CN105524149A - 一种结核分枝杆菌蛋白hbha及其表达方法和亚单位疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了毕赤酵母GS115菌株表达的结核分枝杆菌蛋白HBHA。所述蛋白HBHA，其编码基因为基因突变后的结核分枝杆菌标准毒株H37Rv的HBHA基因。本发明利用毕赤酵母GS115菌株表达的无标签蛋白HBHA不含有除HBHA本身序列外的其他序列，配合相应的疫苗佐剂PLGA/TDB/MPL的免疫反应效果好，抗H37Rv标准毒株感染的保护性好，且安全性高。

Description

一种结核分枝杆菌蛋白HBHA及其表达方法和亚单位疫苗
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌蛋白HBHA及其表达方法和亚单位疫苗。
背景技术
肝素结合血凝素(HBHA)是M.tb、BCG、麻风分枝杆菌(M.leprae)等表面表达和分泌的一种糖蛋白，可同时出现在菌体和培养液中。HBHA能够粘附到上皮细胞和其他非吞噬细胞，有利于M.tb从初次感染部位的体内扩散。
翻译后修饰对HBHA蛋白的免疫原性有重要影响。天然HBHA免疫小鼠后，不但能诱导小鼠产生高水平IFN-γ和抗体，并且能够有效减少感染小鼠的脾、肺脏荷菌量和病理改变，其产生的免疫效果甚可达到BCG的相应水平。鉴于天然HBHA在预防结核病方面的重要作用，需要对其进行大规模的纯化制备以备进一步的进行临床研究应用。但是大规模的纯化制备受表达系统的制约，如大肠杆菌表达系统表达的蛋白HBHA不能进行翻译后修饰，耻垢分枝杆菌表达的蛋白HBHA不适宜大规模生产等。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种毕赤酵母GS115表达的结核分枝杆菌蛋白HBHA及亚单位疫苗，其目的在于获取不含有除蛋白HBHA本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白HBHA，并对其进行大规模的纯化制备以备进一步的进行临床研究应用，配合本发明提供的疫苗佐剂，用于预防结核病，由此解决了大规模的纯化制备受表达系统的制约的问题。
本发明首先提供一种肝素结合血凝素蛋白(HBHA)，包含有：
1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白质；
2)与序列SEQIDNO:1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
上述蛋白质的表达方法，是将核苷酸序列为SEQIDNO:2的基因的的第267碱基由原先的G突变为A；再将突变后的基因片段插入到毕赤酵母表达载体中，构成的重组质粒转入毕赤酵母中进行表达，纯化后获得目的蛋白。
本发明另一个方面提供一种结核病亚单位疫苗，含有所述的HBHA蛋白和疫苗佐剂；其中HBHA蛋白的浓度为0.25～0.75mg/mL：
所述的亚单位疫苗中脂质体形式的DTM疫苗佐剂的使用浓度如下：0.5～2mg/ml二甲基双十八烷基铵、含有0.25～0.75mg/mL的海藻糖，0.25～0.75mg/mL的单磷酰脂质A；
所述的亚单位疫苗中溶液形式的PTM疫苗佐剂的使用浓度如下：0.25～0.75mg/mL的海藻糖，0.25～0.75mg/mL的单磷酰脂质A，12.5～37.5mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
本发明选利用毕赤酵母GS115菌株能够表达出的蛋白HBHA无标签且不含有除HBHA本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列，配合相应疫苗佐剂能够取得下列较好的免疫反应效果，免疫保护效果和高安全性。
附图说明
图1：实施例4的PCR鉴定HBHA基因整合于毕赤酵母GS115染色体基因组和蛋白HBHA的表达纯化图；
图2：实施例9的各组小鼠血清蛋白HBHA特异的IgG抗体、亚类及IgG2a/IgG1比值图；
图3：实施例9的蛋白HBHA特异的小鼠脾细胞上清中细胞因子IFN-γ水平图。
