CN112852741A - 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和细胞药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和细胞药物，涉及CAR‑T细胞治疗技术领域。本发明公开的合抗原受体T细胞表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体且所述嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因被敲除或其表达受到抑制。本发明公开的嵌合抗原受体T细胞的效应性CAR‑T细胞的比例更高，可释放更强的细胞效应因子，具有更好的肿瘤细胞杀伤能力，为肿瘤治疗提供了新的方向和思路。

Description

一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和细胞药物
技术领域
本发明涉及CAR-T细胞治疗技术领域，具体而言，涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和细胞药物。
背景技术
癌症在我国疾病致死原因当中排名第2位，仅次于脑血管疾病。目前我国有700多万癌症患者，且每年新增约180万人，同时每年有超过160万人死于癌症。随着科技和医学的发展，针对肿瘤的治疗方案也有很多。比如，手术切除和放化疗等，这些方法对于早期肿瘤的治疗效果较好，能够明显的缓解肿瘤病人的症状，延长生存时间。但是，这些方法对于患者人体的创伤较大，并且有严重的不良反应。近年来，随着肿瘤免疫治疗的发展，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗肿瘤逐渐进入临床试验，并且在治疗恶性血液病取得了较好的成果。然而，CAR-T对治疗实体瘤的效果较差，因为受到组织结构，强大的免疫抑制环境所限制，除此之外，缺乏特异性也是CAR-T治疗实体瘤的效果较差的关键因素之一。因此，寻找更有效靶点从而推进CAR-T治疗实体瘤是现阶段的一大重要挑战。
此外，现有的CAR-T细胞在其治疗实体瘤的效果有限，有待进一步提高。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体T细胞的方法和细胞药物。本发明提供的嵌合抗原受体T细胞的效应性CAR-T细胞的比例更高，可释放更强的细胞效应因子，具有更好的肿瘤细胞杀伤能力。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种嵌合抗原受体T细胞，上述嵌合抗原受体T细胞表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体且上述嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因被敲除或其表达受到抑制。
蛋白4.1家族，最初因其在红细胞膜蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中位置处在第4.1个条带处而得名，包括4.1R，4.1N，4.1B和4.1G。
本发明实施例的研究内容首次揭示，在嵌合抗原受体T细胞中抑制4.1R蛋白的表达，该嵌合抗原受体T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力得到有效提高，本发明为采用嵌合抗原受体T细胞治疗肿瘤提供了新的方向和思路。
基于本发明实施例的内容，本领域技术人员容易理解到抑制或敲除嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因也能取得相似的抗肿瘤能力提高的技术效果。
在可选的实施方式中，上述4.1R基因的表达通过如下分子中的任意一种或几种的组合被抑制：shRNA、反义RNA、siRNA和antagomir；或者，上述嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因通过如下技术中的任意一种被敲除：CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术。
基于本发明实施例的内容，本领域技术人员能够想到采用本领域技术常见的技术对嵌合抗原受体T细胞进行改造，以使其4.1R基因的表达受到抑制，或敲除4.1R基因，无论通过何种技术得到的嵌合抗原受体T细胞，只要其4.1R基因被抑制表达或被敲除即属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，上述嵌合抗原受体T细胞含有shRNA分子，上述4.1R基因的表达通过上述shRNA分子受到抑制。
在可选的实施方式中，上述shRNA分子的靶序列如SEQ ID NO.1、所示。
本发明实施例的内容显示，利用shRNA分子靶向4.1R基因上如SEQ ID NO.1处的靶序列，4.1R基因表现出被抑制的效果，相应的嵌合抗原受体T细胞均有抗肿瘤能力提高的表现。
在可选的实施方式中，上述shRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示：GUGACAGUACCCACCUCAAAU。
在可选的实施方式中，上述肿瘤相关抗原选自NKG2D配体和CD19中的任意一种；上述嵌合抗原受体的抗原结合结构域能够特异性结合上述肿瘤相关抗原。
