CN110845597B - 一种重组猪表皮生长因子及其制备方法 - Google Patents
一种重组猪表皮生长因子及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110845597B CN110845597B CN201911213159.0A CN201911213159A CN110845597B CN 110845597 B CN110845597 B CN 110845597B CN 201911213159 A CN201911213159 A CN 201911213159A CN 110845597 B CN110845597 B CN 110845597B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- growth factor
- epidermal growth
- recombinant
- porcine
- porcine epidermal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 61
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 title claims abstract description 61
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 24
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 17
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 36
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 4
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 11
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 101500002603 Sus scrofa Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 4
- HFBFSOAKPUZCCO-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N HFBFSOAKPUZCCO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N Asp-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 3
- CYHMMWIOEUVHHZ-IHRRRGAJSA-N Cys-Met-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CYHMMWIOEUVHHZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- ZXGDAZLSOSYSBA-IHRRRGAJSA-N Cys-Val-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ZXGDAZLSOSYSBA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N Gly-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- DUAWRXXTOQOECJ-JSGCOSHPSA-N Gly-Tyr-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DUAWRXXTOQOECJ-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 3
- LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N His-Asp-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- WZDCVAWMBUNDDY-KBIXCLLPSA-N Ile-Glu-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N WZDCVAWMBUNDDY-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- GYXVUTAOICLGKJ-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GYXVUTAOICLGKJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- IYHRKILQAQWODS-VJBMBRPKSA-N Trp-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N IYHRKILQAQWODS-VJBMBRPKSA-N 0.000 description 3
- YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010078326 glycyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 108010079202 tyrosyl-alanyl-cysteine Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 101150084418 EGF gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DGHFNYXVIXNNMC-GUBZILKMSA-N Ser-Gln-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CO)N DGHFNYXVIXNNMC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 2
- BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N Arg-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- MWZSCEAYQCMROW-GUBZILKMSA-N Cys-Gln-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)N MWZSCEAYQCMROW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 108010054561 gastric mucus glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 101150074154 pe gene Proteins 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
- C12N2750/14351—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种重组猪表皮生长因子及其制备方法，通过人工突变获得了高活性的重组猪表皮生长因子，对细胞的增殖活性有显著影响，对猪细小病毒和猪圆环病毒2型的增殖具有更显著促进作用，可以用于高滴度疫苗的生产。本发明所制备的重组猪表皮生长因子rpEGF对能够增强细胞增殖活力，提高病毒在宿主细胞中的增殖滴度，对于疫苗生产中提高疫苗有效成分含量、提高疫苗品质具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组猪表皮生长因子及其制备方法。
背景技术
EGF是一种由53个氨基酸组成的活性单链小分子多肽，分子量为6045Da，等电点为4.6，可以分成N-端（1-32）、C-端（33-53）两个结构域，N-端结构域的结构中心是两股反平行的β-片层，C-端结构域包括一个短的双股β-片层和一个二硫键。在EGF 53个氨基酸中位于第6、14、20、31、33、42号的6个半胱氨酸形成了3对分子内二硫键，EGF及其家族成员的氨基酸顺序最明显的特征就是有6个保守的半胱氨酸并形成3对二硫键。因此，在 6~20、14~3l和33~42之间形成了三个环状结构，使得EGF对蛋白酶具有较高的稳定性，对胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶等具有耐受性，EGF对热对酸碱具有一定的稳定性。例如，EGF在-20 ℃中能保持长期稳定，在中性环境下、100 ℃煮沸30分钟依旧可以保持稳定。
迄今为止，EGF基因已经成功地在大肠杆菌、枯草杆菌、短芽孢杆菌、酵母菌、蓝藻、高等植物以及哺乳动物细胞等原核宿主系统和真核宿主系统中得到克隆表达。由于原核表达具有短周期、高产量等优点而被优先考虑，其中，大肠杆菌系统具有成本低、转化率高、操作简单等优势，表达EGF运用最为广泛，研究最为深入，但由于EGF基因是真核细胞基因，在原核系统的表达会受到限制，例如原核表达多为包涵体形式，变性复性操作复杂，且处理后活性受到不同程度的影响。
猪源性表皮生长因子（porcine epidermal growth factor, pEGF）能增加胃肠黏膜血流量并抑制胃酸分泌，诱导小肠消化酶表达、激活肠道生物酶的活性，影响小肠的免疫应答和促进胃黏膜黏液糖蛋白的合成。EGF的应用十分广泛，遍及了医学、美容、畜牧等领域，在畜牧业中，EGF通常作为饲料添加剂被动物食用，研究表明，pEGF可影响断奶仔猪的免疫功能和生产性能，还能促进激素的合成与分泌等；此外，EGF还作为培养基重要组分用于细胞培养，还对细胞调节机制具有重要的作用。
发明内容
为解决现有技术中猪源性表皮生长因子原核表达过程中存在的问题以及产物活性不高的问题，本发明只在提供一种重组猪表皮生长因子及其制备方法，采用人工突变的手段对猪表皮生长因子进行突变，实现了猪表皮生长因子原核的高效表达。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种重组猪表皮生长因子，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
