和目的片段样品加入DNA loading至1×后加入点样孔后，150 V电泳15 min;
c. 线性化质粒和目的条带切胶
在紫外切胶仪下将含目的条带的琼脂糖凝胶切下转移到新的1.5 mL离心管中
d．目的条带回收
根据琼脂糖凝胶回收试剂盒步骤操作回收目的片段，测定浓度后保存在-20℃。
3）连接
所需试剂
连接试剂盒：Minerva Super Fusion Cloning Kit 试剂盒（苏州宇恒，#M2026-50T）
实验步骤
a．反应体系
配制如下连接反应体系：
组分 体积
Super Fusion Cloning Mix (2×) 5 μL
线性化载体* 1 μL
目的基因片段* 4 μL
*：步骤2）回收的目的基因片段和线性化载体按照2:1 (摩尔比)加入反应体系。
b. 连接
混匀后置37 ℃，反应30 min
c．储存
反应结束后获得含重组慢病毒质粒pLL3.7-TIM3-shRNA-3系列的连接产物立即使用或者保存在-20℃备用。
4）转化
·所需试剂
DH5α感受态细胞(康体生命，# KTSM101L)
LB液体培养基：10g胰蛋白胨(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、5g酵母提取物(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、10g NaCl(沪试，#10019308)加入ddH2O溶解后调节pH 7.0定容到1 L，121℃、15 min高压灭菌后冷却至室温使用
LB固体培养基：10g胰蛋白胨(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、5g酵母提取物(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、10g NaCl(沪试，#10019308) 后调节pH 7.0，然后加入10g琼脂粉(阿拉丁，#A109143-5kg )，定容到1 L，121℃、15 min高压灭菌后冷却至室温使用
抗生素：称取1g对应的抗生素粉末(sigma)，充分溶解到20 mL 双蒸水，0.22 μm除菌过滤洗头除菌后分装保存于-20℃
·实验步骤
a. 取一支DH5α感受态（100 μl）置于冰上解冻，待感受态细胞解冻后，吸取步骤3）的连接产物10 ul加入融融状态的感受态细胞中，轻轻吹打几次混匀后置于冰上冰浴20min;
b. 冰浴结束，置于水浴锅中42℃热激90 s后立刻放于冰上2 min;
c. 混合物中加入500 μl 无抗LB液体培养基,37℃,200 rpm复苏1 h;
d. 吸取适量复苏后菌液涂布到含有100 μg/mL含有对应抗生素的LB固体培养基上；
e. 37℃培养箱中倒置过夜培养，可见LB固体培养基上出现单克隆菌落；
5）质粒抽提
所需试剂
LB液体培养基：10g胰蛋白胨(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、5g酵母提取物(Sigma-Aldrich，#70161-500G)、10g NaCl(沪试，#10019308)加入ddH2O溶解后调节pH 7.0定容到1 L，121℃、15 min高压灭菌后冷却至室温使用
质粒小提试剂盒：Omega质粒小提试剂盒(Omega, #D6943-01-100T)
抗生素：称取1g对应的抗生素粉末(sigma)，充分溶解到20 mL ddH2O，0.22μm除菌过滤洗头除菌后分装保存于-20℃。
实验步骤
a) 挑取步骤4）LB固体培养基生长的单克隆，加入5 mL含有100 μg/mL含有对应抗生素的LB液体培养基，在37℃细菌培养摇床200 rpm过夜培养(12-16 h);；
b) 取1.5~5ml菌液室温10000×g离心1mi
c) 去上清，加250µl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。
d) 加入250µl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖)
e) 加350µl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min.
