CN109306341B - Hdac11基因干扰的嵌合抗原受体t细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了HDAC11基因干扰的嵌合抗原受体T细胞及其应用。具体地，本发明提供了工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包括：(a)嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合于肿瘤细胞表面抗原；和(b)降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子。本发明的工程化免疫细胞具有良好的肿瘤杀伤效果。

Description

HDAC11基因干扰的嵌合抗原受体T细胞及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及HDAC11基因干扰的嵌合抗原受体T细胞及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)疗法作为肿瘤免疫治疗中一种新的技术手段，已经在抗肿瘤领域取得了巨大成功，并且该疗法有可能成为未来几年肿瘤治疗的主流方向。CAR-T疗法主要是通过基因编辑技术在体外对患者的T细胞进行改造，使T细胞表面表达可以特异识别肿瘤表面抗原的单链抗体可变区，并且内部连有T细胞的激活信号。因此CAR-T细胞经过继回输到患者体内后可以打破MHC限制特异的识别并杀伤肿瘤细胞。目前CAR-T疗法在一些恶性血液肿瘤(如急性淋巴细胞白血病)中已经取得非常好的临床效果，该疗法已经在全世界推广。但是CAR-T疗法在实体瘤中的治疗效果仍不尽如人意，究其原因主要是杀伤能力不强以及CAR-T细胞在体内耗竭严重不能够持续性杀伤肿瘤。因此寻求一种可以增强CAR-T细胞的杀伤效果并且延长CAR-T细胞在体内的生存时间的方法至关重要。

因此，本领域迫切需要开发一类能显著增强肿瘤良好杀伤效果的工程化的免疫细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一类能显著增强肿瘤良好杀伤效果的工程化的免疫细胞。

本发明第一方面提供了一种工程化免疫细胞，包括：

(a)嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合于肿瘤细胞表面抗原；和

(b)降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子。

在另一优选例中，所述抗原受体为功能性非T细胞受体。

在另一优选例中，所述抑制分子选自下组：抑制性核酸、小分子化合物、或其组合。

在另一优选例中，所述抑制性核酸包括RNA干扰剂。

在另一优选例中，所述抑制性核酸选自下组：siRNA、miRNA、shRNA、发夹siRNA、串联表达的miRNA、微小RNA适应性shRNA、前体微小RNA、或其组合。

在另一优选例中，所述抑制性核酸分子包括与编码HDAC11的核酸互补的序列。

在另一优选例中，所述抑制性核酸分子包括与编码HDAC11的核酸互补的反义寡核苷酸。

在另一优选例中，所述小分子化合物选自下组：伏瑞斯特(Vorinostat,SAHA)、西达本胺(Tucidinostat)、莫西诺司他(Mocetinostat)、LMK-235、丙戊酸钠(Valproic acidsodium salt)、ACY-738、盐酸替米司他(Resminostat hydrochloride)、恩替诺特(Entinostat)、曲古抑菌素A(Trichostatin A)、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞表面抗原包括各种实体瘤和固体肿瘤的细胞表面抗原。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞表面抗原选自下组：CD19、HER2、c-Met、PSMA、MUC16、CD20、CD22、CD123、CD47、CD138、CD33、CD30、间皮素(mesothelin)、EGFR、GPC3、BCMA、ErbB2、NKG2D配体、LMP1、EpCAM、VEGFR-1、Lewis-Y、ROR1、Claudin18.2、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞表面抗原包括CD19。

在另一优选例中，所述降低或抑制HDAC11蛋白表达活性指将HDAC11蛋白的表达活性降低≥50％，较佳地，≥60％，更佳地，≥70％，更佳地，≥80％，更佳地，≥90％或95％。

在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。

在另一优选例中，所述抗原结合片段是Fab或scFv或单结构域抗体sdFv。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞选自下组：

(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；

(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或

(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。

在另一优选例中，所述免疫细胞为自体的。

在另一优选例中，所述免疫细胞为异体的。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞，优选人细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞还表达降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子。