需要说明的是，基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以选择合适的肿瘤相关抗原，无论选用何种肿瘤相关抗原均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，当上述肿瘤相关抗原为NKG2D配体时，上述嵌合抗原受体的抗原结合结构域为NKG2D蛋白，或者是选自NKG2D蛋白的具有结合活性的片段。
在可选的实施方式中，上述肿瘤相关抗原为NKG2D配体，上述抗原结合结构域为选自NKG2D蛋白的胞外段。
在可选的实施方式中，上述NKG2D蛋白的胞外段的氨基酸序列SEQ ID NO.13所示。
在可选的实施方式中，上述NKG2D配体选自MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP 3、ULBP4、ULBP 5和ULBP 6中的任意一种。
NKG2D及其配体的免疫学特征与肿瘤有着很大的联系。NKG2D的配体包括六个成员：MICA、MICB、ULBP1-6，但是机体大部分正常细胞表面一般不表达或者低表达这些配体，在某些实体肿瘤中，如肝癌细胞、直肠癌细胞、胃癌细胞和乳腺癌细胞等均有不同程度的NKG2D配体表达，将NKG2D受体设计到CAR结构中，当其与配体结合时，便会激活T细胞，产生一系列的抗肿瘤反应。
在可选的实施方式中，当上述肿瘤相关抗原为CD19时，上述抗原结合结构域为抗CD19的scFv。
在可选的实施方式中，上述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区；
上述跨膜结构域选自：CD8、CD28、CD33、CD37、CD8α、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4和CD3ε中的一种或多种的跨膜结构域。
在可选的实施方式中，上述跨膜结构域选自CD8的跨膜结构域。
在可选的实施方式中，上述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，上述共刺激分子选自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3中的一种或多种；
在可选的实施方式中，上述共刺激信号传导区包括4-1BB的细胞内结构域和CD3ζ的细胞内结构域。
第二方面，本发明实施例提供一种制备如前述实施方式任一项所述的嵌合抗原受体T细胞的方法，其包括如下步骤：抑制嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因的表达或敲除上述嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因。
需要说明的是，无论采用何种方法制备出本发明所述的嵌合抗原受体T细胞，其均是属于本发明的保护范围。
通过本发明实施例的方法能够增加效应性CAR-T细胞的比例，增强CAR-T细胞效应因子的释放，有利于增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
第三方面，本发明实施例提供一种细胞药物，其含有作为活性成分的如前述实施方式任一项上述的嵌合抗原受体T细胞以及药学上可接受的辅料。
在可选的实施方式中，上述细胞药物用于治疗肿瘤。
在可选的实施方式中，上述肿瘤选自实体瘤或非实体瘤。
需要说明的是，基于本发明的内容，本领域技术人员容易想到将本发明嵌合抗原受体T细胞应用与治疗各种肿瘤，不仅仅是实体瘤，也适用于非实体瘤，无论哪种肿瘤，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，上述实体瘤为特异性表达NKG2D配体的肿瘤。
在可选的实施方式中，上述实体瘤选自胰腺癌、肝癌、直肠癌、胃癌和乳腺癌中的任意一种。
在可选的实施方式中，上述非实体瘤选自特异性表达CD19的肿瘤。
在可选的实施方式中，上述非实体瘤选自淋巴瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为pLL3.7-EGFP、pLL3.7-shRNA-A-EGFP和shRNA-NC-EGFP载体上的部分表达元件的结构示意图。
图2为pLL3.7空载体以及重组质粒pLL3.7-(shRNA-D/NC)-EGFP载体经EcoR I单酶切鉴定结果。
图3为pLL3.7-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-ANKG2D-CAR和pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR三种质粒的部分表达元件的结构示意图。
图4为重组质粒pLL3.7-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-A-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR经EcoR I单酶切鉴定结果。
图5为经pLL3.7-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-A-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR感染的T细胞的4.1R基因转录结果，pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR感染的T细胞的4.1R基因转录明显下调。