f) 特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱
g) 弃滤过液，加500µl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。
h) 如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略
i) 弃滤过液，再用100%乙醇稀释的750µl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签如果经过冷冻，用前必须恢复室温。
j) 此步可选：再加750µl Wash Buffer清洗吸收柱
k) 必须将吸收柱10000×g离心1min确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤。
l) 将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100µl (取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min。
m) 测浓度后，于-20℃冰箱保存备用。
6）酶切验证
取步骤5）中抽提的pLL3.7-TIM3- shRNA -3重组质粒1 ug，加入1 ul限制性内切酶EcoR I （NEB，R3101S）和1 ul 限制性内切酶Apa I (NEB，R0114S)，5 ul CutSmart®Buffer （NEB），最后加入双蒸水使整个反应体积达到50 ul。样品置于37℃反应1小时。随后通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，显示切下一条约1710 bp的条带则证明目的条带连接上去。同样的方法验证pLL3.7-TIM3- shRNA-NC重组质粒。双酶切结果表明pLL3.7-TIM3-shRNA-3和pLL3.7-TIM3- shRNA-NC重组质粒构建成功（如图2所示）。
图2：pLL3.7-TIM3- shRNA-3和pLL3.7-TIM3- shRNA-NC质粒酶切验证。1：Marker；2：未处理pLL3.7-TIM3- shRNA-3重组质粒；3：EcoR I和Apa I双酶切pLL3.7-TIM3- shRNA-3重组质粒；4：未处理pLL3.7-TIM3- shRNA-NC重组质粒；3：EcoR I和Apa I双酶切pLL3.7-TIM3- shRNA-NC重组质粒
7）测序验证
为了进一步确认pLL3.7-TIM3- shRNA-3和pLL3.7-TIM3- shRNA-NC重组质粒基因序列没有突变、缺失等情况，将步骤6）酶切验证的重组质粒送泓迅生物科技股份有限公司进行Sanger测序验证。插入的目的基因序列测序结果与我们设计的shTIM3序列一致，则说明重组慢病度质粒pLL3.7- shTIM3 -EGFP系列构建成功可用于下一步实验。
4.Lenti-TIM3-shRNA-NC和Lenti-TIM3-shRNA-3重组慢病毒制备。
1）慢病毒包装
a）细胞接种
将293T细胞以7x105个细胞/孔的密度接种于含有2 mL慢病毒包装培养基的6孔培养板中。置于37℃，5% CO2条件下孵育细胞过夜，保证转染时细胞密度应达到95-99%汇合。
b）转染
将所有质粒用Opti-MEM（Thermo，#31985070）稀释至1μg/ul；
i. A管：250 μL 无血清Opti-MEM培养基稀释7 μl Lipofectamine 3000（Thermo,#L3000015），涡旋混匀 10s。
ii. B管：将重组慢病毒转移质粒pLL3.7- TIM3-shRNA-3或对照重组慢病毒转移质粒pLL3.7- TIM3-shRNA-NC、慢病毒包装质粒 psPAX2和pMD2.G以摩尔比1:1:1加至250 μL 无血清Opti-MEM培养基，并加入6 μL P3000试剂，涡旋混匀 10s。
c）制备脂质体-DNA复合物：将A管混合物转移至B管并充分混匀，室温孵育10 min。
d）加入复合物前，每孔去除1mL的培养基，使每孔总体积为1mL，然后向每孔加入500 uL的脂质体-DNA复合物，轻轻震荡培养板，使其分布均匀。将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育6小时。
e）转染6小时后，从每孔中小心吸去包含脂质体-DNA复合物的培养基，吸出的培养基用10%漂白溶液处理后再处置。替换成2mL预热的含10% FBS的 DMEM（Hyclone，#SH30022.01；FBS，#FSP500）新鲜培养基。将培养板放回培养箱，在37°C、5% CO2培养箱中继续孵育。
