CN114480433B

CN114480433B - 一种毒害艾美耳球虫亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114480433B
Application number: CN202210194122.3A
Authority: CN
Inventors: 谭志坚; 周德荣; 蒋嘉豪; 林瑞庆; 翁亚彪; 刘丽丹; 王新秋; 黄仪娟; 刘叶萍
Original assignee: Foshan Standard Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Foshan Standard Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2022-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2042-03-01
Also published as: CN114480433A

Abstract

本发明公开了一种毒害艾美耳球虫亚单位疫苗及其制备方法和应用。所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗包括毒害艾美耳球虫SAG13蛋白，所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。本发明以毒害艾美耳球虫SAG13蛋白作为亚单位疫苗候选蛋白，深入分析其信号肽和跨膜结构域，创造性地去除信号肽和跨膜结构域的多肽序列，发现其能够有效激发鸡抵抗毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力，即可作为高效亚单位疫苗，且序列显著简化，利于制备和纯化，能够实现高效、低成本制备，具有广泛推广应用的潜质。

Description

一种毒害艾美耳球虫亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种毒害艾美耳球虫亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

鸡球虫病是一种严重危害养禽业的原虫病，可以导致鸡采食量减少、营养不良、饲料转换率下降甚至死亡。其中毒害艾美耳球虫(E.necatrix)是7种鸡球虫中致病性最强的球虫之一。目前，鸡球虫病的防治主要以药物和疫苗为主，但随着耐药性的上升，药物防治的作用效果明显降低，所以疫苗预防变得更为重要。但目前市面上的疫苗难以应对毒害艾美耳球虫，主要是因为毒害艾美耳球虫的第1、2代裂殖生殖发生在小肠，第3代裂殖生殖和配子生殖发生在盲肠，分别与巨型和柔嫩艾美耳球虫的寄生部位相同从而存在拥挤效应，用鸡球虫病多价活虫疫苗免疫时，疫苗株的后代卵囊中毒害艾美耳球虫卵囊较少，较难形成完全的免疫保护力，故用鸡球虫病活疫苗免疫也难以防控毒害艾美耳球虫引发的疾病。因此，目前急需研发一种有效防控毒害艾美耳球虫的疫苗。

目前已应用的球虫疫苗主要为活疫苗，但活疫苗因为上述原因难以对毒害艾美耳球虫进行预防，难以满足生产需求。随着分子生物学的快速发展，新一代疫苗如亚单位疫苗的出现给疫苗研发提供了新方法，随着技术的发展与成熟逐渐在养殖行业发挥重要作用。亚单位疫苗含有病原体某种或多种特异性抗原，能够激发机体免疫应答的免疫原成分，但不具有在机体内复制和致病的能力，所以接种亚单位疫苗能够使鸡获得免疫保护力的同时不受活疫苗毒副作用的威胁，安全可靠。而目前已商用亚单位疫苗是使用艾美耳球虫的配子体抗原制备而成，如CN111514284A公开了一种鸡球虫多价重组蛋白疫苗及其制备方法和应用，所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗包含4种鸡球虫蛋白：柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41，柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白22，巨型艾美耳球虫配子体蛋白56，和堆型艾美耳球虫裂殖子蛋白Ea3-1E，将上述4种鸡球虫蛋白分别与大肠杆菌表达载体相连获重组表达载体，表达重组蛋白，将不同种重组蛋白按比例与佐剂混合，免疫母鸡后的后代雏鸡接种球虫后与未免疫母鸡后代雏鸡相比，能够有效提高接种球虫的雏鸡存活率和相对增重，卵囊排出量减少，显示了良好的母源免疫效果，但生产耗时、难度较高，难以广泛推广应用。