图6为经pLL3.7-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-A-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR感染的T细胞其4.1R蛋白表达结果，pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR感染的T细胞其4.1R蛋白表达明显下调。
图7为NKG2D-CAR-T、shRNA-A-NKG2D-CAR-T、shRNA-NC-NKG2D-CAR-T三种T细胞杀伤胰腺癌效率结果，shRNA-A-NKG2D-CAR-T细胞杀伤效率更高。
图8为pLL3.7-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-A-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-NC-CD19-CAR三种质粒的部分表达元件的结构示意图。
图9为重组质粒pLL3.7-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-A-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-NC-CD19-CAR经EcoR I单酶切鉴定结果，载体构建成功。
图10为经pLL3.7-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-A-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-NC-CD19-CAR感染的T细胞4.1R基因转录结果，pLL3.7-shRNA-A-CD19-CAR感染的T细胞4.1R基因转录明显下调。
图11为经pLL3.7-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-A-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-NC-CD19-CAR感染的T细胞的4.1R蛋白表达结果，pLL3.7-shRNA-NC-CD19-CAR的T细胞的4.1R蛋白明显下调。
图12为CD19-CAR-T、shRNA-A-CD19-CAR-T、shRNA-NC-CD19-CAR-T三种T细胞杀伤Raji细胞效率的结果，shRNA-A-CD19-CAR-T杀伤效率最高。
图13为pLL3.7-(shRNA-NC/A/B/C)-EGFP三种重组质粒EcoR I酶切鉴定结果。
图14为设计的四种不同RNA序列(shRNA-NC/A/B/C)的shRNA在4.1R mRNA水平上的干扰效果。
图15为设计的四种不同RNA序列(shRNA-NC/A/B/C)的shRNA在4.1R蛋白水平上的干扰效果。
图16为pLL3.7-EGFP空载体的结构示意图。
图17为pLL3.7-NKG2D-CAR载体的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
pLL3.7-shRNA-4.1R干扰载体的构建
1 RNAi靶序列设计
在NCBI网站中查找到Homo sapiens erythrocyte membrane protein band 4.1(EPB41)的基因序号：001166005.1。根据基因编号在网站(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)设计4.1R基因RNAi靶序列，结果表1所示。
表1. 4.1R基因RNAi靶序列
靶序列名称 起始位置 RNAi靶序列的核苷酸序列 GC％ SEQ ID NO.
靶序列A 1994 GTGACAGTACCCACCTCAAAT 47.62 SEQ ID NO.1
2.2根据靶序列设计干扰序列：
基于筛选出的靶序列，参考如下原则设计和确定干扰序列：5’端以G开头，设定G+C含量为30％-50％。根据pLL3.7载体的要求：(1)在正义链5’端加T重建U6启动子l位的T。(2)干扰靶序列后加Loop环“TTCAAGAGA”。(3)加入反转互补序列及终止信号“TTTTTT”。(4)在3’端再加上EcoR I酶切位点GAATTC以方便鉴定。(5)再补平Xho I酶切位点合成一对互补片段。
将序列打乱设计成NC(Negative Control)序列，各序列如下表2所示。
表2.针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸序列
Figure BDA0002294210020000061
2.3构建干扰质粒pLL3.7-shRNA-(A/NC)-EGFP
将设计好的靶寡核苷酸序列交至苏州泓迅生物科技有限公司合成靶序列的双链DNA序列，并将空载pLL3.7(图16)予以限制性内切酶XhoI、HpaI双酶切，经重组酶连接构建重组质粒pLL3.7-shRNA-(A/NC)-EGFP，如图1所示。重组质粒经EcoR I单酶切鉴定如图2所示。
2.4构建靶向质粒pLL3.7-shRNA-(A/NC)-NKG2D-CAR
