DE60319741T2

DE60319741T2 - Einschlusskörper für die mündliche impfung von tieren

Info

Publication number: DE60319741T2
Application number: DE60319741T
Authority: DE
Inventors: Andrzej Plucienniczak; Malgorzata Kesik; Anna Porebska; Halina Wedrychowicz; Luiza Jedlina-Panasiuk
Original assignee: INST PARAZYTOLOGII PAN; INSTYTUT PARAZYTOLOGII PAN; Instytut Biotechnologii i Antybiotykow
Current assignee: INST PARAZYTOLOGII PAN; INSTYTUT PARAZYTOLOGII PAN; Instytut Biotechnologii i Antybiotykow
Priority date: 2002-12-31
Filing date: 2003-12-31
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2024-01-01
Also published as: WO2004058816A3; DE60319741D1; PL358081A1; EP1578791B1; AU2003294191A8; WO2004058816A2; PL196114B1; EP1578791A2; ATE388962T1; AU2003294191B2; AU2003294191A1; NZ541291A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine orale Impfung und das Verfahren zu ihrer Herstellung. Im Allgemeinen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Induktion einer Immunantwort, umfassend die Verabreichung einer Impfung über den Magen-Darm-Trakt. Die Gegenstände der Erfindung werde verwendet, um eine orale Impfung gegen Leberegel zu erzielen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Leberegel (Fasciola hepatica) ist ein Parasit, der einen komplexen Lebenszyklus durchlebt, dessen Zwischenwirt eine Schnecke, Galba truncatula, ist und dessen Endwirte Haustiere (Rind, Schaf, Ziege und sogar Pferd), wilde Tiere (Wisent, Elch, Rotwild, Eichhömchen – Vaughan et al., 1997; Aust. Vet. J. 75 (11): 811-3) und Mensch. Der Endwirt wird durch die Aufnahme von Metacercaria (eine der Entwicklungsformen des Leberegels) durch die Nahrung infiziert, die auf Pflanzen und im Wasser vorkommen. Im Verdauungstrakt durchlaufen junge Leberegel Excystation, welche die Darmwand, Bauchfellhöhle und den Leberbeutel auf ihrem Weg zum hepatischen Gewebe durchdringen. Nach einigen Wochen erreichen sie die Gallengänge, die den Lebensraum des erwachsenen Leberegels darstellen. Zusätzlich zu den Gallengängen passiert die Invasion auch in anderen Geweben, z. B. in der Lunge. Die Krankheit, die durch den Leberegel verursacht ist wird, als Fasciolose beschrieben. Leberegelinfektionen sind die Ursache für Leber- und Gallengangschäden, Gallenkontamination und Blutung. Leberegelinfektionen verursachen Anämie und Leberzirrhose und als Folge Produktivitätsverlust (signifikanter Gewichtsverlust, niedrige Milchproduktion, niedrige Fleischproduktion und niedrige Wollequalität bei Schafen). Schwererwiegende Leberegelinfektionen können tödlich sein.
Pharmakologische Behandlung ist teuer und zunehmend erfolglos als Folge der sich entwickelnden Resistenzen gegen Medikamente. Die Invasion dieser Parasiten in Polen reicht von 10% der Schafpopulation (in nordöstlichen Regionen) bis 98% (in den Vorbergen). In Australien wird angenommen, dass 40 Millionen Schafe und 6 Millionen Rinder auf dem für Leberegel endemischen Land grasen. Rauem geben mehrere Zehnmillionen Dollar jährlich für Fasciolosebehandlung aus, und die Produktionsverluste betragen weitere 50–80 Millionen Dollar (Boray J.C., 1999; NSW Agriculture Agfact (2nd ed. A0.9.57). Fasciola hepatica ist unter die wichtigsten veterinären Probleme eingestuft aufgrund der Verbreitung dieses Parasiten in der Welt und dem weiten Spektrum der Wirtsorganismen.
Es wird angenommen, dass die beste Methode zur Bekämpfung von Leberegelbefall die Impfung ist. Ihr Hauptvorteil ist, dass sie den Wirtsorganismus in der präpathologischen Phase vor Schaden schützen und gleichzeitig die Immunität über viele Jahre garantieren. Trotz mehrerer Versuche, Impfungen gegen den Leberegel zu erstellen, sind keine kommerziell erhältlich.
Orale Impfungen – im Gegensatz zu parenteralen – können nicht nur systemische Immunität gewährleisten, sondern auch die Immunität der Schleimhäute. Diese sind von besonderem Interesse für Prävention von Infektionen mit Magen-Darm-Parasiten. Ein wachsendes Interesse für orale Impfungen wird auch angeheizt durch ihre einfache Verabreichung, welche eine Anwendung in großem Maßstab erlaubt (Richter L., Kipp B.B., 1999, Curr. Top Microbiol. Immunol., 240, 159–176). Erste Versuche wurden unternommen, um orale Impfungen herzustellen. WO00/37610 beschreibt einen Vektor, der zur Gewinnung immunogener Peptide wie HBsAg in essbaren Pflanzengeweben verwendet wurde. Die auf diese Weise hergestellten transgenen Pflanzen werden zur Herstellung von oralen Impfungen benutzt.
Sie sind jedoch nicht ohne Nachteile. Es ist schwer, eine hohe und konsistente Dosis des impfenden Antigens zu gewährleisten. Der Spiegel des synthetisierten Antigens variiert in verschiedenen Geweben und zwischen individuellen transgenen Pflanzen.
US 5770214 , US 5811105 und US 5804194 offenbaren die Anwendung abgeschwächter Stämme von Salmonella typhi als orale Impfung.
US 6290962 , veröffentlicht am 18.09.2001, beschreibt ein Verfahren einschließend eine Immunantwort gegen Helicobacter beruhend auf der Verabreichung einer immunogenen Menge von Antigen, welches eine Helicobacter-Urease oder eine Untereinheit davon ist. Ähnliche orale Impfungen enthaltend rekombinante Proteine von Helicobacter-Urease, die in E. coli-Zellen hergestellt waren, sind der Gegenstand der polnischen Patente PL 179149 und PL 174448 .
Die relative Unerfahrenheit mit oralen Impfungen und das unvorhersehbare Schicksal des Antigens im Magen-Darm-Trakt machen die Bedingungen für diesen Typ von Impfung weniger klar als für parenterale Impfung. Zudem trägt orale Impfung das Risiko der Entstehung einer Lebensmittelinfektionsresistenz. (McGhee J.R. et al., 1999 in: Mucosal Immunology Ogra P.L., Lamm M.E., Bienenstock J., Mestecky J., Strober W., McGhee J.R., (ed), Seiten 485–505, Academic Press).
WO 98/32427 , veröffentlicht am 30.07.1998, beschreibt ein Polymer, das zur Herstellung beschichteter oraler Impfungen mit verzögerter Freisetzung des Wirkstoffes verwendet wird.
Unabhängig vom Verabreichungsweg beeinflusst die Form des Antigens in großem Maße, wie immunogen es ist.
Die Verstärkung der Immunität als Ergebnis der Impfung erfordert das Festhalten an einem geeigneten Impfzeitplan, welcher die Beschreibung solcher Parameter wie Größe und Anzahl von Antigendosen wie auch die Zeit zwischen den Impfungen einschließt. Der saure pH-Wert von Magensaft, proteolytischen Enzymen und Darmperistaltik führen dazu, dass die Dosen für orale Impfungen viel höher sind als für parenterale. Zugleich können die Verabreichungsdosen, die entlang des Magen-Darm-Trakts zu hoch sind, die obengenannte lebensmittelverursachte Resistenz verursachen. Das bedeutet jedoch nicht, dass niedrige Dosen nicht dasselbe verursachen können. Bislang sind die Grundmechanismen, die dieses Phänomen steuern, nicht aufgeklärt worden und keine Standardmethoden gefunden, die das Problem von induzierter Resistenz lösen. Es wird angenommen, dass das Phänomen der Resistenz in gewissem Maße von obengenannten Faktoren abhängt, z. B. von der Größe der Dosis, dem Immunisierungsplan und dem Typ des Antigens (Tacket C.O., Mason H.S., 1999, Microbes and Infection 1, 777–783). Angesichts der heutigen Erkenntnisse scheinen die Perspektiven der Herstellung universeller Adjuvantien, optimaler Impfzusammensetzungen und wirksamer Dosen und Immunisierungspläne für orale Impfungen fern. (Makels P.H., 2000 FEMS Microbiology Reviews 24, 9–20).
Es scheint, dass für Impfung über die Schleimhäute eine multiple Verabreichung des Antigens in Dosen, die mehrfach größer als effektive Dosen für parenterale Impfung sind, erforderlich ist. Antigene, die Multimere bilden, sind bevorzugt. Die Effektivität der Verwendung eines Adjuvans ist ebenso ungewiss. Im Falle einer Impfung auf der Basis von essbaren Pflanzen scheint das letztere unerwünscht, kann aber für einige Antigene nötig sein (Richter L., Kipp B.B., 1999, Curr, Top Microbiol. Immunol. 240, 159–176).
Zusammengenommen scheint es, ausgehend von der Natur der oralen Impfungen, dass die Festlegung eines Protokolls einer effizienten Impfung über den Magen-Darm-Trakt viel schwieriger ist, als für Impfung mit traditionellen Methoden. Für jede individuelle Impfung ist das eine separate Herausforderung, behaftet mit einem hohen Misserfolgsrisiko.
Es gibt einige Indikatoren für die Effizienz der Impfung über die Schleimhäute, einschließlich des Magen-Darm-Trakts. Diese umfassen den Spiegel der antigenspezifischen Antikörper der Klasse IgA (5-IgA), die mit der Schleimhaut verbunden sind, den Serumtiter von Antikörpern der Klassen IgG und IgA, das Profil von Antikörpern der Klasse IgG und das Zytokinprofil. Um die zelluläre Immunität zu bestimmen, werden Lymphozyten-Zytotoxizitätsassays verwendet. Bislang wurden einige Leberegel-Antigene als Impfungen verwendet (Wedrychowicz and Klockiewicz, 1994, Acta Parasitologica, 39: 173). Diese umfassen Cysteinproteasen (Piacenza L. et al., 1998, Parasitol. It., 47S: 266).
Cysteinproteasen sind Enzyme, die eine wichtige Rolle in Wirt-Parasit-Interaktionen spielen. Sie nehmen teil an der Ernährung von Parasiten, deren Migration durch die Gewebe des Wirts, sowie der Abwehr gegen die Abwehrmechanismen des Immunsystems des Wirts. Es ist bekannt, dass während der Langzeitmigration der verschiedenen Entwicklungsformen des Parasiten im Wirtsorganismus eine Immunantwort gegen die Cysteinprotease induziert wird.
