PL196114B1 - Ciałka inkluzyjne jako antygeny do doustnej immunizacji zwierząt - Google Patents
Ciałka inkluzyjne jako antygeny do doustnej immunizacji zwierzątInfo
- Publication number
- PL196114B1 PL196114B1 PL358081A PL35808102A PL196114B1 PL 196114 B1 PL196114 B1 PL 196114B1 PL 358081 A PL358081 A PL 358081A PL 35808102 A PL35808102 A PL 35808102A PL 196114 B1 PL196114 B1 PL 196114B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- liver fluke
- amino acid
- catalytic
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title description 16
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 14
- 241000242711 Fasciola hepatica Species 0.000 claims abstract description 145
- 208000006275 fascioliasis Diseases 0.000 claims abstract description 128
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 claims description 111
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 claims description 111
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 65
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 63
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 48
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 47
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 47
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 47
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 47
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 47
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 37
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 37
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 37
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 22
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 13
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 12
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 11
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 36
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 51
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 49
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 40
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 25
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 24
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 23
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 241000242541 Trematoda Species 0.000 description 14
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 14
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 14
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 241000935974 Paralichthys dentatus Species 0.000 description 9
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 7
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 244000000050 gastrointestinal parasite Species 0.000 description 5
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108010064245 urinary gonadotropin fragment Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101100184682 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MOT3 gene Proteins 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 4
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 3
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 3
- 101000694973 Homo sapiens TATA-binding protein-associated factor 172 Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102100028639 TATA-binding protein-associated factor 172 Human genes 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 3
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 241000585116 Galba truncatula Species 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 101150062199 MOT2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101001120037 Siganus canaliculatus L-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102100022760 Stress-70 protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000003108 parasitologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000013636 protein dimer Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059193 Acute hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000157302 Bison bison athabascae Species 0.000 description 1
- 101100398597 Botryotinia fuckeliana lcc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282988 Capreolus Species 0.000 description 1
- 101710140962 Capsid scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 241000272471 Circus aeruginosus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102100028007 Cystatin-SA Human genes 0.000 description 1
- 101710144510 Cysteine proteinase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 208000025011 Distomatosis Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101100068374 Gibberella zeae (strain ATCC MYA-4620 / CBS 123657 / FGSC 9075 / NRRL 31084 / PH-1) GIP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010034145 Helminth Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000192497 Oscillatoria Species 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000046974 Tscherskia triton Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000037628 acute hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940126576 edible vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008855 peristalsis Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/10—Anthelmintics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
1. Polipeptyd zawierajacy sekwencje aminokwasowa pochodzaca z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy watrobowej, korzystnie polaczona z sekwencja aminokwasowa bialka rdzeniowego HBV. 2. Polipeptyd wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jest w postaci cialek inkluzyjnych. 3. Polipeptyd wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zawiera jedna z nastepujacych sekwencji: - sekwencje domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy watrobowej polaczona z se- kwencja bialka rdzeniowego HBV, - sekwencje domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy watrobowej polaczona z sekwencja bialka rdzeniowego HBV, - sekwencje domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy watrobowej polaczona z se- kwencja bialka rdzeniowego HBV oraz resztami glicynowymi, tworzacymi strukture mostka glicynowego, - sekwencje domeny katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy watrobowej, - sekwencje bialka prekursora proteazy cysteinowej motylicy watrobowej obejmujaca domene katali- tyczna i liderowa. PL PL PL PL
Description
(22) Data zgłoszenia: 31.12.2002 (19) PL (11)196114 (13) B1 (51) Int.Cl.
A61K 39/00 (2006.01) C07K 16/20 (2006.01) A61P 33/10 (2006.01)
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) Ciałka inkluzyjne jako antygeny do doustnej immunizacji zwierząt (73) Uprawniony z patentu:
Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, Warszawa,PL
Instytut Parazytologii PAN,Warszawa,PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:
12.07.2004 BUP 14/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.12.2007 WUP 12/07 (72) Twórca(y) wynalazku:
Andrzej Płucienniczak,Warszawa,PL Małgorzata Kęsik,Warszawa,PL Anna Porębska,Warszawa,PL Halina Wędrychowicz,Warszawa,PL Luiza Jedlina-Panasiuk,Warszawa,PL (74) Pełnomocnik:
Witek Rafał,
Kancelaria Rzeczników Patentowych, WTS Rzecznicy Patentowi (57) 1. Polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, korzystnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV.
2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci ciałek inkluzyjnych.
3. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera jedną z następujących sekwencji:
- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,
- sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,
- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV oraz resztami glicynowymi, tworzącymi strukturę mostka glicynowego,
- sekwencję domeny katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,
- sekwencję białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą domenę katalityczną i liderową.
PL 196 114 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest szczepionka doustna oraz środki i metody służące do jej wytwarzania. Ogólnie wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej, obejmującego podawanie szczepionki przez układ pokarmowy. Przedmioty wynalazku służą do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko motylicy wątrobowej.
