CN114525287A - 一种毒害艾美耳球虫sag20抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种毒害艾美耳球虫sag20抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114525287A CN202210194522.4A CN202210194522A CN114525287A CN 114525287 A CN114525287 A CN 114525287A CN 202210194522 A CN202210194522 A CN 202210194522A CN 114525287 A CN114525287 A CN 114525287A
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Abstract

本发明提供了一种毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗是通过基因工程方法制备的亚单位疫苗，以毒害艾美耳球虫SAG20蛋白为抗原，以弗氏佐剂作为免疫佐剂，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗具有良好的免疫原性，在抵抗E.necatrix卵囊感染方面具有良好的活性。与强毒或减毒活疫苗相比，本发明中的基因工程亚单位疫苗不仅可以诱导良好的抗体反应，保护禽类抵抗艾美耳球虫卵囊的感染，而且安全性高、稳定性好，解决了活疫苗存在散毒风险的问题。

Description

一种毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
球虫病是由顶复门、孢子虫纲、球虫目、艾美耳亚目、艾美耳科、艾美耳属的不同种艾美耳球虫同时或先后寄生于鸡肠道上皮细胞引起的一种寄生性原虫病，导致鸡的肠上皮细胞大量崩解、坏死、脱落以及肠黏膜出血，不仅严重影响鸡的生长发育，降低饲料回报率，还会引起鸡的发病和死亡，给养鸡业造成巨大的经济损失。据估计，全球养殖业每年因球虫病的损失约为5亿英镑，我国每年仅用于预防鸡球虫病的费用就达到0.3～0.6亿美元。
毒害艾美耳球虫是7种球虫中致病性最强的球虫之一，常危害8～18周龄的鸡，在温暖潮湿的季节最为流行，病鸡可见消瘦、血痢、精神萎靡以及足翅轻瘫等临床症状，发病率高达50～70％，死亡率高，严重者死亡率高达80％。近年来，随着生长周期较长的黄羽鸡饲养数量的不断攀升，以及采用地面平养方式，由毒害艾美耳球虫引起的球虫病呈上升趋势，球虫病给养鸡业带来了巨大的经济损失。
目前，球虫病的防治主要依赖化学药物或鸡球虫活疫苗，虽然人们采取了穿梭用药、轮换用药和联合用药等各种措施，但球虫几乎对所有使用过的抗球虫药物均出现了耐药性。
CN110139670A公开了一种具有改善的效力的艾美耳球虫疫苗，所述疫苗包含活艾美耳球虫卵囊、药学上可接受的载体与TLR3激动剂，添加TLR3激动剂后，在将艾美耳球虫卵囊的剂量降低时，也可以获得与大剂量艾美耳球虫卵囊相同程度的保护。鸡球虫活疫苗有着较强的免疫效果，但存在一些突出的问题，如有扩散病原的风险、疫苗接种剂量难控制、影响饲料回报率等。
与强毒或减毒活疫苗相比，基因工程亚单位疫苗不仅可以诱导良好的抗体反应，具有更高的保护禽类抵抗艾美耳球虫卵囊的潜力，而且安全性高、稳定性好，是研究禽类球虫新型疫苗的主要方向。因此，提供一种免疫效果良好的禽类球虫亚单位疫苗具有重要的经济价值和广阔的应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用。所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗是通过基因工程方法制备的亚单位疫苗，以毒害艾美耳球虫SAG20蛋白为抗原，以弗氏佐剂作为免疫佐剂，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗具有良好的免疫原性，在抵抗E.necatrix卵囊感染方面具有良好的活性。与强毒或减毒活疫苗相比，本发明中的基因工程亚单位疫苗不仅可以诱导良好的抗体反应，保护禽类抵抗艾美耳球虫卵囊感染，而且安全性高、稳定性好，解决了活疫苗存在散毒风险的问题。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码毒害艾美耳球虫SAG20蛋白；
所述核酸分子包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.1：
