CN112649614A - Cd8+肿瘤浸润淋巴细胞作为标志物在食管小细胞癌预后判断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CD8+肿瘤浸润淋巴细胞作为标志物在食管小细胞癌预后判断中的应用。本发明首次发现食管小细胞癌组织中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量与食管小细胞癌预后相关：CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量越多，则食管小细胞癌患者预后越好；CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量越少，则食管小细胞癌患者预后越差。因此，将CD8+肿瘤浸润淋巴细胞作为标志物，通过检测其数量预测食管小细胞癌患者的预后。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及CD8+肿瘤浸润淋巴细胞作为标志物在食管小细胞癌预后判断中的应用。
背景技术
食管小细胞癌(small cell esophageal carcinoma，SCEC)是一种罕见的低分化型食管神经内分泌癌，其发病率仅占同期食管肿瘤总发病率的0.5％-5.9％。食管小细胞癌表现为易侵袭、转移早、预后差的临床特征，其五年生存率仅为9％-13.82％，远低于其他类型食管癌的总体五年生存率。同时，食管小细胞癌的后影响因素尚不明确，最优治疗模式也尚未确立。总的来说，这是一种恶性程度高，预后差，尚无可靠预后标志物的恶性肿瘤。因此，更应注重食管小细胞癌患者早期治疗和管理，筛选出高风险预后差的食管小细胞癌患者，给与更多和及时有效的干预措施，最终降低复发转移率，延长患者的生存期。鉴于此，发现预测食管小细胞癌预后的生物标志物是亟待解决的问题，这对降低食管小细胞癌复发转移率，提高患者生存质量和延长生存时间都有着重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的为预测食管小细胞癌患者的预后。
本发明首先保护一种系统，可包括检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的系统；所述系统用于预测食管小细胞癌患者的预后。
所述系统具体可由检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的系统组成。
上述任一所述的系统中，所述检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的系统可包括通过免疫组织化学染色方法检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞所需的试剂和/或仪器。
进一步的，所述通过免疫组织化学染色方法检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞所需的试剂和/或仪器包括CD8抗体和/或免疫组化试剂。
上述任一所述检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的系统用于检测食管小细胞癌组织中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量。
进一步的，所述通过免疫组织化学染色方法检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞所需的试剂和/或仪器，是将CD8蛋白作为标记，利用CD8抗体以及相关的免疫组化试剂，分析食管小细胞癌组织中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量，从而预测食管小细胞癌患者的预后。
所述CD8抗体可为CD8单克隆抗体或CD8多克隆抗体。
上述任一所述系统还可包含数据处理装置；所述数据处理装置内设模块；所述模块具有如下(a1)和/或(a2)所示的功能：
(a1)以食管小细胞癌患者组成的待测群体的离体食管小细胞癌组织为标本，测定每份标本中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数，之后计算待测群体的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的中位数；待测群体中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数低于中位数的患者组成阴性组，待测群体中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数大于等于中位数的患者组成阳性组；
(a2)按照如下标准确定来自于所述待测群体的待测患者的预后无复发生存期和/或预后总生存期：
“来自于所述阳性组中的待测患者”的预后无复发生存期高于或候选高于“来自于所述阴性组中的待测患者”；
“来自于所述阳性组中的待测患者”的预后总生存期高于或候选高于“来自于所述阴性组中的待测患者”。
在本发明的实施例中，由147例食管小细胞癌患者组成群体，群体的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的中位数为195.9细胞数/mm2。
上述任一所述的系统的检测样本可为食管小细胞癌组织。
本发明还保护上述任一所述的系统的应用，可为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
上述应用中，所述产品的检测样本可为食管小细胞癌组织。
本发明还保护CD8+肿瘤浸润淋巴细胞作为标志物的应用，可为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
本发明还保护用于检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的物质的应用，为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
本发明还保护用于检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的物质和上述任一所述数据处理装置的应用，可为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
本发明还保护上述任一所述数据处理装置的应用，可为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
上述任一所述用于检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的物质可包括通过免疫组织化学染色方法检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞所需的试剂和/或仪器。
进一步的，所述通过免疫组织化学染色方法检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞所需的试剂和/或仪器包括CD8抗体和/或免疫组化试剂。
上述任一所述检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的物质用于检测食管小细胞癌组织中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量。