在另一优选例中，所述的抑制分子是独立表达的和/或与靶向肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体CAR共表达的。

在另一优选例中，所述的与靶向肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体CAR共表达包括抑制分子与靶向肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体CAR的串联表达。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞、NK细胞或巨噬细胞。

在另一优选例中，所述跨膜结构域为选自下组的蛋白的跨膜结构域：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、或其组合。

在另一优选例中，所述胞内结构域包括共刺激信号分子和源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述共刺激信号分子为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，包括第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸含有第一表达盒，所述第一表达盒编码降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子，所述第二核酸含有第二表达盒，所述第二表达盒编码嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合于肿瘤细胞表面抗原。

在另一优选例中，所述第一表达盒和/或第二表达盒还包括组成型启动子或诱导型启动子。

在另一优选例中，所述组成型启动子选自下组：CMV、EF1a、U6、SV40、PGK1、Ubc、CAG、H1、或其组合。

在另一优选例中，所述诱导型启动子选自下组：金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、四环素启动子、或其组合。

本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞，优选人细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞选自下组：

(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；

(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或

(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。

在另一优选例中，所述免疫细胞为自体的。

在另一优选例中，所述免疫细胞为异体的。

在另一优选例中，所述的免疫细胞还表达降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子。

在另一优选例中，所述的抑制分子是独立表达的和/或与靶向肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体CAR共表达的。

在另一优选例中，所述的与靶向肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体CAR共表达包括抑制分子与靶向肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体CAR的串联表达。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞、NK细胞或巨噬细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞。

本发明第五方面提供了一种药物组合物，包括：

(a)本发明第一方面所述的工程化免疫细胞或本发明第四方面所述的宿主细胞；和

(b)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞是(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有选择性杀伤肿瘤细胞的其他药物(如抗体药物、化疗药物或其他CAR-T药物)。

本发明第六方面提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，包括：

将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述导入包括同时、先后、或依次导入。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞或NK细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明第七方面提供了一种试剂组合，所述试剂组合包括：

(i)第一试剂，所述第一试剂为工程化免疫细胞，所述的工程化免疫细胞含有嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合于肿瘤细胞表面抗原；和

(ii)第二试剂，所述的第二试剂为降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的小分子化合物。

在另一优选例中，所述的小分子化合物选自下组：伏瑞斯特(Vorinostat,SAHA)、西达本胺(Tucidinostat)、莫西诺司他(Mocetinostat)、LMK-235、丙戊酸钠(Valproicacid sodium salt)、ACY-738、盐酸替米司他(Resminostat hydrochloride)、恩替诺特(Entinostat)、曲古抑菌素A(Trichostatin A)、或其组合。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞还表达降低或抑制HDAC11蛋白表达量或活性的抑制分子。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞还表达用于降低或抑制HDAC11蛋白表达的抑制性核酸。

本发明第八方面提供了一种增强工程化免疫细胞的肿瘤杀伤效率的方法，包括：

在降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子存在下，将工程化免疫细胞与肿瘤细胞接触，从而增强工程化免疫细胞的肿瘤杀伤效率。

在另一优选例中，所述方法为体外的。

在另一优选例中，所述方法为非治疗和非诊断性的。

在另一优选例中，所述降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子为内源产生的或外源添加的。

在另一优选例中，所述内源产生指由所述工程化免疫细胞产生。

在另一优选例中，所述外源添加指外源添加小分子化合物。

本发明第九方面提供了一种本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第五方面所述的药物组合物的用途，用于制备选择性杀伤肿瘤细胞的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括CD19阳性的肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞来源于选自下组的肿瘤：急性淋巴细胞白血病、骨髓瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、肾细胞癌、肝癌、卵巢癌、食管腺癌、前列腺癌、宫颈癌、多发性骨肉瘤、或其组合。