ATGCTAAAAATAACACAGGCTGGACAACAAACCCCGAAGTATGCCGCTACCCTGGGTAAAAGCGTAAAATGCCTGAGCGAACTGAATAGCGCGCGTGAAGCTGCGGGTCTGCCGAACTTTACTGAGGCAACCGAGGACAAGAAGCTGACCGATCCGAAAGAGGACCTTGATCAAGACACCGAGTGGAAAAAAGTTTGCACCCATCTGATCCCGACCGAGCAGACCGACCCAGTGGCCGCGGCGTCTGCGGCCAATCCGTTTCAGGACGGCACGTACGCCTTCAAGTCCCTGACCGCGGCTGAACCGAATTGTAAAGAGACAGTGGATCATTGGAAGGCGGCGTTCAAGAACTTCACTGGTTTACCGCCTTCGAAAACCCAAGGTGCAGATTTGTACAAAAACCAGGACAACGTCAGCTTTGTTGCGTTGTACAACCCGTCGAGCGATGCAACCGCAGACTGTCAGGTTGTTACGTGCACCAAGACGACCACCGAAGGCACCGTGCTGCAAAACGATTCCGAACAAAGCCCGGAATATGGCTATGCGTTGATCTGCAAGACGATGCCGTCTGCGTTTAAGGACGATAATGCTGTGCCGTTCACTCAGGACCAGTGGGATAAAATTGCGTCCAGCCATCACCACCACCACCACTAA。
在本发明中，所述核苷酸序列表达SAG20蛋白中去除信号肽和跨膜结构域后的多肽序列。利用大肠杆菌异源表达SAG20蛋白时，不需要信号肽的定位作用，多余的信号肽和跨膜结构域也无法被大肠杆菌识别切割，有可能影响SAG20蛋白的正确折叠和免疫原性，通过去除信号肽和跨膜结构域，能够降低异源表达的SAG20蛋白的错误折叠的概率；所述编码毒害艾美耳球虫SAG20蛋白的核苷酸序列为经过大肠杆菌的密码子偏好优化后的核苷酸序列，根据大肠杆菌的密码子偏好性调整所述编码毒害艾美耳球虫SAG20蛋白的核苷酸序列，能够提高翻译效率，进而提高蛋白表达水平。
第二方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体包括至少一个拷贝的第一方面所述的核酸分子。
优选地，所述重组载体的骨架包括pET-30a质粒。
第三方面，本发明提供一种毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗包括毒害艾美耳球虫SAG20蛋白，所述毒害艾美耳球虫SAG20蛋白为由第二方面所述的重组载体诱导表达得到的重组蛋白。
本发明中，选择SAG蛋白作为疫苗候选基因，其中ENH_00078440基因为强毒株的SAG基因，从ToxoDB获得ENH_00078440蛋白序列，经序列比对显示，ENH_00078440基因与Eimeria tenella SAG20同源性较高(79.05％)，故命名为EN-SAG20。从ToxoDB原虫数据库中获得SAG20基因的mRNA序列和预测的蛋白序列。利用Uniprot蛋白数据库分析信号肽和跨膜结构域，去除信号肽和跨膜结构域的多肽序列。在GenSmartTM Codon Optimization系统中，根据大肠杆菌的密码子偏好优化SAG20蛋白的编码基因(长度：654bp，GC％：53.21)，得到优化后的基因序列，利用优化后的序列构建表达载体，诱导表达得到所述重组蛋白。
优选地，所述重组蛋白的浓度为0.1～3.0mg/mL，例如可以是0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL或3.0mg/mL等。
优选地，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗还包括佐剂。
优选地，所述佐剂包括完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。
优选地，所述佐剂与所述重组蛋白的质量比为1:(0.5～3.0)，例如可以是1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0、1:2.5或1:3.0等。
第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第三方面所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗。
第五方面，本发明提供一种第三方面所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)构建第二方面所述的重组载体；
(2)将步骤(1)所述的重组载体转入感受态细胞中，筛选阳性克隆后进行培养，裂解细胞，得到裂解液；
(3)从步骤(2)所述的裂解液中提取和纯化蛋白质，得到所述重组蛋白；
(4)将步骤(3)所述的重组蛋白与佐剂混合，得到所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗。
优选地，步骤(1)中，所述重组载体的构建方法包括如下步骤：
将编码毒害艾美耳球虫SAG20蛋白的核酸分子插入pET-30a质粒的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点之间，构建重组质粒pET-30a-SAG20。