通过网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/查到NKG2D基因全长的CDS区，并且在https://www.uniprot.org/网站找到NKG2D蛋白的胞外段区域，在NKG2D全长基因序列中找到对应的胞外段基因序列。NKG2D蛋白为二型跨膜蛋白，其胞外段序列位于C端，我们将CD8a信号肽的序列加入NKG2D胞外段序列前端。用SnapGene软件设计并在公司合成引物(引物中包含信号肽序列)，以人的T细胞cDNA为模板，通过RT-PCR的方式扩增NKG2D的胞外段，将RT-PCR产物测序得到Sig-NKG2D胞外段的编码序列如下SEQ ID NO.6：
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGATGTTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTG；
氨基酸序列如下(SEQ ID NO.16)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPMLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV。
将得到的sigNKG2DEX序列(CD8a信号肽和NKG2D蛋白的胞外段)与已经构建好的二代CAR基础序列(CD8-4-1BB-CD3ζ)通过重叠PCR的方式连接到一起。通过RT-PCR以及测序鉴定后确定构建成功，获得pLL3.7-NKG2D-CAR载体(图17)，将已经构建好的pLL3.7-shRNA-(A/NC)-EGFP载体经XbaI和NheI双酶切胶回收小片段，pLL3.7-NKG2D-CAR载体经XbaI和NheI双酶切胶回收大片段，T4 DNA连接酶连接过夜，得到重组载体pLL3.7-shRNA-(A/NC)-NKG2D-CAR，如图3所示。重组质粒经EcoR I单酶切鉴定结果，如图4所示。
实施例2
pLL3.7-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-A-NKG2D-CAR和pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR质粒的扩增与病毒包装。
1质粒转染
1)将质粒，PEI，Opti-MEM培养基置于室温5min；
2)取Opti-MEM 436μl于1.5ml EP管中，再加入64μl PEI混匀，室温静置5min；
3)取5μg载体质粒pLL3.7-NKG2D-CAR、pLL3.7-shRNA-A-NKG2D-CAR或pLL3.7-shRNA-NC-NKG2D-CAR，3μg psPA×2，5μg pMD2.G，加入Opti-MEM至500μl，室温静置5min；
4)将配好的PEI-Opti-MEM溶液加入含质粒的Opti-MEM中，室温静置20min；
5)将1ml DNA/PEI混合物慢慢滴入前一天铺好的293T培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育，6-8h后更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育。
2病毒收集和浓缩
1)质粒转染48h后，收集上清后，添加10ml新鲜培养基继续培养至72h，再次收集上清，与48h收集的上清混合后，置于4℃冰箱内待用；
2)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
3)以0.45μm滤器过滤得到的上清；
4)将过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000转离心2h，用1/100上清体积的PBS进行稀释，反复吹打后转入密闭的离心管中4℃过夜；
5)将病毒液分装至合适的体积，置于-80℃中保存，并取200μl病毒进行滴度测定。
3病毒滴度测定
1)消化293T细胞，离心后计数，用含血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为4×105/ml，向24孔培养板的每孔中加入0.5ml细胞悬液；
2)用全培养基按以下比例稀释病毒上清：1:3；1:9；1:27；
3)分别将100μl病毒原液及按不同比例稀释后的病毒液，加入到已接种细胞的24孔板中；
4)16h后弃去感染上清，添加0.5ml新鲜全培养基；
5)48h后流式检测被感染细胞的目的基因表达；
6)计算滴度，滴度＝2×105×感染效率×稀释倍数；
结果如下：病毒收集浓缩后，经滴度检测，LV-NKG2D-CAR、LV-shRNA-A-NKG2D-CAR和LV-shRNA-NC-NKG2D-CAR三种慢病毒的滴度分别为2.6×108、8.1×108、2.7×108。
实施例3
pLL3.7-shRNA-A-NKG2D-CAR载体干扰验证试验
将从医院采取的人的外周血裂解红细胞后，通过磁珠分选获得CD4+、CD8+两种T细胞，用CD3、CD28抗体激活2天后，离心换液，将T接种于24孔板中，每孔2×106个细胞。分为4组：无病毒感染阴性对照组、LV-NKG2D-CAR组，LV-shRNA-A-NKG2D-CAR慢病毒干扰组和LV-shRNA-NC-NKG2D-CAR阴性干扰组，每组各2孔。两个实验组分别按照MOI＝10:1加入相应体积的病毒，并加入10μg/ml polybrene促进感染。24h后将细胞进行收集，1000g离心10min，弃去培养基，加入新鲜培养基。