Motylica wątrobowa (Fasciola hepatica) to pasożyt przechodzący skomplikowany cykl życiowy, w którym żywicielem pośrednim jest ślimak, błotniarka moczarowa, a żywicielami ostatecznymi są: zwierzęta hodowlane (bydło, owce, kozy, a nawet konie), zwierzęta dziko żyjące (żubry, sarny, jelenie, wiewiórki - Vaughan i wsp., 1997; Aust. Vet. J. 75 (11): 811-3), człowiek. Żywiciel ostateczny zaraża się motylicą zjadając metacerkarie (jedna z form rozwojowych motylicy wątrobowej) znajdujące się na roślinach lub w wodzie. W przewodzie pokarmowym zachodzi ekscystacja młodocianych przywr, które penetrują przez ścianę jelita, jamę otrzewnową i torebkę wątrobową do miąższu wątroby. Po kilku tygodniach docierają do przewodów żółciowych - jest to miejsce osiedlania się dorosłych przywr. Prócz inwazji przewodów żółciowych zdarzają się też inwazje innych narządów np. płuc. Choroba wywołana przez motylicę wątrobową określana jest jako fascjoloza. Zakażenia motylicą wątrobową są przyczyną zniszczenia wątroby, uszkodzenia ścianek przewodów żółciowych, wypływu żółci, krwotoków. Skutkami zakażenia motylicą są: anemia, marskość wątroby, a przez to, niska produktywność (duża utrata wagi, niska mleczność, obniżona produkcja mięsa, niska jakość wełny u owiec). Cięższe przypadki zakażeń motylicą wątrobową mogą prowadzić do śmierci.
Leczenie farmakologiczne jest kosztowne i coraz mniej skuteczne ze względu na rozwijającą się lekooporność. Inwazja tego pasożyta sięga w Polsce od 10% populacji owiec (rejony północnowschodnie) do 98% (tereny podgórza). W Australii szacuje się, że 40 mln owiec i 6 mln bydła pasie się na terenach endemicznego występowania motylicy wątrobowej. Hodowcy wydają rocznie blisko 10 mln dolarów na leczenie fascjolozy, a straty produkcji kosztują kolejne 50-80 mln dolarów (Boray J.C., 1999; NSW Agriculture Agfact (2nd ed.) A0.9.57).
Fasciola hepatica zaliczana jest do najistotniejszych problemów weterynaryjnych, ze względu na rozprzestrzenienie pasożyta na całym świecie i szerokie spektrum organizmów ulegających zakażeniu.
Uważa się, że najlepszą metodę walki z inwazją motylicy wątrobowej stanowiłyby szczepionki. Ich zaletą jest min. to, że chronią organizm żywiciela przed uszkodzeniami już w okresie prepatentnym, zapewniając jednocześnie odporność na wiele lat. Jednak mimo wielu prób konstrukcji szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej, żadna z nich nie jest dostępna komercyjnie.
Szczepionki doustne, w przeciwieństwie do parenteralnych, mogą zapewnić nie tylko odporność systemiczną, ale również odporność błon śluzowych, co jest szczególnie ważne w profilaktyce zakażeń pasożytami pokarmowymi. Rosnące zainteresowanie szczepionkami doustnymi wiąże się także z łatwością stosowania, przez co możliwe staje się ich użycie w szczepieniach na szeroką skalę (Richter L., Kipp B.B., 1999, Curr. Top Microbiol. Immunol., 240,159-176). Podjęto już pierwsze próby opracowania szczepionek doustnych. Opis WO 00/37610 ujawnia wektory służące do otrzymywania polipeptydów immunogennych, takich jak HBsAg, w jadalnych tkankach roślinnych. Uzyskane w ten sposób rośliny transgeniczne wykorzystuje się do otrzymywania szczepionek doustnych.
Nie są one jednak pozbawione wad. Trudność stanowi zapewnienie odpowiednio wysokich i precyzyjnych dawek antygenu szczepionkowego. Poziom syntetyzowanego antygenu jest różny w różnych tkankach i egzemplarzach otrzymywanych roślin transgenicznych. Opisy US 5770214, US 5811105 i US 5804194 dotyczą stosowania szczepów atenuowanych Salmonella typhi, jako szczepionki doustnej.
Opis US 6290962 opublikowany 2001.09.18 ujawnia sposób wywoływania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko Helicobacter polegający na podawaniu immunogennej ilości antygenu będącego ureazą z Helicobacter lub jej podjednostką. Podobne szczepionki doustne zawierające rekombinowane białko ureazy z Helicobacter produkowane w komórkach E. coli są przedmiotem polskich patentów PL 179149 oraz PL 174448.
Stosunkowo małe doświadczenie w immunizacji doustnej oraz nieprzewidywalne losy antygenu w przewodzie pokarmowym sprawiają, że warunki efektywnej immunizacji tą drogą nie są tak ściśle określone jak w przypadku immunizacji parenteralnej, a ponadto immunizacja doustna niesie za sobą ryzyko wyindukowania tolerancji pokarmowej (McGhee J.R. i wsp., 1999. w : Mucosal Immunology (Ogra P.L., Lamm M.E., Bienenstock J., Mestecky J., Strober W., McGhee J.R., red), str. 485-505, Academic Press).
