CN109136377B

CN109136377B - 成人t细胞白血病的治疗药物及诊断试剂盒

Info

Publication number: CN109136377B
Application number: CN201811118889.8A
Authority: CN
Inventors: 赵铁军; 王志龙; 张熠玲; 王雍; 衣凯宁; 徐玲玲
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN109136377A

Abstract

本发明涉及诊断成人T细胞白血病(ATL)的试剂盒以及治疗成人T细胞白血病的药物。本发明的发明人首次发现了检测ATL细胞中的ANRIL的表达水平可以成为成人T细胞白血病的诊断指标之一，以及通过特异性干扰/敲低ANRIL的表达水平能够有效地抑制ATL细胞的增殖和促进ATL细胞的凋亡，由此开发了诊断成人T细胞白血病的试剂盒和治疗成人T细胞白血病的药物，为成人T细胞白血病的诊断和治疗提供了新的途径和策略。

Description

成人T细胞白血病的治疗药物及诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及诊断成人T细胞白血病的试剂盒以及治疗成人T细胞白血病的药物，属于生物医药技术领域。

背景技术

成人T细胞白血病(ATL，adult T-cell leukemia)是一种恶性的淋巴系统增殖性疾病，研究表明，ATL由人类T淋巴细胞白血病1型病毒(HTLV-1，human T-cell leukemiavirus type 1)的感染引起，然而，关于ATL发病的分子机制，现在仍未完全阐明。

长链非编码RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)是指长度超过200个核苷酸、具有调控基因表达作用的非编码RNA。越来越多的研究表明，lncRNA在肿瘤的生长、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用。例如，一些lncRNA与DNA、RNA、蛋白质分子结合或与它们的组合相互作用，作为染色质组织，转录和转录后调节中的基本调节因子，lncRNA的错误表达可导致肿瘤启动子的激活，促进肿瘤细胞生长和细胞迁移等。因此，本领域的科学家们也希望通过研究lncRNA来找到更多的肿瘤标志物和肿瘤治疗的靶点，为肿瘤诊断和治疗提供更多的思路。

LncRNA的种类很多，其中INK4基因座中反义非编码RNA(Antisense noncodingRNA in the INK4Locus，ANRIL)是一种新发现的长链非编码RNA，其大小为3.8KB，位于染色体9p21区域的遗传易感性位点，在正常组织中表达丰富。常见的疾病基因组相关性研究(GWAS)阐明ANRIL基因与染色体9p21上的遗传变异体密切相关，是冠状动脉疾病，颅内动脉瘤和2-型糖尿病相关的遗传易感性基因座。同时也有研究发现ANRIL与阿尔茨海默病、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化等的发生也有密切联系。

关于ANRIL与肿瘤的研究，目前也有相关报道，但研究并不深入，ANRIL致癌的分子机制，以及ANRIL是否可以作为某些特定肿瘤疾病发生的标志，尚不清楚。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明一方面提供了ANRIL在制备诊断或治疗成人T细胞白血病的产品方面的用途。

本发明另一方面提供了一种检测成人T淋巴细胞中的ANRIL的表达水平的试剂，在制备诊断成人T细胞白血病的产品方面的用途。

本发明再一方面提供了一种诊断成人T细胞白血病的试剂盒，其中，所述试剂盒包含检测成人T淋巴细胞中的ANRIL的表达水平的试剂。

优选的，所述试剂盒包含RT-PCR反应所需要的特异性检测ANRIL的表达水平的引物对以及反应体系试剂，其中所述RT-PCR反应所需要的引物对的正向序列如SEQ ID NO.5所示，反向序列如SEQ ID NO.6所示。

优选的，所述试剂盒包含qRT-PCR反应所需要的特异性检测ANRIL的表达水平的引物对以及反应体系试剂，其中所述qRT-PCR反应所需要的引物对的正向序列如SEQ ID NO.7所示，反向序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明再一方面提供了一种用于治疗成人T细胞白血病的药物，该药物包含ANRIL的表达抑制剂。