图4为实施例10的气溶胶攻击感染免疫C57BL/6小鼠四周后各组的肺脏荷菌量图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的毕赤酵母GS115表达的蛋白HBHA无标签且不含有除HBHA本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列。本发明提供的结核病亚单位疫苗，含有所述的蛋白HBHA，其浓度为0.25至0.75mg/mL，还含有以下两组成分中的一组的：
0.5mg/ml至2mg/ml二甲基双十八烷基铵、含有0.25至0.75mg/mL的海藻糖，0.25至0.75mg/mL的单磷酰脂质A，为脂质体形式；
含有0.25至0.75mg/mL的海藻糖，0.25至0.75mg/mL的单磷酰脂质A，12.5至37.5mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，为溶液形式。
所述蛋白HBHA(氨基酸序列为SEQIDNO:1)，其编码基因是对结核分枝杆菌标准毒株H37Rv的HBHA基因(SEQIDNO:2)的第267碱基由原先的G突变为A获得的，突变后的基因，其在毕赤酵母中的显著提高。
本发明提供的两种疫苗佐剂，分别命名为DTM和PTM。
DTM疫苗佐剂含有1mg/ml至4mg/ml二甲基双十八烷基铵、含有0.5至1.5mg/mL的海藻糖(Trehalose)，0.5至1.5mg/mL的单磷酰脂质A，为脂质体形式。
PTM疫苗佐剂含有0.5至1.5mg/mL的海藻糖，0.5至1.5mg/mL的单磷酰脂质A，25至75mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，为溶液形式。
全球有三分之一的人群感染结核分枝杆菌(M.tb)，其中5％-10％发展为活动性结核病(ATB)。而卡介苗(BCG)作为目前全球范围唯一预防结核病的疫苗能够有效的预防婴幼儿重症结核病如粟粒样TB及结核性脑膜炎，但对预防成人肺TB的发生、发展的效果差异很大。因而迫切需要发展新的结核疫苗，以提高对成人TB的预防效果。
结核病亚单位疫苗，可用来替代BCG或作为增强疫苗增强BCG免疫后的效应，是新发展的控制TB的主要疫苗类型之一。而且，亚单位疫苗应用于免疫缺陷人群相对于BCG更为安全。广泛接受机体抗M.tb的感染主要是依靠细胞免疫应答，尤其是CD4+Th1型应答在抗原发感染上起重要作用，CD8+T细胞在阻止潜伏感染后的再激活，即成人肺TB的发生具有重要作用。BCG免疫主要是诱导机体产生强的CD4+Th1型应答，因此，其在预防儿童的原发感染后所致的原发重症TB较为有效。但是，BCG免疫机体产生CD8+T细胞反应能力较弱，所以对预防潜伏感染和成人肺TB的价值不大。HBHA是M.tb的黏附素，与M.tb感染后在体内的播散密切相关，同时也是一个重要的T细胞抗原。业也证实，单独利用天然HBHA免疫，可以增强BCG的免疫保护效果。拟以该抗原为基础，建立亚单位疫苗，利用其在诱导CD8+T细胞反应上应具有较强的潜力，以补充BCG免疫的不足。M.tb许多蛋白的免疫原性弱，因而需要免疫刺激佐剂来辅助蛋白诱导的免疫反应，如二甲基双十八烷基铵，海藻糖等。二甲基双十八烷基铵与抗原联合在不同类型动物模型均可诱导细胞和体液免疫反应。海藻糖是人工合成的分枝杆菌细胞壁的免疫刺激成分。
巴斯德毕赤酵母表达系统不但具有原核细胞和真核细胞表达系统的特点，还具有高表达、高稳定和高分泌的优点，适合工业化大规模生产。该菌能以甲醇作为唯一碳源时，其醇氧化酶(AOX)高表达。AOX的合成是在转录水平调控的，基因启动子PAOX具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。当AOX1基因的启动子PAOX1受甲醇强烈诱导时其催化活性很强。外源蛋白的高水平表达依赖于多拷贝基因的插入整合，引入Tn903Kan基因(抗G418)后，有助于筛选高拷贝转化子，酵母菌抵抗G418的能力与其整合质粒的拷贝数成正比。因此，用含不同浓度G418的YEPD平板可筛选高拷贝转化子。近几年来，已经有许多M.tb的外源蛋白在此系统中得到表达，包括培养滤液蛋白32(CFP32)；热休克蛋白70(HSP70)；MPT64；M.tbRv0577基因；ESAT6等。