f）转染24小时后，每孔中收集2mL细胞上清液，装入15mL锥形管中并置于4°C保存。补加2mL预热的含10% FBS的 DMEM（Hyclone，#SH30022.01；FBS，#FSP500）新鲜培养基。将培养板置于37°C、5% CO2条件继续孵育。
g）24小时后（转染约48小时），从每孔中收集2mL的细胞上清液，与首次收集的上清液混合，使收集上清液总体积为4mL。
h）室温下以2,000 rpm离心10分钟，去除细胞碎片。收集并转移上清液，弃去细胞沉淀，用0.45μm的滤膜过滤后制得Lenti-TIM3-shRNA-NC和Lenti-TIM3-shRNA-3重组慢病毒悬液，置于-80°C冰箱保存备用。
2) 慢病毒滴度检测
a）将293T细胞以1x105/孔的密度接种于含有10% FBS的DMEM培养基的6孔板中，总体积为1 m，37℃，5% CO2条件下孵育细胞过夜。
b）取病毒lenti-shRNA-NC或Lenti- TIM3-shRNA3病毒500 μL，250 μL，125 μL,，62.5 μL，31.25 μL，15.625 μL至孔中，调节总体积为500μL/孔，加入polybrene（Sigma-Aldrich，#TR-1003-G）调节其终浓度为6 ug/ml。37°，5% CO2培养24h后换液。
c）第三天：流式细胞检测
i.收取细胞计数，按照1x105个细胞/管进行取样分装，加10 ul 20 ug/ml ROR1-hFC重组蛋白（novoprotein，#Q01973 （CU96））冰上孵育20 min；
ii.用染色缓冲液洗两遍后，向每管中加入10 ul 浓度为100ug/ml的PE交联的抗人igG Fc二抗（ebioscience，#12-4998-82）冰上孵育，20min；
iii.用染色缓冲液洗两遍后，流式细胞分析并计算病毒滴度，病毒滴度计算公式：病毒滴度=（起始细胞接种数×阳性细胞比例）×103/加入的病毒体积（ul）。
5.重组慢病毒对Tim-3基因沉默效率验证。
1）重组慢病毒感染
a）细胞接种：将293A-Tim-3以2x104/孔接种于24孔板中，每孔含有500 ul 10%FBS的 DMEM培养基。在37℃，5% CO2条件下，细胞孵育过夜。
b）病毒感染：根据MOI=2，取lenti-shRNA-NC和lenti -TIM3-shRNA-3两种重组慢病毒，按照4x104/孔加至上述步骤a）的24孔板细胞中，根据已知病毒滴度计算取相应病毒的体积，并补加培养基至每孔中终体积为1 mL。与此同时加入polybrene（Sigma-Aldrich，#TR-1003-G）调节其终浓度为6 ug/ml。在37°，5% CO2条件下培养24小时后更换为含10% FBS的DMEM新鲜培养基。
c）收集细胞：感染72h后收取细胞进行后续检测。
2）WB检测Tim-3蛋白
a）72 h后收集步骤1）中感染后的细胞，加入100 ul RIPA (solarbio，R0010)+1%NP-40 (XW0901645901，国药集团)裂解液(含1%的PMSF)，涡旋混匀30 s，冰上放置20 min;
b）上述样品经过4℃，12000 rpm离心10 min后转移上清到新的离心管中；
c）加入6×protein loading至工作浓度(1×)，100 ℃加热6 min使蛋白变性，样品可直接用于SDS电泳或保存于-20℃冰箱备用。
d）分别取上述两种细胞裂解物30 μL各两份，加样至10% SDS-PAGE，120 V，90 min完成电泳；
e）通过350 mA恒流120 分钟，将SDS-PAGE中的蛋白转移到PVDF膜；
f）转膜后的PVDF膜放置于含5% 脱脂牛奶的封闭液中，4℃封闭过夜；
g）封闭后的PVDF膜剪成两份，再分别放入10 ml含抗人Tim-3抗体（3G11苏州恒康生命科学，1:5000稀释）和10 ml GAPDH抗体（Thermo fisher货号为39-8600, 1:5000)），室温震荡孵育1h；
h）经一抗孵育的PVDF膜用TBST洗涤4次，每次5分钟
i）洗涤后的PVDF膜放入10ml含辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗(中杉金桥，ZB-2305)，室温孵育50 min；
j）TBST洗涤3次，每次5 min;
k）加入ECL超敏显色液后，用天能的成像系统（上海天能科技有限公司，#Tanon-4600SF）拍照；