Kofta et al. haben Cysteinprotease-cDNA als Impfung gegen Leberegelinfektionen verwendet (Kofta et al., 2000, Vaccine, 18: 2985). Mit diesem Experiment wurden hervorragende Ergebnisse erreicht.
US 6281345 (veröffentlicht am 28.08.2001) und US 6265198 (veröffentlicht am 24.07.2001) beschreiben pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend Nukleinsäuren, Proteine, Antikörper und Inhibitoren und ihre Verwendung zum Schutz von Tieren gegen die durch Magen-Darm-Parasiten verursachten Krankheiten.
US 6066503 (veröffentlicht am 23.05.1999) beschreibt eine Lösung, betreffend enzymkodierende Nukleotidsequenzen, Aminopeptidasen von Magen-Darm-Parasiten, ihre Antigene und funktionale Äquivalente und ihre Verwendung als Impfung gegen diese Parasiten.
In US 5885814 (veröffentlicht am 23.03.1999) wird eine Impfung gegen die Parasiten des Magen-Darm-Traktes vorgestellt, die eine Leberegel-Serinprotease enthält.
US 6419923 (veröffentlicht am 22.07.2002), US 6365392 (veröffentlicht am 02.04.2002), US 5795768 (veröffentlicht am 18.08.1998), US 5792624 (veröffentlicht am 11.08.1998), US 5750391 (veröffentlicht am 12.05.1998) und US 5691186 (veröffentlicht am 25.1.1997) beschreiben Verfahren für die Herstellung von Cysteinprotease-Proteinen, Verbindungen, die die Nematoden-Cysteinprotease inhibieren und ihre Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen für den Schutz der Tiere gegen Krankheiten, die durch Magen-Darm-Parasiten verursacht ist. Isolierte rekombinante Zellen exprimieren.
US 5863775 (veröffentlicht am 26.01.1999) beschreibt ein Verfahren zur Bekämpfung von Magen-Darm-Parasiten in Wirtstieren, das auf der oralen Verabreichung eines Antiparasit-Proteins an das Wirtstier in Form von Medikamenten oder Futter beruht, so dass das Protein die Parasiten erreicht. Das Antiparasit-Protein kann ein Inhibitor eines Parasitenenzyms sein, z. B. ein Inhibitor eines Verdauungsenzyms wie ein Inhibitor von Cysteinprotease. Gemäß dieser Lösung ist das Antiparasit-Protein ein Protein, das in transgenem Mais und Reis exprimiert wird, die an die Wirtstiere verfüttert werden.
Bislang gab es keine Hinweise in der Literatur bezüglich der Immunisierung gegen die Invasionen von F. hepatica durch die orale Verabreichung von Leberegel-Antigenen in der Form von Einschlusskörpern.
Das Virus vom Hepatitis B-Typ verursacht schwere und chronische Hepatitis vom Typ B und hepatozellulären Krebs (zitiert in Slumberg, 1997). HBV-Infektionen in Menschen sind begleitet von einer intensiven und anhaltend nachweisbaren Produktion von Antikörpern, die durch die Anwesenheit des viralen Nukleokapsids (HBcAg) stimuliert wird (Milch and McLachlan 1986, Milich et al., 1997a). Das virale Nukleokapsid besteht aus sich wiederholenden Untereinheiten seiner Struktur, Dimeren des Kapsidproteins (Zhou and Standring, 1992), welche aus 183 oder 185 Aminosäuren je nach immunologischem Subtyp des Virus besteht (Tiollais et al., 1981). Zwei Domänen sind im Kapsidprotein gefunden worden. Eine ist für den kooperativen Prozess des Kapsidzusammenbaus verantwortlich und die andere, ein Protoamin, das am C-Terminus (ca. 40 C-terminale Aminosäuren) lokalisiert ist, ist für die Nukleinsäurebindung zuständig.
Das HBcAg-Protein selbstfaltend (Gallina et al., 1989; Birnbaum and Nassal, 1990). Es agglomeriert in vivo in Kapside, die eine prägenomische virale RNA und eine durch HBV kodierte DNA-Polymerase enthalten (Gartenschlager and Schalter, 1992). Das Protein weist an seinem C-Terminus nukleare Translokationssignale auf (Yeh et al., 1990; Eckhardt et al., 1991).
Um Kapsidmoleküle herzustellen genügen die ersten 140 N-terminalen Aminosäuren, wobei Prolin 138 essentiell ist (Metzger and Bringas, 1998). In einigen Laboren wurde die Kapsidstruktur bestimmt, die in der Lösung aus verkürzten Abschnitten des Kernproteins besteht (Crowther et al., 1994; Bottcher et al., 1997; Conway et al., 1997). Es stellte sich heraus, dass das Kapsid aus Dimeren des Kernproteins gebaut wird (siehe auch Zhou and Standring, 1992). Es wird angenommen, dass die vorwiegende Form ein Molekül bestehend aus 120 Dimeren ist, welche Aminosäuren 78–83 nach außen exponieren (Conway et al., 1998b). Auf den Modellen, die von (Bottcher et al., 1997; Conway et al., 1997; Conway et al., 1998a; Zlotnick et al., 1997) vorgestellt wurden, ist jedoch gezeigt worden, dass die C- und N-Termini der Kernproteine, die das Kapsid aus verkürzten Kernproteinen bilden, ebenso von außen zugänglich sind. Die Kapsidstruktur ist gewissermaßen abhängig von der Anzahl von Aminosäuren im Kernprotein, welche von dem C-Terminus entfernt worden waren (Zlotnick et al., 1996). Die erwähnten Charakteristika sind signifikant für die Konstruktion von Hybridkapsiden, die zusätzliche Antigene tragen.
Es wurde gezeigt, dass HBcAg eine einzigartige Fähigkeit zur Induktion des Immunsystems aufweist trotz seiner Position als interne Komponente des HBV-Virions. Bei vielen chronischen Infektionen ist HBcAg das einzige Antigen, das fähig ist, eine Immunantwort zu induzieren. Es ist bekannt, dass es genügt, 25 ng dieses Antigens in einer Injektion ohne Adjuvans zu verabreichen, um die Produktion von Antikörpern zu stimulieren (Milich et al., 1997b). Die Arbeit von Milich und seinen Kollegen, die an Mäusen durchgeführt wurde, hat gezeigt, dass die hohe immunogene Aktivität von HBcAg von der Fähigkeit dieses Antigens stammt, B-Zellen zu aktivieren, um Antikörper gegen HBcAg zu produzieren, sowohl in Anwesenheit von spezifischen T-Zellen als auch ohne (Milich and McLachlan, 1986). HBcAg-spezifische B-Zellen aus nichtimmunisierten Mäusen erfüllen die Funktion von primären antigen-präsentierenden Zellen, weil sie das Antigen von naiven T-Zellen in vivo aktiver prozessieren und präsentieren als Makrophagen und dendritische Zellen (Milich et al., 1997a). HBcAg immunisiert ebenso effizient die T-Zellen, insbesondere Th1 (Milich et al., 1987a).
Außerdem wurde gezeigt, dass HBcAg-spezifische Helfer-Zellen mit Zellen vom B-Typ interagieren können, die für die Oberflächenantigene (HBcAg) spezifisch sind, und dadurch sie zur Produktion entsprechender Antikörper stimulieren (Milich et al., 1997b).
Diese einzigartigen Eigenschaften weisen nur Nukleokapsid-Moleküle auf, und nicht die sezernierte Formen des Antigens (HBeAg).
Eine Fusion an die immunodominante interne Domäne von HBcAg führt zum Verlust der immunogenen und antigenen Aktivität von HBcAg, während die des eingeführten fremden Epitops signifikant stimuliert wird (Schodel et al., 1990a; Clarke et al., 1991).
DIE AUFGABE DER ERFINDUNG
Trotz der oben beschriebenen vorläufigen Studien zur Herstellung einer Impfung gegen Leberegel besteht immer noch ein reelles Bedürfnis, effektive Mittel zur einfachen Produktion effektiver Impfungen, die gegen diesen Parasiten immunisieren, herzustellen.
Im Hinblick auf den oben zitieren Stand der Technologie ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Mitteln, welche effizient und leicht erhältlich sind, so dass sie in oralen Impfung gegen Leberegel verwendet werden können, welche den Aufbau der systemischen sowie der Schleimhautimmunität erleichtern würden. Die Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung müssen leicht zu verabreichen sein und sollen keine anderen bekannten Nachteile in bezug auf die Herstellung und Verabreichung der Impfung aufweisen, wie die relativ hohen Herstellungskosten der Medikation und die mögliche Gefahr einer Blutkontamination währen der Impfung. Orale Impfungen gemäß der vorliegenden Erfindung sollten eine effiziente Immunisierung durch den Magen-Darm-Trakt gewährleisten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Mittel, welche in der Produktion einer effizienten, leicht zu verabreichenden und leicht zugänglichen Impfung gegen die Leberegel verwendet werden können. Eine besondere Aufgabe der Erfindung ist die Produktion von chimären Proteinen, die Antigene der Cystein-Protease aus Fasciola hepatica enthalten würden und für Impfung gegen den Leberegel verwendet könnten, ebenso wie Mittel zur Erleichterung ihrer Expression in E. coli. Eine besondere Aufgabe der Erfindung ist die Produktion von Mitteln zur Herstellung von rekombinanten Proteinen, welche in der Herstellung von essbaren Impfungen gegen den Leberegel verwendet werden könnten.
Unerwartet wurde die Ausführungsform einer solchen beschriebenen Aufgabe und eine Lösung von im Stand der Technologie beschriebenen Problemen, die mit Proteinen, die eine Basis für exogene DNA darstellen, verbunden sind, mit der vorliegenden Erfindung erreicht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der erste Aspekt der Erfindung sind Einschlusskörper enthaltende Polypeptide, die in einem genetisch modifizierten Mikroorganismus hergestellt wurden, enthaltend eine Aminosäuresequenz der Sequenz der Leberegel-Cysteinprotease, eventuell fusioniert an die Aminosäuresequenz des HBV-Kernproteins zur Verwendung als orale Impfung gegen den Leberegel. Vorzugsweise werden sie in E. coli produziert. Ebenso vorzugsweise enthalten die Polypeptide eine der folgenden Sequenzen:

– die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease fusioniert an die Sequenz des HBV-Kernproteins,
– die Sequenz der Führungsdomäne der Leberegel-Cysteinprotease fusioniert an die Sequenz des HBV-Kernproteins,
– die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease fusioniert an die Sequenz des HBV-Kernproteins und Glyzinreste, die eine Glyzin-Brücken-Struktur bilden,
– die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease,
– die Sequenz des Vorläuferproteins der Leberegel-Cysteinprotease umfassend die katalytische und die Führungsdomäne.

Insbesondere bevorzugt sind die Polypeptide enthaltend eine der Sequenzen, die durch die Sequenzen kodiert sind, die in den 7 bis 15 präsentiert sind.
Der nächste Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Polypeptiden in Form von Einschlusskörpern enthaltend die Aminosäuresequenz der Leberegel-Cysteinprotease-Sequenz, eventuell fusioniert an die Aminosäuresequenz des HBV-Kernproteins zur Herstellung einer Impfung gegen den Leberegel. Vorzugsweise wird das Polypeptid in einem genetisch modifizierten Mikroorganismus produziert. Auch vorzugsweise enthält das Polypeptid eine der folgenden Sequenzen:

– die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease fusioniert an die Sequenz des HBV-Kernproteins,
– die Sequenz der Führungsdomäne der Leberegel-Cysteinprotease fusioniert an die Sequenz des HBV-Kernproteins,
– die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease fusioniert an die Sequenz des HBV-Kernproteins und Glyzinreste, die eine Glyzin-Brücken-Struktur bilden,
– die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease,
– die Sequenz des Vorläuferproteins der Leberegel-Cysteinprotease umfassend die katalytische und die Führungsdomäne. Insbesondere bevorzugt sind die Polypeptide enthaltend eine der Sequenzen, die durch die Sequenzen kodiert sind, die in den 7 bis 15 präsentiert sind.

Der nächste Aspekt der Erfindung ist ebenso eine orale Impfung gegen den Leberegel enthaltend ein Antigen und eventuell einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder ein Adjuvans, dadurch gekennzeichnet, dass es als Antigen ein Polypeptid in der Form von oben definierten Einschlusskörpern enthält.
In der vorliegenden Erfindung wurde HbcAg als Träger und Adjuvans für das Antigen der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease verwendet.
Es wurden zwei Konstruktionsvarianten von Konstrukten, die in Expressionsvektoren eingefügt wurden, verwendet:

1. Fusion des 5'-Endes der für HBV-Kernprotein kodierenden Sequenz mit dem 3'-Ende der das entsprechende Fragment der Leberegel-Cysteinprotease kodierenden Sequenz.
2. Fusion des Fragments der für die katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease kodierenden Sequenz mit der für das HBV-Kernprotein kodierenden Sequenz über eine "Glyzinbrücke". Dieser Typ von Bindung gemäß Artikel von Kratz P.5 führt dazu, dass das in das HBV eingeführte Protein an seiner Oberfläche präsentiert wird.