优选地，步骤(2)中，所述感受态细胞包括BL21感受态细胞。
优选地，步骤(2)中，所述裂解细胞的方法包括超声破碎。
优选地，步骤(3)中，所述提取和纯化采用如下步骤进行：
将所述裂解液离心收集上清液，并对所述上清液进行过滤，将过滤后的上清液加入活化后的固定层析柱中，加入洗脱液，收集目标蛋白。
第六方面，本发明提供第一方面所述的核酸分子、第二方面所述的重组载体、第三方面所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗、第四方面所述的药物组合物或第五方面所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗的制备方法中任意一种或至少两种的组合在制备球虫病治疗药物和/或疫苗中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗以毒害艾美耳球虫SAG20蛋白作为抗原，其具有良好的免疫原性；所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗在平均增重、相对增重率、料肉比、卵囊产量、卵囊减少率、平均病变评分和ACI等指标的检测中均呈现较好的检测结果，SAG20亚单位疫苗组的各项指标均优于阳性对照组(用PBS免疫和E.necatrix感染)，在卵囊产量和小肠病变评分方面均差异显著(P<0.05)。SAG20蛋白的ACI高达160.83，明显优于阳性对照组的ACI。结果表明，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗在抵抗E.necatrix卵囊感染方面具有良好的活性。
(2)本发明提供的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗与强毒或减毒活疫苗相比，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗不仅可以诱导良好的抗体反应，保护禽类抵抗艾美球虫卵囊感染，而且安全性高、稳定性好，解决了活疫苗存在散毒风险的问题。
附图说明
图1为实施例2中重组表达载体pET-30a-SAG20的菌落PCR鉴定结果图。泳道M：DL2000Marker；泳道1和泳道2：pET-30a-SAG20菌落PCR阳性产物。
图2为实施例2中重组质粒pET-30a-SAG20的双酶切鉴定结果图。泳道M：KB LadderMarker；泳道1：pET-30a-SAG20质粒双酶切产物；泳道2：pET-30a-SAG20质粒。
图3为实施例3中重组蛋白SAG20的SDS-PAGE检测结果图。泳道M1：蛋白marker；泳道PC1：BSA(1μg)；泳道PC2：BSA(2μg)；泳道NC：未诱导的全细胞；泳道1：15℃诱导16h的全细胞；泳道2：37℃诱导4h的全细胞；泳道NC1：未诱导的细胞裂解上清；泳道3：15℃诱导16h的细胞裂解上清；泳道4：37℃诱导4h的细胞裂解上清；泳道NC2：未诱导的细胞裂解沉淀；泳道5：15℃诱导16h的细胞裂解沉淀；泳道6：37℃诱导4h的细胞裂解沉淀。
图4为实施例3中重组蛋白SAG20的Western blot分析结果图。泳道M2：Westernblot Protein marker；泳道3：15℃诱导16h的细胞裂解上清；泳道4：37℃诱导4h的细胞裂解上清；泳道5：15℃诱导16h的细胞裂解沉淀；泳道6：37℃诱导4h的细胞裂解沉淀。
图5为测试例1中纯化后的重组蛋白SAG20的SDS-PAGE检测结果图。泳道M1：蛋白Marker；泳道BSA：牛血清白蛋白；泳道R：重组蛋白SAG20。
图6为测试例2中重组蛋白SAG20的免疫原性分析结果图。泳道M1：蛋白Marker；泳道1：重组蛋白SAG20。
图7为测试例3中平均增重的统计结果图。
图8为测试例3中相对增重率的统计结果图。
图9为测试例3中料肉比的统计结果图。
图10为测试例3中平均病变评分的统计结果图。
图11为测试例3中卵囊产量的统计结果图。
图12为测试例3中卵囊减少率的统计结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种核酸分子，所述核酸分子编码毒害艾美耳球虫SAG20蛋白。所述核酸分子为根据大肠杆菌的密码子偏好优化之后的编码毒害艾美耳球虫SAG20蛋白的基因，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
