CN101787357A

CN101787357A - 一种以4.1r、cd29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用

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Publication number: CN101787357A
Application number: CN 201010119587
Authority: CN
Inventors: 康巧珍; 安秀丽; 周晴晴; 汲振余; 阎红霞; 陈鲤翔; 王婷
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2010-03-09
Filing date: 2010-03-09
Publication date: 2010-07-28
Anticipated expiration: 2030-03-09
Also published as: CN101787357B

Abstract

一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用，以蛋白4.1R基因敲除小鼠为实验材料制备C57BL/6J_4.1R-/-MEF原代细胞，用SV40大T抗原转化法得到的永生化C57BL/6J_4.1R-/-MEF。本发明的目的是为以蛋白4.1R和CD29为药靶的新药筛选和基因治疗提供离体细胞筛选模型。其优点在于：避免了因基因敲除动物饲养成本高，原代细胞在体外传代受限等对以4.1R为治疗靶的药物筛选和生产产生的局限。降低靶向新药生产成本。本发明所建立的C57BL/6J_4.1R-/-MEF，细胞表面CD29活化由于4.1R的缺失而被抑制，可以成为生产以CD29为靶向，研究与细胞增殖和迁移、细胞因子分泌、细胞信号转导调控及肿瘤耐药等相关的抗肿瘤新药的筛选模型。

Description

一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于药物领域，涉及一种抗肿瘤药物筛选模型的制备，即制备C57BL/6J_4.1R-/-MEF细胞模型，以期作为以4.1R和CD29为靶标的新药制备和基因治疗的细胞筛选模型。

背景技术

蛋白4.1(指红细胞膜蛋白经SDS-PAGE后第4.1条显色带)是红细胞中以血影蛋白(spectrin)为基础的细胞膜骨架的一个基本成分^[1]，是将红细胞跨膜蛋白和血影蛋白-肌动蛋白骨架网络连接起来的桥梁，对维持红细胞的形状、粘附、脆性及正常生理功能发挥重要作用^[2]。人类蛋白4.1表达缺失会导致溶血性贫血^[3]。因蛋白4.1最初是在成熟红细胞中发现的，故命名为4.1R。最近几年，又相继发现了三种与4.1R有很高同源性的蛋白质，分别命名为4.1G(广泛表达)，4.1N(主要在神经元中表达)，4.1B(主要在脑中表达)，这四种蛋白质的基因即构成了蛋白4.1基因家族。蛋白4.1家族成员都具有三个高度保守的功能性结构域：氨基端的膜结合结构域MBD(Membrane binding domain)、血影蛋白-肌动蛋白结合结构域SABD(Spectrin actin binding domain)和参与细胞信号转导的羧基末端结构域(C-terminal domain)。其氨基末端膜结合结构域MBD在序列和空间折叠上都与ERM蛋白(Ezrin radisin moesin)氨基末端膜结合结构域具有同源性，被统称为FERM结构域(four-point-one，ezrin，radixin，moesin domain)，拥有FERM结构域的蛋白被称为4.1蛋白超家族^[1]。已有报道表明ERM蛋白在T细胞活化中发挥重要作用^[4-5]，且Tang TK等^[6-7]人也观察到人T细胞中4.1R在微管组织中心(MTOS)高表达。

最近有研究发现，4.1R的缺失会使小鼠CD4⁺T细胞大量活化增殖，即提出4.1R在T细胞活化中可能起着重要的调控作用^[8]。本专利建立的4.1R敲除小鼠胚胎成纤维细胞，可在体外研究4.1R对T细胞依赖性免疫应答的调控，为以4.1R为药靶研究T细胞相关性疾病提供实验材料。

在国内，胃癌、结肠癌、食管癌和乳腺癌的发病率较高，且治愈较难，因此寻找有效的靶点制备抗癌药物对缓解病情具有一定的临床应用价值。有文献报道，在脑膜瘤^[9]、室管膜瘤^[10]、非小细胞肺癌^[11]、食管小细胞癌^[12]、乳腺癌^[13]和胃癌^[14]等多种癌症中，蛋白4.1表达下降或表达缺失，并且越来越多的临床和实验证据证实编码蛋白4.1的基因在多种肿瘤中表现出抑癌基因的作用^[15]，这表明蛋白4.1与肿瘤的发生和发展有着密切的关系。高艳峰等报导4.1B在食管鳞状细胞癌中表达异常^[16]。因此，以蛋白4.1作为药靶进行抗肿瘤药物的筛选具有一定的临床意义和实用价值。