Impfungen sind geeignete Proteine, deren Expression in bakteriellen Zellen des Stammes BL21 (DE3) von E. coli erreicht wurde, die mit dem Expressionsplasmid pIGCmT7 enthaltend das gegebene Insert transformiert wurden. Diese Proteine waren aus den E. coli-Bakterien in Form von Einschlusskörpern isoliert.
DIE VORTEILE DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung weist viele Vorteile auf, was sie von den bekannten Lösungen des Standes der Technik abhebt. Eine extrem effiziente Impfung gegen den Leberegel wurde gewonnen, welche die systemische sowie die Schleimhautimmunität erleichtert.
Aufgrund der Tatsache, dass der natürliche Invasionsweg des Leberegels der Magen-Darm-Trakt ist, wurde eine Impfung für orale Verabreichung hergestellt, die eine effiziente Immunantwort an der natürlichen Penetrationsstelle des Flachwurms induziert. Die hergestellte Impfung ist einfach zu applizieren und ihr fehlen andere bekannte Nachteile, die mit der Herstellung und Verabreichung klassischer Impfungen verbunden sind, wie die hohen Herstellungskosten des Präparats und die Gefahr einer zufälligen Blutkontamination während der Impfung.
Die Antigenexpression findet in bakteriellen Zellen statt. Das einfache Design des Wirts und die Fähigkeit, den Prozess der Expression des Impfantigens, das in der Form von Einschlusskörpern isoliert wird, zu kontrollieren, gewährleistet die Homogenität des hergestellten Präparats und so eine genaue Dosierungskontrolle.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die angefügten Abbildungen erleichtern ein besseres Verständnis des Wesens der vorliegenden Erfindung.
1 stellt eine Karte des pIGCmT7-Plasmids dar, wobei ARG t-RNA das Gen für Arginin-tRNA für AGA- und AGG-Kodonen ist, ORI der Ursprung der Replikation des pPIGDMI-Plasmids ist, Cm-R das Chloramphenicolresistenzgen ist, T7 ein Promotor ist, stop ein Transkriptionsterminierungssignal ist;
2 stellt die Nukleotidsequenz der gesamten Leberegel-Cysteinprotease des Leberegels (Fasciola hepatica) dar;
3 stellt das isolierte Protein der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease des Leberegels dar; Spuren: 1) Proteinmassestandard LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa, 2) isoliertes Protein der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease.
4 stellt das isolierte Vorläuferprotein der Leberegel-Cysteinprotease (die katalytische und die Führungsdomäne) dar; Spuren: 1) Proteinmassestandard LMW14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa, 2) isoliertes Vorläuferprotein der Leberegel-Cysteinprotease (die katalytische und die Führungsdomäne).
5 stellt das isolierte Protein der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease::Fragment der HBV-Kerndomäne dar; Spuren: 1) Proteinmassestandard LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa, 2) isoliertes Protein der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease:: Fragment des HBV-Kernproteins.
6 stellt das isolierte Protein der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease::Glyzinbrücke::Fragment der HBV-Kerndomäne dar; Spuren: 1) Proteinmassestandard LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa, 2) isoliertes Protein der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease::Glyzinbrücke:: Fragment des HBV-Kernproteins.
7 stellt die CWekGlyKatwBluescr-Sequenz dar, die für das Hybridprotein HBV-Kerndomäne:: katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, verbunden durch eine Glyzinbrücke, kodiert. Das Fragment war in einen Bluescript SK (–)-Vektor in die Stellen inseriert, die durch den Verdau mit den NdeI- und HindIII-Restriktionsnukleasen entstanden sind.
8 stellt die CWekGlyKatwBluescr-Sequenz dar, die für das Hybridprotein HBV-Kerndomäne::katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, verbunden durch eine Glyzinbrücke, kodiert. Das Fragment war in einen pIGCmT7-Vektor in die Stellen inseriert, die durch den Verdau mit den NdeI- und HindIII-Restriktionsnukleasen entstanden sind.
9 stellt die Moty_cat_Ckrd-Sequenz dar, die für das Hybridprotein HBV-Kerndomäne::katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, verbunden durch eine Glyzinbrücke, kodiert. Das Fragment war in einen Bluescript SK(–)-Vektor in die Stellen inseriert, die durch den Verdau mit den BamHI- und SacI-Restriktionsnukleasen entstanden sind.
10 stellt die KAT_Nasza_MOT1_MOT2-Sequenz dar, die für die katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease kodiert. Das Fragment war in einen Bluescript SK(–)-Vektor in die Stellen inseriert, die durch den Verdau mit den BamHI- und HindIII-Restriktionsnukleasen entstanden sind.
11 stellt die Sequenz dar, die für die katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease kodiert. Das Fragment war in einen pIGCmT7-Vektor in die Stellen inseriert, die durch den Verdau mit den NdeI- und HindIII-Restriktionsnukleasen entstanden sind.
12 stellt die MOT_DO_C_POP_MOT1_MOT3_W_BLUESCRIPCIE-Sequenz dar, die für die katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease kodiert. Das Fragment war in einen Bluescript SK(–)-Vektor in die Stellen inseriert, die durch den Verdau mit den BamHI- und HindIII-Restriktionsnukleasen entstanden sind.
13 stellt die MOT_DO_C_POP_MOT1_MOT3_W_PIG-Sequenz dar, die für die katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease kodiert. Das Fragment war in einen pIGCmT7-Vektor in die Stellen inseriert, die durch den Verdau mit den NdeI- und HindIII-Restriktionsnukleasen entstanden sind.
14 stellt die Moty_cat_Ckrd_w_PIG-Sequenz dar, die für die katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease kodiert. Das Fragment war in einen pIGCmT7-Vektor in die Stellen inseriert, die durch den Verdau mit den NdeI- und HindIII-Restriktionsnukleasen entstanden sind.
15 stellt die Cala_Mot_N-Sequenz dar, die für das Vorläuferprotein der Leberegel-Cysteinprotease (die katalytische und die Führungsdomäne) kodiert. Das Fragment war in einen pIGCmT7-Vektor in die Stellen inseriert, die durch den Verdau mit den NdeI- und HindIII-Restriktionsnukleasen entstanden sind.
Folgende Abbildungen stellen die Ergebnisse von serologischen Analysen in Tieren dar, die mit den Präparaten gemäß der vorliegenden Erfindung oral geimpft wurden. 16–20 stellen die Konzentrationen von Antikörpern folgender Klassen dar: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgE und IgA, die mit PC oder ES des Leberegels reagiert, wobei 16 die Konzentration von PC-spezifischen IgG1-Antikörpern darstellt; 17 die Konzentration von PC-spezifischen IgG2-Antikörpern darstellt; 18 die Konzentration von PC-spezifischen IgG2b- Antikörpern darstellt; 19 die Konzentration von PC-spezifischen IgE-Antikörpern darstellt; 20 die Konzentration von PC-spezifischen IgA-Antikörpern darstellt.
Unten sind beispielhafte Ausführungsformen, wie sie in der vorliegenden Erfindung definiert sind.
Beispiel 1. Herstellung eines das Impfantigen exprimierenden Stammes von E.coli
Plasmide
Das bakterielle Expressionsplasmid, pIGCmT7:Plasmid pIGCmT7 (4056 bp) (1) war im Labor von Prof. Andrzej Plucienniczak am Institut für Biotechnology und Antibiotika in Warschau auf der Basis von pIGDM1-Plasmid erzeugt worden (Mikiewicz D. et al., Plasmid 1997), das ein Plasmid der CoIE1-Gruppe von Enterobacter agglomerans ist. Das Plasmid pIGCmT7 ist durch die Addition eines Chloramphenicol-Resistenz-Gens, eines Polylinkers zusammen mit dem T7-RNA-Polymerasen-Promotor und einer Sequenz, die für das Transkriptionsstopkodon aus dem T7-Phagen kodiert, geschaffen worden.
Bakterielle Nichtexpressionsplasmide: Um Fragmente nach der PCR-Amplifikation zu klonieren, wurde das pBluescript SK(–)-Plasmid vom Stratagene verwendet (die Sequenz ist erhältlich aus Gene Bank, Zugangs-Nr. X52324 S52394). Dieses Plasmid weist folgendes auf: einen ColE1-Replikationsursprung, T3- und T7-Phagen-RNA-Polymerasen Promotoren, die den Polylinker flankieren, und ein Ampicillin-Resistenz-Gen.
Ausgangsinsertsequenzen
Die Sequenz der Leberegel-Cysteinprotease (Fasciola hepatica): die cDNA der kompletten Leberegel-Cysteinprotease (Fasciola hepatica) wurde am Institut für Biotechnologie und Antibiotika in Kooperation mit dem Lehrstuhl für Parasitologie der Landwirtschaftsuniversität isoliert. Die Arbeit wurde auf einem Stamm von Escherichia coli auf der Basis eines Plasmids durchgeführt, das ein Gen enthält, das für die Leberegel-Cysteinprotease (Fasciola hepatica) kodiert (Kofta W, Mieszczanek J, Plucienniczak G, Wiedrychowicz H., Successful DNA immunisation of rats against fasciolosis, Vaccine 2000; 18: 2985–2990).
Ein Vergleich mit anderen Proteasesequenzen, zusammengetragen in Gene Bank, wurde zur Basis zur Unterscheidung von drei kodierenden Regionen in der Nukleotidsequenz der Protease: das Signal-, das Führungs- und das katalytische Fragment.
Die Nukleotidsequenz der gesamten Leberegel-Cysteinprotease (Fasciola hepatica) ist als 2 beigefügt.
Die Sequenz, die für das Hepatitis Typ-B-Virus-Kernprotein (HBV) des Stammes ayw4 kodiert: Die Nukleotidsequenz, die für das HBV-Kernprotein (ayw4) kodiert, wurde von Prof. Plucienniczak isoliert. Sie ist in der Gene Bank erhältlich, Zugangsnummer 235716. Ein Fragment von DNA, die für das HBV-Kernprotein (ayw4) kodiert, wurde in das HBV 321-Plasmid kloniert. Dieses ist ein PUC19-Plasmid, enthaltend das gesamte Genom von HBV ayw4, das in die Stellen inseriert wurde, die durch den Verdau mit Restriktionsnuklease BamHI erzeugt wurde.
Schemata der Herstellung von Vektoren mit Inserts.
Die Koordinaten, die in der Beschreibung der Herstellung von Vektoren mit inserierten Fragmenten angegeben sind, beziehen sich entsprechend auf die Koordinaten in der hinzugefügten Sequenz im Falle der Leberegel-Cysteinprotease und auf die in der American Gene Bank hinterlegten Sequenzen im Falle von HBV ayw4.
Schemata der Herstellung des in den pIGCmT7-Vektor inserierten KAT_Nasza_MOT1_MOT2-Fragments.
Aus dem Plasmid, enthaltend die gesamte Nukleotidsequenz der Leberegel-Cysteinprotease wurde ein DNA-Fragment, das für die C-terminale (katalytische) dieser Protease kodiert, von Position 325 bis 982 mittels einer PCR-Reaktion amplifiziert. In der PCR wurden der MOT1-Vorwärtsprimer und MOT2-Rückwärtsprimer verwendet. Die Primer, die in der PCR verwendet wurden, waren auf der Basis der DNA-Sequenzen, die für die Protease kodieren, konzipiert. Die Primer führten Erkennungsstellen für Restriktionsnukleasen ein, BamHI und NdeI für den Vorwärtsprimer und HindIII für den Rückwärtsprimer. Das amplifizierte Fragment wurde electrophoretisch getrennt und aus dem Polyacrylamid-Gel isoliert (Dybczynski I, Phunienniczak A, A protocol for DNA fragment extraction from polyacryloamide gels, Biotechniques 1988; 6: 924–926) und anschließend verdaut mit BamHI und HindIII Restriktionsnukleasen und deproteiniert. Die hergestellten DNA-Fragmente wurden mit einem pBluescriptSk(–)-Vektor, verdaut mit denselben Restriktionsnukleasen, ligiert. Das Ligationsprodukt wurde in E. coli-Zellen des Stammes NM522 transformiert. Die verwendete Transformationsmethode ist von J. Sambrook et al. Chung C. T., Miller R. H., A rapid and convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells, Nucleic Acid, Res. 1988; 16(8) beschrieben. Nach der Isolierung von Plasmid-DNA aus den transformierten E. coli-Zellen wurde die Anwesenheit des klonierten KAT_Nasza_MOT1_MOT2-Inserts mittels Restriktionsanalyse bestätigt, und die Genauigkeit der Sequenz wurde durch die Sequenzierung verifiziert. Das Fragment wurde aus dem pBluescriptSk(–)-Vektor mit NdeI und HindIII Restriktionsnukleasen verdaut und deproteiniert. Das erzeugte DNA-Fragment wurde mit dem pIGCmT7-Vektor ligiert, mit denselben Restriktionsenzymen verdaut und nach dem Verdau deproteiniert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli-Zellen des Stammes NM522. Die Anwesenheit des kAT_Nasza_MOT1_MOT2_w_PIG-Inserts im pIGCmT7-Vektor wurde durch die Restriktionsanalyse bestätigt.
Das Plasmid, enthaltend das bestätigte Insert, wurde in E. coli-Zellen des Stammes BL21(DE3) transformiert.
Schemata der Herstllung des CWekGlyKatwPIG-Fragments, inseriert in den pIGCmT7-Vektor.