慢病毒感染48h后收取细胞，流式检测NKG2D表达效率，即病毒感染阳性率。结果LV-NKG2D-CAR、LV-shRNA-A-NKG2D-CAR和LV-shRNA-NC-NKG2D-CAR三种病毒在T细胞上的感染效率接近100％。
收取感染48h后的四组T细胞。用Trizol裂解细胞，抽提总RNA，进行逆转录。Q-PCR分析重组质粒的干扰效果。结果如图5所示pLL3.7-shRNA-A-NKG2D-CAR慢病毒感染细胞后能显著抑制4.1R mRNA的转录，使得4.1RmRNA的表达量下降到原来的20％。经RNA干扰后，4.1R基因不仅在转录水平上表达下调，在蛋白水平也有明显变化。经pLL3.7-shRNA-A-NKG2D-CAR感染的T细胞，4.1R蛋白的表达量显著下调，结果如图6所示。
实施例4
靶细胞的选择及CAR-T杀伤功能研究
1获取高表达NKG2D配体的人源胰腺癌细胞株Panc28。
2构建带有荧光素酶(luciferase)的胰腺癌细胞株Panc28将胰腺癌细胞株Panc28单细胞悬液与luciferase病毒混合后接种到6孔板中，24h后更换新鲜的DMEM培养基。48h后加入1μg/mL的puromycin进行筛选。72h后检测luciferase的荧光强度。
3靶细胞与效应细胞混合培养
将上述带有luciferase胰腺癌细胞株Panc28分别按照4×104/孔的数量接种至超低吸附细胞培养96孔板中；将NKG2D-CAR-T、shRNA-A-NKG2D-CAR-T和shRNA-NC-NKG2D-CAR-T细胞和未感染病毒的T细胞分别按照效靶比1:1、3:1以及9:1接种至靶细胞中，每组设两个重复，每孔补液至200μl；
将细胞混合后的培养板放至37℃培养箱中培养22h；22h后，收集每孔中所有细胞，将细胞转移至白板中，通过酶标仪检测luciferase的荧光强度。
4杀伤效率分析
如图7所示，与未转染组相比，NKG2D-CAR-T、shRNA-A-NKG2D-CAR-T和shRNA-NC-NKG2D-CAR-T均具有很强的杀伤胰腺癌的效果，并且与NKG2D-CAR-T和shRNA-NC-NKG2D-CAR-T相比，shRNA-A-NKG2D-CAR-T具有更强的杀伤效率，此实验表明，NKG2D可以很好的靶向胰腺癌细胞株发挥功能，并且干扰4.1R能增强shRNA-A-NKG2D-CAR-T的杀伤效率。
实施例5
pLL3.7-shRNA-A-CD19-CAR载体构建与CAR-T功能的验证
为进一步验证干扰蛋白4.1R对CAR-T细胞的影响，我们构建了以CD19为靶向的载体：pLL3.7-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-A-CD19-CAR、pLL3.7-shRNA-NC-CD19-CAR，并分别转染T细胞得到：CD19-CAR-T、shRNA-A-CD19-CAR-T、shRNA-NC-CD19-CAR-T三种T细胞，对其序列、干扰效果以及杀伤功能进行验证，如图8-图12所示。结果显示，干扰蛋白4.1R也能够提高CD19-CAR-T细胞的功能。
对比例
针对多个不同靶序列设计了不同的对照干扰序列，并进行了相关实验。实验方法与前述方法相同。
各对比例的靶序列见表3，各靶序列对应的干扰序列的上下游片段如表4所示，其中shRNA-A为实施例1的原有序列。
表3. 4.1R基因的RNAi靶序列
Figure BDA0002294210020000101
表4.针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸序列
Figure BDA0002294210020000111
靶向靶序列A的shRNA的RNA序列为：GUGACAGUACCCACCUCAAAU(SEQ ID NO.13)。
靶向靶序列B的shRNA的RNA序列为：GACAGUACCCACCUCAAAUGG(SEQ ID NO.14)。
靶向靶序列C的shRNA的RNA序列为：GACCAAACACAGAAGCUUGCA(SEQ ID NO.15)。
利用与上述载体构建相同的方法，设计干扰shRNA后由公司合成干扰序列DNA双链并连接到pLL3.7载体上，进行EcoR I单酶切鉴定，结果如图13所示。
利用相同的方法，进行慢病毒包装。
利用与相同的方法，检测pLL3.7-shRNA-A/B/C/NC-EGFP质粒在Jurkat细胞上的干扰效果。
图14结果显示，从4.1R mRNA表达来看，在众多干扰RNA中，shRNA-A具有最好的效果，shRNA-B和shRNA-C的干扰组mRNA的表达量均高于shRNA-A组，因此shRNA-A片段具有最优的干扰效果。
图15所示为经不同片段shRNA干扰后，western blot检测4.1R的蛋白水平，shRNA-A的条带最淡，也显示出其干扰效果最强。上述实验的结果是本领域技术人员无法预料的。
综上，嵌合抗原受体(CAR)的修饰赋予T细胞具有肿瘤特异性细胞毒性，从而诱导抗肿瘤免疫。然而实体肿瘤的组织结构特性，特异性抗原的缺失和强的免疫抑制环境，使得用CAR-T细胞靶向实体肿瘤比治疗B细胞恶性肿瘤更具有挑战性。因此寻找合适的靶标，并且提高CAR-T细胞杀伤实体肿瘤的效率是治疗实体瘤的关键所在。本发明通过构建靶向实体肿瘤的NKG2D-CAR-T细胞，并且共表达能够提高CAR-T细胞抗肿瘤能力干扰基因4.1R，结果发现干扰4.1R后能够有效地提高NKG2D-CAR-T细胞的抗肿瘤能力，这些研究为治疗实体瘤提供了新的方向和思路。
