CN117045780A - 一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用，涉及生物工程技术领域，褐黄血蜱唾液腺蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该褐黄血蜱唾液腺蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种包括褐黄血蜱唾液腺蛋白的抗蜱疫苗，以及一种褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法。褐黄血蜱唾液腺蛋白制备的抗蜱疫苗能够明显提高动物体内特异性IgG抗体水平，并能同时引起Th1型和Th2型免疫反应，具有良好的抗蜱效果，并且对脊椎动物宿主无副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用。
背景技术
蜱是一种常见的动物体表寄生虫，也是多种动物疾病的传播媒介。褐黄血蜱（Haemaphysalis flava）属于硬蜱科血蜱属，可寄生在犬、猫、山羊、刺猬、野猪以及鸟类体表，同时它也是危害野生大熊猫的优势蜱种。据报道褐黄血蜱能够携带立克次体（Rickettsia rickettsii）、贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）、埃氏疏螺旋体（Borrelia afzelii）和无形体（Anaplasma）等诸多病原体，引起宿主或人类感染多种疾病，对动物和人类健康造成极大威胁。化学防控是控制蜱和蜱传疾病有效方法，但大量使用化学药物可导致耐药蜱的产生以及环境的污染问题，相比之下抗蜱疫苗更加环保并且能有效减少蜱的数量，是替代化学杀虫剂控制蜱感染和病原传播的有效方法。
AV422蛋白是一种保守蜱唾液腺蛋白，其能在蜱的吸血过程中起到抑制血液凝固的作用，并且AV422蛋白是蜱虫体内独有的一种蛋白，在其它节肢动物和脊柱动物体内没有同源物，这可能意味着当该蛋白作为疫苗靶向抗原时，对脊椎动物宿主可能不会产生副作用。有研究发现篦子硬蜱（Ixodes ricinus）重组蛋白rIrAV422能够与感染过网纹革蜱（Dermacentor reticulatus）的大鼠血清和有过蜱虫感染史的猎犬和人血清发生交叉反应，表明AV422蛋白具备交叉免疫反应性特征。
有研究报道长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）甘肃株P27/30基因的核苷酸序列和氨基酸序列与长角血蜱日本Okayama株、长角血蜱四川孤雌生殖株均存在差异，推测蜱株的地域性分布差异可能导致虫株之间的氨基酸序列存在一定的差异。因此，加大褐黄血蜱唾液腺蛋白HfAV422在抗蜱疫苗中的研究对动物保护和人类健康有重要的意义。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用，褐黄血蜱唾液腺蛋白制备的抗蜱疫苗能够明显提高动物体内特异性IgG抗体水平，并能同时引起Th1型和Th2型免疫反应，具有良好的抗蜱效果，并且对脊椎动物宿主无副作用。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用，褐黄血蜱唾液腺蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，编码褐黄血蜱唾液腺蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种抗蜱疫苗，包括褐黄血蜱唾液腺蛋白。
本发明还提供一种褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）提取褐黄血蜱的总RNA作为模板进行反转录，得cDNA；
（2）设计引物，以步骤（1）所得cDNA为模板进行PCR扩增，得褐黄血蜱唾液腺蛋白基因；
（3）将步骤（2）所得褐黄血蜱唾液腺蛋白基因插入pMD19-T载体，转化至DH5α感受态细胞，得阳性克隆菌；
（4）将步骤（3）所得阳性克隆菌进行扩大培养并提取质粒，然后酶切获得目的基因片段，再用T4连接酶连接表达载体，得重组载体；
（5）用步骤（4）所得重组载体转化BL21感受态细胞，并通过诱导剂IPTG诱导表达；
（6）对诱导表达的蛋白质进行纯化，得褐黄血蜱唾液腺蛋白。