综上所述，开发针对毒害艾美耳球虫的高效亚单位疫苗，简化工艺降低成本，对于鸡球虫病防治领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种毒害艾美耳球虫亚单位疫苗及其制备方法和应用，本发明利用毒害艾美耳球虫SAG13蛋白作为亚单位疫苗，所述亚单位疫苗能够有效激发鸡抵抗毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力，成分简单、易制备且整体成本低，具有广泛推广应用的潜质。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种毒害艾美耳球虫亚单位疫苗，所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗包括毒害艾美耳球虫SAG13蛋白，所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明中，以毒害艾美耳球虫SAG13蛋白作为亚单位疫苗候选蛋白，深入分析其信号肽和跨膜结构域，创造性地去除信号肽和跨膜结构域的多肽序列，发现其能够有效激发鸡抵抗毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力，即可作为高效亚单位疫苗，且序列显著简化，更利于制备和纯化，能够实现高效、低成本制备，具有广泛推广应用的潜质。

SEQ ID NO.1：

MVPIRSAIDNPHDSLLDIRPISFARVGTAPAAEEKTDACLPVLNKLRLEGLNNLLSELVKATEEEVASSLQQPKAIGEKTKVTDIAAELAGSDKTCEAANATASPYSGLVITFDYSTAFDCEALINESFTAGLSHLQQANYDASDAATKMGVAPLDNLAAKNLAAIVSTKAGKVACAATKDCEAGKNVLFCYFIEPLGKVEAQPINADVYEALLQRQRGSHHHHHH。

优选地，所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗还包括佐剂。

优选地，所述佐剂包括不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。

优选地，所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗中所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白和所述佐剂的体积比为1:(0.5～3)，包括但不限于2:1、5:3、5:4、1:1、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5或1:3。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗的制备方法，所述制备方法包括：

将编码所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的核酸序列插入载体中，得到重组表达载体，将所述重组表达载体导入宿主细胞，进行细胞培养，进行蛋白质纯化，收集毒害艾美耳球虫SAG13蛋白，得到所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗。

本发明中，通过构建重组表达载体在细胞中过表达毒害艾美耳球虫SAG13蛋白，可通过成熟的细胞培养工艺高效制备毒害艾美耳球虫SAG13蛋白，工艺简单且成本低。

优选地，所述载体包括质粒载体、病毒载体或噬菌体载体中的任意一种。

优选地，所述质粒载体包括pET30a。

优选地，所述编码所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。

SEQ ID NO.2：

ATGGTTCCCATAAGGTCAGCTATTGATAATCCACATGATAGCCTGTTGGACATCCGTCCGATTTCGTTCGCCCGTGTTGGCACCGCACCGGCGGCGGAGGAGAAAACTGACGCCTGCCTGCCGGTTCTGAATAAACTGCGTCTGGAAGGTTTGAACAACCTGCTTAGTGAATTGGTTAAAGCAACGGAAGAGGAGGTGGCCTCTAGCCTGCAACAACCGAAAGCCATTGGTGAAAAGACCAAAGTCACCGACATCGCCGCGGAGCTGGCGGGCTCTGATAAAACGTGCGAGGCGGCGAACGCAACCGCATCCCCGTATAGCGGTCTGGTCATCACCTTTGATTACAGCACCGCGTTTGATTGCGAGGCTCTGATTAATGAGAGCTTCACCGCGGGCCTCTCCCATCTGCAACAGGCAAATTATGATGCGTCCGACGCTGCGACCAAGATGGGTGTGGCTCCGTTGGACAACTTGGCGGCTAAAAATCTGGCGGCGATTGTTAGCACCAAGGCGGGCAAGGTGGCATGTGCAGCGACGAAGGACTGTGAGGCTGGCAAGAACGTGCTGTTCTGCTACTTCATCGAACCGCTGGGTAAGGTGGAAGCGCAGCCGATCAACGCTGATGTTTACGAAGCCTTACTGCAACGCCAGCGCGGTAGCCATCACCACCACCACCACTAA。

本发明中，对所述编码所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的核酸序列进行优化，显著提高了其在大肠杆菌中的表达能力，进一步提高毒害艾美耳球虫SAG13蛋白产量。

优选地，所述编码所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的核酸序列被插入所述pET-30a的5’-NdeⅠ和3’-HindⅢ酶切位点之间。