PL 196 114 B1
Opis WO 98/32427 opublikowany 1998.07.30 ujawnia polimer służący do przygotowywania osłonkowanych szczepionek doustnych o spowolnionym tempie uwalniania substancji czynnej.
Niezależnie od drogi podania, forma antygenu w znacznej mierze warunkuje stopień jego immunogenności.
Nabycie odporności w wyniku szczepienia wymaga zastosowania właściwego reżimu immunizacji, który obejmuje m.in. odpowiednie określenie takich parametrów jak wielkość i ilość dawek antygenu oraz odstępy czasu między poszczególnymi szczepieniami. Kwaśne pH soku żołądkowego, enzymy proteolityczne oraz perystaltyka jelit powodują, że w przypadku szczepień doustnych efektywne dawki antygenu są o wiele wyższe niż w szczepieniach parenteralnych. Jednakże podanie zbyt wysokich dawek antygenu przez układ pokarmowy może powodować wspomnianą już tolerancję pokarmową. Nie oznacza to jednak, że użycie niskich dawek antygenu nie może wywołać tolerancji pokarmowej. Dotychczas nie poznano podstawowych mechanizmów rządzących tym zjawiskiem, i nie osiągnięto standardowego rozwiązania problemu indukowanej tolerancji. Przypuszcza się, że zjawisko tolerancji jest w pewnym stopniu zależne od wspomnianych wyżej czynników, tj. wielkości dawki, terminarza szczepień oraz rodzaju antygenu (Tacket C.O., Mason H.S., 1999, Microbes and Infection 1, 777-783). Perspektywa uzyskania uniwersalnych adiuwantów, optymalnych składów szczepionek, korzystnych dawek i terminarza szczepień dla szczepionek doustnych w świetle dotychczasowych badań wydaje się być jeszcze bardzo odległa. (Makela P.H., 2000, FEMS Microbiology Rewiews 24, 9-20).
Wydaje się, że warunkiem immunizacji przez błony śluzowe jest wielokrotne podawanie antygenu w wielokrotnie wyższych dawkach niż dawki skuteczne parenteralnie. Bardziej korzystne są antygeny tworzące formy multimeryczne. Nie ma również pewności, co do zasadności stosowania adiuwantów. W przypadku roślinnych szczepionek jadalnych wydaje się być to niepożądane, jednak w przypadku pewnych antygenów może być ono konieczne (Richter L., Kipp B.B, 1999, Curr. Top Microbiol. Immunol. 240,159-176). Podsumowując, z istoty szczepień doustnych wynika, że opracowanie protokołu efektywnej immunizacji przez układ pokarmowy jest o wiele trudniejsze niż w przypadku szczepień metodami tradycyjnymi. W przypadku każdego preparatu jest to odrębne wyzwanie obarczone dużym ryzykiem niepowodzenia.
Wskaźnikami efektywności immunizacji przez błony śluzowe, w tym przez układ pokarmowy, są m.in.: poziom antygenowo-specyficznych sekrecyjnych przeciwciał klasy IgA (S-IgA) związanych z błonami śluzowymi, miano przeciwciał klasy IgG i IgA w surowicy, profil przeciwciał klasy IgG oraz profil cytokin. Wcelu określenia odporności komórkowej stosowane są testy na cytotoksyczność limfocytów.
Do tej pory, jako szczepionki, wykorzystywano już różne antygeny motylicy (Wędrychowicz i Klockiewicz, 1994, Acta Parasitologica, 39:173). Należą do nich min. proteazy cysteinowe (Piacenza L. i wsp., 1998, Parasitol. Int., 47S:266).
Cysteinowe proteazy to enzymy odgrywające bardzo ważną rolę w interakcjach pasożytgospodarz. Biorą udział w odżywianiu się pasożyta, jego migracji przez tkanki gospodarza, jak również ucieczce przed mechanizmami obronnymi układu immunologicznego gospodarza. Wiadomo także, że w trakcie długotrwałej migracji poszczególnych form rozwojowych pasożyta w organizmie żywiciela indukowana jest odpowiedź immunologiczna przeciwko proteazie cysteinowej.
Kofta i wsp. użyli cDNA proteazy cysteinowej jako szczepionkę przeciwko infekcjom motylicą wątrobową (Kofta i wsp., 2000, Vaccine, 18: 2985). W przeprowadzonym doświadczeniu uzyskano bardzo dobre wyniki.
Opisy patentowe: US6281345 (opublikowany 2001.08.28), US6265198 (opublikowany 2001.07.24) opisują kompozycje farmaceutyczne zawierające kwasy nukleinowe, białka, przeciwciała i inhibitory oraz ich zastosowanie do ochrony zwierząt przed chorobami spowodowanymi pasożytami układu pokarmowego.
Opis patentowy US6066503 (opublikowany 2000.05.23) opisuje rozwiązanie dotyczące sekwencji nukleotydowych kodujących enzymy aminopeptydazy pasożytów układu pokarmowego, ich antygeny oraz ekwiwalenty funkcjonalne i zastosowanie ich jako szczepionki przeciwko tym pasożytom.