总之，本发明实施例是首次提供了靶向胰腺癌细胞的NKG2D-CAR-T的细胞治疗，也是首次将shRNA-4.1R用于CAR-T治疗中，通过体外实验不仅证明了NKG2D-CAR-T能够有效地靶向治疗胰腺癌，同时证明了干扰4.1R后能够有效地增加NKG2D-CAR-T细胞的抗肿瘤功能，为CAR-T应用于实体瘤治疗提供了新的方向。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
上海邦耀生物科技有限公司
<120> 一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和细胞药物
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgacagtac ccacctcaaa t 21
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtgacagta cccacctcaa atttcaagag aatttgaggt gggtactgtc acttttttga 60
attcc 65
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgaggaatt caaaaaagtg acagtaccca cctcaaattc tcttgaaatt tgaggtgggt 60
actgtcaca 69
<210> 4
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaacccacc tccagtaaat ggttcaagag accatttact ggaggtgggt tcttttttga 60
attcc 65
<210> 5
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcgaggaatt caaaaaagaa cccacctcca gtaaatggtc tcttgaacca tttactggag 60
gtgggttca 69
<210> 6
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgatgttat tcaaccaaga agttcaaatt cccttgaccg aaagttactg tggcccatgt 120
cctaaaaact ggatatgtta caaaaataac tgctaccaat tttttgatga gagtaaaaac 180
tggtatgaga gccaggcttc ttgtatgtct caaaatgcca gccttctgaa agtatacagc 240
aaagaggacc aggatttact taaactggtg aagtcatatc attggatggg actagtacac 300
attccaacaa atggatcttg gcagtgggaa gatggctcca ttctctcacc caacctacta 360
acaataattg aaatgcagaa gggagactgt gcactctatg cctcgagctt taaaggctat 420
atagaaaact gttcaactcc aaatacatac atctgcatgc aaaggactgt g 471
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gacagtaccc acctcaaatg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaccaaacac agaagcttgc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgacagtacc cacctcaaat ggttcaagag accatttgag gtgggtactg tcttttttga 60
attcc 65
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcgaggaatt caaaaaagac agtacccacc tcaaatggtc tcttgaacca tttgaggtgg 60
gtactgtca 69
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgaccaaaca cagaagcttg cattcaagag atgcaagctt ctgtgtttgg tcttttttga 60
attcc 65
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcgaggaatt caaaaaagac caaacacaga agcttgcatc tcttgaatgc aagcttctgt 60
gtttggtca 69
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
gugacaguac ccaccucaaa u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
gacaguaccc accucaaaug g 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 15
gaccaaacac agaagcuugc a 21
<210> 16