ATGCTAAAAATAACACAGGCTGGACAACAAACCCCGAAGTATGCCGCTACCCTGGGTAAAAGCGTAAAATGCCTGAGCGAACTGAATAGCGCGCGTGAAGCTGCGGGTCTGCCGAACTTTACTGAGGCAACCGAGGACAAGAAGCTGACCGATCCGAAAGAGGACCTTGATCAAGACACCGAGTGGAAAAAAGTTTGCACCCATCTGATCCCGACCGAGCAGACCGACCCAGTGGCCGCGGCGTCTGCGGCCAATCCGTTTCAGGACGGCACGTACGCCTTCAAGTCCCTGACCGCGGCTGAACCGAATTGTAAAGAGACAGTGGATCATTGGAAGGCGGCGTTCAAGAACTTCACTGGTTTACCGCCTTCGAAAACCCAAGGTGCAGATTTGTACAAAAACCAGGACAACGTCAGCTTTGTTGCGTTGTACAACCCGTCGAGCGATGCAACCGCAGACTGTCAGGTTGTTACGTGCACCAAGACGACCACCGAAGGCACCGTGCTGCAAAACGATTCCGAACAAAGCCCGGAATATGGCTATGCGTTGATCTGCAAGACGATGCCGTCTGCGTTTAAGGACGATAATGCTGTGCCGTTCACTCAGGACCAGTGGGATAAAATTGCGTCCAGCCATCACCACCACCACCACTAA。
实施例2
本实施例提供一种重组载体，所述重组载体中含有实施例1中所述的核酸分子，所述重组载体的制备方法包括如下步骤：
合成实施例1中所述的核酸分子，将所述核酸分子插入pET-30a载体的5’-NdeⅠ和3’-HindⅢ酶切位点之间，构建重组质粒pET-30a-SAG20，步骤如下：
从超低温冰箱中取出BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上融化，加入质粒pET-30a-SAG20(100ng)，充分混匀，冰浴30min，42℃反应90s，冰浴5min，加入100μL LB培养基，37℃、200rpm摇床培养60min，均匀涂布在Kana+LB平板上，37℃倒置培养12h。
进行菌落PCR鉴定：在培养板上挑取单菌落，接种于新的kana+LB琼脂板上，然后配制如下PCR反应体系：
Figure BDA0003526623040000061
Figure BDA0003526623040000071
反应条件：94℃预变性2min；94℃热变性30s、50℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。
PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，120V电泳30min，于凝胶成像仪上进行分析。重组表达载体pET-30a-SAG20的菌落PCR鉴定结果图如图1所示，泳道M：DL2000 Marker；泳道1和泳道2：pET-30a-SAG20菌落PCR阳性产物。pET-30a-SAG20的菌落PCR结果为阳性，表明SAG20基因已插入pET-30a表达载体。
用内切酶NdeⅠ和HindⅢ对重组质粒pET-30a-SAG20进行双酶切鉴定，反应体系如下：
Figure BDA0003526623040000072
双酶切的反应条件：37℃孵育4h。
取酶切产物5μL与1μL Loading Buffer混合后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，重组质粒pET-30a-SAG20的双酶切鉴定结果图如图2所示，泳道M：KB Ladder Marker；泳道1：pET-30a-SAG20质粒双酶切产物；泳道2：pET-30a-SAG20质粒。图中结果表明酶切后条带大小正确。
取酶切阳性质粒15μL送华大基因公司进行测序，测序结果与SAG20的核苷酸序列进行比对，结果正确，最终成功构建表达载体pET-30a-SAG20。
实施例3
本实施例提供一种由实施例2所述的重组载体诱导表达得到的重组蛋白，并对所述重组蛋白进行检测，所述重组蛋白为毒害艾美耳球虫SAG20蛋白(后称重组蛋白SAG20)，所述重组蛋白SAG20由实施例2中构建的表达载体pET-30a-SAG20诱导表达得到。所述重组蛋白SAG20的制备方法包括如下步骤：
(1)重组蛋白SAG20的诱导表达
挑取阳性克隆接种到4mL含有50μg/mL Knan+的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养，当OD600处于0.6～0.8之间，向2个试管中分别加入0.5mM IPTG，其中一个试管15℃培养16h，另一个试管37℃培养4h，另取一支试管为阴性参照，用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白质的表达情况和溶解度。
(2)重组蛋白SAG20样品的制备
取450μL培养基离心后的沉淀，重悬于300μL裂解缓冲液，超声裂解1min。
全菌样品：取100μL裂解液，与50μL loading buffer(5×)混合均匀，100℃加热10min，12000rpm离心5min处理。
上清和包涵体样品：取剩余裂解液200μL，12000rpm离心10min处理，分别获取上清和沉淀样品。将180μL上清与90μL loading buffer(5×)混合，作为上清样品。用150μLloading buffer(5×)重悬沉淀，作为包涵体样品。100℃加热10min后，12000rpm离心5min，待上样。