W opisie patentowym US5885814 (opublikowanym 1999.03.23) przedstawiona jest szczepionka przeciwko pasożytom układu pokarmowego, zawierająca proteazę serynową otrzymaną z motylicy wątrobowej.
Opisy patentowe US6419923 (opublikowany 2002.07.22), US6365392 (opublikowany 2002.04.02), US5795768 (opublikowany 1998.08.18), US5792624 (opublikowany 1998.08.11),
PL 196 114 B1
US5750391 (opublikowany 1998.05.12) oraz US5691186 (opublikowany 1997.11.25) opisują sposoby otrzymywania białek proteinazy cysteinowej, przeciwciał, związków inhibujących aktywność proteinazy cysteinowej nicieni, a także ich zastosowanie jako kompozycji farmaceutycznych do ochrony zwierząt przed chorobami wywoływanymi przez pasożyty układu pokarmowego, wyizolowane rekombinowane komórki wykazują ekspresję.
Opis patentowy US5863775 (opublikowany 1999.01.26) opisuje sposób zwalczania pasożytów układu pokarmowego w zwierzętach-gospodarzach polegający na dostarczeniu doustnie zwierzęciugospodarzowi białka antyparazytologicznego, w formie lekarstwa bądź pożywienia, tak by białko to trafiło do pasożyta. Białko antyparazytologiczne może być inhibitorem enzymu pasożyta, na przykład inhibitorem enzymu trawiennego takiego jak inhibitor proteinazy cysteinowej. Zgodnie z tym rozwiązaniem białko antyparazytologiczne jest białkiem ulegającym ekspresji w transgenicznej kukurydzy i ryżu, stanowiących paszę dla zwierząt-gospodarzy.
Dotychczas w literaturze specjalistycznej nie było doniesień o uodpornieniu na inwazję F. hepatica poprzez doustne podawanie antygenów przywry w postaci ciałek inkluzyjnych. Wirus zapalenia wątroby typu B powoduje ostrą i przewlekłą żółtaczkę typu B oraz raka wątrobowo-komórkowego (cyt. w Blumberg,1997). Infekcji HBV u ludzi towarzyszy intensywne wytwarzanie i utrzymywanie się wykrywalnych ilości przeciwciał wywoływanych przez obecność nukleokapsydu wirusa (HBcAg) (Milich and McLachlan 1986, Milich et al., 1997a). Nukleokapsyd wirusa jest tworzony z powtarzających się wjego strukturze podjednostek, dimerów białka kapsydowego (Zhou and Standring, 1992), które składa się ze 183 lub 185 aminokwasów, w zależności od podtypu immunologicznego wirusa (Tiollais et al., 1981). W białku kapsydowym można wyróżnić dwie domeny: odpowiedzialną za kooperatywny proces tworzenia się nukleokapsydu i protaminopodobną, zlokalizowaną w C-końcowej części aminokwasów (około 40 C-końcowych aminokwasów), odpowiedzialną za łączenie się kwasami nukleinowymi.
Białko HBcAg ma zdolność do samoskładania się (Gallina et al., 1989; Birnbaum and Nassal, 1990). In vivo zbiera się w kapsydy zawierające pregenomowy RNA wirusa i DNA polimerazę kodowaną przez HBV (Bartenschlager and Schaller, 1992). Białko w swojej C-końcowej części posiada sekwencje sygnałowe warunkujące transport do jądra komórkowego (Yeh et al., 1990; Eckhardt et al., 1991). Do tworzenia cząstek kapsydu wystarcza 140 pierwszych N-końcowych aminokwasów, przy czym konieczna jest obecność proliny występującej w pozycji 138 (Metzger and Bringas, 1998). W kilku laboratoriach określono strukturę kapsydów, które składają się w roztworze ze skróconych cząsteczek białka rdzeniowego (Crowther et al., 1994; Bottcher et al., 1997; Conway et al., 1997). Okazało się, że kapsyd jest tworzony przez dimery białka rdzeniowego (patrz także Zhou and Standring, 1992). Uważa się, że dominującą jest cząstka składająca się ze 120 dimerów (Bottcher et al., 1997; Conway et al., 1997), które eksponują na zewnątrz aminokwasy 78-83 (Conway et al., 1998b). Jednak z modeli przedstawionych przez (Bottcher et al., 1997; Conway et al., 1997; Conway et al, 1998a; Zlotnick et al, 1997) wynika, że także C- i N-końce białek rdzeniowych, tworzących kapsyd ze skróconego białka rdzeniowego, są dostępne od zewnątrz. Struktura kapsydów zależy w pewnym stopniu od ilości aminokwasów białka rdzeniowego, które zostały usunięte z C-końca (Zlotnick et al., 1996). Wymienione charakterystyki mają znaczenie przy konstruowaniu hybrydowych kapsydów niosących dodatkowe antygeny.
