CN102719439A - 一种突变型人表皮生长因子基因、蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
一种突变型人表皮生长因子基因、蛋白及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种突变型人表皮生长因子基因、蛋白及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明所述的突变型人表皮生长因子基因和蛋白序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。本发明采用易错PCR和交错延伸PCR联合的方法将hEGF和pEGF的DNA进行分子定向进化，构建了EGF定向进化文库，进而筛选出上述突变型人表皮生长因子基因。该序列是野生型EGF核苷酸序列119位A突变为T，其编码的氨基酸40位的Glu突变为Val，突变后的蛋白功能与野生型相同，且比野生型EGF蛋白比活提高20%，可用于制备防治表皮生长因子相关疾病药物或诊断试剂等，使用量减少，其副作用降低。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种突变型人表皮生长因子基因、蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)发现于1962 年，是一种由53 个氨基酸残基组成的单体多肽。已证实hEGF 是一种关键性的创伤愈合因子，通过与人表皮生长因子受体（EGFR）的结合，它能对上皮细胞和间质细胞产生很强的致分裂作用；促进皮肤、角膜、肺和气管上皮组织等的增殖和分化；对表皮损伤和溃疡具有卓越修复功能；临床上对肠、胃、肝等器官表面损伤的修复和再生也有显著疗效。
综上所述hEGF在医疗、美容护肤等方面有着广泛的应用前景，但是由于其自身半衰期较短等不利因素，至今尚未得到广泛的使用，利用分子手段将它进行改造已成为必然。上个世纪，我们对EGF的研究多集中于怎样获得更多的EGF。近年来，随着研究技术的进步，人们不再满足于简单的获取与利用，分子水平上的研究和改造也已开始进行。由于EGFR的过表达与多种肿瘤的发生、发展和转移有关，改造EGF以期获得EGFR拮抗剂可能成为肿瘤治疗的辅助药物；另外，由于EGF能够使细胞脱分化、促进细胞生长，因此能得到活性增强的EGF突变体也是改造的一个重要目标。
分析了EGF分子特点后我们发现：1）现在EGF的三维结构已比较清楚但是其结构和功能之间的关系并不清楚；2）EGF分子很小，核酸序列只有159bp，蛋白质水平也仅有53个氨基酸，难以进行传统改组方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种新突变型表皮生长因子基因。
本发明的另一目的是提供上述突变型表皮生长因子基因编码的蛋白。
本发明的又一目的是提供上述突变型表皮生长因子基因和蛋白的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种突变型人表皮生长因子基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该序列是在野生型EGF（表皮生长因子）核苷酸序列的119位的腺嘌呤（A）突变为胸腺嘧啶（T）的核苷酸序列。
上述突变型人表皮生长因子基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。氨基酸序列第40位的谷氨酸突变为缬氨酸，比野生型EGF蛋白比活提高了20%。
上述突变型人表皮生长因子基因的制备方法，是以天然人表皮生长因子基因和猪表皮生长因子基因为模板，进行易错PCR和交错延伸PCR，获得表皮生长因子基因的重组突变文库，连接入噬菌体载体，转化宿主菌获得噬菌体文库，经过噬菌体拯救的方法扩增该噬菌体文库，用过表达人表皮生长因子受体的细胞淘洗筛选，最终获得能与人表皮生长因子受体稳定结合的噬菌体，将所得噬菌体与宿主菌孵育、扩增，进行细胞表面受体ELISA反应，最终筛选出权利要求1所述突变型人表皮生长因子基因。
上述方法更具体的步骤如下：
（1）易错PCR：以天然hEGF基因、pEGF基因为模板，SEQ ID NO:3~6所示序列为引物，进行易错PCR扩增，扩增产物连接载体转化大肠杆菌，进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落用Amp-LB培养基培养筛选，提取质粒；