本发明第十方面提供了一种用于选择性杀伤肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、或本发明第四方面所述的宿主细胞。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有标签或使用说明书。

本发明第十一方面提供了一种选择性杀伤肿瘤细胞的方法，包括：

给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第五方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

本发明第十二方面提供了一种治疗癌症或肿瘤的方法，包括：

给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第五方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括CD19阳性的肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞来源于选自下组的肿瘤：急性淋巴细胞白血病、骨髓瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、肾细胞癌、肝癌、卵巢癌、食管腺癌、前列腺癌、宫颈癌、多发性骨肉瘤、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

图1显示了pLL3.7空载体以及pLL3.7-(shRNA-D/NC)-EGFP载体结构示意图。

图2显示了pLL3.7空载体以及重组质粒pLL3.7-(shRNA-D/NC)-EGFP载体经EcoR I单酶切鉴定结果。

图3显示了pLL3.7-CAR19、pLL3.7-shRNA-D-CAR19、pLL3.7-shRNA-NC

-CAR19三种质粒的结构示意图。

图4显示了重组质粒pLL3.7-CAR19、pLL3.7-shRNA-D-CAR19、pLL3.7-shRNA-NC-CAR19经EcoR I单酶切鉴定结果。

图5显示了经pLL3.7-shRNA-D-EGFP感染的Jurkat细胞其HDAC11基因转录明显下调。

图6显示了经pLL3.7-shRNA-D-EGFP感染的Jurkat细胞其HDA11蛋白水平显著下调。

图7显示了经shRNA-D干扰的Jurkat细胞其HDAC11mRNA水平能够被持续降低。

图8显示了HDAC11-shRNA-CART杀伤效率结果(E:T＝0.5：1)。

流式细胞仪上选择FL3圈出所有CD19阳性的细胞。根据流式结果，发现与未感染病毒的Jurkat组相比，其他各组靶细胞Raji的比例均有不同程度的下降。计算各组别JurCART细胞对Raji的杀伤效率，如图8所示。

图9显示了pLL3.7-(shRNA-A/B/C/D/NC)-EGFP重组质粒EcoR I酶切鉴定结果。

图10显示了设计的四种不同序列(shRNA-A/B/C/D/NC)的shRNA在HDAC11mRNA水平上的干扰效果。

图11显示了设计的四种不同序列(shRNA-A/B/C/D/NC)的shRNA在HDAC11基因蛋白水平上的干扰效果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地发现在工程化的免疫细胞(如T细胞、NK细胞)中敲低HDAC11基因的表达，可显著增加效应性免疫细胞的比例，增强免疫细胞效应因子的释放和免疫细胞的增殖能力，从而增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。同时HDAC11基因表达的沉默还可以延长免疫细胞在体内的存活时间。在此基础上，本发明人完成了本发明。

本发明以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的工程化的免疫细胞进行详细说明。本发明的工程化的免疫细胞不限于上下文所述的CAR-T细胞，本发明的工程化的免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NK细胞等同于T细胞(或T细胞可替换NK细胞)；当免疫细胞为T细胞时，TCR等同于CAR(或CAR可替换为TCR)。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。

如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。

如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。

如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人LAG-3抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。

如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种抗人TX103抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。

本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。

Vorinostat(又名：SAHA)，中文名伏瑞斯特，结构式为

Tucidinostat(又名:Chidamide；HBI-8000；CS 055)

中文名，西达本胺，结构式

Mocetinostat(又名:MGCD0103)，中文名，莫西诺司他，结构式，

LMK-235，结构式为

HDAC11

组蛋白去乙酰化酶11(Histone deacetylases 11，HDAC11)是组蛋白去乙酰化酶家族中最新发现的新成员，组蛋白去乙酰化酶还有其他成员，比如HDACl、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10。

组蛋白去乙酰化酶11参与了多种免疫细胞(如T细胞、B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、抗原递呈细胞等)功能的调控。