整合素(Integrins)是广泛存在于动物细胞表面的一类细胞粘附分子，是一种由α和β亚基组成的异二聚体穿膜糖蛋白，它介导细胞与细胞外基质(ECM)及细胞与细胞间的相互作用，参与细胞内外信息传递，在细胞分化、胚胎发育、凝血、组织修补及细胞粘附、侵袭等各方面起着重要作用^[5]。一般认为，整合素可刺激抗细胞凋亡机制，使肿瘤细胞延迟死亡或促进肿瘤细胞生长。整合素与肿瘤的关系主要表现在肿瘤的生长与转移方面：在肿瘤发生早期，整合素表达降低可导致肿瘤细胞与ECM的粘附作用减弱，从而有利于肿瘤在局部生长和扩散；肿瘤细胞进入血循环后，整合素表达增多有利于肿瘤细胞粘附于血管内皮，继而发生转移等。整合素表达的上调或下调，是评价肿瘤发生和预后的有效标志。有文献曾报道，整合素β1(β1integrin，CD29)在SHG44胶质瘤细胞中高表达，并与胶质瘤细胞增殖、生存密切相关，抑制整合素β1的表达可促进胶质瘤细胞的凋亡^[17]；余小东等人也发现，食管鳞状细胞癌组织中整合素β1表达明显下降^[18]。最近有研究发现，整合素β1的过表达会抑制贺赛汀(trastuzumab)对HER-2型乳腺癌的抗癌作用^[19-20]，阻断肿瘤细胞与细胞外基质的作用可以逆转肿瘤的耐药作用，这也为临床逆转肿瘤耐药提供了新的思路。

我们在前期的研究中首次发现蛋白4.1R基因敲除小鼠(4.1R gene knockoutmice)胚胎成纤维细胞(MEF)中CD29表达量上调，但细胞表面被活化的CD29分布却显著降低。我们已经知道，由于4.1R基因缺失可使人的红细胞膜骨架结构改变，细胞膜表面蛋白分子分布异常^[21-22]。因此，本发明建立的细胞模型为体外研究4.1R的缺失和细胞粘附分子CD29与肿瘤的发生和转移的关系提供了可能，并使其成为研究以4.1R、CD29为靶向的抗肿瘤药物不可缺少的筛选模型。

目前我们采用“基因敲除”技术，沉默小鼠基因组中蛋白4.1R的表达，建立了具有C57BL/6J遗传背景的4.1R基因敲除小鼠导入近交系。为研究以4.1R和CD29为靶向的药物筛选提供了平台。但是基因敲除小鼠动物模型的饲养管理需要特殊技术要求和环境设施，日常维持成本过高，不利于运输保存。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术的状况而提供了一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用，即以C57BL/6J遗传背景的4.1R基因敲除小鼠为材料制备了4.1R基因缺失的小鼠胚胎成纤维细胞系(Miceembryos fibroblast，MEF)，给以蛋白4.1R和CD29为药靶的新药筛选和基因治疗提供模型。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法，包括以下步骤：

(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养

①取C57BL/6J_4.1R-/-小鼠胚胎，去除头、心脏和肝脏，其余部分用PBS洗涤3次，充分去除红细胞后，剪成组织块，每个胚胎加0.25％冷胰蛋白酶，4℃过夜；

②6-12h后，吸去多余的胰蛋白酶，留下2倍于组织体积的胰蛋白酶，37℃水浴30min，加含10％胎牛血清的DMEM培养基，充分混匀，沉淀1min，将上清移到一只新的无菌离心管中，而沉淀加入新的DMEM培养基，重复该分离步骤；

③将上清合并，以1000rpm/min离心10min，收集细胞，用10mlDMEM培养基重新悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度接种于75cm培养瓶中，于37℃5％CO₂培养箱内培养过夜；