编码所述重组猪表皮生长因子的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
一种表达重组猪表皮生长因子的重组载体，其特征在于，其包括SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，优选的，所述重组载体是pGEX 4T。
一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括所述表达重组猪表皮生长因子的重组载体，优选的，所述重组菌为Rosetta（DE3）。
一种制备重组猪表皮生长因子的方法，其特征在于，所述方法是将所述重组菌LB培养基中培养，IPTG诱导。
具体地，所述制备重组猪表皮生长因子的方法包括如下步骤：
（1）重组细菌培养：将重组蛋白表达菌株菌液Rosetta(DE3)-pGEX4T-pEGF、接种于含有终浓度为200 μg·mL-1的Ampr的液体LB培养基中， 37 ℃，220 r·min-1培养2.5 h；
（2）IPTG诱导表达：加入终浓度为1 mmol·L -1的IPTG溶液，28℃、220 r·min-1下诱导四小时以上；
（3）蛋白的提取：取诱导后的菌液，离心收集菌体，采用PBS洗涤菌体后超声破碎，离心分离蛋白，采用GSTrap FF 亲和柱层析分离得到纯度较高的融合蛋白GST-pEGF。
本发明还请求保护所述重组猪表皮生长因子在制备提高仔猪生长性能的药物或饲料添加剂中的用途。
本发明还请求保护所述重组猪表皮生长因子在疫苗制备中的应用，具体用于促进猪源DNA病毒的增殖，具体地，在病毒增殖培养基中添加所述重组猪表皮生长因子。所述病毒为猪细小病毒或猪圆环病毒2型。
优选的，所述重组猪表皮生长因子在病毒增值培养基中的添加了为2-4μg/mL，优选地为2μg/mL。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
第一，本发明突破了现有技术的限制，首次对猪表皮生长因子的二硫键进行了拆解，将第42位的半胱氨酸（Cys，C）突变为丝氨酸（Ser，S），第46位的天冬氨酸（Asp，D）突变为天冬酰胺（Asn，N），通过实验表明，本发明所获得的重组猪表皮生长因子，其生物活性高于未突变的传统的重组猪表皮生长因子，且也远高于仅突变第42位的半胱氨酸（Cys，C）的重组猪表皮生长因子，以上研究表明，仅有在这两个位点同时突变的情况下，才能保持较高的活性。
第二，通过本发明的研究，获得了高活性的重组猪表皮生长因子，对细胞的增殖活性有显著影响，对猪细小病毒和猪圆环病毒2型的增殖具有更显著促进作用，可以用于高滴度疫苗的生产。
综上所述，本发明所制备的重组猪表皮生长因子rpEGF对能够增强细胞增殖活力，提高病毒在宿主细胞中的增殖滴度，对于疫苗生产中提高疫苗有效成分含量、提高疫苗品质具有重要意义。
附图说明
图1：重组质粒pMD19T-pEGF的酶切鉴定：M：2000Marker；1、2、3、4均为pMD19T-pEGF质粒双酶切。
图2：重组质粒pGEX4T-pEGF的双酶切鉴定：M：5000Marker；1：pGEX回收载体；2：pEGF回收片段；M1：Marker2000。
图3：pGEX4T-pEGF在Top 10感受态中表达双酶切鉴定：M：2000Marker；1~7：均为pGEX-pEGF重组质粒双酶切结果。
图4：pGEX4T-pEGF重组质粒在Rossetta感受态中表达双酶切鉴定：M:5000Marker；1~4:均为pGEX4T-pEGF重组质粒双酶切结果；5: pGEX4T-pEGF重组质粒电泳结果；6~9:均为pGEX4T-pEGF单酶切结果（Ecori）；10: pGEX4T质粒。
图5：GST-pEGF融合蛋白的SDS-PAGE检测：M：Marker；1：pEGX-pEGF诱导上清，2：pEGX-pEGF诱导沉淀，3：pEGX诱导上清，4：pEGX诱导沉淀，5：pEGX-pEGF未诱导上清，6：pEGX-pEGF未诱导沉淀，7：pEGX未诱导上清，8：pEGX未诱导沉淀。
图6：West-bloting鉴定结果：1，GST；2，GST-pEGF。
图7：rPEGF不同添加浓度对猪小肠上皮细胞增殖的影响。
图8：突变位点对于对猪小肠上皮细胞增殖的影响。
图9：rPEGF不同添加浓度对猪细小病毒和猪圆环病毒2型增殖的影响。
具体实施方式：
实施例1：pEGF基因的设计、合成与载体构建
1.1 pEGF基因的设计、合成：根据现有报道的猪表皮生长因子氨基酸和核苷酸序列，经序列优化，设计得到SEQ ID No：1所示的氨基酸序列和SEQ ID No：2所示核苷酸序列，人工合成基因序列，其中相比传统的pEGF蛋白，本研究将第42位和第46位的氨基酸进行了人工突变，其中第42位的半胱氨酸（Cys，C）突变为丝氨酸（Ser，S），第46位的天冬氨酸（Asp，D）突变为天冬酰胺（Asn，N）。
将人工合成的序列为SEQ ID No：2所示的pEGF基因克隆到pMD19T，构建重组载体pMD19T-pEGF，转化到Top 10感受态中经克隆后，提取重组质粒，用限制性核酸内切酶SalⅠ、BamHⅠ对重组质粒pMD19T-pEGF进行双酶切，如图1所示，电泳结果为2条带，分子量大小分别为2700 bp和171 bp，且没有杂带，表明pMD19T-pEGF已经完全切开。