进一步，步骤（2）中，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
进一步，步骤（4）中，表达载体为pET32a(+)。
进一步，步骤（5）中，感受态细胞为BL21感受态细胞。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、将褐黄血蜱唾液腺蛋白应用于抗蜱疫苗，能够明显提高动物体内特异性IgG抗体水平，并能同时引起Th1型和Th2型免疫反应，具有良好的抗蜱效果。
2、AV422蛋白具备交叉免疫反应性特征，本发明褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法制备的褐黄血蜱唾液腺蛋白rHfAV422，具有开发为控制不同蜱种的抗蜱疫苗的潜力。
3、AV422蛋白是蜱虫体内独有的一种蛋白，在其它节肢动物和脊柱动物体内没有同源物，本发明褐黄血蜱唾液腺蛋白rHfAV422作为疫苗靶向抗原，对脊椎动物宿主不会产生副作用。
4、使用抗蜱疫苗诱导宿主产生针对蜱虫和蜱媒病原体感染的免疫保护是一种经济有效的替代方法，可以减少化学杀虫剂的使用和耐药蜱的产生，将褐黄血蜱唾液腺蛋白应用于抗蜱疫苗既能直接预防蜱类的感染，又能通过蜱摄取宿主体内的抗体与蜱体内靶蛋白相互作用后破坏靶蛋白的功能，从而影响蜱的摄食、蜕皮和繁殖来控制蜱的数量。
附图说明
图1为褐黄血蜱HfAV422基因扩增片段电泳图；
图2为HfAV422蛋白氨基酸序列与其他蜱种的多序列比对；
图3为双酶切产物电泳图；
图4为rHfAV422重组蛋白的可溶性分析；
图5为纯化后的rHfAV422重组蛋白凝胶电泳图；
图6为rHfAV422重组蛋白的免疫印迹；
图7为免疫组和对照组兔血清中特异性IgG抗体水平的变化；
图8为免疫后兔血清中细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ分析结果。
具体实施方式
本发明下列实施方式所用试剂和仪器如下：
RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）：北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒(Prime Script™RT reagent Kitwith gDNA Eraser)：成都福际生物技术有限公司；T4连接酶和Quick Cut TM限制性内切酶sacI/xhoI/BamHI/HindⅢ：大连宝生物有限公司；HRP-标记山羊抗兔IgG：武汉博士德生物工程有限公司；Rabbit IL-2、IL-4和IFN-γ ELISA Kit 试剂盒，购自江苏酶免实业有限公司。
PCR仪，凝胶成像分析系统和蛋白质电泳仪：美国Bio-Rad公司；中高压蛋白纯化系统：美国Cytiva公司；控温摇床（HZQ-100）：哈尔滨东联电子技术开发有限公司。
所有数据均使用SPSS22.0软件进行统计分析，并利用GraphPadPrism5.0.1软件进行图表制作。计算试验中结果中的平均值，采用单因素方差分析确定其显著性，所有数据以平均±标准差(SD)表示，当P＜0.05时考虑有显著性差异。
实施例1
一种重组褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）将褐黄血蜱饥饿幼蜱按照提取总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA作为模板，使用反转录试剂盒进行反转录，得cDNA，并于-80℃保存。
（2）从褐黄血蜱转录组数据获取褐黄血蜱HfAV422的CDs序列进行生物信息学分析，切除信号肽和跨膜区后然后利用Primer 6.0软件进行引物设计，引物的核苷酸序列如SEQ NO ID.2和SEQ NO ID.3所示，然后进行扩增，得褐黄血蜱HfAV422基因。褐黄血蜱HfAV422基因扩增片段电泳结果如图1所示，其中，M泳道为DNA分子质量标准，其他泳道为扩增片段。
由图1可知，通过扩增成功获得了褐黄血蜱HfAV422基因扩增片段。
将褐黄血蜱HfAV422基因序列翻译成氨基酸序列与其他蜱种的多序列比对，如图2所示，其中，从上到下依次为褐黄血蜱四川株H.flava Sichuan strain、褐黄血蜱湖南株H.flava Hunan strain、美洲花蜱A.americanum、变异花蜱A.variegatum、篦子硬蜱I.ricinus、长角血蜱H.longicornis。