Stwierdzono, że HBcAg posiada unikalne właściwości stymulowania odpowiedzi immunologicznej, mimo że jest wewnętrznym składnikiem wirionu HBV. Podczas wielu chronicznych infekcji HBcAg jest jedynym antygenem zdolnym do indukowania odpowiedzi immunologicznej. Wiadomo, że wystarcza podanie 25 ng tego antygenu w postaci iniekcji bez jakiegokolwiek adiuwantu do wywołania produkcji przeciwciał (Milich et al., 1997b). Prace Milicha i jego kolegów, przeprowadzone na myszach, wyjaśniły, że bardzo duża immunogenność HBcAg wynika ze zdolności tego antygenu do aktywacji komórek B w kierunku wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciw HBcAg, zarówno w obecności specyficznych komórek T, jak i bez nich (Milich and McLachlan, 1986). HBcAg-specyficzne komórki B pochodzące od nieimmunizowanych myszy spełniają funkcję pierwotnych komórek prezentujących antygen, ponieważ przetwarzają i prezentują antygen naiwnym komórkom T in vivo aktywniej niż makrofagi lub komórki dendrytyczne (Milich et al., 1997a). HBcAg efektywnie immunizuje także komórki T, szczególnie Th1 (Milich et al., 1987a).
Ponadto stwierdzono, że specyficzne względem HBcAg komórki pomocnicze mogą oddziaływać z komórkami typu B, specyficznymi dla antygenu powierzchniowego (HBsAg), stymulując je do
PL 196 114 B1 produkcji odpowiednich przeciwciał (Milich et al., 1997b). Te unikalne właściwości posiadają cząstki nukleokapsydu, a nie sekrecyjne formy antygenu (HBeAg).
Fuzja do immunodominantowego wewnętrznego miejsca HBcAg powoduje redukcję immunogenności i antygenności HBcAg, podczas gdy znacznie stymuluje immunogenność włączonego obcego epitopu (Schodel et al., 1990a; Clarke et al., 1991).
Pomimo opisanych powyżej wstępnych badań poświęconych dostarczeniu szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej istnieje ciągła potrzeba uzyskania skutecznych narzędzi pozwalających na łatwe uzyskiwanie skutecznych szczepionek uodparniających przed tym pasożytem.
W świetle przedstawionego powyżej stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie skutecznych i łatwo dostępnych środków, które mogą być stosowane w szczepieniach doustnych przeciw motylicy wątrobowej, pozwalających uzyskać odporność systemiczną, a także odporność błon śluzowych. Środki według wynalazku powinny być łatwe do stosowania i pozbawione innych znanych niedogodności związanych z przygotowywaniem i stosowaniem szczepionek, takich jak stosunkowo wysokie koszty przygotowania preparatu i niebezpieczeństwo przypadkowego zakażenia krwi w trakcie szczepienia. Szczepionki doustne według wynalazku powinny zapewniać skuteczną immunizację przez układ pokarmowy.
Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do otrzymywania skutecznej, prostej w stosowaniu i łatwo dostępnej szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie białek chimerycznych, które zawierałyby wybrane antygeny pochodzące z proteinazy cysteinowej Fasciola hepatica i mogłyby być wykorzystane do szczepień przeciwko motylicy wątrobowej, a także narzędzi pozwalających na ich ekspresję wE. coli. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie środków pozwalających otrzymać rekombinowane białka, które mogłyby być zastosowane do produkowania jadalnych szczepionek przeciwko motylicy wątrobowej.
Nieoczekiwanie realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z białkami powstającymi w komórkach na bazie egzogennego DNA zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd produkowany w genetycznie zmodyfikowanym mikroorganizmie zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, ewentualnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV. Korzystnie jest on w postaci ciałek inkluzyjnych. Równie korzystnie zawiera on jedną z następujących sekwencji:
- sekwencję części katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,
- sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,
- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV oraz resztami glicynowymi, tworzącymi strukturę mostka glicynowego,
- sekwencję części katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,
- sekwencję białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą część katalityczną i liderową.
Szczególnie korzystnie polipeptyd według wynalazku zawiera jedną z sekwencji kodowanych przez sekwencje przedstawione na figurach od 7 do 15.
Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja kodująca polipeptyd, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, ewentualnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV. Korzystnie, zawiera ona jedną z następujących sekwencji:
- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,
- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,
- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV oraz reszty glicynowe,
PL 196 114 B1
- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,
- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą część katalityczną i liderową.
Szczególnie korzystnie, sekwencja według wynalazku została wybrana spośród sekwencji przedstawionych na fig. 7 -fig. 15.
Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt zawierający sekwencję kodującą polipeptyd, charakteryzujący się tym, że jako sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd według wynalazku zdefiniowaną powyżej. Korzystnie konstrukt według wynalazku jest plazmidem powstałym poprzez włączenie sekwencji kodującej polipeptyd do plazmidu pIGDM1, korzystnie plazmidu pIGCmT7.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka bakteryjna transformowana konstruktem ekspresyjnym zawierającym sekwencję kodującą polipeptyd, charakteryzująca się tym, że konstrukt jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera sekwencję według wynalazku zdefiniowaną powyżej. Korzystnie, komórka bakteryjna według wynalazku zawiera plazmid powstały poprzez włączenie sekwencji kodującej polipeptyd do plazmidu pIGDM1, korzystnie plazmidu pIGCmT7. Korzystnie komórka bakteryjna według wynalazku jest szczepem E. coli.