本发明中佐剂成分TDB、DDA、MPL和PLGA均具备安全性。利用毕赤酵母GS115表达的M.tb的许多蛋白的免疫原性弱，因而需要免疫刺激佐剂来辅助蛋白诱导的免疫反应。无标签蛋白HBHA不含有除蛋白HBHA本身序列外的其他序列，配合佐剂PTM和DTM疫苗佐剂诱导较好的免疫反应效果和抗感染保护效果。疫苗组诱导最高水平的HBHA特异的IgG，IgG1和IgG2a抗体和IgG2a/IgG1比值(P<0.05)，而BCG组的这些指标高于佐剂组(P<0.05)。疫苗组诱导的免疫反应倾向于TH1型免疫反应。PBS组，DTM和PTM疫苗佐剂组蛋白HBHA特异的IFN-γ水平最低。所有疫苗组诱导蛋白HBHA特异的IFN-γ显著高于BCG组(P<0.05)。两种无标签疫苗组诱导蛋白HBHA特异的IFN-γ显著高于对应的有标签疫苗组(P<0.05)。PTM疫苗佐剂辅助的疫苗组诱导蛋白HBHA特异的IFN-γ显著高于DTM疫苗佐剂辅助的疫苗组(P<0.05)。PTM/HBHA-无标签疫苗组诱导最高水平的蛋白HBHA特异的IFN-γ。PBS组，DTM和PTM疫苗佐剂组小鼠肺脏荷菌量最高，而BCG组肺脏荷菌量最低(P<0.05)。DTM疫苗佐剂辅助的疫苗组肺脏荷菌量相当。PTM/HBHA-无标签疫苗组肺脏荷菌量显著高于PTM/HBHA-有标签疫苗组(P<0.05)。PTM疫苗佐剂辅助的疫苗组肺脏荷菌量显著高于DTM疫苗佐剂辅助的疫苗组(P<0.05)。
以下为实施例：
实施例1有标签蛋白HBHA毕赤酵母表达载体的构建
1、目的基因获取：
根据HBHA基因的全序列及表达载体pPIC9K质粒上的多克隆位点设计引物，引物序列由上海生工生物公司合成，并按照说明将引物稀释成100pmol/μL，-20℃保存备用，其中，HBHA-Re引物加入了18个his-Tag碱基。
HBHA-Fwd：(SnaBI)-CTACGTAATGGCTGAAAACTCGAAC
HBHA-Re：(EcoRI)-GGAATTCTTACACCACCACCACCACCACCTTCTGGGTGAC以合成基因为模板，建立PCR反应体系，并进行PCR扩增。PCR反应体系如下：
94℃5min，然后94℃50s，60℃40s，72℃50s，30个循环，然后72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果并回收PCR产物，-20℃保存。
2、重组质粒pPIC9K-HBHA的构建：
将回收的PCR产物和载体pPIC9K质粒分别进行双酶切，酶切体系为：
将回收的HBHA基因(大小约为600bp)与载体pPIC9K质粒按照如下条件进行连接反应：
室温过夜。将重组质粒经CaCl2和热休克法转入E.coliTop10菌株，经抗性筛选，双酶切鉴定后获取阳性克隆。
实施例2无标签HBHA基因的基因突变
对获得的H37RvHBHA基因(SEQIDNO:2)的序列进行遗传分析，将第267碱基由原先的G突变为A，突变后的基因，其在毕赤酵母中的表达效率明显提高,以保证后续实验设计的正常进行。基因突变由上海英俊生物公司完成并构建于pET30b(+)质粒。
实施例3无标签蛋白HBHA毕赤酵母表达载体的构建
1、目的基因获取：
根据HBHA基因的全序列及原核表达载体pPIC9质粒上的多克隆位点设计引物，引物序列由上海生工生物公司合成，并按照说明将引物稀释成100pmol/μL，-20℃保存备用。
HBHA-Fwd：(XhoI)-CCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGGCTGAAAACTCGAAC
HBHA-Re：(EcoRI)-GGAATTCTTACTTCTGGGTGACCTTCTTGGC以合成基因为模板，建立PCR反应体系，并进行PCR扩增。PCR反应体系如下：
94℃5min，然后94℃50s，60℃40s，72℃50s，30个循环，然后72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果并回收PCR产物，-20℃保存。
2、重组质粒pPIC9-HBHA的构建：
将回收的PCR产物和载体pPIC9质粒分别进行双酶切，酶切体系为：
将回收的HBHA基因(大小为600bp)与载体pPIC9质粒按照如下条件进行连接反应：