l）结果分析：人TIM3-EGFP蛋白的分子量大小为100 kDa左右，结果显示lenti-TIM3-shRNA-3感染的293A-Tim-3细胞中Tim-3蛋白的表达水平显著降低（图3： lenti-shRNA-TIM3感染的293A-Tim-3细胞中Tim-3蛋白的表达情况），从而确认TIM-3-shRNA-3可以在重组慢病毒基因组中发挥沉默Tim-3基因表达的作用。
6.pLL3.7-TIM3-shRNA-3-ROR1 CAR重组质粒构建（方法同步骤3）。
制备靶向ROR1蛋白的CAR-T细胞，因此需要将靶向ROR1的嵌合抗原受体 （CAR）基因构建到步骤
1）骨架质粒线性化酶切：pLL3.7-TIM3-shRNA-3质粒1 ug，加入1 ul限制性内切酶EcoR I （NEB，R3101S）和1 ul 限制性内切酶Nhe I (NEB，R3131S)，5 ul CutSmart®Buffer （NEB），最后加入双蒸水使整个反应体积达到50 ul。样品置于37℃反应1小时，预期骨架大小为6100 bp。
2）ROR1 CAR片段扩增与酶切
a）设计ROR1 CAR特异性上下游引物HK-133/HK-134（上游引物序列：；下游引物序列：），携带ROR1 CAR基因片段的PMC167质粒作为模板，通过下列反应体系扩增得到ROR1CAR基因并通过凝胶回收基因片段, 预期片段大小为1400 bp。
反应体系：
组分 体积
10x Buffer for KOD –Plus 5 μl
2mM dNTPs 5 μl
25mM MgSO4 2 μl
10pmol/μl HK-133 1.5 μl
10pmol/μl HK-134 1.5 μl
Template DNA 1 μl
PCR grade water 33 μl
KOD-Plus- (1.0 U/μl) 1 μl
b）目的基因片段酶切：上述步骤2）扩增的ROR1 CAR基因片段1 ug，加入1 ul限制性内切酶EcoR I （NEB，R3101S）和1 ul 限制性内切酶Nhe I (NEB，R3131S)，5 ulCutSmart® Buffer （NEB），最后加入双蒸水使整个反应体积达到50 ul。样品置于37℃反应1小时。
c）线性化骨架质粒载体和目的基因片段回收
·所需试剂
1×TAE： 4.84 g Tris (solarbio, #T8060-100g)、0.744 g Na2EDTA.2H2O (沪试，#10009717）、1.142 ml冰醋酸(国药, #10000218)充分溶解到适量ddH2O中，定容到1 L后使用。
琼脂糖 （Biowest，BY-R0100）
琼脂糖凝胶回收试剂盒：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根, #DP209-02)
DNA loading：6x DNA loading (全式金，#GH101)
·实验步骤
i.a．1%琼脂糖凝胶制备
ii.称取0.5 g琼脂糖，加入50 mL 1×TAE溶液后混合均匀，微波炉中煮沸2 min后加入凝胶槽中进行冷凝；
iii.b. 琼脂糖凝胶电泳
iv.将所有样品加入DNA loading至1×后加入点样孔后，150 V电泳15 min;
v.线性化质粒和目的条带切胶
vi.在紫外切胶仪下将含目的条带（图4：EcoRI/NheI双酶切pLL3.7-TIM3-shRNA-3质粒后电泳图和图5：EcoRI/NheI双酶切ROR1 CAR片段后电泳图）的琼脂糖凝胶切下转移到新的1.5 mL离心管中
vii.根据琼脂糖凝胶回收试剂盒步骤操作回收目的片段，测定浓度后保存在-20℃。
3）连接
·所需试剂
连接试剂盒：Minerva Super Fusion Cloning Kit 试剂盒（苏州宇恒，#M2026-50T）
·实验步骤
反应体系
配制如下连接反应体系：
组分 体积
Super Fusion Cloning Mix (2×) 5 μL
线性化载体* 1 μL
目的基因片段* 4 μL
*：步骤2）回收的目的基因片段和线性化载体按照2:1 (摩尔比)加入反应体系。
混匀后置50℃，反应30 min
反应结束后获得含重组慢病毒质粒pLL3.7- TIM3-shRNA-3-ROR1CAR系列的连接产物立即使用或者保存在-20℃备用。
4）转化
·所需试剂
DH5α感受态细胞(康体生命，# KTSM101L)
LB液体培养基：10g胰蛋白胨(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、5g酵母提取物(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、10g NaCl(沪试，#10019308)加入ddH2O溶解后调节pH 7.0定容到1 L，121℃、15 min高压灭菌后冷却至室温使用