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Met Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu
20 25 30
Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys
35 40 45
Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser
50 55 60
Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met
85 90 95
Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly
115 120 125
Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys
130 135 140
Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
145 150 155

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体且所述嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因被敲除或其表达受到抑制。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述4.1R基因的表达通过如下分子中的任意一种或几种的组合被抑制：shRNA、反义RNA、siRNA和antagomir；或者，所述嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因通过如下技术中的任意一种被敲除：CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞含有shRNA分子，所述4.1R基因的表达通过所述shRNA分子受到抑制。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述shRNA分子的靶序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述shRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述肿瘤相关抗原选自NKG2D配体和CD19中的任意一种；
所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域能够特异性结合所述肿瘤相关抗原；
优选地，当所述肿瘤相关抗原为NKG2D配体时，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域为NKG2D蛋白，或者是选自NKG2D蛋白的具有结合活性的片段；
当所述肿瘤相关抗原为CD19时，所述抗原结合结构域为抗CD19的scFv；
优选地，所述NKG2D配体选自MICA、MICB、ULBP1、ULBP 2、ULBP 3、ULBP 4、ULBP 5和ULBP6中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述肿瘤相关抗原为NKG2D配体，所述抗原结合结构域为选自NKG2D蛋白的胞外段；
优选地，所述NKG2D蛋白的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
7.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，
所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区；
所述跨膜结构域选自：CD8、CD28、CD33、CD37、CD8α、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4和CD3ε中的一种或多种的跨膜结构域；
优选地，所述跨膜结构域选自CD8的跨膜结构域；
优选地，所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3中的一种或多种；
优选地，所述共刺激信号传导区包括4-1BB的细胞内结构域和CD3ζ的细胞内结构域。
8.一种制备如权利要求1-7任一项所述的嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，其包括如下步骤：抑制嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因的表达或敲除所述嵌合抗原受体T细胞的4.1R基因。
9.一种细胞药物，其特征在于，其含有作为活性成分的如权利要求1-7任一项所述的嵌合抗原受体T细胞以及药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的细胞药物，其特征在于，所述细胞药物用于治疗肿瘤；
优选地，所述肿瘤选自实体瘤或非实体瘤；
优选地，所述实体瘤为特异性表达NKG2D配体的肿瘤；
优选地，所述实体瘤选自胰腺癌、肝癌、直肠癌、胃癌和乳腺癌中的任意一种；
优选地，所述非实体瘤选自特异性表达CD19的肿瘤；
优选地，所述非实体瘤为淋巴瘤。
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