室温过夜。将重组质粒经CaCl2和热休克法转入E.coliTop10菌株，经抗性筛选，双酶切鉴定后获取阳性克隆。
3、重组质粒pPIC9K-HBHA的构建：
将pPIC9-HBHA和载体pPIC9K质粒分别进行双酶切，酶切体系为
将回收的HBHA基因(大小为850bp)与载体pPIC9K质粒按照如下条件进行连接反应：
室温过夜。将重组质粒经CaCl2和热休克法转入E.coliTop10菌株，经抗性筛选，双酶切鉴定后获取阳性克隆。
实施例4有标签和无标签蛋白HBHA的表达纯化
1、SacI线性化有标签和无标签pPIC9K-HBHA
37℃孵育1h，加1/10体积3M醋酸钠，2倍体积无水乙醇，-20℃醇沉过夜。12000rpm离心收集沉淀，加入10μL灭菌ddH2O，-20℃保存。
2、制备毕赤酵母GS115感受态细胞
挑取酵母单菌落，接种于5mLYPD培养基(30℃250rpm/min孵育过夜)；取100μL菌液接种于50mLYPD培养基(30℃，250rpm/min孵育，至OD600达到1.3～1.5)；将菌液收集到50mL无菌冰预冷的离心管(4℃4500rpm离心20min)；20mL冰预冷的无菌水重悬菌体(4℃4500rpm离心20min)；20mL冰预冷的无菌水重悬菌体(4℃4500rpm离心20min)；2.5mL冰预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体(4℃4500rpm离心20min)；将菌体转移到冰预冷的1.5mL的EP管，0.1mL冰预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体；80μL/EP管(冰预冷的)，-80℃保存。
3、有标签和无标签pPIC9K-HBHA线性化质粒转化毕赤酵母GS115感受态细胞
取80μL感受态细胞加入到10μL(约8μg)线性化有标签或无标签pPIC9K-HBHA质粒，均匀混合，转至0.2cm电转化杯中，预冷10min。电击：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间4.8ms。电击后立即加入1mL1mol/L山梨醇。相同条件下以pPIC9K质粒转化感受态细胞作阴性对照。转移电击杯中菌液到1.5mL离心管，30℃温育1h。将菌液涂布MD平板(30℃孵育至单克隆出现)，其余-40℃冻存。
4、1-5mg/mLG418筛选高拷贝转化子
1mL无菌水涂布MD平板，用涂布棒小心将菌落重悬于无菌水中，将重悬液转移到50mL离心管中(震摇10s)，使用722分光光度计OD＝600测OD值(1OD＝5*107/mL)；将105个细胞涂布含G418的YEPD平板，浓度为1，2，3，4，5mg/mL(30℃孵育至单克隆出现)，剩余重悬液15％甘油-80℃冻存。
5、PCR鉴定HBHA基因整合于毕赤酵母GS115染色体基因组
1)提取毕赤酵母菌GS115总DNA基因组
使用Takara公司酵母基因组DNA提取试剂盒提取毕赤酵母菌GS115总DNA基因组。
2)PCR反应
94℃5min，然后94℃50s，60℃40s，72℃50s，30个循环，然后72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。实验结果如图1A所示，有标签和无标签的HBHA基因均成功整合到毕赤酵母GS115染色体基因组。
6、有标签和无标签蛋白HBHA的表达纯化
挑取抗5mg/mLG418单克隆接种于10mLBMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，10％磷酸缓冲液，1％甘油)培养基(30℃225rpm振摇24h)，转摇至100mLBMGY(摇至OD＝3.0)，离心收集菌体并重悬于20mLBMMY培养基(30℃225rpm振摇120h)诱导表达，按不同时间取1mL上清(48、96h)。同时以pPIC9K质粒转化感受态细胞，在相同条件下诱导表达作为阴性对照。由图2B所示：经SDS-PAGE证实1％甲醇成功诱导有标签和无标签蛋白HBHA的表达，大小均约为22kDa，如图1B所示。