LB固体培养基：10g胰蛋白胨(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、5g酵母提取物(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、10g NaCl(沪试，#10019308) 后调节pH 7.0，然后加入10g琼脂粉(阿拉丁，#A109143-5kg )，定容到1 L，121℃、15 min高压灭菌后冷却至室温使用
抗生素：称取1g对应的抗生素粉末(sigma)，充分溶解到20 mL ddH2O，0.22 μm除菌过滤洗头除菌后分装保存于-20℃
·实验步骤
a. 取一支DH5α感受态（100 μl）置于冰上解冻，待感受态细胞解冻后枪头吸取10μl步骤3）的连接产物加入融融状态的感受态细胞中，轻轻吹打几次混匀后置于冰上冰浴20min;
b. 冰浴结束，置于水浴锅中42℃热激90 s后立刻放于冰上2 min;
c. 混合物中加入500 μl 无抗LB液体培养基,37℃,200 rpm复苏1 h;
d. 吸取适量复苏后菌液涂布到含有100 μg/mL含有对应抗生素的LB固体培养基上；
e. 37℃培养箱中倒置过夜培养，可见LB固体培养基上出现单克隆菌落；
5）质粒抽提
·所需试剂
LB液体培养基：10g胰蛋白胨(Sigma-Aldrich，#T9410-250G)、5g酵母提取物(Sigma-Aldrich，#70161-500G)、10g NaCl(沪试，#10019308)加入ddH2O溶解后调节pH 7.0定容到1 L，121℃、15 min高压灭菌后冷却至室温使用
质粒小提试剂盒：Omega质粒小提试剂盒(Omega, #D6943-01-100T)
抗生素：称取1g对应的抗生素粉末(sigma)，充分溶解到20 mL ddH2O，0.22μm除菌过滤洗头除菌后分装保存于-20℃。
·实验步骤
a) 挑取步骤4）LB固体培养基生长的单克隆，加入5 mL含有100 μg/mL含有对应抗生素的LB液体培养基，在37℃细菌培养摇床200 rpm过夜培养(12-16 h);；
b) 取1.5~5ml菌液室温10000×g离心1mi
c) 去上清，加250µl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。
d) 加入250µl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖)
e) 加350µl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min.
f) 特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱
g) 弃滤过液，加500µl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。
h) 如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略
i) 弃滤过液，再用100%乙醇稀释的750µl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签如果经过冷冻，用前必须恢复室温。
j) 此步可选：再加750µl Wash Buffer清洗吸收柱
k) 必须将吸收柱10000×g离心1min确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤。
l) 将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100µl (取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min。
m) 测浓度后，于-20℃冰箱保存备用。
6）酶切验证
取步骤5）中抽提的质粒1 ug，加入1 ul限制性内切酶EcoR I （NEB，R3101S）和1ul 限制性内切酶Nhe I (NEB，R3131S)，5 ul CutSmart® Buffer （NEB），最后加入双蒸水使整个反应体积达到50 ul。样品置于37℃反应1小时。随后通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定（图6，理论条带掉落大小为1400bp）
7）测序验证
将步骤6）酶切坚定正确的质粒送泓迅生物科技股份有限公司进行Sanger测序验证。测序结果与我们设计的shTIM3序列比对一致，说明重组慢病毒质粒pLL3.7- TIM3-shRNA-3-ROR1CAR构建成功，可用于下一步相应慢病毒的包装，对应的慢病毒命名为：HKP55。
