CN114853883A

CN114853883A - 一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体

Info

Publication number: CN114853883A
Application number: CN202210488867.0A
Authority: CN
Inventors: 孙亚丽; 李积旭; 康明; 马鹤嘉; 劳彦君; 孙雪; 张薇
Original assignee: Qinghai University
Current assignee: Qinghai University
Priority date: 2022-05-06
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2042-05-06
Also published as: CN114853883B

Abstract

本发明公开了一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体，属于生物技术领域，通过青海血蜱的RNA样本反转录出第一链的cDNA，然后通过5'RACE和3'RACE技术扩增得到青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA全长序列，并进行核苷酸序列的测定，而后通过携带基因序列的克隆载体进行基因编码区的克隆；通过宿主菌进行原核表达，制备编码青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的蛋白抗原，并确定其氨基酸序列；获得纯化后的青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂后，用其免疫BALB/c小鼠，3次免疫之后，使用抗原亲和纯化的方法获得针对青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的特异性多克隆抗体，为疫苗的研发做准备。

Description

一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体。

背景技术

青海血蜱是硬蜱科血蜱属的一种蜱虫，为体外吸血性寄生虫。分布于我国青海、甘肃、云南、西藏等地，是青海省的优势蜱种。青海血蜱可以传播诸如立克次氏体、巴贝斯虫、泰勒虫、Q热、莱姆病等多种疾病。发病动物多表现为发食欲不振、体型消瘦、发热、贫血、黄疸及血红蛋白尿症，死亡率高。

青海血蜱随季节的变化会出现卵、幼蜱、若蜱和成蜱的发育过程，往往在6-8月达到寄生的高峰期，根据其季节动态和在减少通过蜱的侵袭及其后果的尝试中，人们已经发现并应用了一些效果较好的驱蜱、杀蜱药剂，大多以喷雾、涂抹、浇泼、药浴的方式使用，如有机磷类药物、拟除虫菊酯类药物、DDT、氨基甲酸酯等药物，也有的使用了如伊维菌素等广谱驱虫药物。

这些药剂的使用能达到一定程度的驱蜱效果，但也有缺点，主要在于用药过程中对宿主、对环境、对寄生虫以及对人类自身的一些影响：体外用药过程中，药物本身对宿主和人会产生毒性作用，用完的药物会污染环境，重复用药的需求增加了人力和物力的成本，同时所用的药物会使寄生虫产生耐药性，因此用药过程中还要考虑轮换用药、穿梭用药的原则。

近年来，作为化学抗寄生虫药的可选替代，疫苗的研发成为热门选项，它不仅效果好、副作用少、而且成本也较低，但是暂时没有对青海血蜱疫苗的研究。通过转录组雌雄蜱肠道差异基因的对比，大量筛选获得到较为重要的一个新基因，即丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)基因，其他蜱种丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究方向主要集中在抗凝血机制、血液消化机制、调节发育生殖、细胞凋亡、抗炎症反应以及病原体传播等多重功能，但在青海血蜱中尚无任何报道，为解决青海血蜱的防控问题提供技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体，以解决背景技术中的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂(Hqipin1)，通过青海血蜱的RNA 样本反转录出第一链cDNA，然后通过5'RACE和3'RACE技术扩增得到青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因并进行核苷酸序列的测定，而后通过携带基因序列的克隆载体进行基因的克隆；通过宿主菌进行原核表达，制备编码青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的蛋白抗原，并确定其氨基酸序列；用获得的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过一系列方法制备出多克隆抗体，为疫苗的研发做准备。

青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的获得：利用聚合酶链式反应(PCR) 的方法，以青海血蜱的cDNA为模板，经PCR扩增得到青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，该基因序列如下所示：