Przedmiotem wynalazku są także ciałka inkluzyjne zawierające polipeptyd według wynalazku zdefiniowany powyżej. Korzystnie są one produkowane w E.coli.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania szczepionki doustnej przeciwko motylicy wątrobowej, charakteryzujący się tym, że obejmuje transformację komórek E. coli wektorem ekspresyjnym, ekspresję polipeptydu kodowanego przez ten wektor, izolowanie ciałek inkluzyjnych zawierających produkowany polipeptyd służących do przygotowania szczepionki, przy czym wektor zawiera kodującą sekwencję nukleotydową według wynalazku, zdefiniowaną powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu według wynalazku zdefiniowanego powyżej, do otrzymywania szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej.
Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka doustna przeciwko motylicy wątrobowej zawierająca antygen i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub adiuwant, charakteryzująca się tym, że jako antygen zawiera polipeptyd według wynalazku zdefiniowany powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie ciałek inkluzyjnych według wynalazku, zdefiniowanych powyżej, do wytwarzania szczepionki doustnej przeciwko motylicy wątrobowej.
W niniejszym wynalazku HbcAg użyto jako nośnik i adjuwant dla antygenu katalitycznej części proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej.
Zastosowano dwa warianty konstrukcji włączonych do wektorów ekspresyjnych:
1. Połączenie 5' końca sekwencji kodującej białko rdzeniowe HBV z 3' końcem sekwencji kodującej odpowiedni fragment proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,
2. Połączenie fragmentu sekwencji kodującej katalityczną część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV poprzez „mostek glicynowy. Tego typu połączenie zgodnie z artykułem Kratz P.5 powoduje ekspozycję białka włączonego w obrębie rdzeniowej cząstki HBV na jej powierzchni.
Szczepionkami są odpowiednie białka, których ekspresję uzyskano w komórkach bakterii E. coli szczep BL21(DE3) transformowanych plazmidem ekspresyjnym pIGCmT7 zawierającym daną wstawkę. Białka te izolowano z komórek bakterii E. coliw postaci ciałek inkluzyjnych.
Zaprezentowany wynalazek posiada liczne zalety wyróżniające go na tle znanych ze stanu techniki rozwiązań. Uzyskano wysoce skuteczną szczepionkę przeciw motylicy wątrobowej, pozwalającą otrzymać odporność systemową, a także odporność błon śluzowych. Ze względu na fakt, iż naturalną drogą inwazji motylicy wątrobowej jest przewód pokarmowy, opracowano szczepionkę aplikowaną drogą pokarmową, która indukuje skuteczną reakcję immunologiczną w naturalnym miejscu wniknięcia robaka. Otrzymana szczepionka jest łatwa do stosowania i pozbawiona innych znanych niedogodności związanych z przygotowywaniem i stosowaniem klasycznych szczepionek, takich jak stosunkowo wysokie koszty uzyskania preparatu i niebezpieczeństwo przypadkowego zakażenia krwi w trakcie szczepienia.
Ekspresja antygenu przebiega w komórkach bakteryjnych. Prosta budowa wybranego gospodarza oraz możliwość kontroli procesu ekspresji antygenu szczepionkowego izolowanego i stosowanego w postaci ciałek inkluzyjnych gwarantuje homogenność otrzymywanych preparatów, a przez to precyzyjne dawkowanie. Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku.
PL 196 114 B1
Figura 1 przedstawia mapę plazmidu pIGCmT7, przy czym ARG t-RNA - gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG, ORI - origin replikacji plazmidu pPIGDM1, Cm-R - gen oporności na chloramfenikol, T7 - promotor, stop - terminacja transkrypcji;
Figura 2 przedstawia sekwencję nukleotydową całej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej (Fasciola hepatica);
Figura 3 przedstawia wyizolowane białko katalitycznej części proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej; Ścieżki: 1) Wzorzec mas białkowych LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa, 2) Wyizolowane białko katalitycznej części proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej.
Figura 4 przedstawia wyizolowane białko prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej (część katalityczna i liderowa); Ścieżki: 1) Wzorzec mas białkowych LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa, 2) Wyizolowane białko prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej (część katalityczna i liderowa).
Figura 5 przedstawia wyizolowane białko katalitycznej części proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej::fragment rdzeniowej części HBV; Ścieżki: 1) Wzorzec mas białkowych LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa, 2) Wyizolowane białko katalitycznej części proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej::fragment rdzeniowej części HBV.
Figura 6 przedstawia wyizolowane białko katalitycznej części proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej mostek glicynowy::fragment rdzeniowej części HBV. Ścieżki: 1) Wzorzec mas białkowych LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa; 2) Wyizolowane białko katalitycznej części proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej::mostek glicynowy::fragment rdzeniowej części HBV.