优选的，所述ANRIL的表达抑制剂为抑制ANRIL表达的shRNA、siRNA或miRNA中的任意一种或者它们的混合物。

优选的，所述ANRIL的表达抑制剂为抑制ANRIL表达的shRNA，所述shRNA的正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；或者，所述shRNA的正向序列如SEQID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述ANRIL的表达抑制剂为含有所述抑制ANRIL表达的shRNA、siRNA或miRNA中的任意一种的重组表达载体或者它们的混合物。

优选的，所述ANRIL的表达抑制剂为抑制ANRIL表达的shRNA的重组慢病毒表达载体或者为抑制ANRIL表达的shRNA的重组慢病毒。

本发明的发明人首次发现了检测ATL细胞中的ANRIL的表达水平可以成为成人T细胞白血病的诊断指标之一，以及通过特异性干扰/敲低ANRIL的表达水平能够有效地抑制ATL细胞的增殖和促进ATL细胞的凋亡，由此开发了诊断成人T细胞白血病的试剂盒和治疗成人T细胞白血病的药物，为成人T细胞白血病的诊断和治疗提供了新的途径和策略。

附图说明

图1为实施例1中RT-PCR检测ANRIL在各种ATL细胞中表达(ANRIL mRNA的表达水平)的电泳结果；

图2为实施例1中qRT-PCR检测ANRIL在各种ATL细胞中的表达(ANRIL mRNA的表达水平)的分析结果；

图3为实施例4中RT-PCR检测ANRIL沉默的结果；

图4为实施例4中qRT-PCR检测ANRIL沉默的结果；

图5为实施例4中MTT检测ANRIL沉默后ATL细胞的增殖能力的分析结果。

具体实施方式

以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。

下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体实施方式中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。

本发明的发明人在研究ANRIL的过程中，首次意外地发现了ANRIL在ATL(成人T细胞白血病)细胞中异常高表达，并通过大量的实验从分子水平充分验证了ANRIL在多种典型的ATL细胞株中异常高表达，验证了ANRIL与ATL细胞的相关性。由此进而验证了，通过检测ATL细胞中的ANRIL的表达水平可以成为成人T细胞白血病的诊断指标之一，以及通过特异性干扰/敲低ANRIL的表达水平能够有效地抑制ATL细胞的增殖，促进ATL细胞的凋亡，为成人T细胞白血病的诊断和治疗提供了新的途径和策略。

实施例1验证ANRIL在ATL细胞中的异常高表达

1、细胞株

ATL细胞株：MT-1，MT-2，MT-4，C8166，ATL-2，ATL-T，TL-Om1均来源于日本京都大学松冈雅雄教授实验室。

对照细胞株：Jurkat，来源于日本京都大学松冈雅雄教授实验室。

2、细胞总RNA提取与逆转录

提取细胞总RNA、纯化以及检测的具体操作如下：1)按照细胞传代的方法分别收集足量的各株细胞，转移到去核酸酶的1.5mL离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清；2)每管加入1mL PBS清洗细胞两次；3)拍散细胞，每管加入1mL Trizol细胞裂解液，用移液枪充分混匀，保证充分裂解，此时混合液呈浑浊状(也可根据细胞的量加入Trizol细胞裂解液)；4)静置5分钟，室温；5)每管加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2～3分钟(沉淀蛋白质和DNA)；6)12,000rpm 4℃离心15分钟；7)吸取500μL上清(注意不要吸到沉淀)至新的1.5mL的去核酸酶的离心管中，注意不要吸到下层有机相，从中间吸；8)加入500μL异丙醇，用手轻晃数次直至液体透明，室温静置10分钟；9)4℃，12,000rpm离心10分钟；10)弃上清，每管加入500μL预冷的75％乙醇洗涤，上下颠倒几次，RNA漂起；11)4℃，12,000rpm离心3分钟；12)在超净工作台内充分弃去上清，但不可让RNA过于干燥，后加入50μL的DEPC水溶解RNA，可轻拍管底促进RNA溶解；13)RNA充分溶解后，采用DNase I RNA纯化试剂盒(购自Thermo FisherScientific公司)进行RNA纯化，具体纯化操作参见试剂盒说明书；14)采用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，测量之前用DEPC水先将仪器调零。A260/280在1.8～2.0之间时RNA纯度较好；15)跑胶测定RNA质量。