gcgattatccactacgctatccttggccaatctcgcttctttggtgtggcccatctttggga gaaataacacgggaaataagaagaagaagaagacgaaggaggggacattccaagcatgggtcagag gagcagccgacacgtcggccccgaagcgacgtctttgcctaccggtgtcgcgactccgacgaggag cgaagacgccgtttctgtttccagccttaaggccaccgcgaccagtttgccgggggacggccgtcg actagccgaaggatggtttgaagactttataccagactcggaggcggtcatgacccgcggcctatt ccagttgggcatcgaccttcttcgagagctgcgccgctctgcgaccgacggtggcaacgtgctgct ctctccgtacgccgtggccagcaccttacaagaacttctcgttggcgcccgaggagacaccgccga gcagatcgccaccgtcctgcatgttaaatcagggcgacaagccaccccgtacttcttggaccgtga tcggcgccttcctaccaggtggcgcagcgacgtccacgcgcgcttcgacatggactacctgaacaa catccaccacgagaagctcctggccaccgtggacacctcgtgctcggcggagaagccgcctgcgct caggcttgagcgcttcagctgggacttcgccggcgatgccgagcggtgccggctcgagatcgaccg ctacgcgcggacggacgccagcgtcttcgcaccggatgagataatgccgaaaggctgcatcacgtc gtcgtctctggtatgcctgctgagtgtgctcgacttccgcggctcgtggaggaacgccttcgacga ctgcacggccacccgccagctcttctacgagtcggtcagggcgcccaccgcggtcgtgatgctaca ccagacgggtcacttccgcgtcgccacctgcaacgacctgcacgccacggccctcgaaattcccta ccagccaccgggccgcgggaccgcatgcagtctagtctccagggctacgcatagcacaggatctta ctcggtctccgggacgagctcaccggaaggcggcatccagacgcccacctctcatctgatccgagg cccggagctgtcgttggtgattttacttcccacggagaaagatggtctttccacgttggaggagaa acttaccagctacgctgccctgcgctgcctaagccagctgaagccgcggggaaatgtccacatcag tctgcccatgtttagcatcaagcaggttaccgagctcagttcggccttgtccgctctcggtgtccg cgacgtcttcagcgaccacgctgagctgtggggaaccacggccggacaagcacgggtctccagcat gcggcacgctgcagccttccagacttcgcagacgggcggccgccacaggtcacgacaaggtctccc ccttcagggcattggttcaaaggtggtgcgcagcctcgtgtcactggtcaaggcgccgcacccgag catggagttcacagtggacaggccctttgccttcttcgtagtctgcatgcacccggacacgcttct cctcttgggctccgtgcgaaagatcacgtggtgaaagtgcccctacgatgactttggtgccgggac agttcccaacgtccgtcccatattgcagcaagatgtgccttgctaaagtatttttagatatctata atcgcaatcgaagcgttttcttcattcgctgttttttttaaccaacgtgagttttattgatggtgt gaagcattcttctatgtgttgtgtataaaaggtgttcacagaaagtacatgcttagtgacgctgca aaaactatttctagggaaggatgcagcactgctgaactatcgcaaatgcctccccggctttgtcat tttaaccttaatcgtatcattcgtatcgctgccaggggaatgccacctttgcttctccaattacgt tatacattgttgttcgttaataccgttaaaggacatattttagatttacggatgtttggtactt

青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如下所示：

SEAVMTRGLFQLGIDLLRELRRSATDGGNVLLSPYAVASTLQELLVGARGDTAEQIATVLHV KSGRQATPYFLDRDRRLPTRWRSDVHARFDMDYLNNIHHEKLLATVDTSCSAEKPPALRLERFSWD FAGDAERCRLEIDRYARTDASVFAPDEIMPKGCITSSSLVCLLSVLDFRGSWRNAFDDCTATRQLF YESVRAPTAVVMLHQTGHFRVATCNDLHATALEIPYQPPGRGTACSLVSRATHSTGSYSVSGTSSP EGGIQTPTSHLIRGPELSLVILLPTEKDGLSTLEEKLTSYAALRCLSQLKPRGNVHISLPMFSIKQ VTELSSALSALGVRDVFSDHAELWGTTAGQARVSSMRHAAAFQTSQTGGRHRSRQGLPLQGIGSKV VRSLVSLVKAPHPSMEFTVDRPFAFFVVCMHPDTLLLLGSVRKITW

进一步地，青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法为：将青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的开放阅读框(ORF)部分与大肠杆菌表达载体构建重组表达质粒pGEX-4T-1-serpin，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选高抗性的转化子，过夜诱导后收集IPTG诱导表达的菌液，分离纯化获得编码丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的重组蛋白，即青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂。

进一步地，青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂纯化处理时首先诱导表达 1000mL菌液，将诱导后的菌液离心集菌，取20mLPBS重悬菌体沉淀后使用压力破碎仪破碎3次；离心弃沉淀并收集上清，微滤后，用GST纯化柱进行纯化。

进一步地，应用western blot和SDS-PAGE的方法进行青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的分析鉴定，将青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂进行SDS-PAGE 分离后，将青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂转移到PVDF膜上，一抗孵育：用 PBST稀释一抗在4℃的条件下过夜，二抗孵育：用5％的牛奶封闭的稀释二抗 (1:10000)，膜在二抗中于37℃的条件下处理1h。根据SDS-PAGE和WB鉴定结果分析，青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白分子量与理论分子量一致。说明通过表达纯化，得到符合要求的青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂。

一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的多克隆抗体的制备方法为：获得纯化后的青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂后，用其免疫BALB/c小鼠，3次免疫之后，使用抗原亲和纯化的方法获得针对青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的特异性多克隆抗体。

进一步地，针对特异性多克隆抗体，通过ELISA检测纯化抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定；最后通过SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。