本发明的研究发现，HDAC11可以作为一个T细胞活化的负调控因子，通过与TBET和EOMES基因启动子的相互作用来调节T细胞的活化。HDAC11在效应T细胞和效应记忆T细胞中表达下调并且在HDAC11 KO T细胞中可以看到更强的效应功能。另外，HDAC11的缺失可以促进幼稚T细胞向记忆T细胞分化，在HDAC11 KO小鼠中可以看到CD8⁺中央记忆T细胞的积累。HDAC11的缺失还可以增强T细胞的增殖能力并产生更多的炎性因子。

肿瘤抗原

本发明的肿瘤抗原包括不限于CD19、HER2、c-Met、PSMA、MUC16、CD20、CD22、CD123、CD47、CD138、CD33、CD30、mesothelin、EGFR、GPC3、BCMA、ErbB2、NKG2D ligands、LMP1、EpCAM、VEGFR-1、Lewis-Y、ROR1。

以CD19为例。

CD19是参与B细胞活化与增殖的重要膜抗原之一，是所有B细胞共有的表面标志，B细胞活化后不消失，是最重要的B细胞标记因子，同时CD19也是B细胞表面的传达信号复合体的构成部分。以CD19为靶向的CAR-T主要应用于B细胞恶性肿瘤治疗领域。CD19可广泛表达在多种B细胞恶性肿瘤细胞表面，却不在其他组织和血液细胞中表达，血液中也未曾检测到CD19可溶性蛋白的存在。因此它被认为是CAR-T治疗B细胞肿瘤的理想靶点。临床试验结果显示，CD19CAR-T对急性B-淋巴细胞白血病(B-ALL)的治愈率已经达到了90％。

抗原结合结构域

在本发明中，嵌合抗原受体CAR的抗原结合结构域特异性结合于肿瘤细胞表面抗原。

在一优选实施方式中，本发明的嵌合抗原受体CAR的抗原结合结构域靶向CD19。

绞链区和跨膜区

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。优选地，本发明的CAR中的绞链区和跨膜区为CD8的绞链区和跨膜区。

胞内结构域

本发明的CAR的胞内结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。

在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。优选地，包括4-1BB(CD137)等。

本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。

在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1BB的信号传导结构域(共刺激分子)以及CD3ζ的信号传导结构域。

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。

CAR-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和/或ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和/或ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域和/或CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab'片段，F(ab')2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达抗原CD47和MSLN的抗体，较佳地为单链抗体。

在本发明中，本发明的scFv还包括其保守性变异体，指与本发明scFv的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR的胞外结构域包括特异性结合于肿瘤细胞表面抗原的抗原结合结构域，优选特异性结合于CD19的抗原结合结构域。

在本发明中，本发明的CAR中的胞内结构域包括CD8的跨膜区、4-1BB的共刺激因子、CD3ζ的信号传导结构域。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明所述的CAR-T细胞，本发明CAR-T细胞可靶向肿瘤细胞表面抗原(优选CD19)，用来治疗肿瘤细胞表面抗原(如CD19)高表达或阳性的肿瘤。

CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。

在本发明中，本发明的CAR包含(i)胞外结构域，其包含特异性结合于肿瘤细胞表面抗原的抗原结合结构域；(ii)跨膜域；(iii)共刺激因子；和(iv)CD3ζ的信号传导结构域。

嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可靶向肿瘤细胞表面抗原(优选CD19)，用于治疗肿瘤细胞表面抗原(如CD19)高表达或阳性的肿瘤。

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

外源T细胞抗原受体

如本文所用，外源T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)为通过基因转移技术从肿瘤反应性T细胞中克隆出TCR的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到T细胞内的TCR。

外源TCR修饰的T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化TCR与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高T细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以启动转录。

合适的启动子的一个例子为U6启动子。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于CMV启动子、类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