重组表达载体的制备：采用限制性核酸内切酶SalⅠ、BamHⅠ分别对重组质粒pMD19T-pEGF和pGEX 4T载体进行双酶切，用Axyprep DNA 凝胶回收试剂盒回收载体和基因，对回收产物进行双酶切鉴定，结果如图2；1号、2号分别出现了4900 bp和171 bp的条带，证明经回收得到了pGEX4T载体和pEGF基因。而后采用T4连接酶将pEGF基因与pGEX 4T载体连接得到重组载体pGEX 4T-pEGF，转化Top10感受态细胞，涂布于含Amp的筛选平板上，正面朝上，37 ℃静置1 h；倒置培养皿，37 ℃培养过夜；次日白天观察菌落的生长状况，挑取单菌落进行鉴定。
阳性质粒的筛选与鉴定：将回收获得的pGEX4T载体和pEGF基因连结，将重组质粒pGEX4T-pEGF转化到Top 10感受态中，挑菌、摇菌然后提取质粒做酶切鉴定，鉴定结果如图3所示；电泳结果为2条带，分子量大小分别为4900 bp和171 bp，且没有杂带，表明，重组载体为阳性载体，对应的菌种为阳性菌株。
阳性质粒转化Rosetta(DE3)感受态菌株：从-80 ℃冰箱里取100 μL Rosetta（DE3）感受态细胞，用手心握住迅速解冻，待试管中只剩下小部分冰晶时，将试管赶快放在冰面上；在超净工作台中，用移液枪混匀Rosetta（DE3）感受态细胞，分装到1.5 mLEP管中，向上述两管中分别加入3 μL pGEX4T-pEGF和空质粒 pGEX4T-1，混匀，冰浴30 min；然后迅速至于42 ℃水浴锅中热击90 s，再放回冰上冷却5 min；再向管中加入800 μL无抗生素的LB液体培养基，于37 ℃，220 rpm条件下振荡培养50 min，让菌液在10000 rpm离心1 min，弃掉700 μL，将管底菌体吹匀，剩余200 μL菌液分成50 μL、150 μL两份，分别涂布于含Amp的筛选平板上，正面朝上，37 ℃静置1 h；倒置培养皿，37 ℃培养过夜；次日白天观察菌落的生长状况，挑取单菌落进行鉴定。
将筛选出的阳性重组质粒pGEX4T-pEGF转化至Rosetta(DE3)菌株中进行扩大培养，通过挑菌、摇菌再酶切鉴定，如图4所示，1~4号电泳结果出现2条分子量大小分别为4900bp和171 bp的条带，表明，重组质粒为阳性质粒，得到Rosetta(DE3)-pGEX4T-pEGF。
实施例2：GST-pEGF的诱导表达与SDS-PAGE鉴定
(1) 细菌培养、IPTG诱导表达与蛋白的提取；
a.活化：分别吸取重组蛋白表达菌株菌液Rosetta(DE3)-pGEX4T-pEGF、Rosetta(DE3)-pGEX4T-1各10 μL分别接种于4 mL含有终浓度为200 μg·mL-1的Ampr的液体LB培养基中，在管壁做好标记，于37 ℃，220 r·min-1振荡培养16 h。次日，取适量上述菌液分别接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 ℃，220 r·min-1培养2.5 h；
b.取三组对照，向每组的2个管里都加入终浓度为1 mmol·L -1的IPTG溶液，28℃、220 r·min-1下诱导四小时以上；
c.取1 mL诱导后的菌液，加入1.5 mL EP管中，12000 r·min-1 离心30 s，弃上清，重复操作，将试管中的菌液浓缩至一个1.5 mL EP管中，做好标记。
d.菌体洗涤：用500 μL的PBS将菌体悬起，12000 r·min-1，30 s。用移液枪吸净上清；
e.超声破碎：往离心管中分别加入200 μL的PBS，用移液枪将菌体悬起，均匀后漩涡振荡1 min，超声破碎（参数为每超5 s间隔5 s，时长为20 min。）要随时观察，当溶液呈透亮时停止超声。
f.12000 r·min-1离心10 min分离蛋白。
g.收集蛋白：分离上清和包涵体蛋白，用移液枪将上清蛋白液吸取到一个新的1.5mL EP管中，标记为“pEGF-S”，-80 ℃保存备用；管底沉淀即为包涵体蛋白(IB)，每管用100μL的PBS悬起，标记为“pEGF-IB”，-80 ℃保存备用。
融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测：
a.取上述步骤中所得样品各20 μL，分别加入20 μL 5 x Loading Buffer(加了β-巯基乙醇)，在沸水中煮10 min，即可用于蛋白电泳。
b.电泳时取制备好的样品每个10 μL，按以下顺序（Marker，诱导pEGF-S，诱导pEGF-IB，未诱导pEGF-S，未诱导pEGF-IB,诱导pGEX4T-IB，未诱导pGEX4T-S，未诱导pGEX4T-IB）进行点样。
c.SDS-PAGE凝胶电泳的操作步骤：制胶（分离胶、浓缩胶），灌胶，封胶，插入制胶梳，安装电泳槽，加样，跑电泳，玻璃胶，染色，脱色，拍照记录。
用IPTG在28℃下诱导GST-pEGF融合蛋白表达，收集菌体提取蛋白收集后各取20 μL的样品与20 μL 5 x Loading Buffer混合，在沸水中煮10 min然后进行SDS-PAGE 电泳检测。结果如图5所示，结果表明，pGEX4T-pEGF诱导沉淀中蛋白表达含量高，蛋白表达效果好。
（3）融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测：