同样的方法制备重组慢病毒质粒pLL3.7- TIM3-shRNA-NC-ROR1CAR，对应的慢病毒命名为：HKP69。
图6：pLL3.7-TIM3-shRNA-3-ROR1CAR质粒酶切验证。
7.CAR-T细胞制备。
1） HKP55和HKP69重组慢病毒制备
a）细胞接种
将293T细胞以7x105个细胞/孔的密度接种于含有2 mL慢病毒包装培养基的6孔培养板中。置于37℃，5% CO2条件下孵育细胞过夜，保证转染时细胞密度应达到95-99%汇合。
b）转染
i.将所有质粒用Opti-MEM（Thermo，#31985070）稀释至1μg/ul；
ii.A管：250 μL 无血清Opti-MEM培养基稀释7 μl Lipofectamine 3000（Thermo,#L3000015），涡旋混匀 10s。
iii.B管：将重组慢病毒转移质粒pLL3.7- TIM3-shRNA-3-ROR1CAR或对照重组慢病毒转移质粒pLL3.7- TIM3-shRNA-NC-ROR1CAR、慢病毒包装质粒 psPAX2和pMD2.G以摩尔比1:1:1加至250 μL 无血清Opti-MEM培养基，并加入6 μL P3000试剂，涡旋混匀 10s。
c）制备脂质体-DNA复合物：将A管混合物转移至B管并充分混匀，室温孵育10 min。
d）加入复合物前，每孔去除1mL的培养基，使每孔总体积为1mL，然后向每孔加入500 uL的脂质体-DNA复合物，轻轻震荡培养板，使其分布均匀。将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育6小时。
e）转染6小时后，从每孔中小心吸去包含脂质体-DNA复合物的培养基，吸出的培养基用10%漂白溶液处理后再处置。替换成2mL预热的含10% FBS的 DMEM（Hyclone，#SH30022.01；FBS，#FSP500）新鲜培养基。将培养板放回培养箱，在37°C、5% CO2培养箱中继续孵育。
f）转染24小时后，每孔中收集2mL细胞上清液，装入15mL锥形管中并置于4°C保存。补加2mL预热的含10% FBS的 DMEM（Hyclone，#SH30022.01；FBS，#FSP500）新鲜培养基。将培养板置于37°C、5% CO2条件继续孵育。
g）24小时后（转染约48小时），从每孔中收集2mL的细胞上清液，与首次收集的上清液混合，使收集上清液总体积为4mL。
h）室温下以2,000 rpm离心10分钟，去除细胞碎片。收集并转移上清液，弃去细胞沉淀，用0.45μm的滤膜过滤后制得HKP69和HKP55重组慢病毒悬液，置于-80°C冰箱保存备用。
2) 慢病毒滴度检测
a）将293T细胞以1x105/孔的密度接种于含有10% FBS的DMEM培养基的6孔板中，总体积为1 m，37℃，5% CO2条件下孵育细胞过夜。
b）取HKP55或HKP69 重组慢病毒500 μL，250 μL，125 μL,，62.5 μL，31.25 μL，15.625 μL至孔中，调节总体积为500μL/孔，加入polybrene（Sigma-Aldrich，#TR-1003-G）调节其终浓度为6 ug/ml。37°，5% CO2培养24h后换液。
c）第三天：流式细胞检测。
iv.收取细胞计数，按照1x105个细胞/管进行取样分装，加10 ul 20 ug/ml ROR1-hFC重组蛋白（novoprotein，#Q01973 （CU96））冰上孵育20 min；
v.用染色缓冲液洗两遍后，向每管中加入10 ul 浓度为100ug/ml的PE交联的抗人igG Fc二抗（ebioscience，#12-4998-82）冰上孵育，20min；
vi.用染色缓冲液洗两遍后，流式细胞分析并计算病毒滴度，病毒滴度计算公式：病毒滴度=（起始细胞接种数×阳性细胞比例）×103/加入的病毒体积（ul）。
2）T细胞活化
·实验材料：
Dynabeads T-Activator CD3/CD28 （Thermo#11131D）: 2ml体积，4x107/mLDynabeads in PBS，PH7.4；外周血单个核细胞（上海妙顺公司）
·方法：
a）提前预热CAR-T培养基（10%FBS+300IU/mL IL-2 in X-vivo 15培养基）
b）2）2x107 PBMC，1500rpm，5min，洗一遍。
c）加入预热的CAR-T培养基，并转移至6孔板中，置于CO2培养箱。
d）加入160ul CD3/CD28 Dynabeads至1.5ml灭菌EP管（6.4x106 beads）。