本发明所设计的整合了HDAC11RNAi的基于Pll3.7的CD19-CAR载体，但本发明内容不限于用Pll3.7构建的CAR载体，应适合于所有适合于构建CART的其他质粒载体，靶点也不限于CD19-CART，应适合于所有靶点的CAR-T。

制剂

本发明提供了一种本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、本发明第四方面所述的宿主细胞、以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/Kg体重，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/Kg体重。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物(如CD19)，协同激活T细胞，引起细胞免疫应答，从而显著提高其对来自恶性肿瘤的肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，CD19的CAR-T细胞引起抗表达CD19的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗CD19的抗原结合结构域、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明的T细胞(如，CD19-CAR-T细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，在CAR-T细胞中敲低HDAC11基因的表达，可增加效应性CAR-T细胞的比例，增强CAR-T细胞效应因子的释放和CAR-T细胞的增殖能力，从而增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

(2)本发明首次发现，在CAR-T细胞中同时沉默HDAC11基因的表达还可以使幼稚T细胞向中央记忆T细胞分化，延长CAR-T细胞在体内的存活时间。

(3)本发明首次发现，低表达HDAC11蛋白的免疫细胞(如JurCART细胞)对肿瘤(如CD19阳性的肿瘤)具有更好的杀伤效率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

实施例1 pLL3.7-HDAC11-shRNA干扰载体的构建

1.1RNAi靶序列设计

在NCBI网站中查找到Homo sapiens histone deacetylase 11(HDAC11)的基因序号：NM_024827.3。根据基因编号在网站(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)设计HDAC11基因RNAi靶序列，结果表1所示。

表1.HDAC11基因RNAi靶序列

1.2根据靶序列设计干扰序列：

基于筛选出的靶序列，按照如下原则设计和确定干扰序列：5端以G开头，设定G+C含量为30％～50％。根据pLL3.7载体的要求，(1)在正义链5'端加T重建U6启动子l位的T。(2)干扰靶序列后加Loop环“TTCAAGAGA”。(3)加入反转互补序列及终止信号“TTTTTT”。(4)在3'端再加上EcoR I酶切位点GAATTC以方便鉴定。(5)再补平Xho I酶切位点合成一对互补片段。

将序列打乱设计NC(Negative Control)序列，各序列如下表2所示

表2.针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸序列

1.3构建干扰质粒pLL3.7-shRNA-(D/NC)-EGFP

将设计好的靶寡核苷酸序列交至苏州泓迅生物科技有限公司合成靶序列的双链DNA序列，并将空载pLL3.7予以限制性内切酶XhoI、HpaI双酶切，经重组酶连接构建重组质粒pLL3.7-shRNA-(D/NC)-EGFP,如图1所示。重组质粒经EcoR I单酶切鉴定并测序如图2所示。

1.4构建靶向质粒pLL3.7-shRNA-(D/NC)-CD19

将CD19-CAR2序列两端分别加有NheI和EcoRI两种酶的酶切位点，再加有pLL3.7空载NheI和EcoRI酶切位点两端的15bp的同源臂，设计上下游引物RT-PCR得到目的片段。利用一步克隆重组酶，构建重组载体pLL3.7-U6-EF1α-CD19。将已经构建好的pLL3.7-shRNA-(D/NC)-EGFP载体经XhoI和XbaI双酶切胶回收大片段，pLL3.7-U6-EF1α-CD19载体经XhoI和XbaI双酶切胶回收小片段，T4DNA连接酶连接过夜，得到重组载体pLL3.7-shRNA-(D/NC)-CD19，如图3所示。重组质粒经EcoR I单酶切鉴定结果，如图4所示。

实施例2 pLL3.7-shRNA-(D/NC)-(EGFP/CAR19)慢病毒的包装

2.1.质粒转染

1)将质粒，PEI，Opti-MEM培养基置于室温5min；

2)取Opti-MEM 436μl于1.5mlEP管中，再加入64μg PEI混匀，室温静置5min；

3)取12μg载体质粒，8μg psPA×2，4μg pMD2.G，加入Opti-MEM至500μl，室温静置5min；

4)将配好的PEI-Opti-MEM溶液加入含质粒的Opti-MEM中，室温静置20min；

5)将1ml DNA/PEI混合物慢慢滴入前一天铺好的293T培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育，6-8h或者过夜；