按照GEHealth公司SepharoseCL-6B使用说明步骤纯化得到的融合蛋白，使用EndotoxinRemovalSolution试剂盒去除表达蛋白产物中残余内毒素并用0.22μm的滤器过滤除菌，即制得有标签和无标签蛋白HBHA。如图1C所示，用大肠杆菌表达的蛋白HBHA联合弗氏不完全佐剂注射小鼠获得的抗蛋白HBHA特异性血清进行Western-blotting，进一步证实SepharoseCL-6B纯化后有标签和无标签蛋白HBHA的特异性及生物活性。
实施例5疫苗佐剂DDA/TDB/MPL(DTM)的制备
一种DTM疫苗佐剂含有2.5mg/mL二甲基双十八烷基铵、1.0mg/mL的海藻糖，1.0mg/mL的单磷酰脂质A，为脂质体形式。所述海藻糖为人工合成的6,6’-二分枝菌酸。
其制备方法如下：
精确称取2.5mgDDA、1.0mgTDB、1.0mgMPL溶解于氯仿与甲醇混合液中(9:1，v/v)，随后缓慢通入氮气将有机溶剂吹干，直至形成一层白色薄膜。将脂质薄膜在室温下过夜晾干，以除去残留的有机溶剂。以1mLPBS溶解。60℃水浴加热1h(每10min涡旋使其充分溶解)，冷却后即制备成所述DTM疫苗佐剂，为脂质体形式。
实施例6结核病亚单位疫苗DTM/HBHA的制备
一种结核病亚单位疫苗，其特征在于，含有实施例3制备的有标签和无标签蛋白HBHA，其浓度为1mg/mL，含有实施例(5)制备的DTM佐剂，等体积混合，常规机械振荡或搅拌，混合成为均一悬液。
所述结核病亚单位疫苗的制备方法如下：
分别吸取100μL工作浓度为1mg/mL的有标签和无标签蛋白HBHA溶液和100μL实施例(5)中制备的DTM佐剂于无菌EP管中，盖紧管盖后，于漩涡振荡器上间隔震荡2至3分钟，最终形成均匀的乳状液，即制备得所述结核病亚单位疫苗DTM/HBHA。
实施例7疫苗佐剂PLGA/TDB/MPL(PTM)的制备
一种PTM疫苗佐剂含有50mg/mL聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、1.0mg/mL的海藻糖，1.0mg/mL的单磷酰脂质A，为溶液形式。所述海藻糖为人工合成的6,6’-二分枝菌酸。
所述疫苗佐剂PTM的制备方法如下：
精确称取1.0mgTDB、1.0mgMPL溶解于氯仿与甲醇混合液中(9:1，v/v)，随后缓慢通入氮气将有机溶剂吹干，直至形成一层白色薄膜。将脂质薄膜在室温下过夜晾干，以除去残留的有机溶剂。以1mLPBS溶解。60℃水浴加热1h(每10min涡旋使其充分溶解)制成TDB/MPL佐剂溶液。
TDB/MPL混合溶液作为内水相备用。
精密称取50mgPLGA溶于10mL的乙酸乙酯中，配制成一定浓度溶液作为油相。
将2mLTDB/MPL混合溶液的内水相在超声条件下(100W，60S)滴加10mL的油相中，形成乳白色的水/油(Wl/O)初乳溶液。
用1％的PVA溶液作外水相，将初乳溶液在均质乳化条件下(22，000rpm，60S)滴加到40mL的外水相溶液中，形成WI/O/W2复乳。
将WI/O/W2复乳稀释到30mL的0.3％PVA溶液中，搅拌器低速搅拌8h后即得到固化的纳米颗粒。
高速离心机50000rpm离心30min收集制得的纳米颗粒，用超纯水重悬洗涤三次后冷冻干燥24h，即得包裹TDB/MPL的PLGA纳米颗粒。
实施例8结核病亚单位疫苗PLGA/TDB/MPL/HBHA(PTM/HBHA)的制备
一种结核病亚单位疫苗，其特征在于，含有实施例3制备的有标签和无标签蛋白HBHA，其浓度为0.5mg/mL，含有0.5mg/mL的海藻糖，含有0.5mg/mL的单磷酰脂质A，含有25mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，为溶液形式。所述海藻糖为人工合成的6,6’-二分枝菌酸。。
所述结核病亚单位疫苗的制备方法如下：
精确称取1.0mgTDB、1.0mgMPL溶解于氯仿与甲醇混合液中(9:1，v/v)，随后缓慢通入氮气将有机溶剂吹干，直至形成一层白色薄膜。将脂质薄膜在室温下过夜晾干，以除去残留的有机溶剂。以1mLPBS溶解。60℃水浴加热1h(每10min涡旋使其充分溶解)制成TDB/MPL佐剂溶液。