RNA逆转录合成cDNA的操作如下：

1)RNA变性

体系如下：

将上述体系置于PCR仪上70℃5min，后将产物立即置于冰上至少5min，离心混匀。

2)采用SuperScript III First-Strand Synthesis System反转录试剂盒(购自Thermo Fisher Scientific公司)将上述变性后的RNA反转录成cDNA，逆转录体系如下：

将上述体系置于PCR仪上，25℃退火5分钟，50℃延伸60分钟，70℃灭活(inactive)15分钟；PCR结束后将产物(cDNA)瞬时离心混匀，置于-20℃冰箱备用。

3、RT-PCR检测ATL细胞中ANRIL的表达

取上述逆转录获得的cDNA进行RT-PCR；

发明人设计了针对ANRIL基因的引物，并进行了筛选和验证，获得了合适的引物对序列，具体如下：

正向引物序列：5’-CAGAGCAATTCCAGTGCAAG-3’(SEQ ID NO.5所示)；

反向引物引物：5’-GATTTGCAAAAACAGCTG-3’(SEQ ID NO.6所示)。

在本实施例中，发明人委托上海生工生物工程有限公司合成了上述序列的引物对。

RT-PCR的反应体系如下：

将上述体系置于PCR仪进行扩增，具体扩增条件如下：

95℃变性3min；之后95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；最后72℃延伸10min；反应停止后，冰上放置1min，瞬时离心10s，4℃保存扩增产物；

琼脂糖凝胶电泳测定RT-PCR产物(同时以GAPDH作为内参对照)。电泳结果参见图1。

从图1的结果可以看出，与对照细胞株(阴性细胞株)Jurkat细胞相比，7种HTLV-1病毒感染的成人T细胞白血病细胞株MT-1、MT-2、MT-4、C8166、ATL-2、ATL-T、TL-Om1中ANRIL均高表达。

4、qRT-PCR检测ANRIL在ATL细胞中的表达

取上述逆转录获得的cDNA进行qRT-PCR；

正向引物序列：5’-CAACATCCACCACTGGATCTTAACA-3’(SEQ ID NO.7所示)；

反向引物引物：5’-AGCTTCGTATCCCCAATGAGATACA-3’(SEQ ID NO.8所示)。

qRT-PCR反应体系如下：

将上述体系置于实时荧光定量PCR仪进行扩增，具体扩增条件如下：

50℃变性2min；之后95℃变性10min，95℃退火15s，60℃延伸1min，共40个循环。

扩增结束后，分析产物的熔解曲线，若熔解曲线为单一峰则说明qRT-PCR引物较好。

最后采用2^-ΔΔC _T法分析产物，分析结果参见图2。

从图2的结果可以看出，与对照细胞株(阴性细胞株)Jurkat细胞相比，7种HTLV-1病毒感染的成人T细胞白血病细胞株MT-1、MT-2、MT-4、C8166、ATL-2、ATL-T、TL-Om1中ANRIL均高表达。