e）清洗Dynabeads。将含Dynabeads的1.5ml灭菌EP管放置于磁性分离架上，等待1分钟，让beads充分吸附至离心管壁；小心用1ml移液枪吸去离心管中的液体，将1.5ml灭菌EP管取出，加入1ml CAR-T培养基，并上下吹打几次，使beads充分混匀；重复上述步骤，三次。
f）取1ml 6孔板中PBMC细胞悬液至上述含beads的1.5ml灭菌EP管中，离心管从磁性分离架上取下，用1ml移液器温柔地上下吹打几次使beads和细胞混匀
g）将上述beads/PBMC混合物转移至6孔板中，温柔震荡培养板使细胞与beads混匀，并放置CO2培养箱中培养过夜。
3）T细胞感染
a）将前一日活化的T细胞计数后，调节细胞密度为1.2x106/ml。
b）在6孔板中，每孔加入6x105个细胞。
c）将先前制备的HKP55和HKP69病毒于37°C水浴溶解后，以MOI=1计算加入病毒6x105/孔。同时加入终浓度为6 ug/ml的polybrene，每孔的最终培养基体积为1 ml。混匀后放入37°C，5% CO2培养箱孵育。
扩大培养5天后，制得HKP69 CAR-T和HKP55 CAR-T细胞，并进行流式细胞检测CAR-T细胞表面TIM3表达水平。结果显示HKP55 CAR-T细胞Tim-3表达水平显著低于HKP69 CAR-T细胞（如图7： HKP69和HKP55重组慢病毒感染的CAR阳性T细胞表面Tim-3表达水平所示），说明成功制备出沉默Tim-3基因表达的靶向ROR1抗原的 CAR-T细胞。
8.Tim-3基因的沉默不影响HKP55 CAR-T细胞对靶细胞的杀伤。
为了检测Tim-3基因的沉默对HKP55 CAR-T细胞特异性的杀伤ROR1阳性的靶细胞能力的影响，我们构建了ROR1、ROR2稳定表达的293A细胞系，命名为293A-ROR1和293A-ROR2细胞。
1）将293A，293A-ROR1，293A-ROR2以2x104/孔铺于96孔板，每种细胞3个重复。
2）取制备的HKP55 CAR-T细胞计数，以效靶比10：1的量调整细胞密度。
3）每孔加入2x105HKP55CAR-T细胞悬液至步骤1）的细胞中，每孔培养基体积为200ul；
4）37°C，5% CO2培养箱中孵育；
5）6小时后收取100 ul上清进行细胞因子检测，其余上清收取后检测LDH释放水平。
结果显示，HKP55 CAR-T细胞与293A-ROR1细胞共培养释放更高水平的IL-2和IFN-g（图8 培养上清中IL-2的释放水平和图9培养上清中IFN-g的释放水平），并且对293A-ROR1细胞的裂解程度远高于对照组（图10 HKP55 CAR-T细胞对靶细胞的裂解）。以上结果表明，Tim-3沉默不影响HKP55 CAR-T细胞对ROR1阳性的细胞特异性识别和杀伤。
9.Tim-3基因沉默增强了ROR1 CAR-T细胞对分泌Galectin-9的ROR1阳性靶细胞的杀伤能力。
Galectin-9是 Tim-3的重要配体之一，主要与细胞上Tim-3的IgV2的低聚糖域结合发挥生理作用，可抑制Th1和Th17扩增，促进Th1细胞凋亡、CD8+T细胞功能耗竭，直接或间接地促进外周免疫耐受，在肿瘤微环境中削弱机体的抗肿瘤免疫应答，从而导致肿瘤免疫逃逸的发生。为了验证Tim-3基因沉默的CAR-T细胞能够克服Galectin-9配体对其抑制作用，我们首先制备了稳定分泌表达Galectin-9的293A-ROR1细胞，命名为239A-ROR1-Gal-9细胞，然后将HKP55（Tim-3基因沉默）和HKP69 CAR-T（野生型）细胞分别与其共培养。孵育24小时和48小时后，通过Elisa检测培养上清中的IL-2和IFN-g的含量。图11-12结果显示，图11 培养上清中IL-2的释放水平，图12 培养上清中IFN-g的释放水平，HKP55 CAR-T细胞与表达Galectin-9的靶细胞共培养释放更高水平的细胞因子。
10.Tim-3基因沉默增强了ROR1 CAR-T细胞对靶细胞依赖的增殖能力
为了验证Tim-3基因沉默的CAR-T细胞能够克服Galectin-9对其增殖的抑制，我们将HKP55（Tim-3基因沉默）和HKP69 CAR-T（野生型）细胞标记CSFE后分别与SW620细胞（ROR1阳性且分泌Galectin-9蛋白的人结肠癌细胞系）共培养，72小时后收集细胞进行流式细胞分析。结果如图13 靶细胞依赖的细胞增殖检测（a）细胞增殖流式检测（b）HKP55和HKP69细胞平均荧光强度所示，HKP55的增殖明显高于HKP69 CAR-T细胞，表明HKP55 CAR-T细胞能够逃避肿瘤细胞通过分泌Galectin-9对其增殖的抑制作用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 苏州恒康生命科学有限公司