分别吸取100μL工作浓度为1mg/ml的有标签和无标签蛋白HBHA溶液和100μL制备的TDB/MPL佐剂溶液于无菌EP管中，盖紧管盖后，于漩涡振荡器上间隔震荡2至3分钟，最终形成均匀的乳状液，制备得到TDB/MPL/HBHA混合溶液。
TDB/MPL/HBHA混合溶液作为内水相备用。
精密称取50mgPLGA溶于10mL的乙酸乙酯中，配制成一定浓度溶液作为油相。
将2mLTDB/MPL/HBHA混合溶液的内水相在超声条件下(100W，60S)滴加10mL的油相中，形成乳白色的水/油(Wl/O)初乳溶液。
用1％的PVA溶液作外水相，将初乳溶液在均质乳化条件下(22，000rpm，60S)滴加到40mL的外水相溶液中，形成WI/O/W2复乳。
将WI/O/W2复乳稀释到30mL的0.3％PVA溶液中，搅拌器低速搅拌8h后即得到固化的纳米颗粒。
高速离心机50000rpm离心30min收集制得的纳米颗粒，用超纯水重悬洗涤三次后冷冻干燥24h，即得包裹TDB/MPL/HBHA的PLGA纳米颗粒。
实施例9结核病亚单位疫苗的DTM/HBHA和PTM/HBHA的免疫学评价
1、疫苗和佐剂制备
DTM佐剂采用实施例(5)。
DTM/HBHA佐剂采用实施例(6)。
PTM佐剂采用实施例(7)。
PTM/HBHA采用实施例(8)。
2、实验动物及分组
选用6-8周龄、雌性BABL/c小鼠，SPF级，使用商品化饲料及双蒸水喂养。根据实验需要，将实验动物分为以下6组：阴性对照组—PBS组，佐剂对照组—DTM组，佐剂对照组—PTM组，疫苗组—DTM/HBHA组，疫苗组—PTM/HBHA组，阳性对照组—BCG组。每组3只小鼠。
3、动物免疫
均采用皮下注射方式进行免疫，注射体积均为200μL。佐剂组和疫苗组需重复免疫三次，每次间隔3周。BCG组注射体积200μL，含有的菌量为1×106CFU。PBS组和BCG组均免疫1次。
4、ELISA检测免疫小鼠血清抗有标签和无标签蛋白HBHA特异的抗体
1)末次免疫后3周的小鼠，经眼球取血后离心收集血清，并分装后冻存于-20℃；
2)将有标签和无标签蛋白蛋白HBHA按照工作浓度5μg/ml进行稀释，100μL/孔进行常规包被96空板，其中有标签蛋白包被有标签蛋白HBHA疫苗组，无标签蛋白包被无标签蛋白HBHA疫苗组、PBS组、BCG组、DTM和PTM疫苗佐剂组；
3)各组小鼠血清样本用过滤后的无菌1×PBS按1：400倍稀释，200μL/孔加至每列第一孔，每列第二孔至第八孔分别加入100μLPBS，每个样本做复孔，然后从第一孔进行倍比稀释至1：51200，空白对照孔加入PBS100μL；
4)HRP标记羊抗鼠二抗稀释度分别为：IgG1:10000，IgG11:10000，IgG2a1:10000；
5)结果处理：将每一各样本OD值减去空白对照孔OD值后，同一份血清样品复孔取平均OD值。其中以PBS阴性对照组的OD值为阴性对照(N)，免疫组为样本(P)，当血清P/N值≥2.1即可判断为阳性。抗体滴度以出现阳性结果的最高稀释倍数的倒数表示；
6)结果计算：各样品结果表示为log10(抗体滴度)，每个样品复孔间取平均值即为该小鼠的实际值，同一组内计算Mean和SEM，进行统计分析；IgG2a：IgG1以每只小鼠的抗体滴度相比，同一组内结果表示为Mean±SEM；实验结果如图2所示。
疫苗组诱导最高水平的HBHA特异的IgG，IgG1和IgG2a抗体和IgG2a/IgG1比值(P<0.05)，且疫苗组相互之间无显著差异。而BCG组的这些指标高于佐剂组(P<0.05)。疫苗组诱导的免疫反应倾向于TH1型免疫反应。
6、ELISA检测免疫小鼠脾细胞培养上清抗原特异性细胞因子
1)取脾细胞悬液100μL接种于96孔板中(细胞数5×106)；
2)刺激物如下：有标签和无标签蛋白HBHA20μL，终浓度10μg/孔；阴性对照RPMI1640完全培养基20μL；其中其中有标签蛋白刺激有标签蛋白HBHA疫苗组，无标签蛋白刺激无标签蛋白HBHA疫苗组、PBS组、BCG组、DTM和PTM疫苗佐剂组；
3)培养72小时后，分别收集孔中液体并做好标记，2000rpm离心10min，收集上清并分装于EP管中，标记后冻存于-80℃待用；
4)按照MouseELISAkit操作手册检测上清中细胞因子IFN-γ的含量；