用IPTG在28℃下诱导GST-pEGF融合蛋白表达，取诱导的样品，上样量10μL，收集沉淀，进行SDS-PAGE检测后，转印到PVDF膜上，用2%的脱脂奶粉于37 ℃封闭1 h，PBST漂洗3次后与GST单克隆抗体（1:2000稀释）孵育1 h，PBST漂洗3次，与HRP-SPA（1：3 000稀释）孵育1h，PBST漂洗后，用DAB显色试剂盒显色。
如图6所示，由于该融合蛋白具有 GST 抗原性，可以特异性地被 anti-GST 抗体识别，经 Western blot检测显示，抗GST单克隆抗体特异性识别GST-pEGF融合蛋白和GST标签对照，此外，融合蛋白特异条带比对照 GST 蛋白略大，与预染蛋白 Marker 相比大约为35kD，验证了此条带携带有pEGF蛋白。
（4）融合蛋白的纯化
用IPTG在28℃下诱导GST-pEGF融合蛋白表达，经过GSTrap FF 亲和柱层析分离得到纯度较高的融合蛋白GST-pEGF。将纯化后的重组蛋白进行复溶，Bradford 法测浓度，过滤除菌并用 ddH2O稀释成 100 ng/uL备用。
实施例3：重组猪表皮生长因子rpEGF对体外培养细胞的影响
试验细胞：猪小肠上皮细胞（SIEC），本实验室保存。
试验方法：将长成单层的猪小肠上皮细胞（SIEC）经0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，接种于MEM培养基中，添加含终浓度为5%的胎牛血清，将重组猪表皮生长因子添加到体猪小肠上皮细胞（SIEC）培养液中，于37℃，5%CO2培养箱培养，采用MTS法测定细胞的增殖活性。
试验（1）：重组猪表皮生长因子rpEGF浓度对体外培养细胞的影响：
将长成单层的猪小肠上皮细胞（SIEC）经0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，接种于MEM培养基中，添加含终浓度为5%的胎牛血清，将重组猪表皮生长因子rpEGF，以不同浓度（终浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL）添加到体猪小肠上皮细胞（SIEC）培养液中，于37℃，5%CO2培养箱培养，设立不添加rpEGF对照，采用MTS法测定细胞的增殖活性。
检测结果如图7所示，rpEGF的终浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL对细胞的增殖均无显著影响，终浓度为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL对细胞的增殖活性有显著影响，且具有剂量依赖性。
试验（2）：突变位点对于体外培养细胞的影响
在本研究中，对猪表皮生长因子第42位和第46位的氨基酸进行了人工突变，其中第42位的半胱氨酸（Cys，C）突变为丝氨酸（Ser，S），第46位的天冬氨酸（Asp，D）突变为天冬酰胺（Asn，N），其突破了已有关于猪生长素蛋白的研究，将猪生长素基因的三对二硫键中的一对二硫键进行了突变，且获得了相比原有结构更高的活性。在本研究中设置了如下对比例。
对比序列1为传统未突变的猪生长素蛋白，其氨基酸序列为：NSYSECPPSHDGYCLHGGVC MYIEAVDSYA CNCVFGYVGE RCQHRDLKWW ELR（SEQ ID No：3），其核苷酸序列为（SEQ ID No：4）。
对比序列2仅将第42位的半胱氨酸（Cys，C）突变为丝氨酸（Ser，S），而第46位的氨基酸未进行突变，其具体的氨基酸序列为：NSYSECPPSH DGYCLHGGVC MYIEAVDSYACNCVFGYVGE RSQHRDLKWW ELR（SEQ ID No：5），其核苷酸序列为（SEQ ID No：6）。
按照实施例1-2的方法，分别制备得到氨基酸序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：5的重组猪表皮生长因子，即对照1和对照2。按照“试验（1）：重组猪表皮生长因子rpEGF浓度对体外培养细胞的影响”同样的方法，分别验证了其对于猪小肠上皮细胞（SIEC）的生长促进作用，具体操作如下：
将长成单层的猪小肠上皮细胞（SIEC）经0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，接种于MEM培养基中，添加含终浓度为5%的胎牛血清，将氨基酸序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：3和SEQ ID No：5的重组猪表皮生长因子rpEGF，分别以2μg/mL添加到体猪小肠上皮细胞（SIEC）培养液中，于37℃，5%CO2培养箱培养，设立不添加rpEGF对照，采用MTS法测定细胞的增殖活性。
检测结果如图8所示，在相同浓度下，序列1对于猪小肠上皮细胞（SIEC）的促增殖作用最强，其增殖活性相比传统的猪表皮生长因子（SEQ ID No：3）以及仅突变半胱氨酸的猪表皮生长因子（SEQ ID No：5）的活性更高，而研究发现，仅对于半胱氨酸进行突变将会导致猪表皮生长因子的活性基本丧失，在培养的24-96h，都未体现对于细胞的促生长和增殖效应。基于以上研究表明，对于猪表皮生长因子仅突变其半胱氨酸可能会导致其活性的急剧下降，而同时突变第42位半胱氨酸和第46位的天冬氨酸这两个保守的氨基酸位点，不但不会导致其活性的丧失，相反，在本试验中其维持了较高的促进细胞生长和增殖的活性。