<120> 利用shRNA沉默人Tim-3基因构建CAR-T细胞的方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggagcctgtc ctgtgtttga att 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcctccctga tataaatcta att 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
gcaaccatca gaataggcat ctaca 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
tttgtactac acaaaagtac tg 22
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
tgcaaccatc agaataggca tctacattca agagatgtag atgcctattc tgatggttgc 60
tttttt 66
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
tggaaagtta ttaggtctac cgtagattca agagatctac ggtagaccta ataactttcc 60
tttttt 66

Claims (5)

1.利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法 ，其特征在于，通过设计小发卡RNA序列特异性的靶向Tim-3基因，筛选获得具有沉默效果的小发卡RNA序列，具有沉默效果的小发卡RNA序列与靶向ROR1的CAR序列共转导入T细胞，制备出Tim-3沉默的ROR1 CAR-T,其中对Tim-3基因沉默的siRNA序列如下：
Tim3-siRNA-3 序列如SEQ ID No.3：GCAACCATCAGAATAGGCATCTACA；
所述具有沉默效果的小发卡RNA序列为Tim-3-shRNA-3 序列如SEQ ID No.5：
TGCAACCATCAGAATAGGCATCTACATTCAAGAGATGTAGATGCCTATTCTGATGGTTGCTTTTTT。
2.根据权利要求1所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述Tim-3基因沉默的siRNA序列的对照为Tim3-siRNA-NC序列如SEQIDNo.4 ：TTTGTACTACACAAAAGTACTG。
3.根据权利要求2所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法还包括根据所述Tim-3-shRNA-3 序列设计合成阴性对照Tim-3-shRNA-NC 序列如SEQ ID No.6：
TGGAAAGTTATTAGGTCTACCGTAGATTCAAGAGATCTACGGTAGACCTAATAACTTTCCTTTTTT。
4.根据权利要求1所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法步骤为：
步骤1. Tim-3基因沉默的siRNA序列设计和合成获得、Tim3-siRNA-3及空白Tim3-siRNA-NC；
步骤2. 筛选对Tim-3基因沉默效率最高的siRNA，获得Tim3-siRNA-3；
步骤3. 构建pLL3.7-Tim-3-shRNA慢病毒转移载体
根据所述步骤2的siRNA沉默效率筛选结果，选择Tim-3-siRNA -3序列进行shRNA序列的设计并合成Tim-3-shRNA-3，同时设计合成阴性对照Tim-3-shRNA-NC；
步骤4. Lenti-TIM3-shRNA-NC和Lenti-TIM3-shRNA-3重组慢病毒制备；
步骤5. 重组慢病毒对Tim-3基因沉默效率验证；
步骤6. 在步骤3的基础上进行pLL3.7-TIM3-shRNA-3-ROR1 CAR重组质粒构建；
步骤7. CAR-T细胞制备。
5.根据权利要求4所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述步骤7获得HKP69 CAR-T和HKP55 CAR-T细胞，其中HKP55 CAR-T细胞Tim-3表达水平低于HKP69 CAR-T细胞，所述HKP55 CAR-T细胞为制备出沉默Tim-3基因表达的靶向ROR1抗原的 CAR-T细胞。
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