优选地，所述导入的方法包括化学诱导法、电转化法、热激法或基因枪法中的任意一种。

优选地，所述宿主细胞包括细菌或哺乳动物细胞。

优选地，所述细菌包括大肠杆菌。

优选地，所述制备方法还包括将所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白与佐剂混合的步骤。

作为优选的技术方案，所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗的制备方法包括以下步骤：

(1)将编码所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的核酸序列插入质粒载体中，得到重组表达载体；

(2)将所述重组表达载体导入大肠杆菌，进行细胞培养；

(3)收集细胞并进行裂解，得到细胞裂解液，过滤，并进行蛋白质纯化，收集毒害艾美耳球虫SAG13蛋白；

(4)将所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白与佐剂混合，得到所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗。

优选地，所述过滤包括使用过滤器进行过滤，所述过滤器的规格为0.22μm或0.45μm。

第三方面，本发明提供第一方面所述的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗在制备预防毒害艾美耳球虫感染的药物中的应用。

第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗。

优选地，所述药物组合物还包括辅料。

优选地，所述辅料包括药学上接受的载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明创造性地对毒害艾美耳球虫SAG13蛋白进行改进，并将其作为亚单位疫苗，其能够有效激发鸡抵抗E.necatrix感染的免疫保护力；

(2)本发明简化毒害艾美耳球虫SAG13蛋白序列，并优化其基因序列，使其能够在大肠杆菌中高效表达，显著提高了毒害艾美耳球虫SAG13蛋白产量，降低了生产成本；

(3)本发明制备的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗具有良好免疫原性，抗球虫指数可达162.07。

附图说明

图1为SAG13插入质粒完成重组质粒pET-30a-SAG13电泳结果图；

图2为SDS-PAGE鉴定重组SAG13蛋白结果图，M1为蛋白标准品，BSA为牛血清白蛋白对照，R为纯化后的SAG13蛋白；

图3为利用重组SAG13蛋白免疫鸡的静脉血作为抗体血清进行Westernblot检测结果图；

图4为小鸡平均增重结果图；

图5为小鸡料肉比结果图；

图6为小鸡卵囊产量结果图；

图7为小鸡平均病变记分结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例构建毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的表达载体pET-30a-SAG13，包括以下步骤：

(1)利用Uniprot蛋白数据库分析信号肽和跨膜结构域，去除信号肽和跨膜结构域的多肽序列，在GenSmartTM Codon Optimization系统中，根据大肠杆菌的密码子偏好优化SAG13编码基因，得到优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)由GenScript公司合成优化的SAG13基因片段，通过酶切法插入pET-30a载体之中，构建重组质粒pET-30a-SAG13，鉴定序列正确结果后如图1所示，获得重组表达质粒pET-30a-SAG13；

(3)将上述pET-30a-SAG13质粒转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，加入100μLLB培养基，于37℃，200rpm的摇床培养1h，均匀涂布在卡那霉素抗性的LB固态培养基平板上，37℃倒置培养过夜；

(4)挑取菌落，分别接种到4mL含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，以37℃，200rpm震荡培养12h，从中取1mL菌液于-80℃保存。

实施例2

本实施例利用实施例1制备pET-30a-SAG13质粒进行重组SAG13蛋白的原核表达及纯化。

1、蛋白表达

(1)从冰箱中取出带有重组pET-30a-SAG13的大肠杆菌液，加入1L含有50μg/mLKnan⁺的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养，当OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，15℃培养16h随后37℃培养4h；