由图2可知，克隆得到的HfAV422基因序列翻译成氨基酸序列与褐黄血蜱湖南株的氨基酸序列比对存在一定差异，相似度为96.68%；与美洲花蜱、变异花蜱氨基酸序列相似度较高均在90%以上；与篦子硬蜱氨基酸序列的相似度较低为85.99%。
（3）将步骤（2）所得褐黄血蜱唾液腺蛋白基因插入pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，得阳性克隆菌。
（4）将步骤（3）所得阳性克隆菌进行扩大培养并提取质粒，然后使用BamⅠ和HindⅢ快切酶双酶切获得目的基因片段。双酶切产物电泳图如图3所示，其中，M泳道为DNA分子质量标准，1和2泳道为双酶切产物。再用T4连接酶连接至pET32a(+)表达载体，得重组载体。
由图3可知，双酶切产物电泳产生两个条带，分别为pMD19-T载体骨架和HfAV422基因的目的片段。
（5）将重组载体转入BL21感受态细胞中，挑取单个菌落接种于1L含氨苄抗性的培养液中，37℃摇床培养至菌液OD590为0.6后加入诱导剂IPTG（1 mmol/L），37℃诱导12 h（160 r/min）。随后进行可溶性分析，取收集的上清和沉淀制样进行SDS-PAGE电泳，分析两种蛋白可溶性表达情况，结果如图4所示，其中，M泳道为蛋白质分子量标记（kDa），1泳道为重组菌诱导表达后菌体裂解物上清，2-4泳道分别为菌体裂解物先后溶解于2M、4M、8M尿素。
由图4可知，rHfAV422重组蛋白在37℃、1mmol/L浓度的IPTG的条件下诱导24h后能够大量表达，重组蛋白主要表达在包涵体中。
（6）用镍离子亲和层析方法对诱导表达的蛋白质进行纯化，得褐黄血蜱唾液腺蛋白。
将该纯化后的重组褐黄血蜱唾液腺蛋白rHfAV422经凝胶电泳分离，结果如图5所示，其中，M泳道为蛋白质分子量标记（kDa），1-2泳道为经纯化的rHfAV422重组蛋白。
由图5可知，纯化后的蛋白均为单一条带，表明纯化后成功获得高纯度的rHfAV422重组蛋白。
将rHfAV422重组蛋白进行免疫印迹分析，以1:100稀释的褐黄血蜱阳性兔血清作为一抗，以1:2000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG作为二抗，结果如图6所示，其中，M泳道为蛋白质分子量标记（kDa），1泳道为感染褐黄血蜱兔阳性血清识别rHfAV422重组蛋白，2泳道为阴性血清识别rHfAV422重组蛋白。
由图6可知，rHfAV422重组蛋白能识别阳性血清，具有良好的免疫反应性。
实验例1重组蛋白免疫保护性试验
1. 试验分组及免疫程序
试验动物分组和免疫程序如表1所示，将14只新西兰兔随机分为两组，皂素对照组6只，蛋白组8只。将新西兰兔通过颈部皮下注射进行免疫，按表中剂量免疫两次，间隔14天。
表1试验动物分组和免疫程序
2. 褐黄血蜱幼蜱的感染
在第二次免疫后间隔一周，将褐黄血蜱幼蜱感染于兔耳部。每只兔感染100只幼蜱，为了方便收集饱血幼蜱，每只耳朵固定耳袋，并套上伊丽莎白圈。攻虫24 h后观察幼蜱感染情况并且计数，之后每天观察并收集饱血幼蜱，并将饱血蜱放入湿润的培养皿中并在温度为26±1℃的条件下进行蜕皮。统计rHfAV422蛋白对幼蜱摄食和蜕皮参数的影响，包括对饱血幼蜱进行计数、称重以及观察其蜕皮情况，并计算抗幼蜱免疫效果，结果如表2所示。
幼蜱的免疫效果计算方法：抗幼蜱免疫效果=（1-Ra×Rb）%，Ra代表免疫组平均饱血蜱数量与皂素对照组平均饱血蜱数量的比值，Rb代表免疫组蜕皮率与皂素对照组蜕皮率的比值。
表2 rHfAV422蛋白对幼蜱摄食和蜕皮参数的影响
注：数据以mean±standard deviation（SD）表示。每一列不同字母标注的数据间存在显著性差异（P＜0.05），相同字母标注的数据间不存在显著性差异（P＞0.05）。
由表2可知，rHfAV422免疫组的幼蜱饱血率和蜕皮率（64.78%和63.29%）与皂素对照组的饱血率和蜕皮率同样存在显著性差异（P＜0.05）。rHfAV422蛋白的抗蜱效力为50.00%，而免疫组与皂素对照组的幼蜱饱血体重无明显差异，表明将HfAV422蛋白应用于疫苗中有良好的抗蜱效果。
3. 抗体水平检测