进一步的，所述通过免疫组织化学染色方法检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞所需的试剂和/或仪器，是将CD8蛋白作为标记，利用CD8抗体以及相关的免疫组化试剂，分析食管小细胞癌组织中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量，从而预测食管小细胞癌患者的预后。
所述CD8抗体可为CD8单克隆抗体或CD8多克隆抗体。
上述任一所述的应用中，所述产品的检测样本可为食管小细胞癌组织。
上述任一所述CD8+肿瘤浸润淋巴细胞可为食管小细胞癌组织中的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞。
上述任一所述检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞可为检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数(细胞数/mm2)。CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数＝阳性染色细胞总数/肿瘤区域面积。其中，肿瘤区域面积可通过CaseViewer_2.3.软件扫描食管小细胞癌组织切片，再由高年资病理医生在高倍镜(400×)下勾画注释出肿瘤区域计算获得。阳性染色细胞总数可使用HALO数字病理分析平台计数：(1)设置并标记出蓝色的细胞核；(2)设置棕黄色细胞膜为阳性细胞；(3)调整细胞核与阳性细胞的参数，读取细胞膜阳性染色细胞总数。
实验证明，食管小细胞癌组织中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量的状态是一个显著独立的预测食管小细胞癌患者总生存期和无复发生存期的危险因素。
本发明的有益效果在于：
1、CD8+肿瘤浸润淋巴细胞与食管小细胞癌相关性的发现，为预测食管小细胞癌患者预后提供了全新的生物标志物，其中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量多的患者预后较好。
2、本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照评估和测定食管小细胞癌组织中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量，并结合术后随访信息，确定CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量与食管小细胞癌患者的生存时间存在相关性，CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量能够作为判断食管小细胞癌患者预后的生物标志物。对于食管小细胞癌患者，可以利用内镜下穿刺获得食管小细胞癌组织进行CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量的检测，从而评估患者的预后。
3、食管小细胞癌组织中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量均是通过绝对定量进行计数，其可靠性和重复性在一定程度上相当客观，是一个相对客观和一定程度上能够反应肿瘤真实世界的预测指标，有望真正应用于的临床预测和指导。
4、食管小细胞癌患者中的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量与患者的预后显著相关，这对于食管小细胞癌患者诊断和治疗具有重要的临床指导意义。
附图说明
图1为147例食管小细胞癌患者癌组织中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的免疫组化染色代表图；左图为阳性组的免疫组化染色结果，右图为阴性组的免疫组化染色结果。
图2为食管小细胞癌患者CD8+肿瘤浸润淋巴细胞阳性组和阴性组的生存分析；CD8阳性表示阳性组，CD8阴性表示阴性组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例、
一、检测食管小细胞癌患者的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数
147个食管小细胞癌组织的石蜡切片标本取自在中国医学科学院肿瘤医院接受治疗的147例食管小细胞癌患者。术中标本离体后立即按操作规范取材，分装于标记好的冻存管中，及时放入液氮速冻，整个过程保证30min内完成，过夜后转移到-80℃超低温冰箱长期保存。所有食管小细胞癌组织标本均得到术后病理组织切片证实(2名病理医生确认)。标本获取及操作过程获得中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准。标本的提供者均知情同意。
1、脱蜡至水
取石蜡切片标本，先用二甲苯脱蜡3次、每次15min，再用无水乙醇浸泡2次、每次5min，最后依次用85％乙醇水溶液水化5min、75％乙醇水溶液水化5min和蒸馏水洗涤5min。
2、抗原修复
取完成步骤1的标本，置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH6.0)的修复盒中，置于微波炉内进行抗原修复(具体参数为：中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片)；自然冷却后将标本置于PBS缓冲液(pH7.4)，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、阻断内源性过氧化物酶
将完成步骤2的标本置于3％双氧水溶液，室温避光孵育25min；然后将标本置于PBS缓冲液(pH7.4)，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、血清封闭
将完成步骤3的标本置于组化圈，滴加3％(v/v)BSA水溶液均匀覆盖标本，室温封闭30min。
5、加一抗
完成步骤4后，轻轻甩掉封闭液(即3％(v/v)BSA水溶液)，在标本上滴加CD8抗体稀释液(用PBS缓冲液(pH7.4)稀释CD8抗体至100倍；CD8抗体为鼠CD8单克隆抗体(Dako，M7103))，然后平放于湿盒内(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)，4℃孵育过夜。
6、加二抗
完成步骤5后，将标本置于PBS缓冲液(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。
7、DAB显色
完成步骤6后，将标本置于PBS缓冲液(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
8、复染细胞核
完成步骤7后，将标本苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
9、脱水封片
完成步骤8后，将标本依次用75％乙醇水溶液脱水5min、85％乙醇水溶液脱水5min、无水乙醇脱水2次(每次5min)、二甲苯处理5min，将标本从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
10、显微镜镜检，图像采集分析，获得患者CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数(细胞数/mm2)