（2）交错延伸PCR：以质粒为模板，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6为引物进行PCR，扩增产物为模板，SEQ ID NO:3~4为引物进行第二轮PCR，所得产物为人重组表皮生长因子基因定向进化文库；
（3）噬菌体展示筛选：人重组表皮生长因子基因定向进化文库与载体pCANTAB-5E连接，转入宿主细胞，同时在转化的宿主细胞中加入辅助噬菌体M13KO7进行噬菌体拯救，获得人重组表皮生长因子基因定向进化DNA的噬菌体展示文库；
（4）用经过封闭的，可以过表达EGFR的A431细胞与人重组表皮生长因子基因定向进化DNA的噬菌体展示文库共同孵育，以大肠杆菌TG1洗脱，同时用辅助噬菌体M13KO7进行噬菌体拯救，反复淘洗4轮，得到与EGFR结合力强的人重组表皮生长因子基因定向进化DNA的噬菌体展示文库；
（5）步骤（4）所得产物与其宿主菌孵育、扩增，然后进行细胞表面受体ELISA反应，筛选出具有高受体亲和力的突变型人EGF基因。
一种突变型人表皮生长因子表达载体，是由上述突变型人表皮生长因子基因插入到载体pET32a(+)的多克隆位点构建而成。
上述突变型人表皮生长因子基因编码的蛋白的制备方法，步骤为：将SEQ ID NO:1所示突变型人表皮生长因子基因连接于表达载体pET32a(+)，转化宿主细胞，进行融合表达、纯化，得到突变型人表皮生长因子基因编码的蛋白。
本发明的突变型人表皮生长因子基因在制备防治表皮生长因子受体表达异常引起的疾病的药物、诊断表皮生长因子受体表达异常引起的疾病的试剂、防治上皮损伤疾病的药物、促表皮生长恢复的药物和/或化妆品添加剂中的应用。
本发明所得到的突变型人表皮生长因子蛋白可作为药物，用于治疗烫伤烧伤、组织乃至器官切除的伤口愈合。本发明蛋白亦可作为美容用品，用于结痂的消除、皮肤美白等。
本发明蛋白当在治疗上进行施用（给药）时，通常将其冻干粉按照pH6-8溶于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中。配制好的药物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）：擦拭、皮下、皮内或局部给药。
当本发明蛋白被用做药物时，治疗有效剂量通常为5μg/100mL，当然具体剂量应当考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用较有利于小分子进化的易错PCR（error prone PCR）和交错延伸PCR（StEP-PCR）联合的方法将hEGF和pEGF的DNA进行分子定向进化，探索了简便、有效、优化的EGF体外定向进化的技术路线，构建了EGF定向进化文库，用单链构象多态性检测法（SSCP）初步检测发现文库突变率可以达到其它大分子改组的突变率水平。本发明采用国际上先进的活细胞筛选技术，将突变文库构建成M13噬菌体展示文库，通过活细胞噬菌体展示、酶联免疫吸附试验（ELISA）和MTT还原测定的方法筛选到活性增强的突变体E40V。
实验表明，在BL21细胞中表达得到的40位的谷氨酸突变为缬氨酸的EGF蛋白经MTT法测活分析，比野生型EGF蛋白比活提高20%，因此可以在实际应用中时减少用量，降低其副作用。
本发明构建的pET32a-EGF/E40V中EGF/E40V基因位于T7启动子控制下，在EGF/E40V基因的5’端融合了硫氧还蛋白基因，可以提高EGF蛋白的可溶性。
附图说明
图1. EGF定向进化文库的构建及噬菌体展示法筛选突变型EGF的流程图。
图2. EGF/E40V基因的测序结果图。
图3. 突变型EGF（rEGF）与野生型EGF（hEGF）的活性比较图，即MTT法比较分析各重组子促A431细胞生长几率，样品1~6分别为第13、14、15、16、22、26号样品，其中26号样品即为EGF/E40V。
图4. SDS-PAGE电泳分析重组EGF表达及纯化情况，其中a图为诱导前后的对比，泳道13b、14b、15b、16b、22b、26b为诱导前的菌液，13a、14a、15a、16a、22a、26a为诱导后的菌液，上样15μL，泳道CK为重组EGF阳性对照，分量子约为27kD；b图为纯化后的蛋白，泳道CK为重组EGF阳性对照，分量子约为27kD，泳道13、14、15、16、22和26为相应编号样品纯化后的结果，上样15μL。
图5.MTT法检测hEGF和EGF/E40V在不同浓度梯度下的促增殖活性。
具体实施方式
以下通过实施例进一步解释本发明，但实施例不对本发明作任何形式的限制，实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验手段。