Na figurze 7 przedstawiona została sekwencja CWekGlyKatwBluescr kodująca białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej, połączone mostkiem glicynowym. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.
Na figurze 8 przedstawiona została sekwencja CWekGlyKatwPIG kodująca białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej, połączone mostkiem glicynowym. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.
Na figurze 9 przedstawiona została sekwencja Moty_cat_Ckrd kodująca białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHl i SacI.
Na figurze 10 przedstawiona została sekwencja KAT_Nasza_MOT1_MOT2 kodująca część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHl i Hindlll.
Na figurze 11 przedstawiona została sekwencja kodująca część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.
Na figurze 12 przedstawiona została sekwencja
MOT_DO_C_POP_MOT1_MOT3_W_BLUESCRIPCIE kodująca część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora Bluescript SK(-) w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHl i Hindlll.
Na figurze 13 przedstawiona została sekwencja
MOT_DO_C_POP_MOT1_MOT3_W_PIG kodująca część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.
Na figurze 14 przedstawiona została sekwencja Moty_cat_Ckrd_w_PIG kodująca białko hybrydowe rdzeniowa część HBV::część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i HindIII.
Na figurze 15 przedstawiona została sekwencja Cala_Mot_N kodująca białko prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej (część katalityczna i liderowa). Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i HindIII.
Kolejne figury przedstawiają wyniki badań serologicznych u zwierząt szczepionych doustnie preparatami według wynalazku. Figury 16-20 przedstawiają poziom przeciwciał klas: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgE oraz IgA reagujących z PC lub ES motylicy, przy czym figura 16 przedstawia poziom przeciwciał IgG1 swoistych dla PC; figura 17 przedstawia poziom przeciwciał IgG2a swoistych dla PC,
PL 196 114 B1 figura 18 przedstawia poziom przeciwciał IgG2b swoistych dla PC, figura 19 przedstawia poziom przeciwciał IgE swoistych dla PC,a figura 20 przedstawia poziom przeciwciał IgA swoistych dla PC.
Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.
P r zyk ł a d 1. Otrzymywanie szczepu E. coliz ekspresją antygenów szczepionkowych.
Plazmidy
Bakteryjny plazmid ekspresyjny pIGCmT7: Plazmid pIGCmT7 (4056 pz.) (Fig. 1) powstał w pracowni prof. Andrzeja Płucienniczaka w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie w oparciu o plazmid pIGDM1 (Mikiewicz D. i wsp., Plasmid 1997), który jest plazmidem z grupy ColE1 Enterobacter agglomerans. Plazmid pIGCmT7 powstał przez dostawienie genu oporności na chloramfenikol, polilinkera wraz z promotorem RNA polimerazy z faga T7 oraz sekwencją kodującą kodon stop transkrypcji pochodzącą z faga T7.
Nieekspresyjne plazmidy bakteryjne: Do klonowania fragmentów DNA po powieleniu PCR używano plazmidu pBluescript SK(-) zakupionego od Stratagene (sekwencja dostępna w Banku Genów pod numerem X52324 S52394). Plazmid ten posiada: origin replikacji Col E1, promotory (dla RNA polimeraz fagowych) T3 i T7 flankujące polilinker oraz gen oporności na ampicylinę.
Wyjściowe Sekwencje wstawek
Sekwencja proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej (Fasciola hepatica): cDNA całej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej (Fasciola hepatica) wyizolowano w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków we współpracy z Katedrą Parazytologii Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego. Prace prowadzono na szczepie Escherichia coli w oparciu o plazmid niosący gen kodujący białko proteazy cysteinowej Fasciola hepatica (Kofta W, Mieszczanek J, Płucienniczak G, Wedrychowicz H., Successful DNA immunisation of rats against fasciolosis, Vaccine 2000; 18:2985-2990).
Porównanie do sekwencji nukleotydowych innych proteaz zgromadzonych w Banku Genów stało się podstawą wyróżnienia w sekwencji nukleotydowej proteazy trzech części kodujących odpowiednio: fragment sygnałowy, liderowy i katalityczny.
Załączono sekwencję nukleotydową całej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej (Fasciola hepatica) -fig. 2.
Sekwencja kodująca białko rdzeniowe wirusa żółtaczki typu B (HBV) szczepu ayw4: Sekwencja nukleotydowa kodująca białko rdzeniowe HBV (ayw4) została wyizolowana przez prof. Płucienniczaka. Jest ona dostępna w bazie danych Banku Genów pod indeksem Z35716. Fragment DNA kodujący białko rdzeniowe HBV (ayw4) wklonowany jest w plazmidzie HBV 321. Jest to plazmid PUC 19, zawierający cały genom HBV ayw4 włączony w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną BamHl.
Schematy otrzymywania wstawek w wektorach
Współrzędne podane w opisach otrzymywania fragmentów włączanych w wektory, odnoszą się odpowiednio do współrzędnych w załączonej sekwencji w przypadku proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej i sekwencji zdeponowanej w amerykańskim banku genów w przypadku HBV ayw4.