实施例2诊断成人T细胞白血病的试剂盒

基于上述实施例1及其结果，发明人开发了诊断成人T细胞白血病的试剂盒，试剂盒包含检测成人T淋巴细胞中的ANRIL的表达水平的试剂。

实施例2的试剂盒包含RT-PCR反应所需要的特异性检测ANRIL的表达水平的引物对以及反应体系试剂，其中所述RT-PCR反应所需要的引物对序列如下：

正向引物序列：5’-CAGAGCAATTCCAGTGCAAG-3’(SEQ ID NO.5所示)；

反向引物引物：5’-GATTTGCAAAAACAGCTG-3’(SEQ ID NO.6所示)。

RT-PCR的反应体系试剂还可以包含2倍的PCR Tag酶和ddH₂O。RT-PCR的反应体系的具体情况可以参见实施例1的第3部分。

当然，本领域技术人员也可以在获知本发明的创新主旨和实施例2的内容的基础之上，简单调整引物对序列，或者调整RT-PCR的反应体系试剂。

实施例3诊断成人T细胞白血病的试剂盒

实施例3的试剂盒包含qRT-PCR反应所需要的特异性检测ANRIL的表达水平的引物对以及反应体系试剂，其中所述qRT-PCR反应所需要的引物对序列如下：

正向引物序列：5’-CAACATCCACCACTGGATCTTAACA-3’(SEQ ID NO.7所示)；

反向引物引物：5’-AGCTTCGTATCCCCAATGAGATACA-3’(SEQ ID NO.8所示)。

qRT-PCR的反应体系试剂还可以包含2倍SYBR酶混合液、50倍ROX试剂和纯水(无核酸酶)。qRT-PCR的反应体系的具体情况可以参见实施例1的第4部分。

当然，本领域技术人员也可以在获知本发明的创新主旨和实施例3的内容的基础之上，简单调整引物对序列，或者调整qRT-PCR的反应体系试剂。

实施例4利用RNA干扰技术沉默ATL细胞中的ANRIL的表达

1、shRNA的构建和合成

关于抑制ANRIL的表达的shRNA，发明人设计了数条shRNA序列，并经过大量的试验筛选和验证，最终获得了两条具有较佳效果的shRNA(分别命名为shRNA#1和shRNA#2)，其序列(从5’端到3’端)具体如下：

shRNA#1正向序列：

CCGGGGAAUGAGGAGCACAGUGAUUCAAGAGAUCACUGUGCUCCUCAUUCCUUUUUU(如SEQ IDNO.1所示)；

shRNA#1反向序列：

AAUUAAAAAAGGAAUGAGGAGCACAGGAUCUCUUGAAUCACUGUGCUCCUCAUUCC(如SEQ IDNO.2所示)；

shRNA#2正向序列：

CCGGAAGCGAGGUCAUCUCAUUGCUCUAUUUCAAGAGAAUAGAGCAAUGAGAUGACCUCGCUUUUUUUU(如SEQ ID NO.3所示)；

shRNA#2反向序列：

AAUUAAAAAAAAGCGAGGUCAUCUCAUUGCUCUAUUCUCUUGAAAUAGAGCAAUGAGAUGACCUCGCUU(如SEQ ID NO.4所示)；

在本实施例中，发明人委托上海生工生物工程有限公司合成了上述shRNA#1和shRNA#2的正/反向序列所对应的DNA序列，再将合成的序列对进行退火粘连处理，具体来说，分别将正向/反向序列(10μL、10μM)与退火缓冲液(10μL)混合后，再将两者混合后放入PCR仪95℃5min，后于PCR仪上降至室温；退火粘连产物(合成的shRNA#1和shRNA#2)于-20℃保存。

2、载体的制备

1)感受态E.coli DH5α的制备

E.coli DH5α购买自上海生工生物工程有限公司的DH5α感受态细胞，具体操作方法参见产品说明书，不再赘述。

2)质粒转化、提取和浓缩

转化操作：

从-80℃冰箱取出制备好的感受态细胞，加入pLkO.1-Puro质粒(空白载体，慢病毒表达质粒，购买自Sigma公司的pLKO.1-puro产品)1μL(不超过50ng)，轻轻混匀，冰上放置30min；热激：42℃水浴加热90s，接着冰上放置10min；每管加入450μL无抗LB培养基，200rpm37℃震荡培养1h；涂平板：取10～20L菌液涂布于含Amp的LB固体培养基中；正置1h后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱培养12～16h。

提取和浓缩操作请参见质粒提取试剂盒(购买自Promega公司的PureYield^TMPlasmid Midiprep System产品)的说明书，具体不再赘述。

3)质粒的酶切

在本实施例中，上述步骤浓缩获得的质粒，依次采用AgeⅠ(购买自Takara公司AgeⅠ内切酶产品)和EcoRⅠ(购买自Takara公司EcoRⅠ内切酶产品)酶切。