在第一次免疫前和免疫后每周固定时间以及攻虫后一周采集兔血并分离血清，使用间接ELISA方法检测IgG抗体水平（蛋白稀释比1:100，二抗稀释比1:3000），结果如图7所示，其中，由上到下依次为rHfAV422免疫组IgG抗体水平和皂素对照组IgG抗体水平。
由图7可知，皂素对照组在免疫前后血清中平均IgG抗体水平一直维持在较低水平，而rHfAV422免疫组在免疫后血清中的平均IgG抗体水平明显升高，其平均水平显著高于皂素对照组的特异性IgG抗体水平（P＜0.05），并且在攻虫后一周的抗体同样保持较高水平。
4. 细胞因子检测
按照试剂盒说明书对攻虫后一周兔血清进行细胞因子（IL-2、IL-4和IFN-γ）测定。细胞因子水平分析结果如图8所示，其中，从左到右分别为IL-2、IL-4和IFN-γ细胞因子显著性差异分析图，不同的字母标注的数据间存在显著差异（P<0.05），相同字母标注的数据间不存在显著差异（P＞0.05）。
由图8可知，rHfAV422免疫组IL-2和IL-4水平与皂素对照组存在显著性差异，IFN-γ无明显差异。
IL-2、IL-4和IFN-γ在宿主免疫反应中发挥重要作用，其中IL-2和IFN-γ主要是由Th1细胞分泌，介导细胞免疫应答；IL-4是由Th2细胞分泌，它可促进B细胞分化和抗体的产生。研究显示蜱唾液腺能促进IL-4上调使细胞因子向Th2型极化。蜱在自然感染宿主过程中主要是引起Th2型免疫反应，其可能是因为蜱在叮咬宿主时从蜱唾液腺中分泌蛋白进入宿主体内引起IL-4、IL-10等相关因子的上调，诱导宿主Th2型免疫反应。在璃眼蜱（Hyalomma）rHaa86对杂交牛的免疫应答中发现rHaa86体外刺激免疫后不同时间段的外周血液淋巴细胞，IFN-γ表达水平均无明显变化，这可能是因为该重组蛋白引起了宿主Th2型免疫反应。不过有研究显示向兔注射重组IL-2后表现出更强的抗蜱能力，能够有效降低篦子硬蜱（Ixodes ricinus）成蜱的饱血能力以及产卵重量，因此细胞免疫在蜱的免疫应答中同样扮演重要角色。本次试验结果显示免疫组的产生的IFN-γ水平与皂素对照组无明显差异，但IL-2浓度水平、IL-4浓度水平都与皂素对照组存在显著性差异，这表明rHfAV422重组蛋白能够同时引起Th1型和Th2型免疫反应。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (7)
1. 一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用，其特征在于，所述褐黄血蜱唾液腺蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述褐黄血蜱唾液腺蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种抗蜱疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白。
4.一种权利要求1所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取褐黄血蜱的总RNA作为模板进行反转录，得cDNA；
（2）设计引物，以步骤（1）所得cDNA为模板进行PCR扩增，得褐黄血蜱唾液腺蛋白基因；
（3）将步骤（2）所得褐黄血蜱唾液腺蛋白基因插入pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，得阳性克隆菌；
（4）将步骤（3）所得阳性克隆菌进行扩大培养并提取质粒，然后酶切获得目的基因片段，再用T4连接酶连接表达载体，得重组载体；
（5）用步骤（4）所得重组载体转入感受态细胞，并通过诱导剂IPTG诱导表达；
（6）对诱导表达的蛋白质进行纯化，得褐黄血蜱唾液腺蛋白。
5.如权利要求4所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.如权利要求4所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述表达载体为pET32a(+)。
7.如权利要求4所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述感受态细胞为BL21感受态细胞。
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