(2)取菌液，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体沉淀；

(3)每克细菌沉淀湿重加入4mL裂解缓冲液，重悬菌体；

(4)于重悬菌体中加入溶菌酶，使其终浓度为1mg/mL，然后冰浴30min；

(5)冰上超声破碎细菌，使其裂解液变得澄清，超声波功率为300W，每次超声处理持续4s，每次间隔持续6s，共超声处理时长30min；

(6)4℃，10000×g离心10min，收集裂解液上清并置于冰上。

2、重组SAG13蛋白的亲和层析纯化与鉴定

根据PurKine^TM组氨酸标签蛋白纯化试剂盒操作步骤，样品在应用于纯化装置前应先经过离心，后用0.22μm过滤器过滤，以防止堵塞色谱柱。

(1)固定层析柱，摘取顶部和底部塞子，让储存的缓冲液排出，在柱上加入2个树脂体积裂解缓冲液，平衡层析柱，排出裂解缓冲液，重复此步骤三次；

(2)将准备好的样品(上述制备的细胞裂解液混合等体积裂解缓冲液制备样品)加入层析柱，收集滤过液，用于进行SDS-PAGE分析；

(3)加入2个树脂体积洗涤缓冲液，以去除非特异性吸附蛋白，收集的洗涤液用于SDS-PAGE分析，重复此步骤6次；

(4)在色谱柱中加入8个树脂体积洗脱缓冲液，以洗脱目标蛋白，收集的洗脱液即为目的蛋白，可进行SDS-PAGE检测，结果如图2所示，M1为蛋白标准品，BSA为牛血清白蛋白对照，R为纯化后的SAG13蛋白。

实施例3

本实施例利用实施例2制备的重组SAG13蛋白制备毒害艾美耳球虫亚单位疫苗。

(1)将重组SAG13蛋白等体积混合完全弗氏佐剂即可制备用于首次免疫的疫苗，用量为50μg/羽。

(2)将重组SAG13蛋白等体积混合不完全弗氏佐剂即可制备用于二次免疫的疫苗，用量为50μg/羽。

实施例4

本实施例进行毒害艾美耳球虫亚单位疫苗动物免疫攻毒评价。

1、纯化重组蛋白的免疫原性检测

使用实施例3制备的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗对1周龄黄鸡(购自佛山市南海种禽有限公司)进行首次免疫，于14日龄时使用二免疫苗进行等量二次免疫，21日龄时从翅下静脉采集血清作为一抗，羊抗鸡HRP标记抗体作为二抗，进行Westernblot分析，验证纯化重组蛋白的免疫原性，结果如图3所示，毒害艾美耳球虫亚单位疫苗能有效激发机体免疫，表明重组SAG13蛋白具有良好免疫原性。

2、动物免疫程序设计

使用以下免疫程序进行攻毒实验：

(1)阴性对照组：不感染不进行免疫，用100μL PBS进行同步接种7、14、21日龄健康鸡；

(2)阳性对照组：7、14日龄健康鸡进行100μL PBS同步注射，21日龄攻毒30000个/羽强毒株卵囊；

(3)SAG13免疫组：7日龄健康鸡进行首次免疫，14日龄进行二次免疫，21日龄攻毒30000个/羽强毒株卵囊。

具体如表1所示。

表1

3、免疫保护效果的评估

(1)卵囊产量：记录实验与对照组6-8dp.i.(感染后天数)的OPG和粪重，统计卵囊产量(实验与对照组共4个，每组3个重复实验，每笼5只鸡，共60只)；

(2)卵囊减少率(％)：记录实验与对照组6-8dp.i.的OPG和粪重，统计卵囊产量，卵囊减少率(％)＝(阳性对照组卵囊产量-免疫组卵囊产量)×100/阳性对照组卵囊产量；

(3)增重：记录感染当天至感染后第10天的增重(感染后第10天体重-感染第1天体重)；

(4)料肉比：记录黄鸡感染球虫后10天的料肉比情况，料肉比＝消耗饲料总量(kg)/增重总量(kg)；

(5)平均病变记分：6dp.i.剖检黄鸡进行病变记分，根据Johnson病变记分准则(Johnson J,Reid W M.Anticoccidial drugs:Lesion scoring techniques in batteryand floor-pen experiments with chickens[J].Experimental Parasitology,1970,28(1):30-36.)评价鸡小肠中段的病变程度；