AgeⅠ的酶切体系如下：

将上述酶切体系放入PCR仪器中反应，37摄氏度，60分钟；

跑胶回收酶切产物。

再将上述回收的AgeⅠ酶切产物进行EcoRⅠ酶切。

EcoRⅠ的酶切体系如下：

将上述酶切体系，37摄氏度，水浴2小时；

跑胶回收酶切产物(即酶切后获得的载体片段)。

3、shRNA与载体片段的连接

将上述第1部分合成的shRNA#1和shRNA#2分别与上述第2部分获得的载体片段连接。

连接体系如下：

将该连接体系置于16摄氏度水浴中3小时获得连接产物。

再利用感受态细胞E.coli DH5α将连接产物转化，涂布于选择性LB板上(AMP)，37℃恒温培养箱培养过夜。

挑取平板上的菌落并小摇，将小摇后的菌液送去上海生工生物工程有限公司测序，通过测序结果判断载体与基因片段有无连接。

然后通过质粒提取试剂盒(购买自Promega公司的PureYield^TMPlasmid MidiprepSystem产品)进行质粒的大提和浓缩，分别获得重组的慢病毒表达质粒pLKO.1-shANRIL#1-Puro和pLKO.1-shANRIL#2-Puro。

4、制备重组慢病毒

将上述构建好的重组的慢病毒表达质粒pLKO.1-shANRIL#1-Puro(实验组1)和pLKO.1-shANRIL#2-Puro(实验组2)，以及空白质粒PLKO.1-Puro(对照组)分别与另外两个慢病毒包装质粒pcDNA-VSVG(由日本京都大学松冈雅雄教授惠赠)、pCMV-△8/9(由日本京都大学松冈雅雄教授惠赠)一起共转染293FT细胞。

具体操作如下：

转染前一天收集293FT细胞(细胞密度为80％-90％左右)，取3个10cm培养皿，分别标记为CTR(对照组)，shANRIL#1(实验组1)，shANRIL#2(实验组2)，以4×10⁵个/mL的密度接种细胞至10cm培养皿中(细胞密度为60％左右)，培养基为DMEM+10％FBS(胎牛血清)+P/S(青霉素/链霉素)；

铺板16-18小时后，将培养基半换液；

准备转染：取3只4mL离心管，首先在每根管中均加入1mL OPTI-MEM试剂，并按以下方式加入质粒：

在1号管(对照组、CTR)中加入空白质粒pLKO.1-puro(15μg)，病毒包装质粒pCMV-△8/9(15μg)和pcDNA-VSVG(7.5μg)；

在2号管(实验组1、shANRIL#1)中加入以下质粒：pLKO.1-shANRIL#1(15μg)，pCMV-△8/9(15μg)，pcDNA-VSVG(7.5μg)；

在3号管(实验组2、shANRIL#2)中加入以下质粒：pLKO.1-shANRIL#2(15μg)，pCMV-△8/9(15μg)，pcDNA-VSVG(7.5μg)；

将1号、2号和3号离心管轻轻混匀，低速离心，室温静置20分钟；

之后将lipo3000(22.5μL)和OPTI-MEM试剂(1mL)的混合液分别加入到1-3号管中，

室温静置5分钟后，将混合体系均匀滴加至10cm培养皿中，十字交叉法摇晃后放入培养箱中培养。

一段时间后，病毒颗粒即包装成功并分泌于培养基中，收集病毒颗粒，具体操作如下：转染48小时后，收集细胞上清液10mL，1500rpm离心5分钟，将上清液用0.45μM过滤器过滤，滤液于4℃保存备用；转染72小时后，收集细胞上清液10mL，1500rpm离心5分钟，将上清液用0.45μM过滤器过滤，滤液与48小时收集的滤液混合；收集到的20mL上清液超速离心，4℃25000rpm离心2小时；充分弃去上清，每盘细胞用500μL RPMI-1640+10％FBS+P/S培养基吹打重悬病毒颗粒，每管100μL分装，冻于-80℃保存。

收集到的重组慢病毒颗粒分别为对照组、实验组1和实验组2的重组慢病毒颗粒。

5、感染ATL细胞

感染当天，将ATL细胞株(ATL-T细胞株)接种于24孔板，共接种3个孔，每孔1×10⁶个细胞，每孔体积为500μL。分别将对照组、实验组1和实验组2的重组慢病毒颗粒各100μL加入细胞培养基中，并在每孔加入3μL聚凝胺(Polybrene、母液1mg/mL)，至Polybrene终浓度为5ug/mL(4-8μg/mL均可)，混匀后置于培养箱中培养；