本发明的有益效果：

本发明中青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因是青海血蜱在吸血以及传播疾病过程中发挥作用的关键基因之一，利用原核表达所制备的编码丝氨酸蛋白酶蛋白抑制基因的蛋白是研发用于畜牧业抗青海血蜱疫苗的候选蛋白，通过针对青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的特异性多克隆抗体进行间接ELISA效价检测和浓度鉴定，表明该多克隆抗体已达到有效的抗体效价和纯化浓度，为疫苗的研发奠定了基础，有利于推动青海血蜱寄生等问题的解决。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂纯化的SDS-PAGE分析图；

图2是本发明cDNA第一链目的片段的电泳图；

图3是本发明5’RACE实验目的片段的电泳图；

图4是本发明3’RACE实验目的片段的电泳图；

图5是本发明青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂表达鉴定的SDS-PAGE分析图；

图6是本发明青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的Western Blot鉴定分析图；

图7是本发明纯化抗体的SDS-PAGE分析电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

青海血蜱第一链cDNA的合成，包括如下步骤：

在无RNA酶的PCR管中加入1μg电泳检测合格的总RNA，和1μL的100 μM的oLigo(dT)引物，并用DEPC处理过的灭菌水加至体积12μL；将上述混合液于65℃处理5min后，在冰上立即冷却1min。然后再在反应液中依次加入4μL 5X reaction buffer、1μL RiboLock RNaseInhibitor(20u/ μL)、2μL 10mM dNTP mix、1μL RevertAid M-MuLV ReverseTranscriptase (200u/μL)，将其轻轻混匀，并短暂离心，在PCR仪上42℃孵育1个h， 70℃孵育5min结束反应，即得到cDNA的第一链。

实施例2

青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆及序列验证，包括如下步骤：

步骤1：采用Primer Premier 5.0软件进行特异性引物的设计，特异性引物包括正向引物(Primer F)和反向引物(Primer R)，序列如下：

M5F2(Primer F)5'-TCCAAGCATGGGTCAGAGGAGC-3'；

M5R1(Primer R)5'-TCACCACGTGATCTTTCGC-3'。

步骤2：以青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的cDNA为模板，以M5F2 (Primer F)、M5R1(Primer R)为引物进行PCR扩增，反应体系的总量为 50μL，PCR反应体系如表1所示：

表1

PCR反应的条件为：98℃5min；98℃10s，55℃30s，68℃1min30s； 68℃10min；35个循环周期。

步骤3：目的片段的回收纯化，具体方法为：PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至120V，电泳0.5h，照相记录电泳结果(请参阅图1)，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。

图1中箭头所指为目的片段PCR产物，M为分子量标记。

步骤4：利用5'RACE实验得到已知序列所在cDNA的完整序列，具体方法如下：

(1)引物的设计及序列：利用验证的已知序列，采用Primer Premier 5.0 软件设计三条特异性5’RACE引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

5'RACE引物名称及序列如表2所示：

表2

(2)目的基因第一链cDNA的合成：使用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSP-1对总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成，使用RNase Mix对合成的 cDNA进行去RNA处理。

具体方法为：a.按照表3体系进行添加：

表3

组成	用量
		GSP1	2.5pmoLes
sampLeRNA	5μg
		DEPC净化水	使体系的总体积为15.5μL

b.70℃温育上述混合物10min，并在冰上冷却1min。离心后按表4体系进行添加，体系的总量为8.5μL。

表4

组成	用量
		10XPCRbuffer	2.5μL
25mMMgCl<sub>2</sub>	2.5μL
		10mMdNTPmix	1μL
0.1MDTT	2.5μL

c.混合且离心后，42℃条件下温育1min，添加1μL of SUPERSCRIPT II RT，42℃温育50min；升温至70℃后温育15min，离心后在37℃的条件下反应。

d.添加1μL of RNase mix，混合后在37℃的条件下反应30min，离心并置于冰上。

(3)使用DNA Purification System：GLASSMAX DNA isoLation spin cartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化，具体方法为：e.冷却溶液到室温。

f.对于每个样本进行纯化，用100μL灭菌蒸馏水进行平衡，在65℃下，在步骤m.中使用。

g.添加120μL的粘合溶液(6M碘化钠)进行的第一链的反应，得到转移基因/碘化钠溶液。

h.转移基因/碘化钠溶液至GLASSMAX旋筒，放入离心机中在重力为 13000g的条件下离心20s。

i.将离心后的溶液转移到同一个离心管中，保存溶液，直到cDNA的得到确认。

j.添加0.4mL温度为4℃的1X洗涤缓冲液到旋转筒中，放入离心机中在重力为13000g的条件下离心20s。丢弃穿透液，重复此洗涤步骤三次。

k.用400μL温度为4℃且质量分数为70％的乙醇溶液洗涤两次。

L.除去最后70％的乙醇，放入离心机中在重力为13000g的条件下离心 1min。

m.将旋转筒插入到一个新的样本回收管中，加入50μL预热至65℃的无菌蒸馏水，在重力为13000g的条件下离心20s以洗脱cDNA。

(4)使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上多聚C，包括如下步骤：

n.按照表5体系进行添加，体系的总量为24μL。

表5

组成	用量
		DEPC-treatedwater	6.5μL
5XtaiLingbuffer	5.0μL
		2mMdCTP	2.5μL
GLASSMAXpurifiedcDNAsampLe	10.0μL