采用CaseViewer_2.3.软件扫描食管小细胞癌组织切片，由高年资病理医生在高倍镜(400×)下勾画注释出肿瘤区域，再使用HALO数字病理分析平台进行CD8+肿瘤浸润淋巴细胞计数。具体如下：
(1)设置并标记出蓝色的细胞核；
(2)设置棕黄色细胞膜为阳性细胞；
(3)调整细胞核与阳性细胞的参数，读取细胞膜阳性染色细胞总数；
(4)计算患者的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数。
CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数＝阳性染色细胞总数/肿瘤区域面积
二、根据CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数可以对食管小细胞癌患者进行预后
1、为了明确CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数与食管小细胞癌患者的预后等临床病理相关性，获取147例食管小细胞癌组织的提供者的人口学资料(如性别、年龄或出生日期)、生活饮食习惯(如吸烟、饮酒)、家族史、临床病理信息和随访信息。部分患者的预后信息采取电话随访的方式获得。
2、将147例食管小细胞癌患者的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞中位数195.9细胞数/mm2(7.5-1458.6细胞数/mm2)作为cut-off值，CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数低于cut-off值的患者组成阴性组，CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数为cut-off值以上的患者组成阳性组。将阴性组和阳性组中步骤1获得的信息进行统计学分析。
147例食管小细胞癌患者的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数与临床病理特征见表1。
表1. 147例食管小细胞癌患者的临床病理特征
147例食管小细胞癌患者的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数与临床参数相关性分析结果见表2。
表2. 147例食管小细胞癌患者的CD8+肿瘤浸润细胞数与临床参数相关性分析
147例食管小细胞癌患者单因素的Cox回归分析见表3。
表3. 147例食管小细胞癌患者Cox单因素分析
147例食管小细胞癌患者多因素Cox回归分析见表4。
表4. 147例食管小细胞癌患者多因素Cox回归分析
结果表明，CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数与食管小细胞癌患者的预后具有相关性。
3、以生存时间为横坐标，累计生存率为纵坐标，绘制阴性组和阳性组的生存曲线。
生存曲线见图2。结果表明，阳性组患者的预后较好。
因此，CD8+肿瘤浸润淋巴细胞作为生物标志物，对其数量进行检测能够预测食管小细胞癌患者的预后。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种系统，包括检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的系统；所述系统用于预测食管小细胞癌患者的预后。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于：所述检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的系统包括通过免疫组织化学染色方法检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞所需的试剂和/或仪器。
3.如权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述系统还包含数据处理装置；所述数据处理装置内设模块；所述模块具有如下(a1)和/或(a2)所示的功能：
(a1)以食管小细胞癌患者组成的待测群体的离体食管小细胞癌组织为标本，测定每份标本中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数，之后计算待测群体的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的中位数；待测群体中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数低于中位数的患者组成阴性组，待测群体中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数大于等于中位数的患者组成阳性组；
(a2)按照如下标准确定来自于所述待测群体的待测患者的预后无复发生存期和/或预后总生存期：
“来自于所述阳性组中的待测患者”的预后无复发生存期高于或候选高于“来自于所述阴性组中的待测患者”；
“来自于所述阳性组中的待测患者”的预后总生存期高于或候选高于“来自于所述阴性组中的待测患者”。
4.权利要求1至3任一所述的系统的应用，为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
5.如权利要求1至3任一所述的系统、或、权利要求4所述的应用，其特征在于：所述系统或产品的检测样本为食管小细胞癌组织；
所述CD8+肿瘤浸润淋巴细胞为食管小细胞癌组织中的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞。
6.CD8+肿瘤浸润淋巴细胞作为标志物的应用，为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
7.用于检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的物质的应用，为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
8.用于检测CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的物质和权利要求3中所述的数据处理装置的应用，为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
9.权利要求3中所述的数据处理装置的应用，为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)制备用于预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期的产品；
(b2)预测食管小细胞癌患者预后无复发生存期；
(b3)制备用于预测食管小细胞癌患者预后总生存期的产品；
(b4)预测食管小细胞癌患者预后总生存期；
(b5)预测食管小细胞癌患者预后；
(b6)制备用于预测食管小细胞癌患者预后的产品。
10.如权利要求6至9任一所述的应用，其特征在于：
所述产品的检测样本为食管小细胞癌组织；
所述CD8+肿瘤浸润淋巴细胞为食管小细胞癌组织中的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞。
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