5)终止反应后10min内，以空白对照孔调零，使用酶标仪读取双波长检测吸光值：450nm为检测波长，630nm为参考波长；
6)依据标准品孔数据绘制标准曲线，根据样品实测OD值测得相应细胞因子浓度。每只小鼠复孔结果取平均值，减去RPMI1640对照组数值后，同一组内分别计算Mean和SD。
实验结果如图3所示。
PBS组，DTM和PTM疫苗佐剂组蛋白HBHA特异的IFN-γ水平最低。所有疫苗组诱导蛋白HBHA特异的IFN-γ显著高于BCG组(P<0.05)。两种无标签疫苗组诱导蛋白HBHA特异的IFN-γ显著高于对应的有标签疫苗组(P<0.05)。PTM疫苗佐剂辅助的疫苗组诱导蛋白HBHA特异的IFN-γ显著高于DTM疫苗佐剂辅助的疫苗组(P<0.05)。PTM/HBHA-无标签疫苗组诱导最高水平的蛋白HBHA特异的IFN-γ。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例10结核亚单位疫苗免疫小鼠抗M.tbH37Rv经气溶胶感染的保护性
采用实施例9中制备的疫苗佐剂和结核病亚单位疫苗。
1、实验动物的分组及免疫
6周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠，合格证批号为No.4200592074，购自武汉大学ABSL-3动物实验中心。饲养于武汉大学动物实验中心ABSL-3实验室的Ventirack动物饲养柜，所有操作均严格遵守武汉大学动物实验操作手册。
根据实验需要，将实验动物同实施例9，每组5只。动物免疫方法及剂量同前。
动物感染途径：免疫6周后，利用M.tbH37Rv标准毒株经气溶胶感染免疫小鼠(实际攻毒菌量为60CFU/只)。
2、肺脏和脾脏的荷菌量分析
4周后处死小鼠，以75％酒精浸泡消毒10min，无菌取出肺脏和脾脏，按照每脏器分别加入2mL无菌1×PBST，在研钵内研磨并冲洗，转移到10ml无菌管中，振荡器充分混匀。取100μL原液加入到900μLPBST中做倍比稀释，振荡器充分混匀后，取3个稀释度的菌液各100μL涂布7H11-OADC培养基(配制时加入放线菌酮，抑制真菌的生长，加入TCH可以选择性抑制残留BCG的生长)。37℃培养箱培养3～4周后进行菌落计数。以Log10(CFU)进行各组脏器荷菌量分析。计算各组的均值和标准误。
实验结果如图4所示。
PBS组，DTM和PTM疫苗佐剂组小鼠肺脏荷菌量最高，而BCG组肺脏荷菌量最低(P<0.05)。DTM疫苗佐剂辅助的疫苗组肺脏荷菌量相当。PTM/HBHA-无标签疫苗组肺脏荷菌量显著高于PTM/HBHA-有标签疫苗组(P<0.05)。PTM疫苗佐剂辅助的疫苗组肺脏荷菌量显著高于DTM疫苗佐剂辅助的疫苗组(P<0.05)。

Claims (6)

1.一种肝素结合血凝素蛋白，其特征在于，所述的肝素结合血凝素蛋白包含有：
1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白质；
2)与序列SEQIDNO:1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的素结合血凝素蛋白的表达方法，其特征在于，所述的方法是将核苷酸序列为SEQIDNO:2的基因的第267碱基由原先的G突变为A；再将突变后的基因片段插入到毕赤酵母表达载体中，构成的重组质粒转入毕赤酵母中进行表达，纯化后获得目的蛋白。
3.一种结核病亚单位疫苗，其特征在于，所述的结核病亚单位疫苗含有权利要求1所述的肝素结合血凝素蛋白和疫苗佐剂。
4.如权利要求3所述的结核病亚单位疫苗，其特征在于，所述的肝素结合血凝素蛋白的浓度为0.25～0.75mg/mL。
5.如权利要求3或4所述的结核病亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗中的疫苗佐剂为脂质体形式，包含有如下浓度的组分：0.5～2mg/ml二甲基双十八烷基铵、含有0.25～0.75mg/mL的海藻糖，0.25～0.75mg/mL的单磷酰脂质A。