o.94℃温育2-3min，冰上冷却1min，置于冰上；加入1μL TdT酶，37℃温育10min；65℃加热10min灭活TdT酶，离心置于冰上。

(5)使用引物GSP-2和试剂盒里面带的桥连铆钉引物AAP对已经加dC 尾的cDNA进行PCR第一轮扩增。

设置热循环仪温度为94℃，向thin-waLL PCR tube中添加试剂并置于冰上，反应体系如表6所示，体系的总量为50.0μL。

表6

组成	用量
		steriLized，distiLLedwater	31.5μL
10XPCRbuffer	5.0μL
		25mMMgCl<sub>2</sub>	3.05μL
10mMdNTPmix	1.0μL
		nestedGSP2	2.0μL
AbridgedAnchorPrimer(10μM)	2.0μL
		dC-taiLedcDNA	5.0μL
TaqDNApoLymerase(5units/μL)	0.5μL

进行PCR反应，程序如表7所示：

表7

(6)使用引物GSP-3和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增，PCR第二轮扩增的体系如表8所示，体系的总量为50μL。

表8

(7)进行目的片段的回收纯化，具体方法为：将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，步骤按回收试剂盒说明书进行，得到电泳结果(请参阅图2)。图2中箭头所指为5’RACE扩增PCR产物，M为分子量标记。

步骤5：利用3'RACE实验得到已知序列所在cDNA的完整序列，包括如下步骤：

(1)利用验证的已知序列，采用Primer Premier 5.0软件设计两条特异性3’RACE引物，该引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。3’RACE引物名称及序列如表9所示：

表9

(2)实验方法及结果：使用逆转录酶SMARTScribe^TM Reverse Transcriptase和引物3’CDS primer A对总RNA进行逆转录合成cDNA；使用引物GSP1和UPM，以合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。反应体系如表10，体系的总量为50μL。

表10

进行第一轮PCR反应，反应程序如表11所示：

表11

将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物GSP2和UPM进行第二轮 PCR扩增。反应条件及程序同第一轮。

(3)将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，得到电泳结果(请参阅图3)。图3中箭头所指为3’RACE扩增PCR产物，M为分子量标记。

步骤6：进行基因全长拼接及ORF预测结果，具体步骤如下：

根据ORF全长克隆，5’RACE和3’RACE结果，拼接出实验目的基因的全长cDNA序列，然后通过NCBI比对分析预测出基因的起始和终止密码子位置。

该基因5’UTR序列为：

gcgattatccactacgctatccttggccaatctcgcttctttggtgtggcccatctttggga gaaataacacgggaaataagaagaagaagaagacgaaggaggggacattccaagc

该基因3’UTR序列为：

aagtgcccctacgatgactttggtgccgggacagttcccaacgtccgtcccatattgcagca agatgtgccttgctaaagtatttttagatatctataatcgcaatcgaagcgttttcttcattcgct gttttttttaaccaacgtgagttttattgatggtgtgaagcattcttctatgtgttgtgtataaaa ggtgttcacagaaagtacatgcttagtgacgctgcaaaaactatttctagggaaggatgcagcact gctgaactatcgcaaatgcctccccggctttgtcattttaaccttaatcgtatcattcgtatcgct gccaggggaatgccacctttgcttctccaattacgttatacattgttgttcgttaataccgttaaa ggacatattttagatttacggatgtttggtactt