实施例中所用到的生物材料及来源：
载体pMD18T：TAKARA 公司；
大肠杆菌DH5α：TAKARA 公司；
pCANTAB-5E载体：NEB 公司；
大肠杆菌TG1感受态细胞：TAKARA 公司；
噬菌体M13KO7：NEB 公司；
A431细胞：中山大学实验动物中心；
载体pET32a(+)：Novagen 公司；
大肠杆菌BL21的感受态细胞：TAKARA 公司；
大肠杆菌JM109感受态细胞：TAKARA 公司；
NTH3T3细胞：TAKARA 公司。
实施例1
天然的人表皮生长因子为53个氨基酸，天然的猪表皮生长因子同为53个氨基酸，两者同源性为84%。我们通过DNA定向进化的方法和噬菌体展示方法得到了具有高EGFR亲和性的突变型EGF的编码核苷酸序列。其DNA序列及氨基酸编码序列见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。通过将该序列与pET32a(+)载体融合表达获得新的具有高EGFR亲和性的突变型人重组表皮生长因子蛋白。具体实验步骤如下：
1．突变型人重组表皮生长因子基因定向进化文库的构建。
1）分别以人表皮生长因子（hEGF）核苷酸序列（Gene ID: 1950，SEQ ID NO:7）和猪表皮生长因子（pEGF）核苷酸序列（Gene ID: 397083，SEQ ID NO:8）为模板，用引物1，2，3，4进行易错PCR（Mn2+0.25/Mg2+1.00mM）扩增得到5’端带SfiI酶切位点，3’端带NotI酶切位点的基因片段。
hEGF引物：
引物1：5’ TAGGCCCAGCAGGCCAATAGTGACTCTGAATGTCC 3’（SEQ ID NO:3）；
引物2：5’ CCGGCGGCCGCGCGCAGTTCCCACCACTTCAG 3’ （SEQ ID NO:4）。
pEGF 引物：
引物3：5’ TAGGCCCAGCAGGCCAATAGTACTCTGAATGCCCGC 3’ （SEQ ID NO:5）；
引物4：5’ CCGGCGGCCGCGCGCAGCTCCCACCATTTCAAG 3’ （SEQ ID NO:6）。
易错PCR反应体系：50μL 体系中含10×PCR buffer 5μL（不含Mg2+），dNTP 1μL，上游引物、下游引物各1μL，模板DNA1μL (约1ng)，Taq DNA聚合酶1μL，Mn2+0.1/0.25/0.4mM，Mg2+0.5/1.0/1.5mM，加ddH2O至50μL。
反应条件为：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸1分钟，循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温3分钟，使反应产物扩增充分。
2）将扩增产物分别与pMD18T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含IPTG/X-Gal的平板上，37℃倒置培养18小时后，进行蓝白斑筛选。挑取白色单菌落于Amp-LB液体培养基中，37℃ 220rpm振荡过夜培养（Amp-LB液体培养基配制：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，pH7.4~7.6，灭菌冷却后加入氨苄青霉素1mL）。分别提取扩大培养的质粒。
3）将提取的含有hEGF易错PCR产物的质粒和含有pEGF易错PCR产物的质粒等比例混合作为PCR模板（标记为StEP模板），用引物1，2，4进行PCR扩增（扩增程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，50℃退火30秒，循环50轮，进行PCR，最后一轮循环结束后，于72℃下保温3分钟，使反应产物扩增充分），取扩增产物为模板，用引物1，2再进行PCR扩增（扩增程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分钟，循环30轮，最后一轮循环结束后，于72℃下保温3分钟，使反应产物扩增充分）。扩增产物进行胶回收保存。该产物即为人重组表皮生长因子基因定向进化文库。
2. 用噬菌体展示文库的方法筛选具有高EGFR亲和性的突变型人重组表皮生长因子基因。