(6)抗球虫指数(Anticoccidial index，ACI)：ACI是包括存活率、平均增重、病变记分、卵囊产量等因素，综合评估后作为判定球虫药物效力的指标，在此作为候选基因工程疫苗效力的评价方法，采用以下ACI计算公式：

ACI＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)；

存活率＝(试验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)×100％；

相对增重率＝(试验组增重率/不感染不用药对照组增重率)×100％；

病变值(0～40)＝各试验组的平均病变记分(0～4)×10。

卵囊值(0～40)按以下方法(表2)计算，此后，用以下标准评价每种蛋白质的免疫保护作用：ACI>180表示优良活性，160-179中度活性，120-159有限的活性，<120无免疫保护力。

表2

粪便匀浆中卵囊百万数/只	卵囊数
		小于0.1	0
0.1～1.0	1
		2.0～5.0	10
6.0～10.0	20
		大于11.0	40

4、免疫保护效果分析

(1)本研究结果的数据采用GraphPad Prism 6软件进行处理，均以平均±标准差表示，并使用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件进行差异显著性分析(Spss Software,Inc.,New York,USA)。数据用方差分析比较不同组间的差异。P值<0.05表示有统计学意义；

(2)在平均增重、相对增重率、料肉比、卵囊值、平均病变评分如和ACI结果(图4～图7和表3)方面，疫苗接种组优于阳性对照组(用PBS免疫和E.necatrix感染)，在卵囊产量和小肠病变评分方面均差异显著(P<0.05)，SAG13蛋白的ACI分别高达162.07，两者均优于阳性对照组的ACI，这些结果表明，SAG13蛋白亚单位疫苗在抵抗3万个E.necatrix卵囊感染方面具有中等活性。

表3

组别	存活率(％)	相对增重率(％)	病变值	卵囊值	抗球虫指数(ACI)
						阴性	100	100	0	0	200
阳性	100	77.60	31.33	10	136.27
						SAG13	100	85.74	22.67	1	162.07

注：阴性组用PBS免疫但不感染E.necatrix卵囊；阳性组用PBS免疫并感染E.necatrix卵囊。优异的活性：ACI>180；中等活性：179>ACI>160；有限的活性：159>ACI>120；无免疫保护力：ACI<120。

综上所述，本发明创造性地对毒害艾美耳球虫SAG13蛋白进行改进，并将其作为亚单位疫苗，其能够有效激发鸡抵抗E.necatrix感染的免疫保护力，简化毒害艾美耳球虫SAG13蛋白序列，并优化其基因序列，使其能够在大肠杆菌中高效表达，显著提高了毒害艾美耳球虫SAG13蛋白产量，降低了生产成本，明制备的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗具有良好免疫原性，抗球虫指数可达162.07。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 佛山市正典生物技术有限公司

<120> 一种毒害艾美耳球虫亚单位疫苗及其制备方法和应用

<130> 2022-02-10

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Val Pro Ile Arg Ser Ala Ile Asp Asn Pro His Asp Ser Leu Leu