6)更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育。

2.2.病毒收集和浓缩

1)质粒转染48h后，收集上清后，添加10ml新鲜培养基继续培养至72h，再次收集上清，与48h收集的上清混合后，置于4℃冰箱内待用；

2)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；

3)以0.45μm滤器过滤得到的上清；

4)将过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000转离心2h，用1/100上清体积的PBS进行稀释，反复吹打后转入密闭的离心管中4℃过夜；

5)将病毒液分装至合适的体积，置于-80℃中保存，并取200μl病毒进行滴度测定。

2.3.病毒滴度测定

1)消化293T细胞，离心后计数，用含血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为4×10⁵/ml，向24孔培养板的每孔中加入0.5ml细胞悬液；

2)用全培养基按以下比例稀释病毒上清：1:3；1:9；1:27；

3)分别将100μl病毒原液及按不同比例稀释后的病毒液，加入到已接种细胞的24孔板中；

4)16h后弃去感染上清，添加0.5ml新鲜全培养基；

5)48h后流式检测被感染细胞的目的基因表达；

6)计算滴度，滴度＝2*10⁶*感染效率*稀释倍数。

结果如下：

病毒收集浓缩后，经滴度检测，pLL3.7-shRNA-D-EGFP、pLL3.7-shRNA-NC-EGFP两种病毒的滴度分别为1.99*10⁸、1.97*10⁸。pLL3.7-shRNA-D-CD19、pLL3.7-shRNA-NC-CD19两种病毒的滴度分别为1.92*10⁸、1.79*10⁸。

实施例3 pLL3.7-HDAC11-shRNA-EGFP载体干扰验证试验

将Jurkat T接种于6孔板中,每孔2×10⁶个细胞，共9孔。分为3组：无病毒感染阴性对照组、pLL3.7-shRNA-D-EGFP慢病毒干扰组和pLL3.7-shRNA-NC-EGFP阴性干扰组，每组各2孔。两个实验组分别按照MOI＝10:1加入相应体积的病毒，并加入10μg/ml polybrene促进感染。10h后将细胞进行收集，1000g离心10min，弃去培养基，加入新鲜培养基。

慢病毒感染48h后收取细胞，流式检测GFP表达效率，即病毒感染阳性率。结果pLL3.7-shRNA-D-EGFP和pLL3.7-shRNA-NC-EGFP两种病毒在Jurkat细胞上的感染效率接近100％。

收取感染48h后的三组Jurkat细胞。用Trizol裂解细胞，抽提总RNA，进行逆转录。Q-PCR分析重组质粒的干扰效果。结果如图5所示pLL3.7-shRNA-D-EGFP慢病毒感染细胞后能显著干扰HDAC11mRNA的转录使得HDAC11mRNA的表达量明显下降到原来的40％。经RNA干扰后，HDAC11基因不仅在转录水平上表达下调，在蛋白水平也有明显变化。经pLL3.7-shRNA-D-EGFP感染的Jurkat细胞HDAC11蛋白的表达量显著下调，结果如图6所示。

为了验证pLL3.7-shRNA-D-EGFP慢病毒感染细胞能否持续抑制HDAC11的转录，分别收取感染第0d、5d、10d、15d、20d的细胞，检测HDAC11的转录水平。发现随着时间延长，shRNA-D干扰靶序列可以持续干扰Jurkat T细胞HDAC11的表达，其mRNA表达水平持续降低，结果如图7所示。