该基因CDS编码区序列为：

atgggtcagaggagcagccgacacgtcggccccgaagcgacgtctttgcctaccggtgtcgc gactccgacgaggagcgaagacgccgtttctgtttccagccttaaggccaccgcgaccagtttgcc gggggacggccgtcgactagccgaaggatggtttgaagactttataccagactcggaggcggtcat gacccgcggcctattccagttgggcatcgaccttcttcgagagctgcgccgctctgcgaccgacgg tggcaacgtgctgctctctccgtacgccgtggccagcaccttacaagaacttctcgttggcgcccg aggagacaccgccgagcagatcgccaccgtcctgcatgttaaatcagggcgacaagccaccccgta cttcttggaccgtgatcggcgccttcctaccaggtggcgcagcgacgtccacgcgcgcttcgacat ggactacctgaacaacatccaccacgagaagctcctggccaccgtggacacctcgtgctcggcgga gaagccgcctgcgctcaggcttgagcgcttcagctgggacttcgccggcgatgccgagcggtgccg gctcgagatcgaccgctacgcgcggacggacgccagcgtcttcgcaccggatgagataatgccgaa aggctgcatcacgtcgtcgtctctggtatgcctgctgagtgtgctcgacttccgcggctcgtggag gaacgccttcgacgactgcacggccacccgccagctcttctacgagtcggtcagggcgcccaccgc ggtcgtgatgctacaccagacgggtcacttccgcgtcgccacctgcaacgacctgcacgccacggc cctcgaaattccctaccagccaccgggccgcgggaccgcatgcagtctagtctccagggctacgca tagcacaggatcttactcggtctccgggacgagctcaccggaaggcggcatccagacgcccacctc tcatctgatccgaggcccggagctgtcgttggtgattttacttcccacggagaaagatggtctttc cacgttggaggagaaacttaccagctacgctgccctgcgctgcctaagccagctgaagccgcgggg aaatgtccacatcagtctgcccatgtttagcatcaagcaggttaccgagctcagttcggccttgtc cgctctcggtgtccgcgacgtcttcagcgaccacgctgagctgtggggaaccacggccggacaagc acgggtctccagcatgcggcacgctgcagccttccagacttcgcagacgggcggccgccacaggtc acgacaaggtctcccccttcagggcattggttcaaaggtggtgcgcagcctcgtgtcactggtcaa ggcgccgcacccgagcatggagttcacagtggacaggccctttgccttcttcgtagtctgcatgca cccggacacgcttctcctcttgggctccgtgcgaaagatcacgtggtga

该基因有完整的开放阅读框(ORF)，其开放阅读框的序列如表12所示：

表12

实施例3

以原核表达载体在大肠杆菌中的诱导表达制备编码蛋白，包括如下步骤：

步骤1：重组表达质粒的构建。

选用pGEX-4T-1质粒，利用同源重组的方法将serpin截短片段与GST 标签载体pGEX-4T-1连接，构成重组表达载体质粒。

步骤2：重组载体转化至大肠杆菌。

将pGEX-4T-1-serpin质粒(1μL)无菌条件下加入大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞(100μL)，用移液器温和反复吹打混匀，冰浴放置20min；42℃水浴，热激90s，之后立即冰浴5min使之冷却，并且避免晃动。

转移菌液至装有600μL预热至37℃的LB培养液中，在220r/min和37℃的条件下振荡1h，离心后全部涂抹于50μg/mL Amp的LB平板，在37℃的条件下倒置培养过夜，获得含有单克隆的转化平板。

步骤3：IPTG诱导重组载体融合蛋白表达。

挑取转化平板上的单克隆接种于3mL含有50μg/mL Amp的LB培养液的试管中，在37℃和220r/min的条件下振摇过夜；同时转化未加入任何外源基因的pGEX-4T-1空载体作为阴性对照。

次日按照1：100的比例将试管中的单克隆接种于30mL含有50μg/mL Amp 的LB培养液中，在15℃和120r/min的条件下振摇至菌体的OD600为0.6-0.8。取出1mL培养物，在10000r/min的条件下离心2min，弃上清，用100μL上样缓冲液重悬离心后的菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为 0.1mM，然后加入1mM DTT，在15℃和120r/min的条件下振摇过夜，诱导融合蛋白表达。取出1mL培养物，在10000r/min的条件下离心2min，弃上清，用100μL上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物在4000r/min的条件下离心 10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀加入上样缓冲液重悬，然后进行12％SDS-PAGE分析。

实施例4

重组蛋白的纯化，包括如下步骤：

步骤1：包涵体蛋白的变复性。

将菌体沉淀重悬于20mL Lysis buffer(20mM Tris-HCL containing 1mM PMSFand bacteria protease inhibitor cocktaiL，pH值8.0)，超声破碎(功率400W，工作4s，间歇8s，共20min)。将超声破碎的细胞裂解液在4℃和10000r/min的条件下离心20min，收集沉淀。使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH值8.0)洗涤包涵体3次。用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH值8.0)，溶解包涵体后在4℃的条件下放置过夜，然后在室温和10000r/min的条件下离心15min获得蛋白溶液，将蛋白溶液滴加到含有20mM Tris-HCl、0.15M NaCl 且pH值8.0的缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于含有20mM Tris-HCl、0.15M NaCl且pH值8.0的缓冲液中透析过夜，获得包涵体复性溶液。

步骤2：融合蛋白的GST柱亲和纯化及结果分析。

利用低压层析系统，包涵体复性溶液以0.5mL/min流速上样至GST Binding-Buffer预平衡的GST亲和层析柱。以0.5mL/min的流速用GST Binding-Buffer冲洗，直至流出液体的OD280值到达基线，以1mL/min流速用GST ELution-Buffer(20mM Tris-HCL，50mMGSH，0.15M NaCL，pH值8.0) 洗脱目的蛋白，收集流出液。将收集的流出液加入透析袋中，使用含有20mM Tris-HCl、0.15M NaCl且pH值8.0的缓冲液进行透析过夜，然后进行12％ SDS-PAGE分析。