1 5 10 15

Asp Ile Arg Pro Ile Ser Phe Ala Arg Val Gly Thr Ala Pro Ala Ala

20 25 30

Glu Glu Lys Thr Asp Ala Cys Leu Pro Val Leu Asn Lys Leu Arg Leu

35 40 45

Glu Gly Leu Asn Asn Leu Leu Ser Glu Leu Val Lys Ala Thr Glu Glu

50 55 60

Glu Val Ala Ser Ser Leu Gln Gln Pro Lys Ala Ile Gly Glu Lys Thr

65 70 75 80

Lys Val Thr Asp Ile Ala Ala Glu Leu Ala Gly Ser Asp Lys Thr Cys

85 90 95

Glu Ala Ala Asn Ala Thr Ala Ser Pro Tyr Ser Gly Leu Val Ile Thr

100 105 110

Phe Asp Tyr Ser Thr Ala Phe Asp Cys Glu Ala Leu Ile Asn Glu Ser

115 120 125

Phe Thr Ala Gly Leu Ser His Leu Gln Gln Ala Asn Tyr Asp Ala Ser

130 135 140

Asp Ala Ala Thr Lys Met Gly Val Ala Pro Leu Asp Asn Leu Ala Ala

145 150 155 160

Lys Asn Leu Ala Ala Ile Val Ser Thr Lys Ala Gly Lys Val Ala Cys

165 170 175

Ala Ala Thr Lys Asp Cys Glu Ala Gly Lys Asn Val Leu Phe Cys Tyr

180 185 190

Phe Ile Glu Pro Leu Gly Lys Val Glu Ala Gln Pro Ile Asn Ala Asp

195 200 205

Val Tyr Glu Ala Leu Leu Gln Arg Gln Arg Gly Ser His His His His

210 215 220

His His

225

<210> 2

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggttccca taaggtcagc tattgataat ccacatgata gcctgttgga catccgtccg 60

atttcgttcg cccgtgttgg caccgcaccg gcggcggagg agaaaactga cgcctgcctg 120

ccggttctga ataaactgcg tctggaaggt ttgaacaacc tgcttagtga attggttaaa 180

gcaacggaag aggaggtggc ctctagcctg caacaaccga aagccattgg tgaaaagacc 240

aaagtcaccg acatcgccgc ggagctggcg ggctctgata aaacgtgcga ggcggcgaac 300

gcaaccgcat ccccgtatag cggtctggtc atcacctttg attacagcac cgcgtttgat 360

tgcgaggctc tgattaatga gagcttcacc gcgggcctct cccatctgca acaggcaaat 420

tatgatgcgt ccgacgctgc gaccaagatg ggtgtggctc cgttggacaa cttggcggct 480

aaaaatctgg cggcgattgt tagcaccaag gcgggcaagg tggcatgtgc agcgacgaag 540

gactgtgagg ctggcaagaa cgtgctgttc tgctacttca tcgaaccgct gggtaaggtg 600

gaagcgcagc cgatcaacgc tgatgtttac gaagccttac tgcaacgcca gcgcggtagc 660

catcaccacc accaccacta a 681

Claims

1.一种毒害艾美耳球虫亚单位疫苗，其特征在于，所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗包括去除了信号肽和跨膜结构域的毒害艾美耳球虫SAG13蛋白和佐剂；

所述去除了信号肽和跨膜结构域的毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的序列；

所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗中所述去除了信号肽和跨膜结构域的毒害艾美耳球虫SAG13蛋白和所述佐剂的体积比为1:(0.5~3)。

2.根据权利要求1所述的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂包括不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。

3.一种如权利要求1或2所述的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将编码所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的核酸序列插入载体中，得到重组表达载体，将所述重组表达载体导入宿主细胞，进行细胞培养，进行蛋白质纯化，收集毒害艾美耳球虫SAG13蛋白，将所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白与佐剂混合，得到所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗，所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白和所述佐剂的体积比为1:(0.5~3)。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述载体包括质粒载体、病毒载体或噬菌体载体中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述质粒载体包括pET30a。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述编码所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述编码所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的核酸序列被插入所述pET-30a的5’ -Nde Ⅰ和3’ -Hind Ⅲ酶切位点之间。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述导入的方法包括化学诱导法、电转化法、热激法或基因枪法中的任意一种。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞包括细菌或哺乳动物细胞。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述细菌包括大肠杆菌。

11.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）将编码所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白的核酸序列插入质粒载体中，得到重组表达载体；

（2）将所述重组表达载体导入大肠杆菌，进行细胞培养；

（3）收集细胞并进行裂解，得到细胞裂解液，过滤，并进行蛋白质纯化，收集毒害艾美耳球虫SAG13蛋白；

（4）将所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白与佐剂混合，得到所述毒害艾美耳球虫亚单位疫苗，所述毒害艾美耳球虫SAG13蛋白和所述佐剂的体积比为1:(0.5~3)。

12.权利要求1或2所述的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗在制备预防毒害艾美耳球虫感染的药物中的应用。

13.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的毒害艾美耳球虫亚单位疫苗。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括辅料。