感染24小时后若细胞长满，则可将细胞转移至6孔板继续培养；

合计感染72小时后，加入抗生素筛选，嘌呤霉素终浓度为0.5μg/mL；

筛选48小时后，分别收集对照组、实验组1和实验组2的感染的ATL细胞。感染的ATL细胞用于后续MTT实验、流式检测细胞凋亡等。

6、ANRIL沉默效率检测

在本实施例中，采用RT-PCR及qRT-PCR技术检测ANRIL沉默效率。

采用RT-PCR分别检测对照组、实验组1和实验组2的感染的ATL细胞的ANRIL的表达水平，具体的检测操作过程参见实施例1的第2和3部分。

RT-PCR检测结果参见图3，从图3中可以很明显地看出，与对照组CTR相比，实验组1(shANRIL#1)和实验组2(shANRIL#2)的ANRIL的表达均沉默。

采用qRT-PCR分别检测对照组、实验组1和实验组2的感染的ATL细胞的ANRIL的表达水平，具体的检测操作过程参见实施例1的第2和4部分。

qRT-PCR检测结果参见图4，图4的结果采用Excel、SPSS19.0统计软件进行显著性检验，“*”P<0.05，表示统计学上有显著性差异；**P<0.01表示统计学上有极显著性差异。

从图4中可以很明显地看出，与对照组CTR相比，实验组1(shANRIL#1)和实验组2(shANRIL#2)的ANRIL表达的沉默效率分别为46.7％和59.6％。

7、感染的ATL细胞的增殖能力的检测

为了检测ATL细胞株中ANRIL沉默后细胞增殖能力的情况，采用MTT实验进行检测，实验步骤如下：

胰蛋白酶消化感染慢病毒72h后的ATL-T细胞，并用移液器将细胞吹打混匀，进行计数；按每孔6×10⁴个/mL密度接种于96孔板，90μL/孔。每组分别设置3个复孔，然后分别培养0，24，48，72h；到规定时间后，取出96孔板，每孔加入10μL的MTT反应液，后继续37℃避光孵育3h；排枪吸取100μL/孔酸化异丙醇裂解液加入到孔板中，用力吸打混匀；避光30min，放入酶标仪连续振荡3s，检测OD595；计算每组OD值的平均值，并统计分析。

MTT实验结果参见图5，图5的结果采用Excel、SPSS19.0统计软件进行显著性检验，“*”P<0.05，表示统计学上有显著性差异；**P<0.01表示统计学上有极显著性差异。

从图5可以看出，实验组1(shANRIL#1)和实验组2(shANRIL#2)的OD值明显低于对照组CTR，该结果表明ANRIL沉默的ATL细胞(经shANRIL#1和shANRIL#2慢病毒颗粒感染的ATL细胞)的增殖活力受到显著抑制；即ANRIL的沉默抑制ATL细胞的增殖活力。

另外，利用平板克隆实验进一步探究ANRIL对ATL细胞增殖能力的影响。平板克隆实验结果如下：对照组ATL-T的克隆形成率为44.8％，实验组1的ATL-T细胞的克隆形成率为24.4％，实验组2的ATL-T细胞的克隆形成率为31.0％；该实验结果表明：ANRIL沉默可抑制ATL-T细胞的克隆形成能力。

8、感染的ATL细胞的细胞凋亡检测

为了检测ATL细胞株中ANRIL沉默后细胞凋亡的情况，收集细胞，将对照组、实验组1和实验组2的感染的ATL细胞进行Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析凋亡率情况。具体实验步骤如下：收集细胞并用PBS清洗细胞两次；重悬细胞于500μL 1倍的结合缓冲液；先加入5μL的Annexin V-FITC，混匀后加入5μL PI，混匀；室温避光孵育10min；使用100目尼龙网将细胞进行过滤，PBS稀释后将细胞转移到流式细胞管中，检测细胞凋亡。细胞流速100～200个/s，收集1万个细胞后停止检测；十字门中第一象限为坏死或晚期凋亡细胞；第二象限为机械损伤的死细胞；第三象限代表正常细胞；而早期凋亡细胞在第四象限。

细胞凋亡实验结果如下：对照组的ATL-T细胞基本上没有发生凋亡，然而，在实验组1中42.6％的ATL-T细胞发生凋亡，在实验组2中，39.6％的ATL-T细胞发生凋亡。