6.如权利要求3或4所述的结核病亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗中的疫苗佐剂为溶液形式，包含有如下浓度的组分：0.25～0.75mg/mL的海藻糖，0.25～0.75mg/mL的单磷酰脂质A，12.5～37.5mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110368488A (zh) * 2019-07-23 2019-10-25 中国农业大学 重组argF蛋白纳米微粒的制备及应用
CN110559432A (zh) * 2019-10-11 2019-12-13 南京农业大学 一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101565680A (zh) * 2009-05-22 2009-10-28 江苏省农业科学院 猪肺炎支原体p97r1基因重组毕赤酵母及表达蛋白
CN101580542A (zh) * 2008-05-12 2009-11-18 北京市结核病胸部肿瘤研究所 结核分枝杆菌粘附素hbha在结核病诊断与治疗中的应用
CN102584977A (zh) * 2012-02-17 2012-07-18 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪防御素pBD2多肽及其在抑制猪病原菌中应用
CN103204945A (zh) * 2013-05-03 2013-07-17 扬州大学 一种用于牛结核病诊断的真核表达cfp10-esat-6融合蛋白
CN103981209A (zh) * 2014-04-24 2014-08-13 中国农业大学 一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法及其重组菌和应用
CN105037561A (zh) * 2015-08-24 2015-11-11 华中科技大学 一种融合蛋白cmfo及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101580542A (zh) * 2008-05-12 2009-11-18 北京市结核病胸部肿瘤研究所 结核分枝杆菌粘附素hbha在结核病诊断与治疗中的应用
CN101565680A (zh) * 2009-05-22 2009-10-28 江苏省农业科学院 猪肺炎支原体p97r1基因重组毕赤酵母及表达蛋白
CN102584977A (zh) * 2012-02-17 2012-07-18 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪防御素pBD2多肽及其在抑制猪病原菌中应用
CN103204945A (zh) * 2013-05-03 2013-07-17 扬州大学 一种用于牛结核病诊断的真核表达cfp10-esat-6融合蛋白
CN103981209A (zh) * 2014-04-24 2014-08-13 中国农业大学 一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法及其重组菌和应用
CN105037561A (zh) * 2015-08-24 2015-11-11 华中科技大学 一种融合蛋白cmfo及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李传友 等: "结核分枝杆菌黏附素HBHA 的克隆表达及其免疫原性研究", 《首都医科大学学报》 *
江鹰 等: "结核分枝杆菌肝素结合血凝素蛋白的表达、纯化及免疫学特性的初步研究", 《现代生物医学进展》 *
聂理会: "结核分枝杆菌肝素结合血凝素免疫作用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110368488A (zh) * 2019-07-23 2019-10-25 中国农业大学 重组argF蛋白纳米微粒的制备及应用
CN110559432A (zh) * 2019-10-11 2019-12-13 南京农业大学 一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用

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