Stufe I: PCR mit den Primer COREWP und COREWK wurde zum Amplifizieren eines Fragments des Gens verwendet, das für die ayw4-Kerndomäre (von Position 1903 bis 2349) des HBV kodiert, aus dem HBV321-Plasmid enthaltend das gesamte Genom von HBV ayw4. Die in der PCR verwendeten Primer wurden auf der Basis auf der DNA-Sequenz, die für die HBV ayw4-Kerndomäne kodiert, konzipiert. Der führende Primer, COREWP, verlängert das 5'-Ende des DNA-Moleküls unter Einführung von Erkennungsstellen für die Restriktionsnukleasen EcoRI und NdeI. Er führt auch Änderungen in die Nukleotidsequenz durch Austausch Cytosine 1908 und 1914 gegen Thymine ein, was eine Erkennungsstelle für die Clal-Restriktionsnuklease einführt, während die Aminosäuresequenz unverändert bleibt. Der Rückwärtsprimer, COREWK, verlängert das DNA-Molekül am 3'-Ende und fügt eine Erkennungsstelle für SacI- und HindIII-Restriktionsnukleasen sowie ein TAA-Terminierungskodon ein. Nach der PCR wurde das Gemisch elektrophoretisch auf dem Polyacrylamid-Gel getrennt. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde aus dem Polyacrylamid-Gel eluiert und dann mit den EcoRI- und HindIII-Restriktionsnukleasen verdaut und deproteiniert. Das erzeugte DNA-Fragment wurde in den pBluescript SK(–)-Vektor ligiert, der mit denselben Restriktionsenzymen verdaut war, und deproteiniert nach dem Verdau. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli-Zellen des Stammes NM522 verwendet. Nach der Isolierung von Plasmid-DNA wurde die Anwesenheit des Inserts durch die Restriktionsanalyse bestätigt. Aus dem pBluescript S(–)-Vektor, der das klonierte Insert enthält, wurde ein Fragment mittels HindIII- und BgIII-Restriktionsenzymen herausgeschnitten. Das verdaute Gemisch wurde elektrophoretisch auf einem Agarosegel getrennt, aus welchem das Fragment, das dem pBluescript SK(–)-Vektor enthaltend das 97 bp HBV-ayw4-Fragment entspricht, herausgeschnitten und eluiert wurde.
Stufe II: Das HBV-ayw4-Kerndomänenfragment wurde aus dem HBV 321-Plasmid, enthaltend das gesamte Genom von HBV-ayw4, mittels PCR mit Primern CXBAD und COREWK amplifiziert. Beide Primer wurden auf der Basis von DNA-Sequenz, die für die HBV-ayw4-Kerndomäne kodiert, konzipiert. Rückwärtsprimer COREWK fügt Restriktionsstellen in die Sequenz des HBV-ayw4-Kerndomänenfragments ein, wie oben beschrieben. Primer CXBAD wurde auf der Basis der Sequenz konzipiert, die für das HBV-ayw4-Kerndomänenfragment kodiert. Dieser Primer tauscht Adenin 1995 gegen Guanin und eliminiert dadurch eine Erkennungsstelle für XbaI-Restriktionsnuklease, während die Aminosäuresequenz unverändert bleibt. Nach der PCR wurde das Gemisch elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel getrennt. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde aus dem Gel eluiert und dann mit HindIII- und BgIII-Restriktionsnukleasen verdaut und anschließend deproteiniert.
Stufe III: DNA-Fragmente, die die Endprodukte des Vorgangs waren, der in Stufen I und II beschrieben wurde, wurden ligiert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli-Zellen des Stammes NM522 verwendet. Nach der Isolierung von Plasmid-DNA aus den transformierten Kolonien von E. coli wurde die Anwesenheit des Inserts durch die Restriktionsanalyse bestätigt. Das isolierte Plasmid wurde als Matrize für zwei PCR-Reaktionen verwendet: Verwendung von Primern COREWP (vorwärts) und CXHOBAM (rückwärts). Der Rückwärtsprimer wurde auf der Basis der Sequenz von HBV-ayw4 von Position 2116 bis 2142 konzipiert. Dieser Primer fügt folgende Austäusche in die Nukleotidsequenz hinzu: Thymin 2128 ist ausgetauscht gegen Cytosin, Guanin 2130 ist ausgetauscht gegen Cytosin, und Adenin 2133 ist ausgetauscht gegen Guanin. Die eingefügten Austäusche lassen die Aminosäuresequenz unverändert und fügen Erkennungsstellen für die Restriktionsnukleasen XhoI und BamHI hinzu. Verwendung von Primern CBAMAVR (vorwärts) und COREWK (rückwärts). Der Führungsprimer wurde auf der Basis von Sequenz von HBV-ayw4 von Position 2120 bis 2152 konzipiert. Dieser Primer führt dieselben Austäusche ein wie CXHOBAM und tauscht zusätzlich Thymin 2143 gegen Cytosin aus. Austäusche, die unter Verwendung von Primer CXHOBAM eingefügt wurden, erleichtern den Verdau des DNA-Fragments in dem Bereich, in dem es komplementär ist, mit den Restriktionsnukleasen XhoI, BamHI und AvrII. Produkte der oben beschriebenen PCR-Reaktionen wurden elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. In der ersten PCR wurde ein DNA-Fragment von 251 bp amplifiziert, und in der zweiten PCR wurde ein DNA-Fragment von 249 bp amplifiziert. Beide Fragmente waren aus dem Polyacrylamid-Gel eluiert. Das Gemisch von beiden Fragmenten wurde als Matrize für eine PCR mit Primern COREWP und COREWK verwendet. Das Gemisch aus beiden PCRs wurde auf Polyacrylamid-Gelen getrennt. Das amplifizierte DNA-Fragment von 477 bp Länge wurde aus dem Polyacrylamid-Gel durch Eluieren isoliert und dann mit den Restriktionsenzymen NdeI und HindIII verdaut und deproteiniert. Das erzeugte DNA-Fragment wurde mit dem pIGCmT7-Vektor, der mit den gleichen Restriktionsnukleasen verdaut war, ligiert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli-Zellen des Stammes NM522 verwendet.
Stufe IV: Herstellung der Glyzinbrücke, eines DNA-Fragmentes, das in die Stellen, die durch den Verdau mit Restriktionsenzymen BamHI und AvrI entstanden sind, in dem in Stufe III erhaltenen Konstrukt kloniert ist. Phosphorylierung des Oligonukleotids SCORE2 durch die Bakteriophagen-T4-Polynukleotidkinase. Phosphorylierung der Oligonukleotide SCORE3 SCORE2 durch die Bakteriophagen-T4-Polynukleotidkinase. Ligation des phosphorylierten Oligonukleotides SCORE2 mit Oligonukleotid SCORE4 mithilfe der komplementären Bereiche der Sequenz. Ligation des phosphorylierten Oligonukleotides SCORE3 mit Oligonukleotid SCORE1 mithilfe der komplementären Bereiche der Sequenz. Ligation von in Punkten 3 und 4 erhaltenen Produkten. Das Ligationsgemisch wurde elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Das DNA-Fragment von 73 bp wurde aus dem Polyacrylamid-Gel durch Eluieren isoliert. Das eluierte DNA-Fragment wurde phosphoryliert und anschließend mit dem in Stufe 111 erhaltenen Vektor ligiert. Der Vektor wurde mit Restriktionsnukleasen AvrII und BamHI verdaut und vor der Ligation deproteiniert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformierung von E. coli-Zellen des Stammes NM522 verwendet. Nach der Isolierung der Plasmid-DNA aus der E. coli-Kultur, die mit dem Vektor transformiert war, wurde die Anwesenheit des klonierten Inserts durch Restriktionsanalyse bestätigt.
Stufe V: Mittels PCR wurde das Fragment, dass für die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease von Position 325 bis 982 kodiert, von einem Plasmid, das die gesamte Länge dieses Enzyms enthält, amplifiziert. In dieser PCR wurden die Primer MOTEPW (vorwärts) und MOTEKWIN (rückwärts) verwendet. Die Primer wurden auf der Basis von DNA-Sequenz konzipiert, die für die katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease kodiert. Primer MOTEPW verlängert das 5'-Ende des DNA-Moleküls und fügt eine Erkennungsstelle für die Restriktionsnuklease BgII hinzu sowie einen Austausch in der Nukleotidsequenz.

Cytosin 327 ist gegen Thymin ausgetauscht. Die eingefügten Austäusche lassen die Aminosäuresequenz unverändert. Primer MOTEKWIN verlängert das 3'-Ende des DNA-Moleküls unter Einführung einer Erkennungsstelle für die Restriktionsnukleasen ClaI und BgII. Nach der PCR wurde das Gemisch elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel getrennt. Das amplifizierte DNA-Fragment von 700 bp wurde aus dem Polyacrylamid-Gel eluiert und anschließend mit der Restriktionsnuklease BgII verdaut und deproteiniert. Das erzeugte DNA-Fragment wurde mit dem Vektor ligiert, der in Stufe IV erhalten wurde, mit Restriktionsnuklease Sfil verdaut und nach dem Verdau deproteiniert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli-Zellen des Stammes NM522 verwendet. Nach der Isolierung von Plasmid-DNA aus den transformierten E. coli wurde Restriktionsanalyse verwendet, um die Anwesenheit des Inserts GWekGlyKatwPIG zu bestätigen. Die Genauigkeit des GWekGlyKatwPIG-Fragments, das in das pIGCmT7-Plasmid kloniert war, wurde mittels Primern PIGMSEK und T7SEK, die komplementär zur Polylinker-Sequenz des Plasmids pIGCmT7 sind, bestätigt. Für die Sequenzierung dieses Konstrukts wurden die Primer MOTSEK1, MOTSEK4 und MOTSEK3 verwendet, die komplementär zur Sequenz des katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease und Oligonukleotid SCORE4 sind.
Ein Plasmid, enthaltend das bestätigte Insert, wurde in E. coli-Zellen des Stammes BL21 (DE3) transformiert.
Schema der Herstellung von Moty_cat_Ckrd_w_PIG, inseriert in den pIGCmT7-Vektor.