细胞凋亡实验结果表明，沉默ANRIL后，ATL-T细胞凋亡率升高；即沉默ANRIL可显著诱导ATL-T细胞发生凋亡。

综上可以看出，ANRIL的沉默可以抑制ATL细胞的增殖活力和克隆形成能力，并且可以显著诱导ATL细胞发生凋亡。

由此，发明人开发了用于治疗成人T细胞白血病的药物。在本发明的一个具体实施方案中，一种用于治疗成人T细胞白血病的药物，其中，该药物包含ANRIL的表达抑制剂。ANRIL的表达抑制剂通过抑制/沉默ANRIL的表达，抑制ATL细胞的增殖活力并诱导ATL细胞发生凋亡。

关于ANRIL的表达抑制剂，可以选用抑制ANRIL的表达的shRNA、siRNA或miRNA中的任意一种或者它们的混合物；也可以选用为含有这些shRNA、siRNA或miRNA中的任意一种的重组表达载体或者它们的混合物。

在本发明的具体实施方式中，给出了抑制ANRIL的表达的shRNA、含有抑制ANRIL的表达的shRNA的重组慢病毒表达载体及其重组慢病毒。

本领域技术人员在获知本发明的精神主旨和上述具体实施方式的情况下，可以很容易地推知抑制ANRIL的表达的siRNA或miRNA，及其重组表达载体等也可以作为ANRIL的表达抑制剂，可以用于本发明的用于治疗成人T细胞白血病的药物中。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江师范大学

<120> 成人T细胞白血病的治疗药物及诊断试剂盒

<130> 2018-zjnu-2

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 57

<212> RNA

<213> Artificially Synthesized

<400> 1

ccggggaaug aggagcacag ugauucaaga gaucacugug cuccucauuc cuuuuuu 57

<210> 2

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificially Synthesized

<400> 2

aauuaaaaaa ggaaugagga gcacaggauc ucuugaauca cugugcuccu cauucc 56

<210> 3

<211> 69

<212> RNA

<213> Artificially Synthesized

<400> 3

ccggaagcga ggucaucuca uugcucuauu ucaagagaau agagcaauga gaugaccucg 60

cuuuuuuuu 69

<210> 4

<211> 69

<212> RNA

<213> Artificially Synthesized

<400> 4

aauuaaaaaa aagcgagguc aucucauugc ucuauucucu ugaaauagag caaugagaug 60

accucgcuu 69

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificially Synthesized

<400> 5

cagagcaatt ccagtgcaag 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificially Synthesized

<400> 6

gatttgcaaa aacagctg 18

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificially Synthesized

<400> 7

caacatccac cactggatct taaca 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificially Synthesized

<400> 8

agcttcgtat ccccaatgag ataca 25

Claims

1.检测成人T淋巴细胞中的ANRIL的表达水平的试剂在制备诊断成人T细胞白血病的产品方面的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的检测成人T淋巴细胞中的ANRIL的表达水平的试剂包含RT-PCR反应所需要的特异性检测ANRIL的表达水平的引物对以及反应体系试剂，其中所述RT-PCR反应所需要的引物对的正向序列如SEQ ID NO.5所示，反向序列如SEQ ID NO.6所示。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的检测成人T淋巴细胞中的ANRIL的表达水平的试剂包含qRT-PCR反应所需要的特异性检测ANRIL的表达水平的引物对以及反应体系试剂，其中所述qRT-PCR反应所需要的引物对的正向序列如SEQ ID NO.7所示，反向序列如SEQ ID NO.8所示。

4.ANRIL的表达抑制剂在制备治疗成人T细胞白血病的药物方面的用途；

所述ANRIL的表达抑制剂为抑制ANRIL表达的shRNA，或者，所述ANRIL的表达抑制剂为含有抑制ANRIL表达的shRNA的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于：

所述ANRIL的表达抑制剂为抑制ANRIL表达的shRNA，

所述shRNA的正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；或者，

所述shRNA的正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于：

所述ANRIL的表达抑制剂为含有抑制ANRIL表达的shRNA的重组慢病毒表达载体。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：

所述抑制ANRIL表达的shRNA的正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；或者，

所述抑制ANRIL表达的shRNA的正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示。