实施例4 HDAC11敲低可以促进CART对肿瘤杀伤效率的验证实验

4.1.HDAC11-shRNA-JurCART细胞的制备

培养Jurkat细胞，离心换液，将三种慢病毒lenti-pLL3.7-shRNA-D-CD19、lenti-pLL3.7-shRNA-NC-CD19和lenti-pLL3.7-CD19按照MOI＝10:1的比例分别加入到培养基中，16h后离心换液，加入新鲜培养基继续培养，得到三种JurCART细胞，分别命名为CD19-shRNA-D-JurCART，CD19-shRNA-NC-JurCART和CD19-JurCART。收集细胞进行流式检测，结果显示CD19-shRNA-D-JurCART，CD19-shRNA-NC-JurCART和CD19-JurCART三种细胞的阳性率分别为95.6％、94.7％和95.4％。

4.2.HDAC11-shRNA-JurCART体外杀伤验证实验

1)Raji细胞与JurCART细胞的混合培养

将培养的高表达CD19的Raji细胞分别按照1*10⁵/孔的数量接种至96孔板中；将CD19-shRNA-D-JurCART，CD19-shRNA-NC-JurCART和CD19-JurCART三种细胞和未感染病毒的Jurkat分别按照5*10⁴/孔的数量接种至预先接种Nalm6的孔中，每组两个重复，每孔补液至200ul；

将细胞混合后的培养板放至37℃培养箱中培养6h；

6h后，收集每孔中所有细胞，将细胞转移至EP管中，加入1mL1×PBS洗一遍后，加入0.5ul Anti-Human-CD19(Percp Cy5.5)抗体标记靶细胞Raji，4℃孵育30分钟，再用1×PBS洗一遍，200ul的1×PBS重悬细胞，将细胞转移至流式管中，上机检测。

2)杀伤效率分析

流式细胞仪上选择FL3圈出所有CD19阳性的细胞。根据流式结果，发现与未感染病毒的Jurkat组相比，其他各组靶细胞Raji的比例均有不同程度的下降。计算各组别JurCART细胞对Raji的杀伤效率，如图8所示。通过Raji细胞比例的不同程度的降低计算不同处理组的肿瘤细胞的杀伤效率，干扰靶序列shRNA-D处理组的CD19-shRNA-D-JurCART具有最高的杀伤效率为35.5％，与不进行HDAC11干扰的CD19-JurCART或HDAC11干扰阴性对照序列处理组CD19-shRNA-NC-JurCART相比，具有显著差异。因而充分证实了低表达HDAC11蛋白的JurCART细胞对肿瘤具有更好的杀伤效率。

实施例5筛出的其他shRNA的效果

在筛选本申请的shRNA-D干扰序列的过程中，还同时针对多个不同靶序列设计了不同的干扰序列，并进行了相关实验。实验方法与上述相同。

1.筛选出的其他RNAi靶序列如表3所示，各靶序列对应的干扰序列的上下游片段如表4所示，其中shRNA-D为实施例原有序列。

表3.HDAC11基因RNAi靶序列

表4.针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸序列

利用与上述载体构建相同的方法，设计干扰shRNA后由公司合成干扰序列DNA双链并连接到pLL3.7载体上，进行EcoR I单酶切鉴定，结果如图9所示。

利用上述相同的方法，进行慢病毒包装。

利用上述相同的方法，检测pLL3.7-shRNA-D/A/B/C/NC-EGFP质粒的干扰效果。

结果如图10所示，结果显示，从HDAC11mRNA表达来看，在众多被筛选的干扰RNA中，shRNA-A、shRNA-B和shRNA-C和shRNA-D均具有显著效果，其中，shRNA-D的效果最好，因此shRNA-D片段具有最优的干扰效果。

图11所示为经不同片段的shRNA干扰后，western blot检测HDAC11的蛋白水平，shRNA-D的条带最淡，也显示出其干扰效果最强。

对比例

方法同实施例1-4，区别在于：用针对HDAC的其他蛋白(如HDAC5、9或10)的shRNA分别替换针对HDAC11的shRNA。

结果表明，与不进行HDAC干扰的CD19-JurCART相比，低表达HDAC5、9或10蛋白的JurCART细胞，未表现出对肿瘤的杀伤效率的促进作用(HDAC5和10)，或仅有微弱的促进作用(HDAC9)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东师范大学