1）使用限制性内切酶SfiI和NotI分别将pCANTAB-5E载体和步骤1得到的人重组表皮生长因子基因定向进化文库进行双酶切，两种DNA反应体系相同，反应体系30μL：10×M/H buffer 3μL，质粒DNA20μL，SfiI或NotI1μL，ddH2O6μL，50℃或37℃温浴2小时，pCANTAB 5E载体温浴4h。
2）将双酶切产物胶回收后使用T4连接酶进行连接，连接产物转入大肠杆菌TG1感受态细胞。在转化的细胞中加入辅助噬菌体M13KO7进行噬菌体拯救（具体步骤为：1、在转化细胞中加入9.1mL不含Amp的2×YT-G培养基，37℃下250rpm震荡培养1小时。2、加入50mL 20ng/mL的Amp和4×1010pfu的辅助噬菌体M13KO7，37℃下250rpm震荡培养1小时。3、1000×G离心10分钟收集，小心地弃除上清并轻柔地加入10mL 2×YT-AK重悬。4、用0.45μm滤膜过滤，储存于4℃或者进行淘洗。5、如滴度小于107 pfu/mL则要进行文库扩增，将过滤的噬菌体重新感染TG1细胞37℃下250rpm震荡培养过夜再进行噬菌体拯救），获得人重组表皮生长因子基因定向进化DNA的噬菌体展示文库（简称噬菌体展示文库）。
3）利用A431细胞表面过量表达EGFR（表皮生长因子受体）的现象，将A431细胞用含5%胎牛血清的PBS封闭后，与上述步骤2）得到的噬菌体展示文库共同孵育，然后用含0.1%吐温20的PBS洗涤，后用5mL对数期的大肠杆菌TG1洗脱得到与EGFR结合力强的噬菌体展示文库，并使用辅助噬菌体M13KO7拯救文库。如此反复淘洗，总计4轮。
4）在最后一轮淘洗得到的文库涂布SOBAG平板（细菌用蛋白胨20g，酵母粉5g，NaC1 0.5g，加水至900mL，高压灭菌，灭菌后待培养基冷却至60℃，加入10mL 1M的MgCl2，55.6mL 2M的葡萄糖，以及5mL 20mg/mL的Amp青霉素<三者均为过滤除菌>，固体培养基在灭菌前加入琼脂粉15g）培养，挑取30个单菌落，扩大培养后用辅助噬菌体M13KO7侵染获得单克隆噬菌体液，将该噬菌体液加入种有过量A431细胞的96孔板内进行细胞表面ELISA，获得SEQ ID NO:1所示的DNA分子EGF/E40V。具体步骤如下：
细胞固定
① 选择覆盖度70%，25cm2培养瓶中细胞数达到3.5~4×106左右的细胞，胰蛋白酶作用消化，计数；
② 1500转离心3分钟，用完全培养基悬浮到合适浓度(A431为上皮细胞所以浓度应为4×105 cells/mL)；
③ 在96孔板上每孔加100μL的细胞悬浮液，应注意的是，为了保证每个孔的细胞数分布均匀，每加三个孔就要将细胞吹打悬浮一次，37℃培养过夜；
④ 用PBSI洗两次；
⑤ 每孔加入125μL缓冲液稀释过的10%的福尔马林，室温下固定15分钟；
⑥ 双蒸水洗涤三次，吸干水分；
⑦ 2~8℃储存，尽快使用。
ELISA
① 用双蒸水洗涤ELISA板一次；
② 封闭：每孔加250μL PBS II，37℃孵育1h；
③ 双蒸水洗涤3次，每孔加入用PBS I 稀释过的检测物50μL；
④ 37℃孵育2h；
⑤ 双蒸水洗涤5次，每孔加入生物素标记的抗体（PBS I 稀释）50μL；
⑥ 37℃孵育1h；
⑦ 双蒸水洗涤5次后，每孔加入亲和素标记的辣根过氧化物酶（PBS I 稀释）50μL孵育1h；
⑧双蒸水洗涤5次后，再用碳酸盐buffer洗涤一次；
⑨ 显色：每孔加入0.5 μL 4.0% OPD，5 μL 30% H2O2，1.0 μL 10×酶作用底物buffer，8.5 μL dd-H2O，室温孵育20min；
⑩ 每孔加入25μL 4.5N的硫酸（终止反应），15min内酶标仪A490波长读数，筛选到13、14、15、16、22、26号样品为具有较高亲和活性的突变子，其中第26号即为SEQ ID NO:1所示的DNA分子EGF/E40V。
3．高效表达融合型pET32a(+)-EGF/E40V重组载体的构建。
1）以SEQ ID NO:1所示的DNA分子（EGF/E40V）为模板，用引物5，6进行PCR扩增，得到5’端带EcoRI 酶切位点，3’端带XhoI酶切位点的基因片段。
引物5：5’-GCGAATTCAATAGTGACTCTGAATGTCC-3’（SEQ ID NO:9）；
引物6：5’-ATCTCGAGGCGCAGTTCCCACCACTTCAG-3’（SEQ ID NO:10）。
2）用EcoRI与XhoI同时双酶切PCR胶回收产物与质粒载体pET32a，酶切的重组EGF/E40V片段与pET32a进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，Amp-LB平板上37℃过夜培养。