实施例5

对实施例3和实施例4中12％SDS-PAGE分析的方法如下：

步骤1：将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。配置12％的分离胶，混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层无水乙醇以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。配置浓缩胶，混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30min，聚合完全，配制出凝胶。

步骤2：将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块12％的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1×Tris-GLy电泳缓冲液。样品直接取80μL的样品，依次加上 20μL 5×buffer(含有β-巯基乙醇)，混匀，煮沸10min，在12000r/min 的条件下离心10min，备用。用移液枪取5μL处理过的样品溶液，依次加入到各凝胶凹形样品槽内，将marker加入到其中一个槽内，为区别两块板， marker可加在不同的孔槽中。将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好(以盖子盖严为准，盖子有两个小洞，这与电泳槽是对应的)。电压调至 80v保持恒压。待溴酚蓝在浓缩胶和分离胶界面压成一条直线后，调整电压至120v，溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，轻轻取下凝胶，放置于含有20mL染色液的器皿中。将器皿置于微波炉中，中火加热10min，取出置于摇床上，轻摇约0.5h，完成后染液回收并用水洗掉染液。取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可将器皿置于微波炉中，中火加热10min，置于摇床上，轻摇过夜，次日将胶放置于清水中，直至背景清楚为止。将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出，放到扫描仪上，拍照。即可得到结果。

实施例3中12％SDS-PAGE分析显示(请参阅图4)，用考马斯亮蓝染色显示条带，可见M为蛋白分子量标准，泳道1空载体，泳道2未诱导，泳道 3诱导，泳道4包涵体，泳道5上清。

实施例4中12％SDS-PAGE分析显示(请参阅图5)，M为蛋白分子量标准，泳道6纯化后的可溶性重组蛋白分子量大小为80KD，(serpin大小为54KD， GST标签蛋白为24KD)。

实施例6

纯化后的蛋白为青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂，对该蛋白进行western bLot鉴定分析，具体方法为：实施例5电泳结束后，将凝胶放置转膜液里浸泡5-10min，PVDF膜在甲醇中浸泡15s，膜成半透明状，在超纯水中冲洗一下，放入转膜液中转膜浸泡后转膜。电转结束后，取出膜用PBST洗涤4次，每次5min。然后置于37℃摇床封闭1h。PBST稀释一抗(感染青海血蜱，兔的阳性血清)，稀释体积3mL放于抗体孵育盒中在4℃的条件下过夜，一抗结束后，在37℃的条件下用PBST洗涤4次，每次5min；将羊抗兔IgG按1： 10000的比例用牛奶封闭稀释，膜在二抗中37℃1h，洗膜4次同上，加入BLC 显色。western bLot结果显示请参阅图6，纯化后的青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂在80KD(serpin大小为54KD，PGEX-4T-1载体的标签蛋白26KD)与一抗有特异性反应。

青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的氨基酸序列为：

实施例7

青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的特异性多克隆抗体的制备及鉴定，包括如下步骤：

步骤1：进行动物免疫，以青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫10只BALB/c 小鼠，按照100μg/次量进行皮下免疫，3周免疫1次。免疫3次后，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的效价，待效价＞1：50000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。

步骤2：进行抗体纯化，将氨基胶与青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，在4℃的条件下立即在PBS中透析过夜。

步骤3：纯化抗体间接ELISA效价检测，具体为：根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。用PBS包被液将青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂稀释并混匀后加入板条中，每孔100μL，4℃冰箱过夜。其中，包被抗原为丝氨酸蛋白酶抑制剂；包被浓度为1μg/mL，100μL/孔；包被缓冲液为PBS， pH值7.4。

包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μL封闭液，在37℃恒温箱中放置1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。纯化抗体按1：500 的比例稀释，2倍稀释，每孔100μL，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μL稀释好的酶标二抗(酶标二抗：山羊抗鼠-HRP，1：20000)，在37℃的恒温箱中保存1h。取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μL TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间。每孔加入100μL浓度为1M的HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm 读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值2.1倍的孔所对应的稀释度，定为该样品的效价。表13所示为ELISA检测效价结果，丝氨酸蛋白酶抑制剂 (Hqipin1)抗体效价在64K左右，获得纯化抗体得率＞0.9mg。

表13

步骤4：鉴定抗体纯度，对纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果请参阅图7。

需要说明的是，在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 青海大学

<120> 一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2040

<212> DNA

<213> 青海血蜱(Haemaphysails qinghaiensis)