Stufe I: Mittels PCR wurde ein Fragment des Gens, das für die HBV ayw4-Kerndomäne (von Position 1903 bis 2349) kodiert, vom Plasmid HBV321 amplifiziert, das das komplette Genom des HBV ayw4-Kerndomänenfragments enthält. Der Vorwärtsprimer COREWP verlängert das 5'-Ende des DNA-Moleküls unter Einführung von Erkennungsstellen für die Restriktionsnukleasen EcoRI und NdeI und fügt Austäusche in der Nukleotidsequenz durch den Austausch von Cytosinen 1908 und 1914 gegen Thymin hinzu und Einführen einer Erkennungsstelle für die Restriktionsnuklease ClaI, wobei die Aminosäuresequenz unverändert bleibt. Der Rückwärtsprimer COREWK fügt Erkennungsstellen für die Restriktionsnukleasen SacI und HindIII und eine Sequenz für Transkriptionsstop ein. Das PCR-Reaktionsgemisch wurde elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel getrennt. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde aus dem Polyacrylamid-Gel eluiert und anschließend mit den Restriktionsenzymen ClaI und HindIII verdaut und deproteiniert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in einen pBluescript SK(–)-Vektor, der mit denselben Restriktionsnukleasen verdaut und anschließend deproteiniert war, ligiert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli-Zellen des Stammes NM522 verwendet. Nach der Isolierung von Plasmid-DNA wurde die Anwesenheit des Inserts durch die Restriktionsanalyse bestätigt und die Genauigkeit des Inserts durch Sequenzierung bestätigt. Das erzeugte Plasmid pBluescript SK(–), enthaltend das klonierte Fragment des Gens, das für die HBV ayw4-Kerndomäne kodiert, wurde in E. coli-Zellen des Stammes BZ37 transformiert. Nach der Isolierung von Plasmiden aus der Kultur von transformierten E. coli des Stammes BZ37 wurden diese mit den Restriktionsnukleasen ClaI und HindIII verdaut. Das Gemisch wurde elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel getrennt, aus dem ein Fragment von 450 bp Länge zunächst ausgeschnitten und einschließend eluiert wurde.
Stufe II: Mittels PCR wurde das Gen, das für die katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease von Position 324 bis 928 kodiert, vom Plasmid, enthaltend die komplette Nukleotidsequenz dieser Protease, amplifiziert. In der PCR wurden folgende Primer verwendet: MOT1 (vorwärts) und MOT3 (rückwärts). Die Primer wurden auf der Basis von DNA-Sequenz konzipiert, die für die katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease kodiert. Primer MOT1 verlängert das 5'-Ende des DNA-Moleküls unter Einführung von Erkennungsstellen für die Restriktionsnukleasen BamHI und NdeI und eines Austausches in der Nukleotidsequenz. Cytosin 327 ist gegen Thymin ausgetauscht. Der erzeugte Austausch lässt die Aminosäuresequenz unverändert. Primer MOT3 verlängert das 3'-Ende des DNA-Moleküls durch Einführung von Erkennungsstellen für die Restriktionsnukleasen HindIII und ClaI und eines Terminierungskodons TAA. Nach der PCR wurde das Gemisch elektrophoretisch auf dem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Das 688 bp lange Fragment wurde aus dem Polyacrylamid-Gel eluiert, mit Restriktionsnukleasen BamHI und HindIII verdaut und deproteiniert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit einem pBluescript SK(–)-Vektor ligiert, der mit denselben Restriktionsnukleasen verdaut und anschließend deproteiniert wurde. Nach der Isolierung von Plasmid-DNA aus den transformierten E. coli wurde die Anwesenheit des Inserts MOT_DO_C_POP_MOT1_MOT3_W_BLUESCRIPCIE mittels Restriktionsanalyse bestätigt. Aus dem pBluescript SK(–)-Vektor, der das klonierte Insert enthält, wurde ein DNA-Fragment mithilfe von Restriktionsenzymen NdeI und HindIII ausgeschnitten. Das Verdau-Reaktionsgemisch wurde elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt, aus dem ein 679 bp-Fragment zunächst ausgeschnitten und dann eluiert wurde. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem pIGCmT7-Vektor ligiert, der mit denselben Restriktionsnukleasen verdaut und nach dem Verdaut deproteiniert wurde. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli-Zellen des Stammes NM522 verwendet. Nach der Isolierung von Plasmid-DNA aus Kolonien von transformierten E. coli wurde Restriktionsanalyse zur Bestätigung der Anwesenheit des Inserts MOT_DO_C_POP_MOT1_MOT3_W_BLUESCRIPCIE, das in den pIGCmT7-Vektor kloniert wurde, verwendet. Als nächstes wurde der erhaltene Vektor mit den Restriktionsnukleasen ClaI und HindIII verdaut. Das Verdau-Reaktionsgemisch wurde elektrophoretisch auf einem Agarose-Gel aufgetrennt, aus dem ein Fragment, das dem pIGCmT7-Vektor mit einem 678 bp-Fragment zunächst ausgeschnitten und anschließend eluiert wurde.
Stufe III: DNA-Fragmente, die die Endprodukte der Verfahren sind, die in Stufen I und 11 beschrieben sind, wurden ligiert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli-Zellen des Stammes NM522 verwendet. Nach der Isolierung des Plasmids aus den trasformierten E. coli-Kulturen wurde die Anwesenheit des klonierten Inserts im pIGCmT7-Verktor durch Restriktionsanalyse bestätigt.

Ein Plasmid enthaltend das bestätigte Insert wurde zur Transformation E. coli des Stammes BL21 (DE3) verwendet.
Schema der Herstellung des Fragments Cala_Mot_N, das in den Expressionsvektor pIGCmT7 inseriert ist.
Mittels PCR wurde ein Fragment, das für den Vorläufer der Leberegel-Cysteinprotease (beide katalytische und Führungsdomänen) kodiert, aus dem Plasmid, enthaltend die gesamte Nukleotidsequenz dieser Protease, von Position 52 bis 982 amplifiziert. In der PCR wurden die Primer MOTPRO1 (vorwärts) und MOT3 (rückwärts) verwendet. Die Primer wurden auf der Basis von DNA-Sequenz konzipiert, die für den Vorläufer der Leberegel-Cysteinprotease kodiert. Primer MOTRO1 verlängert das 5'-Ende des DNA-Moleküls unter Einführung von Erkennungsstellen für die Restriktionsnukleasen BamHI und NdeI. Primer MOT3 verlängert das 3'-Ende des DNA-Moleküls unter Einführung einer Erkennungsstelle für Restriktionsnukleasen HindIII und ClaI und eines Terminierungskodons TAA. Nach der PCR wurde das Gemisch elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Das amplifizierte Fragment von 960 bp Länge wurde aus dem Polyacrylamid-Gel eluiert und anschließend mit den Restriktionsnukleasen BamHI und HindIII verdaut und deproteiniert. Das erzeugte DNA-Fragment wurde in den pBluescript SK(–)-Vektor, verdaut mit denselben restriktionsnukleasen und nach dem Verdau deproteiniert, ligiert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli-Zellen des Stammes DH5α verwendet. Nach der Isolierung von Plasmid-DNA aus transformierten Bakterien wurde eine Restriktionsanalyse verwendet, um die Anwesenheit des Cala_Mot_N-Inserts im pBluescript SK(–)-Vektor zu bestätigen.
Aus dem pBluescript SK(–)-Vektor, enthaltend das Insert, wurde ein Fragment unter Verwendung der Restriktionsnukleasen NdeI und HindIII verdaut. Das Verdaugemisch wurde elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt, aus welchem ein Fragment von einer Länge, die dem Cala_Mot_N-Insert entspricht, zunächst ausgeschnitten und anschließend eluiert wurde. Das erzeugte DNA-Fragment wurde mit dem pIGCmT7-Vektor, der mit denselben Restriktionsnukleasen verdaut und nach dem Verdau deproteiniert war, ligiert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von E. coli des Stammes DH5α verwendet. Nach der Isolierung von Plasmid-DNA aus Kulturen von transformierten E. coli wurde eine Restriktionsanalyse zur Bestätigung der Anwesenheit des Cala_Mot_N-Inserts in dem pGCmT7-Vektor verwendet. Die Genauigkeit der Sequenz des Cala_Mot_N-Fragments, das in den pIGCmT7-Vektor inseriert wurde, wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Transformation von E. coli-Zellen
Zur Transformation von kompetenten bakteriellen E. coli-Zellen wurde die in J. Sambrook et al. (supra) beschriebene Methode verwendet.
Herstellung von Einschlusskörpern und Impfantigenen.
Expression und Isolierung von Einschlusskörpern.
E. coli Bakterien vom Stamm BL21 (DE3), die ein entsprechendes rekombinantes Plasmid tragen, wurden auf einem LB-Medium, enthaltend Chloamphenicol (20 μg/ml) bei 37°C über 3 Stunden kultiviert, wonach es mit frischem LB-Medium 1:100 verdünnt wurde; nach weiteren 3 Stunden Schütteln bei 37°C wurde die Expression durch den Zusatz von Isopropyl-thio-β-D-Glaktosid (IPTG) in der Endkonzentration von 0,1 μg/ml induziert. Nach 3 Stunden wurden die Bakterien abzentrifugiert. Die Zellsuspension wurde im Lysepuffer (0,5 M NaCl, 0,05 M Tris HCl, 0,01 M EDTA, 0,005 M 2-Mercaptoethanol, 0,35 mg/ml) suspendiert und für 30 Minuten bei 20°C inkubiert. Triton X-100 wurde in der Endkonzentration von 1% zugesetzt. Die Suspension wurde sonifiziert und zentrifugiert. Das Einschlusskörpersediment wurde zwei Mal im PBS-Puffer suspendiert, der 1% Triton X-100 enthält, sonifiziert und zentrifugiert. Die isolierten Einschlusskörper wurden zwei Mal mit PBS gewaschen. Abschließend wurden die Einschlusskörper im PBS-Puffer suspendiert.
Analyse der aufgereinigten Einschlusskörper
Die Anwesenheit der Einschlusskörperfraktion wurde durch die elektrophoretische Analyse von Proben auf einem 15%-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) bestätigt. Proteine wurden mit dem Farbstoff Coomassie blau visualisiert.
Bilder von den elektrophoretischen Auftrennungen von Proben von isolierten Einschlusskörpern sind in 3, 4, 5 und 6 dargestellt.
Spektrophotometrische Bestimmung von Proteinkonzentration
Die Konzentration von Proteinen wurde durch die Messung der Absorption bei λ = 595 nm mit Bradford-Reagenz bestimmt.
Primer und PCR-Oligonukleotide.
Primer, die zur Amplifikation von DNA-Fragmenten verwendet wurden, wurden bestellt bei und hergestellt von der Firma Perkin Elmer.
Geräte und andere Stoffe