④6-12h后，弃培养基，PBS洗2次，加入新的DMEM培养基至长成单层，1∶5传代；

(2)小鼠胚胎成纤维细胞永生化

①865细胞(ATCC Number：CRL-7601)在MDEM培养基中培养48h后，以1000rpm/min离心10Min，收集上清后，进行滤膜(规格为0.4μm)过滤，滤液按1∶5000(体积比：滤液∶聚凝胺＝1∶5000)加入聚凝胺(polybrene)(sigmas-2667，40mg/ml)备用；

②将5×10⁵个传至第3代的MEF细胞加入5ml上述含聚凝胺的SV40病毒大T抗原滤液中，培养24h后弃培养液，换成DMEM正常培养基进行传代培养；

③培养至10代后，液氮罐中冻存。

本发明的4.1R-/-MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)模型的应用，为以蛋白4.1R和CD29为药靶的新药筛选制备和基因治疗提供离体细胞模型。

本发明的优点在于：

(1)本发明具有唯一性和原始创新性。目前，国内、外尚未见以蛋白4.1R为靶标的新药筛选和基因治疗细胞模型的专利和相关报道。

(2)本发明具有先进性。本发明以蛋白4.1R基因敲除小鼠为实验材料制备了C57BL/6J_4.1R-/-MEF原代细胞，用SV40大T抗原转化法得到的永生化C57BL/6J_4.1R-/-MEF在体外已传至第30代，其形态与C57BL/6J_4.1R+/+小鼠MEF无差异。经蛋白免疫印记技术检测，建立的C57BL/6J_4.1R-/-MEF细胞模型，既具有C57BL/6J遗传背景，又成功沉默了蛋白4.1R的基因表达，可以为生产以4.1R为靶向的新药提供筛选模型。避免了因基因敲除动物饲养成本高，原代细胞在体外传代受限等因素对以4.1R为治疗靶向的药物筛选和生产而产生的局限。因此，建立可在体外传代培养的基因敲除MEF工程细胞系更加符合“减少、替代、优化”的实验动物发展“3R”原则，降低了靶向新药生产成本。

(3)本发明具有广泛的适用性。本发明建立的C57BL/6J_4.1R-/-MEF，由于4.1R的缺失，其细胞表面CD29的活化被抑制。因此，本发明制备的细胞模型可以成为生产以CD29为靶向，研究与细胞增殖和迁移、细胞因子分泌、细胞信号转导调控及肿瘤耐药等相关的抗肿瘤新药的筛选模型。

此外，由于MEF具有体外培养传代易行，分裂增殖迅速，纯度高等特点，可作为一种体外模型，对外界环境中有害因子(物理、化学和生物)进行检测，评价其对人体可能产生的危害。已有研究证明：将小鼠胚胎成纤维细胞体外暴露于氯化镉、甲醛中，可造成其存活率下降和遗传损伤。因此，本发明建立的C57BL/6J_4.1R-/-MEF也可作为一种新的环境评价因子，来检测环境中镉和甲醛对细胞的毒副作用。

附图说明

图1为永生化的4.1R WT/KO MEF形态学比较图。

注：WT：C57BL/6J_4.1R+/+小鼠MEF KO：C57BL/6J_4.1R-/-小鼠MEF

图2为4.1R、4.1N、4.1B、4.1G，Paxillin和β1integrin在4.1R WT/KOMEF中的表达。

图3为4.1R WT/KO MEF中CD29的活化情况比较图。(A)4.1R WT/KOMEF中未活化的CD29含量比较(B)4.1RWT/KO MEF中活化的CD29含量比较；图中1：unstained cells CD29(空白对照)；2：WT/MEF-CD29；3：KO/MEF-CD29

具体实施方式

本发明以下结合实施例(附图)做进一步描述：

1.实验材料

野生型C57BL/6J近交系小鼠(C57BL/6J_4.1R+/+)、4.1R基因敲除C57BL/6J近交系小鼠(C57BL/6J_4.1R-/-)，均为2月龄的SPF小鼠(special pathogen freemouses)，饲养在屏障系统(barrier system)中。含SV40大T抗原的865细胞系(ATCCNumber：CRL-7601)在MDEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)培养基中，37℃、5％CO₂条件下培养。

2.实验方法

2.1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养：

①2月龄C57BL/6J_4.1R-/-小鼠在下午6:00按雌雄1∶1配对合笼，每天早晨观察雌鼠生殖道有无精栓(乳白色胶状物)，于发现精栓的当日记录胚胎日龄为0.5d；