<400> 1

gcgattatcc actacgctat ccttggccaa tctcgcttct ttggtgtggc ccatctttgg 60

gagaaataac acgggaaata agaagaagaa gaagacgaag gaggggacat tccaagcatg 120

ggtcagagga gcagccgaca cgtcggcccc gaagcgacgt ctttgcctac cggtgtcgcg 180

actccgacga ggagcgaaga cgccgtttct gtttccagcc ttaaggccac cgcgaccagt 240

ttgccggggg acggccgtcg actagccgaa ggatggtttg aagactttat accagactcg 300

gaggcggtca tgacccgcgg cctattccag ttgggcatcg accttcttcg agagctgcgc 360

cgctctgcga ccgacggtgg caacgtgctg ctctctccgt acgccgtggc cagcacctta 420

caagaacttc tcgttggcgc ccgaggagac accgccgagc agatcgccac cgtcctgcat 480

gttaaatcag ggcgacaagc caccccgtac ttcttggacc gtgatcggcg ccttcctacc 540

aggtggcgca gcgacgtcca cgcgcgcttc gacatggact acctgaacaa catccaccac 600

gagaagctcc tggccaccgt ggacacctcg tgctcggcgg agaagccgcc tgcgctcagg 660

cttgagcgct tcagctggga cttcgccggc gatgccgagc ggtgccggct cgagatcgac 720

cgctacgcgc ggacggacgc cagcgtcttc gcaccggatg agataatgcc gaaaggctgc 780

atcacgtcgt cgtctctggt atgcctgctg agtgtgctcg acttccgcgg ctcgtggagg 840

aacgccttcg acgactgcac ggccacccgc cagctcttct acgagtcggt cagggcgccc 900

accgcggtcg tgatgctaca ccagacgggt cacttccgcg tcgccacctg caacgacctg 960

cacgccacgg ccctcgaaat tccctaccag ccaccgggcc gcgggaccgc atgcagtcta 1020

gtctccaggg ctacgcatag cacaggatct tactcggtct ccgggacgag ctcaccggaa 1080

ggcggcatcc agacgcccac ctctcatctg atccgaggcc cggagctgtc gttggtgatt 1140

ttacttccca cggagaaaga tggtctttcc acgttggagg agaaacttac cagctacgct 1200

gccctgcgct gcctaagcca gctgaagccg cggggaaatg tccacatcag tctgcccatg 1260

tttagcatca agcaggttac cgagctcagt tcggccttgt ccgctctcgg tgtccgcgac 1320

gtcttcagcg accacgctga gctgtgggga accacggccg gacaagcacg ggtctccagc 1380

atgcggcacg ctgcagcctt ccagacttcg cagacgggcg gccgccacag gtcacgacaa 1440

ggtctccccc ttcagggcat tggttcaaag gtggtgcgca gcctcgtgtc actggtcaag 1500

gcgccgcacc cgagcatgga gttcacagtg gacaggccct ttgccttctt cgtagtctgc 1560

atgcacccgg acacgcttct cctcttgggc tccgtgcgaa agatcacgtg gtgaaagtgc 1620

ccctacgatg actttggtgc cgggacagtt cccaacgtcc gtcccatatt gcagcaagat 1680

gtgccttgct aaagtatttt tagatatcta taatcgcaat cgaagcgttt tcttcattcg 1740

ctgttttttt taaccaacgt gagttttatt gatggtgtga agcattcttc tatgtgttgt 1800

gtataaaagg tgttcacaga aagtacatgc ttagtgacgc tgcaaaaact atttctaggg 1860

aaggatgcag cactgctgaa ctatcgcaaa tgcctccccg gctttgtcat tttaacctta 1920

atcgtatcat tcgtatcgct gccaggggaa tgccaccttt gcttctccaa ttacgttata 1980

cattgttgtt cgttaatacc gttaaaggac atattttaga tttacggatg tttggtactt 2040

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> 青海血蜱(Haemaphysails qinghaiensis)