Enzyme, die für die Klonierung verwendet wurden: Taq DNA-Polymerase und Puffer (Roche, Expand Long Template PCR System kit, Katalog-Nr. 1 681 834); T4 Polynukleotidkinase und Puffer (USB) Kommerziell erhältliche Restriktionsnukleasen wurden verwendet.
PCR: Der PCR-Thermocycler war ein PCT-100^TM Programmable Thermal Controller MJ Research, Inc.
Sequenzierung: Das verwendete Sequenziergerät wurde von Visible Genetics, Inc. geliefert; ein Kit von Amersham, Katalognr. US79840 (gemäß Empfehlungen des Herstellers); Plasmid-DNA Aufreinigungs-Kit von Kucharczuk Techniki Elektroforetyczne.
Proteinkonzentrationsbestimmung: Spektrophotometer Philips PU 8730.
Dokumentation: Sony Digital Graphics Printer UP 0890 Geldokumentationskit und Software Grab it.
Bakterielle Stämme: Stämme von E. coli, die in dieser Arbeit verwendet wurden: NM522 supE thiΔ (lac-proAB) hsd5 F'[proAB⁺ lacI^qlacZΔ M15] DH5α supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 BL21(DE3) hsdS gal (λclts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1) BZ37 dam- dcm-

Die Sequenzen der Inserts, die in die Vektoren eingefügt wurden, sind in 7–15 dargestellt.
In den Sequenzen wurden die Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme unterstrichen. Nach dem Verdau mit diesen Enzymen wurde das gegebene Insert in den Vektor eingefügt. Die Start- und Terminierungskodons sind fett markiert.
Beispiel 2. Analyse der Effizienz der in Form von Einschlusskörpern exprimierten Cysteinprotease aus F. hepatica in der Immunisierung eines Wirts gegen die Invasion von Parasiten.
Der Versuch wurde an Ratten durchgeführt, weil die Immun- und Verteidigungsantwort in diesen Tieren ähnlich der von Rindern ist, dem typischen Wirt von F. hepatica.
Ratten der Linie Sprague Dawley (eine Inzuchtlinie) wurden vom Department of Laborstory Animals of the Institute Centre for Polish Mothers' Health, ul. Rzgowska 281/289, Lódz ´ bezogen.
Die Experimente wurden mit der Genehmigung der III. lokalen Ethikkommission in Warschau durchgeführt. Die Ratten waren in Gruppen von 4 Individuen vom selben Geschlecht unterteilt, in standardisierten Plastikkäfigen in einem Raum mit Klimaanlage mit HEPA-gefilterter Luft unter natürlichen Lichtbedingungen untergebracht. Die Ratten bekamen Wasser aus 750 ml-Flaschen (Techniplast) und wurden ad libitum mit LSM-Diet gefüttert.
Vor dem Versuch wurden die Ratten über 1 bis 2 Wochen akklimatisiert. Eine parasitologische Analyse des Kots wurden in dieser Zeit durchgeführt, um andere Invationen, die den Verlauf des Versuchs beeinflussen könnten, zu bestimmen.
Im untersuchten Kot wurden keine Entwicklungsformen von Parasiten entdeckt.
Keine der Ratten ist während des Versuchs gestorben und die Ratten in der physiologischen Kontrollgruppe zeigten Stabilität von hämatologischen Indikatoren, die zeigen würden, dass sie keine ernsthaften Infektionen durchmachen.
Eine in vivo-Entnahme von kleinen Blutvolumina (150 μl jedes mal) wurde während des Versuchsverlaufs durch das Abschneiden der Schwanzspitze durchgeführt.
Am Tag der Sectios wurden 5 ml Blut aus dem Herzen der Ratten unter Vollnarkose entnommen. Nach der Entnahme wurde die Narkosedosis erhöht, um den Tod zu verursachen. Nach der Leberentnahme wurden die Leberegel aus dem Gallengang und Lebergewebe isoliert.
Kultur von Fasciola hepatica-Metacercarien
Am W.-Stefaski-Institut für Parasitologie wurde der komplette Entwicklungszyklus von Fasciola hepatica unterhalten. So haben wir Zugang zu einer Kultur des Zwischenwirts des Parasiten, der Schnecke Galba truncatula und ihrem Hauptfutter, Algen der Gattung Oscillatoria.
Aus den lebendigen Leberegeln, die aus Kalbslebern stammten, wurden Eier isoliert und anschließend in Oligovcene-Wasser bei 4°C aufbewahrt. Am Tag der geplanten Infektion der Schnecke wurden die Eier unter eine starke Lichtquelle für die Dauer der Zeit, die das Ausbrüten der Miracidien bewirkt, plaziert. Die Galba truncatula-Schnecken wurden infiziert, indem sie in flache Kunststoffwells zusammen mit 3 Miracidia plaziert wurden über die Zeit, die ausreichend war für Miracidien, um die Gewebe des Wirtes durchzudringen. Nach ca. 90 Tagen Kultur wurden die Metacercarien von der Wasseroberfläche und der unteren Seite des Deckels der Zuchtplatten eingesammelt.
Am Tag der Infektion von Ratten wurden die Metacercarien von verschiedenen Schnecken in ein Röhrchen gesammelt, aus dem eine Anzahl von Metacercarien abgezählt wurde, die zur Infektion eines Individuums nötig ist, und in ein anderes Röhrchen gegeben.
Entnahme und Aufbewahrung von Seren.
Das entnommene Blut wurde über 2 Stunden bei 37°C stehen gelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde es bei 4°C aufbewahrt. Am nächsten Tag wurde das Blut in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und das klare Serum in die Eppendorf-Röhrchen überführt. Das Serum wurde bei –70°C bis zur Durchführung der serologischen Tests aufbewahrt.
Orale Impfung von Sprague-Dawley-Ratten beider Geschlechter mit der Leberegel-Cysteinprotease in Einschlusskörpern.
Versuch
Individuelle Gruppen von Tieren wurden mit Proteinen immunisiert, die in E. coli-Bakterien in Form von Einschlusskörpern exprimiert wurden.

Gruppe 1 – oral immunisiert mit dem Protein der katalytischen Domäne der Cysteinprotease (PC) von Fasciola hepatica, das in der Sequenz KAT_Nasza_MOTZ_MOT2 kodiert ist.
Gruppe 2 – oral immunisiert mit dem Vorläufer-Protein der Cysteinprotease (PC) von Fasciola hepatica (beide katalytische und Führungsdomänen), das in der Sequenz Cala_Mot_N kodiert ist.
Gruppe 3 – Infektionskontrolle: oral behandelt mit Proteinen aus lysierten nichttransformierten Bakterien.
Gruppe 4 – physiologische Kontrolle.

Im ersten Versuch wurden folgende Aufbereitungen an die Ratten oral verabreicht:

Gruppe 1–300 Mikrogramm des Proteins der katalytischen Domäne der Cysteinprotease (PC) von Fasciola hepatica (von der Sequenz KAT_Nasza_MOT1_MOT2 kodiert) in 0,9% NaCl;
Gruppe 2–300 Mikrogramm des Vorläufer-Proteins (beide katalytische und Führungsdomänen) der Cysteinprotease (PC) von F. hepatica (von der Sequenz Cala_Mot_N kodiert);
Gruppe 3–300 Mikrogramm von bakteriellen Lysatproteinen (E. coli), nichttransformiert, in 0,9% NaCl
Gruppe 4–250 Mikroliter von 0,9% NaCl

Das Volumen der an die Tiere verabreichen Suspension betrug 250 ml. 28 Tage später wurde Ratten in individuellen Gruppen eine zweite orale Dosis einer identischen Präparation, aber enthaltend 100 Mikrogramm Protein, gegeben. 28 Tage nach der zweiten Runde wurden individuelle Ratten oral mit 30 Metacercarien von Fasciola hepatica infiziert.
35 Tage später wurde ein großes Volumen Blut entnommen. Die Ratten wurden notgeschlachtet, die Sektion wurde durchgeführt und die Leber wurde auf die Anwesenheit von Leberegel analysiert.
Versuche IIa und IIb wurden durchgeführt um festzustellen, ob es möglich wäre, die Schutzfähigkeit der Impfung durch die Modifizierung des Antigens zu erhöhen.
In Versuch IIa wurde individuelle Gruppen von Tieren mit Proteinen immunisiert, die in E. coli-Bakterien in Form von Einschlusskörpern exprimiert waren.

Gruppe 1 – oral immunisiert mit dem Konstrukt: HBV-Kerndomäne:: katalytische Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, die von der Moty_Cat_Ckrd kodiert ist.
Gruppe 2 – physiologische Kontrolle

Der Verlauf dieser Versuche war identisch mit dem oben beschriebenen.
Bestimmung des Schutzgrades
Der Schutzgrad in geimpften Gruppen wurde bestimmt durch den Vergleich der Durchschnittszahl von in der Leber von geimpften Tieren vorhandenen Leberegeln mit der Durchschnittszahl von Leberegeln in einem Individuum aus der Kontrollgruppe, die Lysate aus nichtrekombinierten E. coli oral bekommen haben.
Der Schutzgrad wurde ausgerechnet gemäß der Formel: (1 – d/W)·100%,wobei:

d: – die Durchschnittszahl von Leberegeln, die in einem Individuum vorhanden sind aus der Gruppe, die mit dem Vorläufer (Führungs- und katalytische Domänen, die Sequenz Cala_Mot_N) von Cystein-Protease oder einfach mit der katalytischen Domäne dieser Protease (die Sequenz KAT_Nasza_MOT1_MOT2) geimpft wurde.
k: – die Durchschnittszahl von Leberegeln, die in einem Individuum aus der Kontrollgruppe vorhanden sind, der nichtrekombinierte Bakterien gegeben wurden, ist.