②当小鼠胚胎发育至13.5d-15.5d时，用乙醚麻醉妊娠雌鼠，无菌取出妊娠子宫，PBS(磷酸盐缓冲液，pH 7.2，下同)洗涤胎鼠，胎鼠置一无菌培养皿内，去除头、心脏和肝脏，其余部分用PBS洗涤3次，充分去除红细胞后，剪成组织块，每个胚胎加0.25％的冷胰蛋白酶，4℃过夜；

③6-12h后，吸去多余的胰蛋白酶，留下2倍于组织体积的胰蛋白酶，组织块于37℃水浴30min，加含10％胎牛血清的DMEM培养基，充分混匀，沉淀1min，将上清移到一只新的无菌离心管中，而沉淀加入新的DMEM培养基，重复分离步骤③；

④将上清合并，以1000rpm/min离心10min，收集细胞，用10ml DMEM培养基重新悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度接种于75cm培养瓶中，于37℃5％CO₂培养箱内培养过夜；

⑤6-12h后，弃培养基，PBS洗2次，加入新的DMEM培养基至长成单层，1∶5传代。

注：C57BL/6J_4.1R+/+小鼠作为基因敲除小鼠对照系，同时建立MEF细胞系。

2.2小鼠胚胎成纤维细胞永生化

①865细胞在MDEM培养基中培养48h后，以1000rpm/min离心10min，收集上清后，进行滤膜(规格为0.4μm)过滤，滤液按1∶5000加入聚凝胺(polybrene)(sigma s-2667，40mg/ml)备用；

③培养至第10代后，液氮罐中冻存。

注：C57BL/6J_4.1R+/+小鼠作为基因敲除小鼠对照系，进行相同处理。

3.检测结果

3.1C57BL/6J_4.1R-/-小鼠MEF原代培养及永生化

我们从C57BL/6J_4.1R-/-小鼠分离的MEF在体外传至第7代增殖能力显著降低，传至第13代则全部死亡，而用SV40大T抗原转化法得到的永生化MEF在体外最多已传至第30代，其形态与C57BL/6J_4.1R+/+小鼠MEF无差异。见图1。

3.2C57BL/6J_4.1R-/-小鼠MEF相关基因表达检测

用蛋白免疫印迹法(Western blotting或Immunoblotting)检测C57BL/6J_4.1R-/-小鼠永生化MEF中4.1R、4.1B、4.1G、4.1N、Paxillin(桩蛋白)、β1integrin(CD29)、β-Actin(β-肌动蛋白)的表达。

与C57BL/6J_4.1R+/+MEF相比，C57BL/6J_4.1R-/-MEF中分子量为135kDa、80kDa的蛋白4.1R分子表达缺失，而4.1蛋白家族的其他成员4.1B、4.1N、4.1G及Paxillin表达正常，β1integrin表达上调。见图2。

3.3流式细胞术检测细胞表面CD29的活化

纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)包被的MatTek(聚焦显微镜专用玻底培养皿)6孔细胞培养板分别接种C57BL/6J_4.1R-/-和C57BL/6J_4.1R+/+永生化MEF细胞，细胞长至单层，细胞消化后用BD Fc Block^TM试剂(BD Pharmingen公司)封闭10min，PBS洗涤后分别用CD29活化和非活化一抗孵育1h，PBS洗3次，聚乙烯(PE)标记的二抗孵育30min，PBS洗涤，流式细胞仪(FACS-CANTO

BD Biosciences公司)检测，Diva软件(BD Biosciences公司)分析，实验结果表明4.1R表达缺失抑制了MEF细胞表面CD29的活化。见图3。

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Claims

1.一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养

(2)小鼠胚胎成纤维细胞永生化

①865细胞(ATCC Number：CRL-7601)在MDEM培养基中培养48h后，以1000rpm/min离心10min，收集上清后，进行滤膜过滤，滤液按1∶5000加入聚凝胺备用；

③培养至10代后，液氮罐中冻存。

2.一种权利要求1所述的以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的应用，为以蛋白4.1R和CD29为药靶的新药筛选制备和基因治疗提供离体细胞模型。