(3)重组蛋白SAG20的SDS-PAGE检测
按照碧云天公司的BeyoGelTMSDS-PAGE预制胶(Tris-Gly，4～20％，12孔)的操作说明书进行实验，包括预制胶的处理，样品孔的清洗和上样等，而后进行80V、30min、120V、60min的电泳，撬开胶板，切割目的胶体，备用。按照碧云天公司的考马斯亮蓝染色试剂盒(P0017A)的操作说明书进行凝胶染色试验，包括凝胶染色、室温孵育1h、脱色过夜与凝胶成像等。利用化学发光成像系统的SDS灰度值分析重组蛋白的可溶性比例，以及利用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测破碎后样品的总蛋白浓度，通过可溶性比例预测目的蛋白的浓度。
(4)重组蛋白SAG20的Western blotting分析
电泳：将表达的目的蛋白作为样品进行SDS-PAGE电泳试验，电泳结束前预先剪取大小合适的PVDF膜1张和同该膜一样大的滤纸6张。PVDF膜先于甲醇中浸泡10min激活，后于电转缓冲液泡10min；将滤纸和海绵在电转缓冲液中稍作浸泡。
转膜：待电泳结束，切取所需的凝胶部分于电转缓冲液泡10min，按照负极板、海绵、3层滤纸、PVDF膜、分离胶、3层滤纸、海绵、正极板的顺序放妥，在放置期间应该使用玻棒赶尽滤纸、凝胶和PVDF膜之间可能存在的气泡，否则，在显色时可见膜上有气泡印迹。将转膜板放入电转糟，加入电转缓冲液至膜上沿所在的位置，恒流200mA、电转60min。
洗膜：将转膜结束后的PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。
封闭：把洗毕的膜浸泡在5％脱脂奶粉封闭液中，摇床80rpm振摇，室温2h。
洗膜：用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min。
一抗温育：将HIS单抗用TBST稀释，稀释比例为1:10000(按照Thermo FisherScientific说明书操作)，与PVDF膜在室温作用1h。
洗膜：用TBST洗涤PVDF膜4次，每次5min。
二抗温育：用TBST对兔抗鼠IgG多抗进行稀释，稀释比例1:40000(按照ThermoFisher Scientific说明书操作)，将PVDF浸泡于其中，室温作用1h。
洗膜：用TBST洗涤PVDF膜5次，每次5min。
显色：使用ECL显色液进行显色1min，后用TBST终止反应，利用化学发光成像系统观察特异性条带。
重组蛋白SAG20经过SDS-PAGE和Western blotting鉴定，结果如图3和图4所示。其中，图3为重组蛋白SAG20的SDS-PAGE检测结果图，泳道M1：蛋白marker；泳道PC1：BSA(1μg)；泳道PC2：BSA(2μg)；泳道NC：未诱导的全细胞；泳道1：15℃诱导16h的全细胞；泳道2：37℃诱导4h的全细胞；泳道NC1：未诱导的细胞裂解上清；泳道3：15℃诱导16h的细胞裂解上清；泳道4：37℃诱导4h的细胞裂解上清；泳道NC2：未诱导的细胞裂解沉淀；泳道5：15℃诱导16h的细胞裂解沉淀；泳道6：37℃诱导4h的细胞裂解沉淀。图4为重组蛋白SAG20的Westernblotting分析结果图，泳道M2：Western blot Protein marker；泳道3：15℃诱导16h的细胞裂解上清；泳道4：37℃诱导4h的细胞裂解上清；泳道5：15℃诱导16h的细胞裂解沉淀；泳道6：37℃诱导4h的细胞裂解沉淀。
诱导表达后的重组蛋白SAG20的分子量约为23kDa，而未诱导的全细胞在此位置无明显条带。可溶性分析表明，在15℃、16h的诱导情况下，上清和沉淀中均有目的蛋白存在，但沉淀中目的蛋白更多。表明最佳诱导结果为：15℃诱导16h，表达水平为30mg/L，可溶性比例为5％。
实施例4
本实施例对实施例3中所述重组蛋白SAG20进行大量表达和纯化。
(1)重组蛋白SAG20的大量表达
前期先进行1L菌液的IPTG诱导，取菌液4℃、4000rpm离心10min后，弃上清，收集菌体沉淀。
(2)重组蛋白SAG20的纯化
将步骤(1)中收集的菌体沉淀按照每克细菌沉淀湿重加入4mL裂解缓冲液的比例，重悬菌体；于重悬菌体中加入溶菌酶，使其终浓度为1mg/mL，然后冰浴30min；冰上超声破碎细菌，使其裂解液变得澄清，超声波功率为300W，每次超声处理持续4s，每次间隔持续6s，共超声处理时长30min；将超声处理后的裂解液在4℃、10000g离心10min，收集裂解液的上清液并置于冰上。
根据PurKineTM组氨酸标签蛋白纯化试剂盒的操作步骤进行纯化，样品在应用于纯化装置前应先经过离心，后用0.22μm或0.45μm过滤器过滤，以防止堵塞色谱柱。
固定层析柱，摘取顶部和底部塞子，让储存的缓冲液排出；在柱上加入2个树脂体积的裂解缓冲液；平衡层析柱，排出裂解缓冲液，重复此步骤三次。