3）挑取单个的阳性克隆培养，并进行双酶切（EcoRI 酶切和XhoI酶切）和PCR验证，最终通过测序确定pET32a(+)-EGF/E40V重组载体构建成功。
4．pET32a(+)-EGF/E40V重组载体在BL21细胞中的表达及分离纯化和鉴定。
1）将构建成功的pET32a(+)-EGF/E40V重组载体转化大肠杆菌BL21的感受态细胞。
2）挑取单克隆培养，在扩大培养至对数期后，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG,终浓度为0.5mM）在30℃、220rpm的条件下进行诱导表达6小时后，收集菌体。
3）使用PBS洗涤菌体2次后，反复冻融菌体3次。
4）加入100μL溶菌酶和10μL苯甲基磺酰氟（PMSF）与之冰上孵育1小时，然后超声破碎（4s/4s/99个循环），离心，取上清（含蛋白）。
5）将上步得到的蛋白上清液加入TALONTM金属离子树脂纯化柱中，按照其操作指南进行纯化，得到SEQ ID NO:2所示多肽蛋白，具体步骤如下：
① 用1mL Equilibration/Wash Buffer 重悬His-Tag纯化柱，之后700g 离心2分钟，去掉离心所得液。重复此步骤3次；
② 将表达获得的蛋白上清1mL加到纯化柱中，重悬树脂后静置30s；
③ 将纯化柱放置在静音混合器上，4℃结合过夜（12-16h）；
④ 第二天700g 离心2分钟，收集流出液用于跑胶检测；
⑤ 向纯化柱中加入0.5mL Equilibration/Wash Buffer （20mM咪唑），静置30s,之后放置在静音混合器上5min,充分重悬树脂；
⑥ 700g 离心2分钟,收集流出液跑胶检测；并重复此步骤5次；
⑦ 空转，700g 离心纯化柱2分钟，以除去多余的Equilibration/Wash Buffer；
⑧ 加入0.5mL Elution Buffer （300mM咪唑）到纯化柱中，静置1min，之后轻轻搅动，重悬树脂；
⑨ 700g 离心2分钟，收集洗脱液，用以跑胶检测；并重复次步骤4次。
6）使用15% SDS-PAGE检测纯化产物，考马斯亮蓝染色检测呈一条带，见图4，表明获得了纯的，最终得到突变型表皮生长因子蛋白。
实施例2MTT法检测突变蛋白的促增殖活性
1）培养NTH3T3细胞至状态良好，覆盖度达到75%，消化离心后重悬，进行细胞计数。
2）按细胞计数结果，用完全培养基重悬细胞至合适浓度（保证96孔板每孔细胞数为1000个），在96孔板上每孔加入100μL细胞悬液，其中第一列不加细胞作为空白对照。37℃，5%CO2培养4~6小时。
3）倒置显微镜观察细胞贴壁后，将培养基小心吸出，换成无血清培养基，继续37 ℃，5%CO2饥饿培养4小时。
4）小心吸出无血清培养基，将稀释于含0.2FBS%的DMEM的实验药物（hEGF、EGF/E40V）按照0.001nM，0.1nM，1nM，10nM，100nM，1000nM的浓度加入，每个浓度设置3个重复孔， 37℃，5%CO2培养24小时。
5）每孔加入5mg/mL溶解于PBS的MTT 50 μL，37 ℃，5%CO2培养4小时，以使细胞内线粒体充分还原MTT形成甲瓒。
6）小心地将96孔板倒扣于卫生纸上，轻轻地将培养基倒出，然后每孔加入150 μl DMSO，于脱色摇床上摇匀15分钟，使甲瓒充分溶解，酶标仪492nm波长检测，取3孔的平均值扣除阴性对照，于GraphPad prism 5软件中作图分析，并比较hEGF与EGF/E40V的促增殖活性。
7）实验结果见图5，表明EGF/E40V相对于hEGF具有显著的增长，其促增殖活性提高了20%。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种突变型人表皮生长因子基因、蛋白及其制备方法和应用
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac gatgggtact gcctacatga tggtgtgtgc 60
atgtatattg aagcattgga caagtatgca tgcaactgtg ttgttggcta catcggggtg 120
cgatgtcagt accgagacct gaagtggtgg gaactgcgc 159
<210> 2
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Val Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taggcccagc aggccaatag tgactctgaa tgtcc 35