<400> 2

Ser Glu Ala Val Met Thr Arg Gly Leu Phe Gln Leu Gly Ile Asp Leu

1 5 10 15

Leu Arg Glu Leu Arg Arg Ser Ala Thr Asp Gly Gly Asn Val Leu Leu

20 25 30

Ser Pro Tyr Ala Val Ala Ser Thr Leu Gln Glu Leu Leu Val Gly Ala

35 40 45

Arg Gly Asp Thr Ala Glu Gln Ile Ala Thr Val Leu His Val Lys Ser

50 55 60

Gly Arg Gln Ala Thr Pro Tyr Phe Leu Asp Arg Asp Arg Arg Leu Pro

65 70 75 80

Thr Arg Trp Arg Ser Asp Val His Ala Arg Phe Asp Met Asp Tyr Leu

85 90 95

Asn Asn Ile His His Glu Lys Leu Leu Ala Thr Val Asp Thr Ser Cys

100 105 110

Ser Ala Glu Lys Pro Pro Ala Leu Arg Leu Glu Arg Phe Ser Trp Asp

115 120 125

Phe Ala Gly Asp Ala Glu Arg Cys Arg Leu Glu Ile Asp Arg Tyr Ala

130 135 140

Arg Thr Asp Ala Ser Val Phe Ala Pro Asp Glu Ile Met Pro Lys Gly

145 150 155 160

Cys Ile Thr Ser Ser Ser Leu Val Cys Leu Leu Ser Val Leu Asp Phe

165 170 175

Arg Gly Ser Trp Arg Asn Ala Phe Asp Asp Cys Thr Ala Thr Arg Gln

180 185 190

Leu Phe Tyr Glu Ser Val Arg Ala Pro Thr Ala Val Val Met Leu His

195 200 205

Gln Thr Gly His Phe Arg Val Ala Thr Cys Asn Asp Leu His Ala Thr

210 215 220

Ala Leu Glu Ile Pro Tyr Gln Pro Pro Gly Arg Gly Thr Ala Cys Ser

225 230 235 240

Leu Val Ser Arg Ala Thr His Ser Thr Gly Ser Tyr Ser Val Ser Gly

245 250 255

Thr Ser Ser Pro Glu Gly Gly Ile Gln Thr Pro Thr Ser His Leu Ile

260 265 270

Arg Gly Pro Glu Leu Ser Leu Val Ile Leu Leu Pro Thr Glu Lys Asp

275 280 285

Gly Leu Ser Thr Leu Glu Glu Lys Leu Thr Ser Tyr Ala Ala Leu Arg

290 295 300

Cys Leu Ser Gln Leu Lys Pro Arg Gly Asn Val His Ile Ser Leu Pro

305 310 315 320

Met Phe Ser Ile Lys Gln Val Thr Glu Leu Ser Ser Ala Leu Ser Ala

325 330 335

Leu Gly Val Arg Asp Val Phe Ser Asp His Ala Glu Leu Trp Gly Thr

340 345 350

Thr Ala Gly Gln Ala Arg Val Ser Ser Met Arg His Ala Ala Ala Phe

355 360 365

Gln Thr Ser Gln Thr Gly Gly Arg His Arg Ser Arg Gln Gly Leu Pro

370 375 380

Leu Gln Gly Ile Gly Ser Lys Val Val Arg Ser Leu Val Ser Leu Val

385 390 395 400

Lys Ala Pro His Pro Ser Met Glu Phe Thr Val Asp Arg Pro Phe Ala

405 410 415

Phe Phe Val Val Cys Met His Pro Asp Thr Leu Leu Leu Leu Gly Ser

420 425 430

Val Arg Lys Ile Thr Trp

435

Claims

1.一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如下所示：

SEAVMTRGLFQLGIDLLRELRRSATDGGNVLLSPYAVASTLQELLVGARGDTAEQIATVLHVKSGRQATPYFLDRDRRLPTRWRSDVHARFDMDYLNNIHHEKLLATVDTSCSAEKPPALRLERFSWDFAGDAERCRLEIDRYARTDASVFAPDEIMPKGCITSSSLVCLLSVLDFRGSWRNAFDDCTATRQLFYESVRAPTAVVMLHQTGHFRVATCNDLHATALEIPYQPPGRGTACSLVSRATHSTGSYSVSGTSSPEGGIQTPTSHLIRGPELSLVILLPTEKDGLSTLEEKLTSYAALRCLSQLKPRGNVHISLPMFSIKQVTELSSALSALGVRDVFSDHAELWGTTAGQARVSSMRHAAAFQTSQTGGRHRSRQGLPLQGIGSKVVRSLVSLVKAPHPSMEFTVDRPFAFFVVCMHPDTLLLLGSVRKITW。

2.根据权利要求1所述的一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，编码所述青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列有正确的开放阅读框。

3.根据权利要求2所述的一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，根据所述基因序列设计特异性引物，进行青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的cDNA序列全长扩增及克隆。

4.根据权利要求3所述的一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述特异性引物包括正向引物M5F2：5'-TCCAAGCATGGGTCAGAGGAGC-3'和反向引物M5R1：5'-TCACCACGTGATCTTTCGC-3'。

5.根据权利要求2所述的一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂通过如下步骤制备：将编码该蛋白的基因序列的开放阅读框部分与大肠杆菌表达载体构建重组表达质粒pGEX-4T-1-serpin，转化至大肠杆菌中，然后筛选高抗性的转化子并且过夜诱导，收集诱导表达的菌液，分离纯化后获得青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂。

6.根据权利要求1所述的一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的多克隆抗体，其特征在于，包括如下制备步骤：

用纯化青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫BALB/c小鼠3次，使用抗原亲和纯化的方法获得针对青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的多克隆抗体。