Hämatologische Analysemethoden.
20 Mikroliter des Probeblutes wurden mit einem Antikoagulans gemischt und automatisch in dem AutoCounter AC920 (Swelab) analysiert. Die erhaltenen Daten waren: der Hämatokrit (HCT), Anzahl von Erythrozyten (RBC), Durchschnittsvolumen von Erythrozyten (MCV), Hämoglobingehalt (HGB), Durchschnittshämoglobingehalt pro Erythrozyte (MCH), Anzahl von Plättchen (PLT) und die Anzahl von Leukozyten (WBC).
Subpopulationen von Leukozyten wurden durch das Abzählen der Anzahl von Zellen im Blutschmier auf dem mikroskopischen Objektträger nach der Methode von Pappenheim bestimmt.
Immunoenzymatischer Assay (ELISA).
Rattenseren, die während des Versuchs gesammelt wurden, wurden einem immunoenzymatischen Assay sowohl individuell als auch gemischt innerhalb der individuellen Experimentalgruppen unterzogen.
Flachboden-ELISA-Mikrotiterplatten wurden über Nacht bei 4°C mit Exkretions-Sekretions-Proteinen (ES) von Fasciola hepatica in einer Konzentration von 15 Mikrogramm/ml in Karbonatpuffer (pH 9.6) beschichtet. 100 Mikroliter des Beschichtungsgemisches pro Well wurden verwendet. Als Nächstes wurden die Wells drei Mal in TBS (10 mM Tris, 0,15 M NaCl) mit Tween 40, pH 7,4, gewaschen. Nichtspezifische Bindungen wurden durch Zugabe von 100 Mikrolitern von 4% Lösung von Magermilch in TBS in die Wells für zwei Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Als Nächstes wurde eine zweifache Wäsche durchgeführt: mit TBS und TBS+Tween. Die untersuchten Seren wurden anschließend 1:100 verdünnt in einer 2% Magermilchlösung in TBS in die Wells gegeben. Jede Probe wurde zwei bis drei Mal wiederholt. Die Inkubation dauerte 30 min bei 37°C. Anschließend folgten 4 Wäschen in TBS+Tween. Als Nächstes wurde ein Serum, das spezifische Typen von Rattenantikörpern erkennt, zugegeben. Im Falle von IgG, IgM und IgE wurden die Seren mit der Meerrettichperoxidase (HRP) getaggt, aus dem Schaf (IgG, IgM) oder aus der Maus (IgE). Im Falle von Anti-IgA stand uns nur ein nichtgetaggtes Serum aus der Maus zur Verfügung, so dass wir ein drittes, Schaf-anti-Maus IgG Serum, tagged mit HRP, zugeben mussten. Alle Seren waren von Serotec und waren für verschiedene Tests gemäß Anweisungen des Herstellers verdünnt.
Die enzymatische Reaktion wurde nach dem dreifachen Waschen in TBS+Tween unter Verwendung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzol als Substrat durchgeführt. Die enzymatische Reaktion wurde nach 30 Minuten durch Zugabe von 50 Mikroliter von 2M Schwefelsäure angehalten, und die optische Dichte wurde in einem automatischen ELISA-Plattenleser (Dynatech Laborstories) bei einer Wellenlänge von 405 nm untersucht.
Ergebnisse und Diskussion
Versuch I.
Tabelle 1. Schutzgrad

Gruppe Anzahl der Ratten % des Schutzes Statistische Signifikanz Index der Leberschädigung

1 8 79 P < 0.001 1,1

2 8 73 P < 0.05 1,3

3 8 0 3,56
Die Ergebnisse der parasitologischen Versuche zeigen, dass eine doppelte orale Verabreichung des Proteins einer rekombinanten Cysteinprotease aus Fasciola hepatica einen sehr hohen Grad von Immunität gegen die Infektionen mit diesem Flachwurm verursacht. Durch Analyse von Leberschäden wurde gezeigt, dass im Falle von gegen PC immunisierten Ratten nur einige wenige Leberegel ihre Migration durch dieses Organ unternommen haben.
Bislang gab es keine Hinweise in der Fachliteratur bezüglich der Immunisierung gegen eine F. hepatica-Invasion durch orale Verabreichung von Leberegel-Antigenen in Form von Einschlusskörpern.
Hämatologische Parameter.
Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Anzahl von Plättchen gefunden. Die Anzahl von Erythrozyten sank nichsignifikant zwei Wochen nach der Infektion, der Hämatokrit blieb jedoch unverändert. Die Gesamtanzahl von Leukozyten erfuhr eine leichte Fluktuation, wohingegen die Anzahl von Zellen in individuellen Subpopulationen sich veränderte.
Die größte Veränderung zeigte sich bei den Eosinophilen in Gruppe 3. Eine leichte Erhöhung dieser Zellen tritt bereits 14 Tage nach der Dosis auf, wobei sich am Tag 28 nach der Infektion eine ernsthafte Eosinophilie entwickelte, die ihr Niveau 42 Tage nach der Invasion beibehielt. Die Erhöhung in der Anzahl von Eosinophilen in Gruppen 1 und 2 war nichtsignifikant, was nochmals bestätigt, dass die Invasion in die geimpften Ratten sehr mild war.
Ergebnisse des serologischen Assays.
Durch die ELISA-Methode erhaltene Ergebnisse. Die Ergebnisse der Assays für den Spiegel von Antikörpern der Klassen IgG1, IgG2a, IgG2b, IgE und IgA, die mit PC oder ES der Leberegel reagieren, sind in 15–20 dargestellt.
Die Analyse der ELISA-Tests zeigt, dass oral geimpfte Ratten auf die Invasion mit einer Th2-lymphozytenabhängigen Antikörperantwort reagieren. Es wird angenommen, dass die immunologische Antwort, die sich in Th2-abhängigen Antikörpern äußert, ein Charakteristikum für Abwehrkräfte gegen die Invasion von Helminthen ist.
Versuch IIa
Tabelle 2. Schutzgrad

Gruppe Anzahl der Ratten des Schutzes Statistische Signifikanz* index der Leberschädigung

1 8 61,6 P < 0,05 1,4

2 8 0 4,1
Versuch IIb

Tabelle 3. Schutzgrad

Gruppe	Anzahl der Ratten	% des Schutzes	Statistische Signifikanz*	index der Leberschädigung
1	8	65,5	P < 0,05	1,3
2	8	0		4,4
* die Durchschnittszahl von Leberegeln in der geimpften Gruppe gegen die Durchschnittszahl von Leberegeln in der geimpften Gruppe ("challenge"-Kontrolle)

Um die Ergebnisse der vorliegenden Versuche zusammenzufassen, muss dringend betont werden, dass es unumstritten ist, dass eine orale Impfung, die auf dem Protein von Fasciola-hepatica-Cysteinprotease in Form von Einschlusskörpern basiert, für die Prävention von Invasionen dieses Flachwurms wirksam sein kann.
Ein großer Vorteil und die Neuheit einer solchen Impfung ist die Möglichkeit der ihrer Verabreichung in Form von Suspensionen zusammen mit Trinkwasser. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Einschlußkörper, enthaltend ein Polypeptid, enthaltend die Aminosäuresequenz der Sequenz der Leberegel-Cysteinprotease, gegebenenfalls fusioniert an die Aminosäuresequenz des HBV-Kemproteins, zur Verwendung als ein oraler Impfstoff gegen den Leberegel.
Einschlußkörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese in E.coli hergestellt werden.
Einschlußkörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine der folgenden Sequenzen enthält: – die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, fusioniert an die Sequenz des HBVKernproteins, – die Sequenz der Leitdomäne der Leberegel-Cysteinprotease, fusioniert an die Sequenz des HBV-Kernproteins, – die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, fusioniert an die Sequenz des HBVKernproteins und Glyzinreste, die eine Glyzin-Brückenstruktur ausbilden, – die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, – die Sequenz des Vorläuferproteins der Leberegel-Cysteinprotease, umfassend die katalytische und Leit-Domänen.
Einschlußkörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine der Sequenzen enthält, die von den Sequenzen kodiert wird, die in den 7 bis 15 dargestellt sind.
Verwendung eines Polypeptids in Form von Einschlußkörpern, enthaltend die Aminosäuresequenz der Sequenz der Leberegel-Cysteinprotease, gegebenenfalls fusioniert an die Aminosäuresequenz des HBV-Kernproteins zur Herstellung eines Impfstoffs gegen den Leberegel.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid in einem genetisch modifizierten Mikroorganismus hergestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine der folgenden Sequenzen enthält: – die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, fusioniert an die Sequenz des HBVKernproteins, – die Sequenz der Leitdomäne der Leberegel-Cysteinprotease, fusioniert an die Sequenz des HBV-Kernproteins, – die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, fusioniert an die Sequenz des HBVKernproteins und Glyzinreste, die eine Glyzin-Brückenstruktur ausbilden, – die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, – die Sequenz des Vorläuferproteins der Leberegel-Cysteinprotease, umfassend die katalytische und Leit-Domänen.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine der Sequenzen enthält, die von den Sequenzen kodiert wird, die in den 7 bis 15 dargestellt sind.
Oraler Impfstoff gegen den Leberegel, enthaltend das Antigen und gegebenenfalls pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Adjuvans, dadurch gekennzeichnet, daß er als das Antigen ein Polypeptid in der Form von Einschlußkörpern, enthaltend die Aminosäuresequenz der Sequenz der Leberegel-Cysteinprotease, gegebenenfalls fusioniert an die Aminosäuresequenz des HBV-Kernproteins, enthält.
Impfstoff nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid in einem genetisch modifizierten Mikroorganismus hergestellt wird.
Impfstoff nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine der folgenden Sequenzen enthält: – die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, fusioniert an die Sequenz des HBVKernproteins, – die Sequenz der Leitdomäne der Leberegel-Cysteinprotease, fusioniert an die Sequenz des HBV-Kernproteins, – die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, fusioniert an die Sequenz des HBVKernproteins und Glyzinreste, die eine Glyzin-Brückenstruktur ausbilden, – die Sequenz der katalytischen Domäne der Leberegel-Cysteinprotease, – die Sequenz des Vorläuferproteins der Leberegel-Cysteinprotease, umfassend die katalytische und Leit-Domänen.
Impfstoff nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine der Sequenzen enthält, die von den Sequenzen kodiert wird, die in den 7 bis 15 dargestellt sind.