实施例4：重组猪表皮生长因子rpEGF对猪源DNA病毒增殖的影响
试验材料：猪小肠上皮细胞（SIEC），猪细小病毒、猪圆环病毒2型均为本实验室保存。
试验方法：
试验（1）重组猪表皮生长因子rpEGF浓度对猪源DNA病毒增殖的影响
将长成单层的猪小肠上皮细胞（SIEC）经0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，接种于MEM培养基中，添加含终浓度为5%的胎牛血清，于37℃，5%CO2培养箱培养，至细胞密度生长至80%时，弃掉培养液，用0.85%生理盐水洗涤2次，接种猪细小病毒或猪圆环病毒2型，将重组猪表皮生长因子rpEGF，以不同浓度（终浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL）添加到培养液中，轻轻摇匀，于37℃，5%CO2培养箱培养96h，收集细胞与-80℃和37℃反复冻融3次，设立不添加rpEGF对照，采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法测定病毒的滴度。
由上述结果可知，重组猪表皮生长因子rpEGF能够显著促进猪小肠上皮细胞的增殖，病毒的增殖往往跟宿主细胞的生长特性相关，本试验结果表明：rpEGF的终浓度为0.1μg/mL和0.2μg/mL对猪细小病毒和圆环病毒2型均无影响，0.5μg/mL能促进病毒的增殖但差异不显著，终浓度为1μg/mL、 2μg/mL、4μg/mL对猪细小病毒和圆环病毒2型的增殖具有显著促进作用，且具有剂量依赖性，但4μg/mL对病毒促进作用比2μg/mL的作用要稍差。有鉴于次，在生产应用中可以根据细胞不同类型选择1μg/mL至4μg/mL的终浓度使用。
试验（2），突变位点对于猪源DNA病毒增殖的影响
将长成单层的猪小肠上皮细胞（SIEC）经0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，接种于MEM培养基中，添加含终浓度为5%的胎牛血清，于37℃，5%CO2培养箱培养，至细胞密度生长至80%时，弃掉培养液，用0.85%生理盐水洗涤2次，接种猪细小病毒或猪圆环病毒2型，将氨基酸序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：3和SEQ ID No：5的重组猪表皮生长因子rpEGF，分别以2μg/mL、4μg/mL的浓度添加到培养液中，轻轻摇匀，于37℃，5%CO2培养箱培养96h，收集细胞与-80℃和37℃反复冻融3次，设立不添加rpEGF对照，采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法测定病毒的滴度。具体检测结果如下表1所示：
表1 突变位点对于猪源DNA病毒增殖的影响
基于以上表1的结果可知，本发明的重组猪表皮生长因子rpEGF对猪细小病毒和猪圆环病毒2型的增殖具有更显著促进作用， 其中对于猪圆环病毒-2而言，其生产的病毒培养液的浓度是传统猪表皮生长因子的4倍左右，而对于猪细小病毒而言，其生产的病毒培养液的浓度是传统猪表皮生长因子的3倍左右，以上结果表明，本发明的重组猪表皮生长因子rpEGF相比其他序列具有更好的促进病毒增殖的作用，取得了预料不到的技术效果。
序列表
<110> 衡阳师范学院
<120> 一种重组猪表皮生长因子及其制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工合成(swine)
<400> 1
Asn Ser Tyr Ser Glu Cys Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Phe Gly Tyr Val Gly Glu Arg Ser Gln His Arg Asn Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 2
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工合成(swine)
<400> 2
aatagttact ctgaatgccc gccgtcccac gacgggtact gcctccacgg tggtgtgtgt 60
atgtatattg aagccgtcga cagctatgcc tgcaactgtg tttttggcta cgttggcgag 120
cgaagtcagc acagaaactt gaaatggtgg gagttgcgc 159
<210> 3
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工合成(swine)
<400> 3
Asn Ser Tyr Ser Glu Cys Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Phe Gly Tyr Val Gly Glu Arg Cys Gln His Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 4
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工合成(swine)