将准备好的样品(裂解液的上清液混合等体积裂解缓冲液制备样品)加入层析柱中，收集滤过液，可进行SDS-PAGE分析。为了目的蛋白的最佳结合，样品可在室温或4℃下孵育30min，注意不要超过树脂的结合能力。
加入2个树脂体积的洗涤缓冲液，以去除非特异性吸附蛋白，收集的洗涤液可用于SDS-PAGE分析，重复此步骤6次。
在色谱柱中加入10个树脂体积的洗脱缓冲液以洗脱目标蛋白(或直到流出液在280nm的吸光度稳定)。收集的洗脱液即为目的蛋白，可进行SDS-PAGE检测或Westernblotting检测。
测试例1
本测试例对实施例4中纯化后的重组蛋白SAG20进行SDS-PAGE检测和蛋白浓度测量。
(1)对纯化后的重组蛋白SAG20进行SDS-PAGE检测
取上步纯化后的重组蛋白SAG20样品20μL，加入4μL 6×SDS-PAGE上样缓冲液，在沸水中煮10min，对处理后的样品进行SDS-PAGE检测，观察电泳结果进行分析。
纯化后的重组蛋白SAG20的SDS-PAGE检测结果图如图5所示，泳道M1：蛋白Marker；泳道BSA：牛血清白蛋白；泳道R：重组蛋白SAG20；结果表明所述重组蛋白SAG20纯化成功，蛋白大小为23kDa。
(2)对纯化后的重组蛋白SAG20进行蛋白浓度测定
根据BCA蛋白浓度测定试剂盒的操作程序，按样品数量制备BCA工作液，充分混匀。
将标准品按0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL和20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL，相当于标准品浓度分别为0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL和0.5mg/mL。
加20μL重组蛋白SAG20样品到96孔板的样品孔中，向各孔中加入200μL BCA工作液，37℃孵育30min，用酶标仪测定A562波长的吸光度，绘制的标准曲线，按照标准曲线和使用的样品的体积计算出样品的蛋白浓度。
蛋白标准曲线：y＝0.0009x+0.0998，根据蛋白标准曲线对重组蛋白SAG20样品进行OD562测定，代入公式中的y值，得重组蛋白SAG20样品的浓度为0.63mg/mL。
实施例5
本实施例提供一种毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗含有实施4中所述的重组蛋白SAG20。所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗中的重组蛋白SAG20的浓度为0.5mg/mL，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗还包括佐剂，所述佐剂为完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，所述佐剂与所述重组蛋白的质量比均为1:1。
测试例2
本测试例对实施例5中所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗进行免疫原性检测。
将重组蛋白SAG20与完全弗氏佐剂等体积混合，按50μg/羽分别免疫1周龄清远麻鸡(简称麻鸡)，14日龄时将重组蛋白SAG20与不完全弗氏佐剂等体积混合(50μg/羽)，进行等量二次免疫，21日龄时从翅下静脉采集血清作为一抗，羊抗鸡HRP标记抗体作为二抗，进行Western blot分析，验证重组蛋白SAG20的免疫原性。
重组蛋白SAG20的免疫原性分析结果图如图6所示，泳道M1：蛋白Marker；泳道1：重组蛋白SAG20；结果表明重组蛋白SAG20具有良好的免疫原性。
测试例3
本测试例对实施例5中所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗进行免疫保护效果的评估。
(1)动物免疫程序
实验组：7日龄健康鸡，首次免疫50μg重组蛋白SAG20/羽(等体积预混完全弗氏佐剂)，14日龄二次免疫50μg重组蛋白SAG20/羽(等体积预混不完全弗氏佐剂)，21日龄攻毒30000个强毒株卵囊/羽。3组重复实验，每组10只清远麻鸡。
阳性对照组：7日龄健康鸡，首次免疫100μg PBS/羽，14日龄二次免疫100μg PBS/羽，21日龄鸡攻毒30000个强毒株卵囊/羽，3组重复实验，每组10只清远麻鸡。
阴性对照组：用100μL PBS/羽同步接种7、14和21日龄健康鸡，3组重复实验，每组10只清远麻鸡。
(2)免疫保护效果的评估
卵囊产量：记录实验与对照组6～8天p.i.(Post infect)的OPG(克粪便卵囊数)和粪重，统计卵囊产量(实验组与对照组共4个，每组3个重复实验，每笼5只鸡，共60只)。
卵囊减少率(％)：记录实验与对照组6～8天p.i.的OPG和粪重，统计卵囊产量，卵囊减少率(％)＝(阳性对照组卵囊产量-免疫组卵囊产量)×100/阳性对照组卵囊产量。