上海邦耀生物科技有限公司

<120> HDAC11基因干扰的嵌合抗原受体T细胞及其应用

<130> P2018-1444

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

ggatgatgag tacctggata a 21

<210> 2

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

tggatgatga gtacctggat aattcaagag attatccagg tactcatcat ccttttttga 60

attcc 65

<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

tcgaggaatt caaaaaagga tgatgagtac ctggataatc tcttgaatta tccaggtact 60

catcatcca 69

<210> 4

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

tggatccata gtcgtggtaa tcttcaagag agattaccac gactatggat ccttttttga 60

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<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tcgaggaatt caaaaaagga tccatagtcg tggtaatctc tcttgaagat taccacgact 60

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gcacacgagg cgctatctta a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ggctaccatc attgatcttg a 21

<210> 9

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

tcgaggaatt caaaaaagga gaagctgcat ccctttgatc tcttgaatca aagggatgca 60

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<210> 10

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

tgcacacgag gcgctatctt aattcaagag attaagatag cgcctcgtgt gcttttttga 60

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<210> 11

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

tcgaggaatt caaaaaagca cacgaggcgc tatcttaatc tcttgaatta agatagcgcc 60

tcgtgtgca 69

<210> 12

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

tggctaccat cattgatctt gattcaagag atcaagatca atgatggtag ccttttttga 60

attcc 65

<210> 13

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

tcgaggaatt caaaaaaggc taccatcatt gatcttgatc tcttgaatca agatcaatga 60

tggtagcca 69

Claims (12)

1.一种工程化免疫细胞，其特征在于，包括：

(a) 嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合于肿瘤细胞表面抗原；和

(b) 降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子，所述肿瘤细胞表面抗原为CD19，所述抑制分子为抑制性核酸，所述抑制性核酸包括RNA干扰剂，所述抑制性核酸分子包括与编码HDAC11的核酸互补的序列。

2.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述的抑制分子是独立表达的和/或与靶向肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体CAR共表达的。

3.一种核酸分子，其特征在于，包括第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸含有第一表达盒，所述第一表达盒编码降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子；所述第二核酸含有第二表达盒，所述第二表达盒编码嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合于肿瘤细胞表面抗原，所述肿瘤细胞表面抗原为CD19，所述抑制分子为抑制性核酸，所述抑制性核酸包括RNA干扰剂，所述抑制性核酸分子包括与编码HDAC11的核酸互补的序列。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求3所述的核酸分子。

6.一种药物组合物，其特征在于，包括：

(a) 权利要求1所述的工程化免疫细胞或权利要求5所述的宿主细胞；和

(b) 药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，所述细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml。

8.一种制备工程化免疫细胞的方法，其特征在于，包括：

将权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

9.一种试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括：

(i) 第一试剂，所述第一试剂为工程化免疫细胞，所述的工程化免疫细胞含有嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合于肿瘤细胞表面抗原；和

(ii) 第二试剂，所述的第二试剂为降低或抑制HDAC11蛋白表达活性的抑制分子；

其中所述肿瘤细胞表面抗原为CD19，所述抑制分子为抑制性核酸，所述抑制性核酸包括RNA干扰剂，所述抑制性核酸分子包括与编码HDAC11的核酸互补的序列。

10.一种权利要求1所述的工程化免疫细胞、权利要求5所述的宿主细胞、或权利要求6所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备选择性杀伤肿瘤细胞的药物或制剂。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述肿瘤细胞包括CD19阳性的肿瘤细胞。

12.一种用于选择性杀伤肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的权利要求1所述的工程化免疫细胞、或权利要求5所述的宿主细胞。

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