<400> 4
aatagttact ctgaatgccc gccgtcccac gacgggtact gcctccacgg tggtgtgtgt 60
atgtatattg aagccgtcga cagctatgcc tgcaactgtg tttttggcta cgttggcgag 120
cgatgtcagc acagagactt gaaatggtgg gagttgcgc 159
<210> 5
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工合成(swine)
<400> 5
Asn Ser Tyr Ser Glu Cys Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Phe Gly Tyr Val Gly Glu Arg Ser Gln His Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 6
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工合成(swine)
<400> 6
aatagttact ctgaatgccc gccgtcccac gacgggtact gcctccacgg tggtgtgtgt 60
atgtatattg aagccgtcga cagctatgcc tgcaactgtg tttttggcta cgttggcgag 120
cgaagtcagc acagagactt gaaatggtgg gagttgcgc 159
Claims (12)
1.一种重组猪表皮生长因子，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.编码权利要求1中所述重组猪表皮生长因子的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
3.一种表达重组猪表皮生长因子的重组载体，其特征在于，其包括SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，所述载体是pGEX 4T。
4.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括所述表达权利要求1中所述的重组猪表皮生长因子的重组载体，所述重组菌为Rosetta（DE3）。
5.一种制备权利要求1中所述的重组猪表皮生长因子的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求4所述重组菌在LB培养基中培养，IPTG诱导。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述制备重组猪表皮生长因子的方法包括如下步骤：
（1）重组细菌培养：将重组蛋白表达菌株菌液Rosetta(DE3)-pGEX4T-pEGF、接种于含有终浓度为200 μg·mL-1的Ampr的液体LB培养基中， 37 ℃，220 r·min-1培养2.5 h；
（2）IPTG诱导表达：加入终浓度为1 mmol·L -1的IPTG溶液，28℃、220 r·min-1下诱导四小时以上；
（3）蛋白的提取：取诱导后的菌液，离心收集菌体，采用PBS洗涤菌体后超声破碎，离心分离蛋白，采用GSTrap FF 亲和柱层析分离得到纯度较高的融合蛋白GST-pEGF。
7.权利要求1中所述的重组猪表皮生长因子在疫苗制备中的应用。
8.根据权利要求7所述的重组猪表皮生长因子在疫苗制备中的应用，所述重组猪表皮生长因子用于促进猪源DNA病毒的增殖。
9.根据权利要求8所述的重组猪表皮生长因子在疫苗制备中的应用，在病毒增殖培养基中添加所述重组猪表皮生长因子。
10.根据权利要求9所述的重组猪表皮生长因子在疫苗制备中的应用，所述病毒为猪细小病毒或猪圆环病毒2型。
11.根据权利要求9所述的重组猪表皮生长因子在疫苗制备中的应用，所述重组猪表皮生长因子在病毒增殖培养基中的添加量为2-4μg/mL。
12.根据权利要求11所述的重组猪表皮生长因子在疫苗制备中的应用，所述重组猪表皮生长因子在病毒增殖培养基中的添加量为2μg/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911213159.0A CN110845597B (zh) | 2019-12-02 | 2019-12-02 | 一种重组猪表皮生长因子及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911213159.0A CN110845597B (zh) | 2019-12-02 | 2019-12-02 | 一种重组猪表皮生长因子及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110845597A CN110845597A (zh) | 2020-02-28 |
| CN110845597B true CN110845597B (zh) | 2021-01-01 |
Family
