CN111116727B

CN111116727B - 柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111116727B
Application number: CN202010036894.5A
Authority: CN
Inventors: 刘群; 宋星桔; 刘晶; 杨旭; 许建海
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN111116727A

Abstract

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41及其制备方法和应用。该蛋白是新发现的、柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达的蛋白，是与子孢子入侵宿主细胞相关蛋白，该蛋白的氨基酸序列包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。将EtROP41基因与大肠杆菌表达载体相连获重组表达载体，在大肠杆菌中表达重组EtROP41蛋白，将重组蛋白纯化并与佐剂混合，制得鸡柔嫩艾美耳球虫ROP41重组蛋白疫苗，该疫苗免疫雏鸡后能有效抵抗柔嫩艾美耳球虫感染，提高雏鸡存活率、增高雏鸡的相对增重率、减少球虫卵囊排出量，是一种新的具有良好免疫保护效果的重组蛋白疫苗，具有作为预防鸡柔嫩艾美耳球虫病疫苗研发的潜力。

Description

柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41及其制备方法和应用

技术领域

本发明是关于生物兽药技术领域，特别是关于一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41及其制备方法和应用。

背景技术

鸡球虫病是一种以肠道病变为主的寄生原虫病，是集约化养鸡场最常见的疾病之一，呈世界性分布，鸡球虫病的发病率高达50-70％，死亡率为20-30％，严重时高达80％，给养鸡业带来巨大经济损失，美国农业部将该病列为对禽类危害最严重的五大疾病之一。世界公认的鸡球虫有7种，其中寄生于盲肠中的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)致病性最强，危害最严重。

目前，球虫病的防控主要是依靠抗球虫药物和活疫苗，但由于球虫耐药性、药物残留和环境毒性等问题，抗球虫药物的使用受到了很大限制。鸡球虫病活毒疫苗常指由分离虫株制作的活毒苗，国内外已有数个产品注册使用，免疫保护力较强，但由于疫苗虫株即为分离毒株，存在一定的安全隐患。鸡球虫病早熟弱毒苗是经过人工选育的早熟弱毒虫株组成的活疫苗，具有代表性的产品是英国的

和捷克的

与强毒苗相比，弱毒苗的免疫效力与其相当，致病力较低，安全性较高。上述两大类球虫疫苗的生产均须在鸡体内进行，且早熟弱毒株的繁殖能力显著低于强毒株，致使生产成本更高，销售价格也随之提高。两类疫苗均为活疫苗，对其的保存、运输、使用以及管理要求均较高，限制了这两类疫苗的应用；弱毒活疫苗成本更高，目前主要用于种鸡。由于活疫苗生产和使用中存在的种种问题，人们一直致力于亚单位疫苗的研发，但迄今为止，仅有

球虫疫苗上市，该疫苗是由巨型艾美耳球虫配子体的天然蛋白制备而成，主要成分是提取的巨型艾美耳球虫的配子体天然蛋白EmGAM56、EmGAM82和EmGAM230，有较好的母源免疫效果；但由于

主要是从球虫配子体阶段提取的天然蛋白，存在抗原提取纯化流程复杂，抗原来源不稳定，生产成本高，难以标准化等问题，所以未得到广泛应用。近年来，应用基因工程技术构建的重组蛋白疫苗证实可以诱导宿主产生较强的免疫保护力，一定程度地抵抗包括球虫在内的多种疾病。重组蛋白疫苗与强毒苗、弱毒苗以及天然蛋白疫苗相比，具有安全性高、生产成本低、易于纯化、稳定性好、便于保存和运输等优点，是疫苗研发的新方向。

筛选到高效的抗原是研制鸡球虫病重组蛋白疫苗的关键因素，也是本发明的切入点。近年来，已经有多种柔嫩艾美耳球虫的保护性抗原见诸研究报道，如柔嫩艾美耳球虫IMP1和CD40 L重组蛋白免疫鸡后,鸡只产生较好的体液和细胞免疫应答，盲肠病变记分和体增重优于佐剂免疫组；柔嫩艾美耳球虫的重组RHO1蛋白免疫鸡后,被免疫鸡的IL–2和IFN-γ的表达水平以及CD4+T、CD8+T细胞的比例显著高于未免疫组,攻虫后免疫组鸡只的保护效率达到77.3％；用重组蛋白rEF-1α免疫雏鸡后攻虫，雏鸡的卵囊排出量减少70％左右。还有多位研究者分别报道了柔嫩艾美耳球虫的TA4、SO7、3-1E、SAG、HSP70、MIC1、MIC2和5401等一系列重组蛋白作为免疫抗原的研究，均具有一定免疫效果，但大多数重组蛋白的保护效果有限，主要原因是它们的免疫原性低或在虫体发育过程中的表达较低。由此可见，不同的重组蛋白虽然能够在不同程度上诱导机体产生免疫反应，具有一定的抗球虫作用，但作为预防鸡球虫病的疫苗尚有一定的局限性，因此至今尚没有商品化的鸡球虫病重组蛋白疫苗，鸡球虫病重组蛋白疫苗还处于探索研究阶段。

球虫均具有棒状体、微线体和致密颗粒三种重要的分泌细胞器，它们分泌大量功能蛋白，在虫体的入侵、发育及繁殖过程中发挥重要作用。迄今为止，也还没有对艾美耳球虫棒状体蛋白的研究报道。因此，筛选该艾美耳球虫棒状体蛋白并对其免疫保护效果进行评价，将对鸡球虫病重组蛋白疫苗的应用具有重大意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41(rhoptry protein，ROP41)，该蛋白是新筛选到的、在柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达的蛋白，其是由棒状体分泌的、在柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞和繁殖过程中发挥重要作用。筛选到该高效的抗原蛋白是研制鸡球虫病重组蛋白疫苗的关键因素。

为实现上述目的，本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41，命名为EtROP41(由于其氨基酸序列与弓形虫棒状体蛋白41(TgROP41)同源性最近，因此命名为EtROP41)，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41，命名为EtROP41，具有SEQ IDNO.1中的部分氨基酸序列，该部分氨基酸序列能够表达出活性蛋白质片段。

在本发明的一实施方式中，编码该柔嫩艾美尔球虫棒状体蛋白41的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了用于扩增上述核苷酸序列的引物，具有以下序列：上游引物：AGCAAATGGGTCGCGGATCCGAACCTCCCCGAGTCAACCT(SEQ ID NO.3)，下游引物：TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTATCCTGGAACTCCCTGGACACC(SEQ ID NO.4)。

本发明还提供了一种重组载体，包含上述核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组蛋白，包含上述氨基酸序列。

本发明还提供了一种重组蛋白疫苗，包括上述重组蛋白和佐剂。

本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：基因扩增：通过上述引物以柔嫩艾美尔球虫子孢子的cDNA为模板扩增出EtROP41基因序列；重组载体构建：将扩增出的EtROP4基因序列与pET-28a骨架构建重组载体；以及重组蛋白表达：将上述重组载体通过IPTG进行诱导表达(具体的，表达载体转化表达菌Transetta(DE3)，表达菌接种于1L的新鲜LB(含AMP 100μg/mL)培养液中，37℃摇床培养4h(170r/min)，至菌液OD_600nm值约为1后加入诱导剂IPTG(0.2-1.6mmol/L)，37℃诱导5h-24h(160r/min))，并通过Western bloting鉴定，即得。Western-blot分析显示该重组蛋白具有良好的抗原性。免疫保护实验显示，将该重组蛋白作为免疫原与佐剂混合后免疫雏鸡，具有良好的免疫保护效果，可用于预防鸡柔嫩艾美耳球虫病。

本发明还提供了一种能够与上述柔嫩艾美尔球虫棒状体蛋白41特异性结合的抗体或血清，该抗体是用100μg上述重组蛋白免疫BALB/c小鼠而制得的多克隆抗体。

本发明还提供了上述柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41在制备预防鸡球虫病疫苗中应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明在ToxoDB数据库中，通过New serach-Genes-Transcriptomics-RNASeqEvidence筛选出子孢子阶段高表达的蛋白，通过预测这些蛋白的分子量、信号肽、B细胞及T细胞抗原表位，以分子量在20-100kDa、有信号肽、各阶段表达量大、抗原表位多的分泌蛋白作为筛选依据，在ToxoDB数据库中筛选到EtROP41蛋白。

(2)本发明进一步通过上述获取的柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41(EtROP41)的基因信息，成功表达、鉴定并纯化EtROP41重组蛋白，并对其免疫保护效果进行评价，发现该重组蛋白具有表达量大、可溶性表达、易表达和纯化、保存方便等优点，并具有良好的免疫保护效果，具有作为鸡的柔嫩艾美耳球虫病重组蛋白疫苗的潜力，有利于重组蛋白疫苗的开发应用。

附图说明

图1是根据本发明一实施方式的柔嫩艾美耳球虫EtROP41基因扩增产物电泳鉴定图；

图2是根据本发明一实施方式的EtROP41重组蛋白表达及纯化的SDS-PAGE图；

图3是根据本发明一实施方式的EtROP41蛋白免疫原性分析的Western-blot图；

图4是根据本发明一实施方式的EtSAG，、EtSAG2和EtSAG16重组蛋白表达及纯化的SDS-PAGE图。

主要附图标记说明：

1-诱导后菌液；2-菌液超声裂解并离心后上清；3-菌液超声裂解并离心后包涵体；4-纯化并浓缩后的蛋白；5-其他蛋白多克隆抗体；6-EtROP41多克隆抗体；7-阴性血清；8-鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清；9-纯化并浓缩后的EtSAG16蛋白；10-纯化并浓缩后的EtSAG蛋白；11-纯化并浓缩后的EtSAG2蛋白。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本发明所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

E.coli Transetta(DE3)菌株：购自北京全式金生物技术有限公司。

E.coli DH5α菌株：购自北京聚合美生物技术有限公司。

高保真酶，Taq酶：购自购自南京诺唯赞生物技术有限公司。

多片段连接试剂盒，反转录试剂盒：购自北京全式金生物技术有限公司。

镍亲和层析填料：购自美国novagen公司。

表达载体pET-28a(+)：本实验室保存。

弗氏佐剂(完全佐剂，不完全佐剂):Sigma-aldrich，USA。

6～8周龄雌性BALB/c小鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司。

SPF雏鸡：购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司。

柔嫩艾美耳球虫：由中国农业大学大学兽医寄生虫学实验室分离、鉴定并保存。

以下通过实施例1-4对EtROP41重组蛋白的制备、抗原性、以及免疫保护效果进行具体描述。

实施例1：EtROP41重组蛋白的制备

本发明中所述的鸡柔嫩艾美耳球虫的EtROP41蛋白在ToxoDB数据库中的登录号为ETH_00005405(https://toxodb.org/toxo/app/record/gene/ETH_00005405)，编码该蛋白的基因片段序列长为1527bp。

1.EtROP41基因的克隆和重组质粒的构建

设计引物扩增EtROP41基因，引物如下表所示：

表1

以柔嫩艾美耳球虫子孢子的cDNA为模板，对EtROP41进行扩增，反应体系如下：

表2

PCR反应条件：94℃预变性10min，进行30轮循环，循环包括94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸90s，终延伸72℃10min。PCR产物取样进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定其是否扩增成功(结果见图1)。将与目的片段大小相符的PCR产物利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。

利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒(ClonExpressTMMultiS One StepCloning Kit)连接EtROP41片段和pET-28a骨架构建重组质粒，具体反应体系如下：

表3

2.EtROP41重组蛋白的表达

将上述重组质粒转入表达感受态Transetta(DE3)中，冰浴30min，42℃热激1min，冰浴3-5min，加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃摇菌1h，取100-200μl菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养。次日挑取单个菌落，加入含有卡那霉素的LB液体培养基37℃培养至对数生长期(OD_600nm值约为1)，加入IPTG，使其终浓度为0.8mM。继续培养12h后，将菌液8000rpm 4℃离心20min，收集菌体沉淀，超声破碎菌体，将破碎后的菌体裂解液在4℃条件下离心10min(12,000rpm)，分离沉淀与上清，沉淀加入适量的8M尿素溶解。上清和沉淀各取40μL，分别加10μL 5×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸10min，离心10min(12,000rpm)，进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白是否为可溶性表达。IPTG浓度在0.2-1.6mM之间、诱导时间为5h-24h时均能大量表达，EtROP41蛋白表达于上清中，诱导表达条件要求低，可见EtROP41重组蛋白的表达条件要求低且表达量大。将表达于上清的EtROP41-His用镍亲和层析法纯化，纯化效果好，结果见图2。

实施例2：EtROP41抗原性的鉴定

1.多克隆抗体的制备

EtROP41-His重组蛋白加同体积弗氏完全佐剂乳化后，按照100μg/只剂量首次免疫BALB/c小鼠；用重组蛋白加弗氏不完全佐剂乳化，按照50μg/只剂量免疫BALB/c小鼠；再用弗氏完全佐剂乳化，照50μg/只剂量免疫BALB/c小鼠，进行第二次和第三次免疫，每次免疫间隔14天，分别于二免和三免后10天眼眶采集血液、分离血清，用ELISA检测抗体滴度，当滴度达到10⁶以上，摘小鼠眼球，采血、分离血清，制备鼠源EtROP41多抗血清。

2.鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清的制备

以鸡柔嫩艾美耳球虫2000个孢子化卵囊/只经口接种3周龄SPF鸡，间隔2周后再次接种相同剂量卵囊，14天后采集血液、分离血清并检测抗体滴度，制备鸡柔嫩艾美耳球虫的阳性血清。

3.EtROP41抗原性的鉴定

取重组EtROP41-His蛋白进行SDS-PAGE，随后电转移至PVDF膜上，分别用鼠源EtROP41-His重组蛋白多抗血清和鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清进行Western-blotting分析。结果显示，EtROP41蛋白可与两种血清均能反应，并呈现单一条带(图3)，证实重组EtROP41-His蛋白具有良好的抗原性。

实施:3：鸡柔嫩艾美耳球虫EtROP41重组蛋白的免疫保护效果的评价

1.鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的制备

用5只14日龄无球虫感染鸡，分别经口接种1×10⁴个孢子化E.tenella卵囊，感染后144h后连续3天收集粪便，，用饱和盐水漂浮法收集卵囊；将收集的卵囊置于27℃摇床培养，期间吸取适量卵囊液镜检，观察孢子化程度，当95％球虫卵囊完成孢子化后，停止培养，计数卵囊量，标记并置于4℃保存备用。

2.重组蛋白疫苗的免疫保护效果评价

2.1免疫及攻虫程序

购买30只1日龄SPF雏鸡，淘汰体重偏低或偏高的鸡，将30只鸡随机分为3组，每组10只鸡，第一组为佐剂免疫非攻虫对照组(阴性对照组)、第二组为佐剂免疫攻虫组(阳性对照组)、第三组为EtROP41-His重组蛋白免疫攻虫组。饲养至14日龄进行首次免疫，第一组和第二组的首免用弗氏完全佐剂，二免用弗氏不完全佐剂免疫，第三组首免用EtROP41-His重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1混合制备乳剂进行免疫，二免用EtROP41-His重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1:1混合制备乳剂进行免疫，重组蛋白免疫剂量为100μg/羽。第21日龄进行二免，剂量同上。免疫途径均采用鸡腿部肌肉注射。鸡只饲养至28日龄时，逐只称重，然后经口服接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1×10⁴个/羽。逐日观察，记录鸡只的精神状态、临床表现以及死亡情况。至鸡只34日龄时，再次称重，每组剖杀6只鸡进行盲肠病变记分；至39日龄时，收集每组剩余鸡只的粪便，进行卵囊计数。具体免疫及攻虫程序见表4。

表4

2.2重组蛋白疫苗的免疫保护效果

1)存活率：攻虫后各组鸡只的死亡情况。结果见表5，与对照组相比，免疫重组蛋白组的鸡攻虫后，雏鸡的临床症状减轻，死亡率显著降低，说明重组蛋白免疫能有效地减少鸡抵抗柔嫩艾美尔球虫病。

表5

2)增重:分别于免疫、攻虫和剖杀时对鸡逐只称重，记录免疫时、攻虫前以及攻虫后到宰杀时鸡的体重变化，计算鸡只的平均增重和相对增重率。比较各组鸡只的攻虫后增重的变化。

增重＝(宰杀时重-攻虫时重)/只

相对增重率(％)＝(实验组增重/非免疫非攻虫组增重率)×100

各组鸡的平均增重和相对增重率见表6。结果显示，EtROP41-His重组蛋白免疫攻虫组与佐剂免疫攻虫组之间的平均增重和相对增重率差异极显著(P<0.01)，免疫组的鸡只相对增重率达47.2％，免疫佐剂组鸡只相对增重率是-45.5％，说明免疫EtROP41-His重组蛋白能有效预防鸡只感染球虫后导致的增重下降。

表6

注：与非免疫攻虫组相比，*P<0.05,差异显著；**P<0.01,差异极显著

3)盲肠病变记分：在鸡只攻虫后第6天，称重，每组剖杀6只鸡，按Johnson方法进行盲肠病变记分，记分标准如下：

0:未见病变。

+1:盲肠壁散在极少数的点状出血斑，肠壁不增厚，内容物正常。

+2:盲肠内容物混有少量血液，肠壁稍肥厚，可见很多出血病灶。

+3:盲肠内大量血液或盲肠凝块(凝血或灰白色的栓芯)，盲肠壁肥厚，盲肠明显地变形或萎缩。

+4:盲肠显著萎缩，病变延伸至直肠。盲肠壁极度肥厚，盲肠内容物为凝血或栓芯。

如两侧病变不一致，以病变严重的一侧为准。

病变值＝各组平均病变记分×10

各组的病变记分见表7。由表看出，佐剂免疫攻虫组与佐剂免疫非攻虫组之间盲肠病变记分差异明显，说明攻虫成功。佐剂免疫攻虫组鸡盲肠病变最明显，平均病变记分达4；重组蛋白EtROP41免疫组病变记分为2.9，与佐剂免疫攻虫组的盲肠病变记分差异显著(P<0.05)，表明重组蛋白免疫后对鸡柔嫩艾美耳球虫感染有较好的保护效果，有效减轻球虫对鸡盲肠粘膜造成的损伤。

表7

4)卵囊计数：按麦克马斯特法进行卵囊计数，具体方法为：收取攻虫后6-11天的鸡粪便，加入适量的2.5％的重铬酸钾，充分搅拌粪便，称量粪便总重，用50毫升离心管在不同的三个位置各取三份粪便样品，再次混匀所取得的三份粪便样品，每份称取2g，放入100毫升烧杯，先加10mL饱和食盐水混匀，再加50mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满两个计数室，静止2min，镜检计数。克粪便卵囊数(OPG)＝两侧计数室卵囊总量×100。

卵囊排出量＝OPG×粪便总重(克)

卵囊减少率(％)＝(佐剂免疫攻虫组鸡的卵囊排出量-蛋白免疫组鸡的卵囊排出量)/佐剂免疫攻虫组鸡的卵囊排出量×100

各组鸡的卵囊排出量和卵囊减少率结果见表8，由表可看出EtROP41-His重组蛋白免疫组鸡的卵囊减少率达83％(P<0.01)，与佐剂免疫攻虫组鸡相比，差异极显著(P<0.01)，表明免疫重组蛋白后能够显著减少柔嫩艾美耳球虫在鸡体内的发育繁殖和卵囊形成，具有较好的预防球虫病效果。

表8

注：与非免疫攻虫组相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。

实例4：EtROP41重组蛋白与其它重组蛋白的免疫保护效果的比较

为比较EtROP41重组蛋白与其他重组蛋白的免疫保护效果，选择柔嫩艾美耳球虫的三个表面蛋白EtSAG2(ToxoDB序列号：ETH_00034890；https://toxodb.org/toxo/app/record/gene/ETH_00034890)，EtSAG16(ToxoDB序列号：ETH_00013140；https://toxodb.org/toxo/app/record/gene/ETH_00034890)，EtSAG(ToxoDB序列号：ETH_00008670；https://toxodb.org/toxo/app/record/gene/ETH_00008670)。用与制备EtROP41重组蛋白同样的方法表达纯化出EtSAG、EtSAG2和EtSAG16重组蛋白，见图4，将三种重组蛋白进行实例3所述的方法进行免疫保护效果的评价，各项检测指标的结果见表9。结果显示，所有蛋白免疫组的保护效果均优于只佐剂免疫组，四种蛋白免疫组相互比较发现，EtROP41重组蛋白的免疫保护效果最好，鸡只存活率、卵囊减少率和相对增重率明显高于其它各组，表明EtROP41重组蛋白是一种新的免疫保护效果更好的鸡柔嫩艾美耳球虫重组蛋白疫苗。

表9

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41及其制备方法和应用

<130> P191271DD1F

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 508

<212> PRT

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 1

Met Glu Ser Pro Pro Val Ser Phe Pro Glu Ala Val Pro Gly Ala Tyr

1 5 10 15

Ser Glu Ser Ala Lys Ala Pro Ile Glu Lys Pro Lys Asn Lys Val Thr

20 25 30

Asn Glu Ala Glu Gly Asp Asp Ser Asn Ala Phe Phe Leu Asn Ala Arg

35 40 45

Pro Gly Arg Arg Gln Gln Arg Gln Val Gly Ser Arg Val Ala Leu Gly

50 55 60

Phe Gly Leu Met Phe Ser Gly Leu Val Ala Ala Ile Leu Ser Ser Leu

65 70 75 80

Leu Leu Arg Gln Leu Gln Glu Pro Pro Arg Val Asn Leu Ser Asn Ala

85 90 95

Trp Gln Gln Leu Glu Ser Gln Glu Ala Thr Trp Leu Leu Pro Thr Val

100 105 110

Asp Gln Gln Glu Val Ala Ala His Pro Arg Leu Ala Met Gly Lys Trp

115 120 125

Leu Leu Ala Asp Ala Val Asn Phe Arg Gln Ala Ala Asp Met Gln Trp

130 135 140

Arg Gly Pro Leu Gly Arg Glu Leu Met Leu Val Leu Ala Glu His Leu

145 150 155 160

Thr Lys Gly Arg Ser Ser Ser Val Ile Gly Ala Thr Ile Asn Leu Val

165 170 175

Asn Thr Gln Gln Leu Gly Tyr Pro Glu Val Asp Pro Thr Pro His Pro

180 185 190

Phe Thr Ile Lys Arg Tyr Leu Tyr Glu Asp Asn Glu Ser Val Thr Leu

195 200 205

Glu Ile Val Asp Gln Ala Thr Asn Leu Pro Tyr Ala Met Arg Leu Arg

210 215 220

Thr Val Arg Pro Arg Val His Gly Glu Asp Val Leu Pro Glu Thr Ala

225 230 235 240

Glu Glu Leu Asn Gln Arg Ser Leu Val Glu Thr Thr Ser Ser Met Leu

245 250 255

Gln Ala Ile Gly Glu Ser Asp Leu Arg Asp Ala Ala Glu Glu Arg Gly

260 265 270

Leu Ala Val Ala Ser Ala Val Ala Thr Ile Gln Gly Val Pro Thr Val

275 280 285

Met Arg Gly Ser Thr Val Tyr Leu Val Ala Asp Val Glu Leu Gly Glu

290 295 300

Val Tyr Ser Gly Arg Leu Ser Asp Ile Phe Ala Ala Gly Thr Ala Ala

305 310 315 320

Ser Leu Glu Ala Lys Glu Tyr Ala Ala Ser Arg Met Leu Leu Gln Val

325 330 335

Leu Gln Leu Gln His Ala Arg Phe Ser His Asn Asn Leu Lys Leu Glu

340 345 350

Asn Phe Phe Met Arg Pro Asp Gly Ser Phe Leu Leu Gly Asn Phe Gly

355 360 365

Thr Gly Thr Pro Ile Gly Glu Arg Leu Asp Arg Val Ser Ala Val Asp

370 375 380

Pro Lys Tyr Ala Glu Met Glu Leu Gly Ala Asn Ala Ala Ala Ala Glu

385 390 395 400

Ala Glu Gly Glu Glu Asp Leu Ala Lys Pro Val Val Asp Glu Lys Ser

405 410 415

Asp Met Trp Gly Leu Gly Val Cys Leu Tyr Lys Ile Phe Thr Gly Gly

420 425 430

Asp Met Pro Phe Asp Leu Ala Ser Glu Asp Pro Pro Ala Ser Val Phe

435 440 445

Ser Phe Met Lys Glu His Arg Met Ser Gly Gln Ala Leu Arg Gly Arg

450 455 460

Leu Thr Asp Leu Gly Val Pro Val Arg Trp Gln Glu Leu Ile Thr Gly

465 470 475 480

Leu Leu Glu Ile Asp Arg Asp Asp Arg Leu Asp Ala Glu Thr Val Ser

485 490 495

Arg Glu Phe Gln Asp Leu Leu His Leu Arg Gly Val

500 505

<210> 2

<211> 1527

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 2

atggagagtc caccagtaag ctttcccgag gcagtgcctg gtgcgtactc cgaaagtgct 60

aaggccccta tagagaagcc aaagaacaaa gtaacaaacg aagcagaggg agatgacagc 120

aatgctttct tcctaaacgc gcggcctggc cgacggcagc agcggcaagt tggctcgcgc 180

gttgctctgg gttttggcct gatgttttcc ggccttgttg cagctatcct atctagcctg 240

ctgttgcggc agctccaaga acctccccga gtcaacctgt ccaacgcatg gcagcagctg 300

gagtcgcagg aggcgacgtg gctgcttcct actgtagacc agcaagaagt agcggctcac 360

cctcgcttgg ccatgggtaa atggttgctt gcagatgcag ttaactttag gcaagcagct 420

gacatgcagt ggcggggccc gctaggccgg gagttaatgc tcgttcttgc tgagcacctc 480

acaaagggaa ggtcaagcag tgtgataggc gccacgatca acttggtaaa cacgcagcag 540

ttaggttatc ctgaagtcga cccaacccca caccctttta ccataaagcg ctatctatat 600

gaagacaatg agtctgttac cttggagata gtagatcaag caacgaattt gccttatgcc 660

atgcggctgc gcaccgtgcg acctcgcgtc cacggtgagg acgtgctgcc agagacagcg 720

gaggaactga atcagcggtc cttggtggag accactagct ctatgcttca ggcaattggg 780

gagtcggatc tgcgagacgc agcagaggag aggggcttgg ctgttgcatc tgccgttgct 840

acgatccaag gcgtgcccac ggtcatgcgc ggcagtactg tttacctggt ggctgacgtt 900

gagctgggtg aggtttacag cggtcgcttg agtgatatat tcgcagcagg gactgctgcc 960

tctttggagg ctaaggagta cgcagcgagc cgaatgctgc tgcaggtgtt gcagttgcag 1020

cacgcccgat tcagccacaa caatctgaag cttgaaaact ttttcatgcg gccagacggc 1080

tcttttctac tgggaaactt tggcactggt acccccatag gcgagcgcct agacagagtc 1140

agcgctgtgg acccaaaata tgcggagatg gagctaggtg ccaacgctgc agctgctgag 1200

gctgaggggg aggaagatct cgccaaacct gtagttgacg agaagtcgga tatgtggggc 1260

ttgggtgttt gtctatacaa aatattcaca ggcggcgata tgccttttga cctggcctca 1320

gaagaccctc ctgcatccgt cttctcgttt atgaaggaac acagaatgag cgggcaggcg 1380

ctgcgtggtc ggctgacaga tttgggggtg cctgtcaggt ggcaggaatt aattacaggc 1440

ctcttggaga ttgatagaga cgacagactg gacgcagaaa cggtgtccag ggagttccag 1500

gatcttctac acctgcgggg tgtgtag 1527

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaaatggg tcgcggatcc gaacctcccc gagtcaacct 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgagtgcgg ccgcaagctt atcctggaac tccctggaca cc 42

Claims

1.一种重组蛋白疫苗，其特征在于，包括重组蛋白和佐剂，

其中，重组蛋白为一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41，具有如SEQ ID NO.1所示的第87-501氨基酸序列；编码该柔嫩艾美尔球虫棒状体蛋白41的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中第259-1503位所示；

用于扩增前述的核苷酸序列的引物，其特征在于，具有以下序列：

上游引物：AGCAAATGGGTCGCGGATCCGAACCTCCCCGAGTCAACCT（SEQ ID NO.3），

下游引物：TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTATCCTGGAACTCCCTGGACACC（SEQ ID NO.4）。

2.权利要求1所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

基因扩增：通过权利要求1所述的引物以柔嫩艾美尔球虫子孢子的cDNA为模板扩增出柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41的DNA序列；

重组载体构建：将扩增出的柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41的DNA序列与pET-28a骨架构建重组载体；以及

重组蛋白表达：将上述重组载体通过IPTG进行诱导表达，并通过Western bloting鉴定，即得。

3.权利要求1所述的重组蛋白在制备预防鸡球虫病疫苗中应用。