增重：记录感染当天至感染后第10天的增重(感染后第10天体重-感染第1天体重)。
料肉比：记录清远麻鸡感染球虫后10天的料肉比情况，料肉比＝消耗饲料总量(kg)/增重总量(kg)。
平均病变记分：6天p.i.剖检麻鸡进行病变记分。根据Johnson病变记分准则(Johnson，1970)评价鸡小肠中段的病变程度。
抗球虫指数(Anticoccidial index，ACI)：ACI是包括存活率、平均增重、病变记分、卵囊产量等因素，综合评估后作为判定球虫药物效力的指标，在此作为候选基因工程疫苗效力的评价方法。
ACI＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)；
存活率＝(试验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)×100％；
相对增重率＝(试验组增重率/不感染不用药对照组增重率)×100％；
病变值(0～40)＝各试验组的平均病变记分(0～4)×10。
卵囊值(0～40)按以下方法(表1)计算。此后，用以下标准评价每种蛋白质的免疫保护作用：ACI>180表示优良活性，160～179中度活性，120～159有限的活性，<120无免疫保护力。表1为E.necatrix卵囊值。
表1
粪便匀浆中卵囊(百万数/只) 卵囊值
小于0.1 0
0.1～1.0 1
2.0～5.0 10
6.0～10.0 20
大于11.0 40
统计实验组、阳性对照组和阴性对照组在平均增重、相对增重率、料肉比、卵囊产量、卵囊减少率、平均病变评分和ACI种的评价结果，其中图7为平均增重的统计结果图，图8为相对增重率的统计结果图，图9为料肉比的统计结果图，图10为平均病变评分的统计结果图，图11为卵囊产量的统计结果图，图12为卵囊减少率的统计结果图。图中阴性指阴性对照组，阳阴性指阳性对照组，SAG20指实验组；图中统计数据是3组独立实验的平均值±SD(误差线)，每组样本数n为5。所有数据均用t-tests分析，p值由“*”代表：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
从统计结果可知，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗组优于阳性对照组(用PBS免疫和E.necatrix感染)，在卵囊产量和小肠病变评分方面均差异显著(P<0.05)。所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗的ACI高达160.83，明显优于阳性对照组的ACI。上述结果表明，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗在抵抗3万个E.necatrix卵囊感染方面具有中等活性，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗对E.necatrix卵囊感染的保护效果统计结果如表2所示。
表2
组别 存活率(％) 相对增重率(％) 病变值(分) 卵囊值 抗球虫指数(ACI)
阴性 100 100 0 0 200
阳性 100 77.60 31.33 10 136.27
SAG20 100 82.16 20.33 1 160.83
注：阴性组用PBS免疫但不感染E.necatrix卵囊；阳性组用PBS免疫并感染E.necatrix卵囊。优异的活性：ACI>180；中等活性：179>ACI>160；有限的活性：159>ACI>120；无免疫保护力：ACI<120。
综上，本发明提供的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗具有良好的免疫原性，在抵抗E.necatrix卵囊感染方面具有良好的活性。与强毒或减毒活疫苗相比，本发明中的基因工程亚单位疫苗不仅可以诱导良好的抗体反应，保护禽类抵抗艾美球虫卵囊感染，而且安全性高、稳定性好，解决了活疫苗存在散毒风险的问题。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 佛山市正典生物技术有限公司
<120> 一种毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
atgctaaaaa taacacaggc tggacaacaa accccgaagt atgccgctac cctgggtaaa 60
agcgtaaaat gcctgagcga actgaatagc gcgcgtgaag ctgcgggtct gccgaacttt 120
actgaggcaa ccgaggacaa gaagctgacc gatccgaaag aggaccttga tcaagacacc 180
gagtggaaaa aagtttgcac ccatctgatc ccgaccgagc agaccgaccc agtggccgcg 240
gcgtctgcgg ccaatccgtt tcaggacggc acgtacgcct tcaagtccct gaccgcggct 300
gaaccgaatt gtaaagagac agtggatcat tggaaggcgg cgttcaagaa cttcactggt 360
ttaccgcctt cgaaaaccca aggtgcagat ttgtacaaaa accaggacaa cgtcagcttt 420
gttgcgttgt acaacccgtc gagcgatgca accgcagact gtcaggttgt tacgtgcacc 480
aagacgacca ccgaaggcac cgtgctgcaa aacgattccg aacaaagccc ggaatatggc 540
tatgcgttga tctgcaagac gatgccgtct gcgtttaagg acgataatgc tgtgccgttc 600
actcaggacc agtgggataa aattgcgtcc agccatcacc accaccacca ctaa 654

Claims (10)

1.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码毒害艾美耳球虫SAG20蛋白；
所述核酸分子包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括至少一个拷贝的权利要求1所述的核酸分子；
优选地，所述重组载体的骨架包括pET-30a质粒。
3.一种毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗，其特征在于，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗包括毒害艾美耳球虫SAG20蛋白，所述毒害艾美耳球虫SAG20蛋白为由权利要求2所述的重组载体诱导表达得到的重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗，其特征在于，所述重组蛋白的浓度为0.1～3.0mg/mL。
5.根据权利要求3或4所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗，其特征在于，所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗还包括佐剂；
优选地，所述佐剂包括完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂；
优选地，所述佐剂与所述重组蛋白的质量比为1:(0.5～3.0)。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求3～5中任一项所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗。
7.一种权利要求3～5中任一项所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)构建权利要求2所述的重组载体；
(2)将步骤(1)所述的重组载体转入感受态细胞中，筛选阳性克隆后进行培养，裂解细胞，得到裂解液；
(3)从步骤(2)所述的裂解液中提取和纯化蛋白质，得到所述重组蛋白；
(4)将步骤(3)所述的重组蛋白与佐剂混合，得到所述毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗。
8.根据权利要求7所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述重组载体的构建方法包括如下步骤：
将编码毒害艾美耳球虫SAG20蛋白的核酸分子插入pET-30a质粒的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点之间，构建重组质粒pET-30a-SAG20。
9.根据权利要求7或8所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述感受态细胞包括BL21感受态细胞；
优选地，步骤(2)中，所述裂解细胞的方法包括超声破碎；
优选地，步骤(3)中，所述提取和纯化采用如下步骤进行：
将所述裂解液离心收集上清液，并对所述上清液进行过滤，将过滤后的上清液加入活化后的固定层析柱中，加入洗脱液，收集目标蛋白。
10.权利要求1所述的核酸分子、权利要求2所述的重组载体、权利要求3～5中任一项所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗、权利要求6所述的药物组合物或权利要求7～9中任一项所述的毒害艾美耳球虫SAG20抗原亚单位疫苗的制备方法中任意一种或至少两种的组合在制备球虫病治疗药物和/或疫苗中的应用。
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