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccggcggccg cgcgcagttc ccaccacttc ag 32
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taggcccagc aggccaatag tactctgaat gcccgc 36
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccggcggccg cgcgcagctc ccaccatttc aag 33
<210> 7
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac gatgggtact gcctccatga tggtgtgtgc 60
atgtatattg aagcattgga caagtatgca tgcaactgtg ttgttggcta catcggggag 120
cgatgtcagt accgagacct gaagtggtgg gaactgcgc 159
<210> 8
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aatagttact ctgaatgccc gccgtcccac gacgggtact gcctccacgg tggtgtgtgt 60
atgtatattg aagccgtcga cagctatgcc tgcaactgtg tttttggcta cgttggcgag 120
cgatgtcagc acagagactt gaaatggtgg gagctgcgc 159
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcgaattcaa tagtgactct gaatgtcc 28
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atctcgaggc gcagttccca ccacttcag 29
Claims (6)
1.一种突变型人表皮生长因子基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述突变型人表皮生长因子基因编码的蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述突变型人表皮生长因子基因的制备方法，其特征在于以天然人表皮生长因子基因和猪表皮生长因子基因为模板，进行易错PCR和交错延伸PCR，获得表皮生长因子基因的重组突变文库，连接入噬菌体载体，转化宿主菌获得噬菌体文库，经过噬菌体拯救的方法扩增该噬菌体文库，用过表达表皮生长因子受体的细胞淘洗筛选，最终获得能与表皮生长因子受体稳定结合的噬菌体，将所得噬菌体与宿主菌孵育、扩增，进行细胞表面受体ELISA反应，最终筛选出权利要求1所述突变型人表皮生长因子基因。
4.一种突变型人表皮生长因子表达载体，其特征在于由权利要求1所述突变型表皮生长因子基因插入载体pET32a(+)的多克隆位点构建而成。
5.权利要求2所述突变型人表皮生长因子基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于将SEQ ID NO:1所示突变型人表皮生长因子基因连接于表达载体pET32a(+)，转化宿主细胞，进行融合表达、纯化，得到突变型人表皮生长因子基因编码的蛋白。
6.权利要求1所述突变型人表皮生长因子基因在制备防治表皮生长因子受体表达异常引起的疾病的药物、诊断表皮生长因子受体表达异常引起的疾病的试剂、防治上皮损伤疾病的药物、促表皮生长恢复的药物和/或化妆品添加剂中的应用。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN1293250A (zh) * | 1999-10-18 | 2001-05-02 | 上海生元基因开发有限公司 | 一种表皮生长因子样蛋白及编码它的多核苷酸序列 |
| CN102020710A (zh) * | 2010-09-03 | 2011-04-20 | 深圳市华生元基因工程发展有限公司 | 人表皮生长因子一个新的突变体en-46 |
-
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