ID=69607143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911213159.0A Active CN110845597B (zh) | 2019-12-02 | 2019-12-02 | 一种重组猪表皮生长因子及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110845597B (zh) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007109673A2 (en) * | 2006-03-20 | 2007-09-27 | Stanford University | Mutant epidermal growth factor polypeptides, nucleic acids, and uses therefor |
| CN102719439A (zh) * | 2012-05-29 | 2012-10-10 | 中山大学 | 一种突变型人表皮生长因子基因、蛋白及其制备方法和应用 |
| CN106337054A (zh) * | 2016-08-22 | 2017-01-18 | 四川华德生物工程有限公司 | 一种高活性的重组猪表皮生长因子的制备方法 |
-
2019
- 2019-12-02 CN CN201911213159.0A patent/CN110845597B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110845597A (zh) | 2020-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111087463B (zh) | 一种重组人源iii型胶原蛋白及其原核表达方法 | |
| CN111087464B (zh) | 一种具有功能结构的重组人源iii型胶原蛋白及其表达方法 | |
| CN111363029B (zh) | 重组人源ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法 | |
| CN108912221A (zh) | 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法 | |
| CN107033250B (zh) | 牛冠状病毒重组多表位抗原及其应用 | |
| CN110577592B (zh) | 一种重组人纤连蛋白肽 | |
| CN111217903B (zh) | 一种重组人纤连蛋白ⅲ1-c及其制备方法和应用 | |
| CN115925895B (zh) | 抗bvdv的纳米抗体及其制备方法及应用 | |
| CN105925597B (zh) | 一种pedv s基因主要抗原表位串联的重组基因及其制备方法和应用 | |
| CN113480665B (zh) | 一种用于猪流行性腹泻病毒的融合蛋白以及重组蛋白疫苗 | |
| CN103193887B (zh) | 一种重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法 | |
| CN114853883A (zh) | 一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体 | |
| CN103131676A (zh) | 表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用 | |
| CN107033245A (zh) | 一种鸡caspase‑1多克隆抗体的制备方法和用途 | |
| CN110616227A (zh) | 一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌株和应用 | |
| CN110845597B (zh) | 一种重组猪表皮生长因子及其制备方法 | |
| CN114409804B (zh) | 一种大肠杆菌肠毒素多表位融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN113940993B (zh) | 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN109384834A (zh) | 重组Protein A蛋白及其高效表达和应用 | |
| CN108841793A (zh) | 抗鸭Mx-A单克隆抗体及其在检测鸭Mx蛋白的应用 | |
| CN106632690A (zh) | 一种重组人热休克蛋白10及其编码基因与制备方法 | |
| CN112695052A (zh) | 一种重组人糖皮质激素受体GRα-His蛋白及其表达和纯化方法 | |
| CN112094853A (zh) | 白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用 | |
| CN107502616B (zh) | 一种可溶性重组蛋白cta-cd154及其制备方法和应用 | |
| CN110734492B (zh) | 抗f4/80的多克隆抗体及制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |