CN110559432A

CN110559432A - 一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110559432A
Application number: CN201910961262.7A
Authority: CN
Inventors: 李祥瑞; 严若峰; 宋小凯; 徐立新; 黄剑梅
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2039-10-11
Also published as: CN110559432B

Abstract

本发明公开了一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用。一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗，所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗是由PLGA包裹重组蛋白EaMIC3形成的纳米粒子，所述的重组蛋白EaMIC3为堆型艾美耳球虫微线蛋白3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明将EaMIC3重组蛋白包被于纳米材料PLGA形成了一个全新的疫苗形式，得到免疫保护效果较高的堆型艾美耳球虫PLGA纳米亚单位疫苗。

Description

一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物兽药技术领域，涉及一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

鸡球虫病是由艾美耳属原生动物寄生虫引起的肠道疾病，是世界上最重要的家禽疾病之一。鸡球虫病的发病率为50-70％，死亡率为20-30％，严重时高达80％。鸡球虫病可导致鸡肠道发生广泛损伤，感染鸡体重减轻，饲料转化率降低，蛋鸡出现产蛋率下降，每年给养禽业造成的经济损失超过30亿美元。目前，控制鸡球虫病主要方法是在饲料中添加精确计量的抗球虫药物。但是长期使用抗球虫药物导致耐药虫株不断出现，使药物防治鸡球虫的效果明显降低。近年来，抗微生物药物耐药性的广泛出现引起了人们对抗微生物药物的安全性及其对人类健康、动物健康和环境的潜在影响的关注。此外，欧洲兽医联合会在2016年发布了一份关于主张加强对抗球虫药物监管的文件，表明了其加强对抗球虫药物监管的立场。抗球虫药物在使用过程中产生的抗球虫药残留，严重影响了动物源食品安全。人们对无药物残留防治鸡球虫方法的需求日益迫切。研究发现，免疫预防可以解决药物残留问题。具有抗球虫作用的球虫活疫苗和亚单位疫苗的免疫预防方法，被认为是控制球虫病的理想方法。当前市售的抗鸡球虫疫苗均为球虫活疫苗，虽然球虫活疫苗控制球虫病的效果优良，但球虫活疫苗因其生产量有限、难保存、使用方法不易控制、成本高，存在毒力可能返强、易散毒等安全性问题和免疫效果问题，难以满足现代养鸡业的需求。近年来，分子生物学领域发展迅速，促使亚单位疫苗的诞生。亚单位疫苗只含有病原体的一种产生保护性免疫应答所必需的免疫原蛋白成分，具有不能在鸡体内复制、对鸡无致病性、不散毒等特点。将亚单位疫苗接种鸡后，可使鸡在获得抗性的同时增强机体抵抗球虫感染的能力，而且亚单位疫苗具有使用安全、性质稳定，方便运输，生产成本低等优点，因此，亚单位疫苗极具研究意义。此外，亚单位疫苗在畜禽疫病防控上发挥日益重要的作用。但是目前商品化的亚单位疫苗极少。纳米技术的不断发展使设计不同成分、大小、形状和表面特征的纳米颗粒成为可能，也为纳米颗粒应用于医学领域创造机会。由于纳米颗粒大小与细胞成分相似，故能通过细胞内吞机制，尤其是胞饮作用进入活细胞。纳米颗粒作为疫苗载体运输工具和免疫增强剂被广泛应用，不仅能够提高抗原的稳定性、增强抗原的递呈和免疫原性，同时也能够靶向性递呈抗原和缓慢释放。此外，纳米颗粒正在改变疾病的诊断，以及为疾病预防和治疗提供生物活性物质。聚乙丙交酯(PLGA)具有良好的生物相容性和生物降解性，是美国FDA和欧洲药物管理局批准用于临床治疗的纳米材料，已经在HIV DNA疫苗中显示出了良好的免疫增强效果。目前未见PLGA纳米亚单位疫苗在鸡球虫的应用研究报道。

国际上公认的鸡球虫病病原体有7种，分别为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)，早熟艾美耳球虫(E.praecox)和和缓艾美耳球虫(E.mitis)。其中堆型艾美耳球虫(E.acervulina)为分布最广泛危害最为严重的虫种之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗。

本发明的另一目的是提供该堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗的制备方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗，所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗是由PLGA包裹重组蛋白EaMIC3形成的纳米粒子，所述的重组蛋白EaMIC3为堆型艾美耳球虫微线蛋白3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的重组蛋白EaMIC3优选将E.acervulina重组表达质粒pET-32a-EaMIC3 ORF在转入大肠杆菌中进行表达，将表达出来的重组蛋白EaMIC3经His蛋白纯化柱纯化所得。

所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗粒径为143nm-186nm。

本发明所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗的制备方法，包含以下步骤：

(1)将E.acervulina重组表达质粒pET-32a-EaMIC3 ORF转化E.coli BL21感受态细胞，得到含有pET-32a-EaMIC3 ORF重组表达质粒的大肠杆菌；

(2)表达纯化堆型艾美耳球虫重组蛋白EaMIC3；

(3)制备纳米亚单位疫苗PLGA-EaMIC3：制备PLGA的二氯甲烷溶液，其中PLGA的质量体积浓度为4～5g/100mL；向PLGA的二氯甲烷溶液中加入5％PVA，涡旋混匀1～2min；冰浴条件下，超声破碎3～5min；边涡旋边逐滴加入步骤(2)制备的重组蛋白EaMIC3溶液，涡旋混匀1～2min；冰浴条件下，超声破碎3～5min，形成乳白色的初乳液；往初乳液中边涡旋边加入5％PVA，冰浴条件下超声破碎3～5min，形成复乳液；将超声后获得的复乳液边搅拌边挥发，直至有机溶剂挥发尽；冷冻超速离心机28000～30000r/min离心30～40min；离心结束后，分别收集上清和沉淀；用去离子水重悬超速离心后获得的沉淀得到PLGA包裹的重组蛋白混悬液，将其置于西林瓶中，-80℃放置1.5～2h，再将其转移到真空冷冻干燥机中，冷冻干燥20～24h得所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗；其中，每次加入5％PVA的体积为PLGA的二氯甲烷溶液体积的2～2.5倍。

步骤(1)中所述的E.acervulina重组表达质粒pET-32a-EaMIC3 ORF的构建方法优选见张振超,鸡堆型艾美耳球虫微线蛋白在侵入部位特异性中的作用.南京农业大学博士学位论文，2016。

步骤(2)表达纯化堆型艾美耳球虫重组蛋白EaMIC3方法优选：将含有pET-32a-EaMIC3 ORF重组表达质粒的大肠杆菌按1:80～120体积比例接种于LB液体培养基，37℃,200r/min培养至OD₆₀₀为0.4-0.6时，加入终浓度为0.8～1mmol/L的IPTG进行诱导表达，将表达出来的重组蛋白EaMIC3经His蛋白纯化柱纯化得纯化的堆型艾美耳球虫重组蛋白EaMIC3。

步骤(3)中每次超声破碎功率优选40～50W，超声3～5s，间隔5s。

本发明所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗在制备预防鸡堆型艾美耳球虫感染的药物中的应用。

本发明具有以下优点和效果：

(1)目前未见堆型艾美耳球虫PLGA纳米亚单位疫苗的研究与报道，本发明填补了堆型艾美耳球虫PLGA纳米亚单位疫苗研究的空白。(2)堆型艾美耳球虫微线蛋白3(EaMIC3)存在于堆型艾美耳球虫子孢子的顶端，并且能够与鸡的十二指肠上皮细胞结合，此外，EaMIC3的抗血清能够显著的抑制堆型艾美耳球虫侵入宿主细胞，表明EaMIC3与子孢子侵入过程相关。本发明将EaMIC3重组蛋白包被于纳米材料PLGA形成了一个全新的疫苗形式，EaMIC3重组蛋白与纳米材料PLGA包被以后，抗球虫指数(ACI)得到提升(由173.76提升为176.6)，说明其对堆型艾美耳球虫的免疫保护效果得到增强。(3)本发明对报道的纳米材料的包埋工艺进行了改进，将PVA的浓度由报道的1％提升到5％，纳米疫苗的包埋率得到显著提升。

附图说明

图1SDS-PAGE分析纯化后的EaMIC3融合蛋白。

M：蛋白Mark(kDa)；1：纯化后的EaMIC3融合蛋白

图2纳米亚单位疫苗PLGA-EaMIC3的扫描电镜结果。

具体实施方式

基础材料：

1.孢子化卵囊：江苏株堆型艾美耳球虫孢子化卵囊，每3个月经鸡体复壮并孢子化，孢子化率在80％以上(索勋,李国清.鸡球虫病学[M].北京:中国农业大学出版社，1998.)。

2.实验动物：0日龄海兰白雏鸡，购自安海县双利孵禽场，自出壳至实验结束时饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由采食和饮水。

3.菌种：转化了重组表达质粒E.acervulina pET-32a-EaMIC3 ORF(张振超,鸡堆型艾美耳球虫微线蛋白在侵入部位特异性中的作用.南京农业大学博士学位论文，2016)的E.coli BL21菌株。

4.工具酶与试剂：蛋白分子量Marker购自Thermo Fisher Scientific公司；HIS融合蛋白纯化试剂盒(美国GE公司)、聚丙烯酰胺、N,N′-亚甲双丙烯酰、考马斯亮蓝购自上海化学试剂分装厂；聚乙丙交酯(PLGA,Poly(D,L-lactide-co-glycolide)lactide:glycolide 65:35,Mw 40000-75000)、聚乙烯醇(PVA,Poly(vinyl alcohol),Mw 31000-50000)购自Sigma Aldrich公司；其余试剂为国产分析纯。

5.主要仪器设备：冷冻台式离心机(Eppendorf centrifuge 5417R)；紫外可见分光光度计(Bio-Rad)；空气浴摇床(THZ，江苏太仓市实验设备厂)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)；冷冻超速离心机(美国Beckman Coulter公司)；真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)；扫描电子显微镜(日本JEOL JSM-IT100)。

实施例1.堆型艾美耳球虫重组蛋白EaMIC3的表达纯化

1.基因工程菌制备

将E.acervulina pET-32a-EaMIC3 ORF(张振超,鸡堆型艾美耳球虫微线蛋白在侵入部位特异性中的作用.南京农业大学博士学位论文，2016)重组表达质粒转化E.coliBL21感受态细胞，得到含有pET-32a-EaMIC3 ORF重组表达质粒的细菌。

2.堆型艾美耳球虫重组蛋白EmMIC3的表达纯化

将含有pET-32a-EaMIC3 ORF重组表达质粒的细菌按1:100体积比例接种于LB液体培养基，37℃,200r/min培养至OD₆₀₀为0.4-0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。按照GE公司蛋白纯化试剂盒说明书对EaMIC3重组蛋白进行纯化，将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析纯化情况，结果表明该重组蛋白纯化效果良好(附图1)。用PEG20000浓缩纯化获得的EaMIC3重组蛋白，用0.22μm滤器过滤除菌，再用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，然后将该重组蛋白用无菌PBS稀释成试验所需的浓度，即为堆型艾美耳球虫重组蛋白亚单位疫苗。

1.纳米亚单位疫苗PLGA-EaMIC3的制备

称取50mg PLGA置于10mL EP管中，加入1mL二氯甲烷(通风橱中操作)，用二氯甲烷溶解PLGA；加入2mL 5％PVA逐滴加入到已经溶解的PLGA中，边涡旋边滴加，涡旋混匀1min；冰浴条件下，超声破碎5min(超声功率40W，超声5s，间隔5s)；边涡旋边逐滴加入5mg蛋白溶液，涡旋混匀1min；冰浴条件下，超声破碎3min(超声功率40W，超声5s，间隔5s)，形成乳白色的初乳液；往初乳液中边涡旋边加入2mL 5％PVA，冰浴条件下超声破碎5min(超声功率40W，超声5s，间隔5s)，形成复乳液；将超声后获得的复乳液置于通风橱中，边搅拌边挥发，直至有机溶剂挥发尽；冷冻超速离心机30000r/min离心30min；离心结束后，分别收集上清和沉淀；测量上清总体积和上清中蛋白含量，计算PLGA包裹重组蛋白的包埋率(包埋率＝(加入的蛋白总量-上清中的蛋白含量)/加入的蛋白总量×100％)；用2mL去离子水重悬超速离心后获得的沉淀，将其置于5mL西林瓶，将PLGA包裹的重组蛋白混悬液放入西林瓶中，-80℃放置2h，再将其转移到真空冷冻干燥机中，冷冻干燥24h；取出样品，将PLGA纳米亚单位疫苗置于4℃保存，备用。取出少量PLGA纳米亚单位疫苗冻干粉送上海擎奥检测技术有限公司进行扫描电子显微镜观察。结果发现PLGA包裹重组蛋白亚单位疫苗的包埋率为82.3％，PLGA纳米亚单位疫苗的粒径约为143nm-186nm(附图2)。

实施例2.堆型艾美耳球虫重组蛋白亚单位疫苗和纳米亚单位疫苗的免疫保护性检测1.试验设计

0日龄海兰白雏鸡饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由饮水采食。14日龄鸡逐只称重，淘汰体重过重和过轻的个体，随机分组并调整各试验组间的平均体重，使平均体重接近一致，每组15羽；分别用重组蛋白EaMIC3、pET-32a标签蛋白、PLGA，以及PLGA纳米材料包裹重组蛋白制备而成的纳米亚单位疫苗PLGA-EaMIC3和PLGA-pET-32a标签蛋白经腿部肌肉注射免疫鸡，免疫剂量为100μg，21日龄时进行加强免疫，28日龄时经口感染新鲜的E.acervulina孢子化卵囊10×10⁴个/羽，并设感染非免疫组(红对照组)和非感染非免疫组(白对照组)，共7组。各组分别于首免、攻虫和剖杀时逐只称重。攻虫后7天(35日龄)剖杀并逐只进行肠道病变记分和卵囊计数，分组情况见表1。

表1重组蛋白亚单位疫苗及PLGA纳米亚单位疫苗免疫程序

2.免疫保护效果的观察

2.1增重效果

在首次免疫时、攻虫时和宰杀时对试验鸡逐只称重，计算平均增重和相对增重率。

平均增重＝宰杀时重一攻虫时重

相对增重率(％)＝试验组平均增重/非感染非免疫组平均增重×100

2.2肠道病变记分

攻虫后7天宰杀全部鸡，逐只观察肠道病变，并按Johnson病变记分方法(索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京：中国农业大学出版社，1998,257-258,296-298)进行肠道病变记分。具体记分方法如下：

感染E.acervulina后小肠病变记分：

0分，无肉眼可见病变。

+1分，十二指肠浆膜面有散在白色斑，每平方厘米不超过5处。

+2分，白色斑增多但不融合，形成白色梯形条纹状外观，3周龄以上的鸡，病变可扩展到十二指肠下20cm，肠壁不增厚，内容物正常。

+3分，白色病灶增多且融合成片，小肠壁增厚；内容物呈水样，病变蔓延到卵黄囊憩室之后。+4分，被感染的肠绒毛缩短融合，十二指肠和小肠粘膜呈灰白色，肠壁高度肥厚，肠内容物呈奶油状。死亡鸡只也计为+4分。

病变记分减少率(％)＝(感染非免疫组病变记分-试验组病变记分)/感染非免疫组病变记分×100

2.3卵囊计数

按麦克马斯特法计算卵囊，具体为：攻虫后第7天，宰杀全部鸡，逐只取其肠道，将肠管纵向剖开，用载玻片刮取肠道内容物，混合均匀后称取2g，先加10mL饱和食盐水，搅拌均匀后再加50mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满两个计数室，静置1-2min后，镜检计数两个计数室的卵囊数。计数室容积为1×1×0.15＝0.15mL，0.15mL内含肠道内容物2×0.15/(10+50)＝0.005g，两个计数室则为0.01g，所得卵囊数乘100即为每克肠道内容物卵囊数(OPG)。

卵囊减少率(％)＝(感染非免疫组克卵囊数-试验组克卵囊数)/感染非免疫组克卵囊数×100

2.4抗球虫指数(Anticoccidial Index，ACI)

ACI包括存活率、增重、肠道病变以及卵囊产量等多项指标，综合评定抗球虫药物的效力或疫苗免疫的效果。本研究采用如下ACI计算公式：

ACI＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)

存活率(％)＝(实验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)×100

相对增重率(％)＝(试验组的平均增重/非感染非免疫组的平均增重)×100

病变值(0-40)＝各试验组的平均病变记分(0-4)×10

卵囊值(0～40)的转化标准如下：E.acervulina肠内容物卵囊值取决于试验组卵囊数占感染非免疫组的比例(％)，若此比例(％)为0～1.0％，卵囊值则计为0，若为1％～25％，则计为1，若为26％～50％，则计为10，若为51％～75％，则计为20，若为76％～100％，则计为40。

3免疫保护效果分析

根据SPSS 25软件统计分析结果显示(表2)：首免时选择体重相近的鸡进行免疫，各组间体重差异不显著(P>0.05)，表明试验分组平均、合理；平均增重代表疫苗免疫对鸡的保护作用；试验所用重组蛋白亚单位疫苗EaMIC3和PLGA纳米亚单位疫苗PLGA-EaMIC3对鸡感染E.acervulina后的平均增重均显著高于感染非免疫组和标签蛋白对照组的平均增重(P<0.05)；EaMIC3组与PLGA-EaMIC3组的平均增重差异不显著(P>0.05)，其余试验组之间差异也不显著(P>0.05)；说明上述重组蛋白亚单位疫苗EaMIC3和PLGA纳米亚单位疫苗PLGA-EaMIC3能够缓解鸡在感染E.acervulina时对体重的负面影响，且具有保护效果。上述亚单位疫苗和PLGA纳米亚单位疫苗免疫组鸡的OPG和肠道病变记分均明显低于感染非免疫组，差异显著(P<0.05)；各试验组的卵囊减少率和肠道病变记分减少率高于感染非免疫组和标签蛋白免疫组。说明重组蛋白亚单位疫苗EaMIC3和PLGA纳米亚单位疫苗PLGA-EaMIC3能够不同程度的减少E.acervulina感染后的卵囊排出量和减轻肠道的病变，对E.acervulina感染均具有不同程度的免疫保护力。亚单位疫苗EaMIC3的抗球虫指数(ACI)为173.76，大于160，表明其对E.acervulina具有良好的免疫保护效果；纳米亚单位疫苗PLGA-EaMIC3的ACI为176.6，大于160，表明其对E.acervulina具有良好的免疫保护效果。PLGA纳米材料包裹亚单位疫苗，可使亚单位疫苗的ACI获得提升(ACI由173.76提升为176.6)，表明纳米亚单位疫苗PLGA-EaMIC3的免疫保护效果比亚单位疫苗EaMIC3的强。

表2亚单位疫苗和纳米亚单位疫苗对堆型艾美耳球虫感染的免疫保护效果评价

备注：抗球虫指数(ACI)的判定标准：当ACI>180时，为保护效果优秀；当ACI＝160～180时，为保护效果良好；当ACI＝120～160时，为保护效果差；ACI<120时，为无保护效果。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 868

<212> PRT

<213> 堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina )

<400> 1

Met Pro Val Tyr Ala Arg Tyr Asp Gly Arg Ser Asn Asn Val Asn Ser

1 5 10 15

Lys Glu Trp Arg Cys Tyr Thr Glu Asp Ala Leu Asn Phe Glu Val Ala

20 25 30

Arg Ala Ser Cys Val Asp Thr Cys Gly Lys Leu Lys Met Cys Leu Gly

35 40 45

Ala Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Arg His Ser Lys Leu

50 55 60

Ser Ser Gln Leu Asp Glu Leu Lys Pro Glu Tyr Cys Ser Ala Pro Ala

65 70 75 80

Pro Thr Leu Gln Glu Ala Leu Asp Arg Lys Cys Ala Gly Phe Gly Glu

85 90 95

Glu Ala Cys Lys Gln Gly Leu Trp Ala Tyr Cys Asn Val Thr Met Tyr

100 105 110

Ala Arg Tyr Asp Val Gly Thr Ala Ser Gln Lys Ala Arg Glu Trp Arg

115 120 125

Cys Tyr Ala Gln Asp Ala Leu Asp Phe Asp Ile Ser Gly Asn Gly Cys

130 135 140

Val Asp Asp Cys Gly Asn Phe Thr Ser Cys Arg Gly Ala Val Asn Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr His Leu Ser Arg Val Gly Gln Leu Arg Asp Phe Met

165 170 175

Thr Ser Asn Arg Asp Phe Tyr Cys Leu Ser Ser Thr Glu Glu Ala Pro

180 185 190

Val Glu Ser Glu Asp Val Asp Ser Ala Glu Ala Ser Glu Ser Thr Thr

195 200 205

Leu Ser Ser Asn Pro Thr Ser Asn Leu Gln Ser Ala Leu Asp Lys Val

210 215 220

Cys Ala Glu Glu Gly Lys Lys Ala Cys Glu Gln Gly Leu Lys Ala Tyr

225 230 235 240

Cys Asp Ala Asp Met Phe Ala Arg His Asp Val Gly Thr Gly Ser Gln

245 250 255

Arg Asn Arg Glu Trp Arg Cys Tyr Val Arg Glu Ser Leu Asp Phe Gly

260 265 270

Ile Ser Gly Asp Gly Cys Val Asp Asp Cys Gly Asn Ala Thr Pro Cys

275 280 285

Leu Gly Ala Val Asn Gly Thr Ser Thr Thr His Leu Ser Arg Asp Ala

290 295 300

Gln Val Gly Ser Ala Ile Asn Ala Asn Lys Asp Glu Phe Cys Gly Arg

305 310 315 320

Ala Ser Glu Ser Pro Ala Ala Pro Glu Glu Ser Val Glu Val Gln Glu

325 330 335

Thr Thr Ala Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ser Gln Leu Gln Glu Val Leu

340 345 350

Asp Asn Leu Cys Ala Glu Glu Gly Arg Arg Ala Cys Gln Gly Gly Leu

355 360 365

Ser Ala Tyr Cys Glu Ala Asp Met Phe Ala Arg His Asp Val Gly Thr

370 375 380

Glu Gln Gln Arg Thr Arg Glu Trp Arg Cys Tyr Ala Gln Pro Ser Leu

385 390 395 400

Asp Phe Asp Ile Ser Gly Asp Gly Cys Val Asp Asp Cys Gly Asn Ile

405 410 415

Thr Ser Cys Leu Gly Ala Val Asn Gly Thr Ser Thr Thr His Leu Ser

420 425 430

Arg Asn Ala Gln Val Ala Ser Ala Ile Asp Ala Asn Lys Gly Glu Phe

435 440 445

Cys Gly Arg Thr Ser Glu Ser Pro Ala Ala Ser Glu Lys Glu Glu Ser

450 455 460

Val Glu Val Gln Gly Thr Thr Thr Thr Pro Pro Ser Gly Pro Leu Arg

465 470 475 480

Met Gln His Phe Val Asp Glu Phe Cys Leu Glu Glu Ala Lys Arg Ala

485 490 495

Cys Gln Asn Gly Leu Ser Ala Tyr Cys Asp Ala Thr Val Ile Ala Arg

500 505 510

His Asp Val Gly Thr Glu Gln Gln Arg Thr Lys Glu Trp Arg Cys Tyr

515 520 525

Val Ile Asp Ser Leu Asp Phe Asp Leu Ser Gly Asp Gly Cys Val Asp

530 535 540

Asp Cys Gly Asn Ile Ile Ser Cys His Gly Ala Val Asn Gly Thr Ser

545 550 555 560

Thr Thr His Leu Thr Arg Asp Asp Ala Val Asn Thr Ala Ile Asp Ser

565 570 575

Lys Leu Asp Glu Phe Cys Asn Pro Thr Ser Glu Ser Pro Glu Ala Ser

580 585 590

Glu Lys Lys Glu Ser Val Glu Val Pro Glu Thr Thr Ala Leu Pro Ser

595 600 605

Asn Pro Pro Ser Asn Leu Gln Ala Leu Val Asp Gly Phe Cys Ala Glu

610 615 620

Glu Gly Arg Lys Ala Cys Gly Gln Gly Leu Lys Ala Tyr Cys Asp Ala

625 630 635 640

Asp Met Phe Ala Arg His Asp Val Gly Thr Gly Ser Gln Arg Asn Arg

645 650 655

Glu Trp Arg Cys Tyr Ala Arg Glu Ser Leu Asp Phe Gly Ile Ser Gly

660 665 670

Asp Gly Cys Val Asp Asp Cys Gly Asn Leu Thr Ser Cys Leu Gly Ala

675 680 685

Val Asn Gly Ser Ser Thr Thr His Leu Ser Arg Gly Glu Ser Ile Gln

690 695 700

Glu Leu Ile Asp Thr Glu Lys Ala Gly Arg Cys Thr Leu Glu Glu Gly

705 710 715 720

Glu Glu Ala Ser Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Val Pro Glu Val Pro

725 730 735

Ala Gly Gly Pro Ala Ser Glu Val Ser Asp Lys Gly Leu Lys Val Pro

740 745 750

Pro Arg Val Pro Gly Gly Gly Ala Leu Gln Glu Ile Ile Asp Val Lys

755 760 765

Cys Met Val Phe Phe Ala Lys Gln Cys Val Thr Asp Glu Ser Thr Cys

770 775 780

Gln Tyr Ala Val Ala Arg Arg Ile Gly Ser Thr Trp Lys Cys Tyr Pro

785 790 795 800

Tyr Gly Ala Val Asp Asp Ser Gln Ser Gly Asp Ala Cys Thr Asp Asp

805 810 815

Cys Gly Asn Ala Ile Asn Cys Pro Gly Ile Pro Lys Asn Gly Asp Ala

820 825 830

Asp Gly Ile Arg Ile Pro Val Leu Asp Gly Leu Phe Glu Glu Leu Lys

835 840 845

Ser Gly Thr Cys Lys Met Ser Lys Glu Gln Glu Leu Lys Lys Val His

850 855 860

Val His Arg Gln

865

Claims

1.一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗，其特征在于其特征在于所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗是由PLGA包裹重组蛋白EaMIC3形成的纳米粒子，所述的重组蛋白EaMIC3为堆型艾美耳球虫微线蛋白3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗，其特征在于所述的重组蛋白EaMIC3是将E.acervulina重组表达质粒pET-32a-EaMIC3 ORF在转入大肠杆菌中进行表达，将表达出来的重组蛋白EaMIC3经His蛋白纯化柱纯化所得。

3.根据权利要求1所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗，其特征在于所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗粒径为143nm-186nm。

4.权利要求1所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(2)表达纯化堆型艾美耳球虫重组蛋白EaMIC3；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的E.acervulina重组表达质粒pET-32a-EaMIC3 ORF的构建方法见张振超,鸡堆型艾美耳球虫微线蛋白在侵入部位特异性中的作用.南京农业大学博士学位论文，2016。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(2)表达纯化堆型艾美耳球虫重组蛋白EaMIC3方法为：将含有pET-32a-EaMIC3重组表达质粒的大肠杆菌按1:80～120体积比例接种于LB液体培养基，37℃,200r/min培养至OD₆₀₀为0.4-0.6时，加入终浓度为0.8～1mmol/L的IPTG进行诱导表达，将表达出来的重组蛋白EaMIC3经His蛋白纯化柱纯化得纯化的堆型艾美耳球虫重组蛋白EaMIC3。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中每次超声破碎功率40～50W，超声3～5s，间隔5s。

8.权利要求1所述的堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗在制备预防鸡堆型艾美耳球虫感染的药物中的应用。