Schemat otrzymywania fragmentu KAT_Nasza_MOT1_MOT2 włączonego do wektora pIGCmT7.
Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej powielono w reakcji PCR fragment DNA kodujący C-terminalną część (katalityczną) tej proteazy od pozycji 325 do 982. W reakcji PCR wykorzystano primery MOT1 (primer wiodący) i MOT2 (primer odwrotny). Primery użyte do reakcji PCR zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującego proteazę. Primery wprowadzały miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne: BamHl i Ndel dla primeru wiodącego, oraz Hindlll dla primeru odwrotnego. Powielony fragment rozdzielono elektroforetycznie i wyizolowano z żelu poliakryloamidowego (Dybczyński I, Płucienniczak A, A protocol for DNA fragment extraction from polyacryloamide gels, Biotechniques 1988; 6:924-926), a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i Hindlll i odbiałczono. Otrzymane fragmenty DNA ligowano z wektorem pBluescriptSK(-), trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Produkt ligacji wtransformowano w komórki E. coli szczepu NM522. Wykorzystywana była metoda transformacji opisana przez J. Sambrook i wsp. Chung C. T., Miller R. H., A rapid and convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells, Nucleic Acid. Res. 1988;16(8). Po izolacji DNA plazmidowego z komórek transformowanych E. coli potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wklonowanej wstawki KAT_Nasza_MOT1_MOT2, a poprawność sekwencji zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Z wektora pBluescriptSK(-) wytrawiono fragment enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll i odbiałczono. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pIGCmT7, trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki
PL 196 114 B1
E. coli szczepu NM522. Obecność wklonowanej wstawki KAT_Nasza_MOT1_MOT2_w_PIG w wektorze pIGCm T7 potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej.
Plazmidem zawierającym sprawdzoną wstawkę transformowano komórki E. coli szczep BL21(DE3).
Schemat otrzymywania fragmentu CWekGlyKatwPIG włączonego do wektora pIGCmT7
Etap I: Z plazmidu HBV321 zawierającego cały genom HBV ayw4 powielono w reakcji PCR primerami COREWP i COREWK fragment genu kodującego część rdzeniową HBV ayw4 (od pozycji 1903 do 2349). Użyte primery zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującej fragment części rdzeniowej HBV ayw4. Primer wiodący COREWP wydłuża cząsteczkę DNA na końcu 5', wprowadzając miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne EcoRI i Ndel oraz wprowadza zmiany w sekwencji nukleotydowej, zmieniając cytozynę na tyminę w pozycjach 1908 i 1914 wprowadzając miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną ClaI, przy zachowaniu sekwencji aminokwasowej. Primer odwrotny COREWK wydłuża cząsteczkę DNA na 3' końcu i wprowadza miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Sacl i Hindlll oraz kodon terminacyjny TAA. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA wyeluowano zżelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRl i Hindlll, i odbiałczono. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pBluescript SK(-) trawionym tymi samymi nukleazami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep NM522. Po izolacji DNA plazmidowego potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wstawki. Z wektora pBluescript SK(-) zawierającego wklonowaną wstawkę wytrawiono fragment enzymami HindIII i BglII. Mieszaninę po reakcji trawienia rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym, z którego wycięto, a następnie wyeluowano fragment odpowiadający wektorowi pBluescript SK(-) z 97 pz fragmentem HBV ayw4.
Etap II: Z plazmidu HBV 321 zawierającego cały genom HBV ayw4 powielono w reakcji PCR fragment części rdzeniowej HBV ayw4, z użyciem primerów CXBAD i COREWK. Oba primery zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującego fragment części rdzeniowej HBV ayw4. Primer odwrotny COREWK wprowadza w sekwencji fragmentu części rdzeniowej HBV ayw4 miejsca restrykcyjne jak opisano wyżej. Primer CXBAD zaprojektowano na podstawie sekwencji kodującej fragment części rdzeniowej HBV ayw4. Primer ten zmienia adeninę w pozycji 1995 na guaninę, likwidując w ten sposób miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną Xbal, przy zachowaniu sekwencji aminokwasowej. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA wyeluowano z żelu, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi HindIII i BglII, i odbiałczono.
Etap III: Ligowano fragmeny DNA będące produktami końcowymi procedur opisanych w Etapie I i II. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z transformowanych kolonii E. coli potwierdzono obecność wstawki w wyniku analizy restrykcyjnej. Wyizolowany plazmid użyto jako matrycę w dwóch reakcjach PCR:
Z użyciem primerów COREWP (primer wiodący) i CXHOBAM (primer odwrotny).
Primer odwrotny zaprojektowano na podstawie sekwencji HBV ayw4 od pozycji 2116 do 2142. Primer ten wprowadza zmiany w sekwencji nukleotydowej: tyminę w pozycji 2128 zmieniono na cytozynę, guaninę w pozycji 2130 zmieniono na cytozynę, adeninę w pozycji 2133 zmieniono na guaninę.
Wprowadzone zmiany zachowują sekwencję aminokwasową i wprowadzają miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Xhol i BamHl.
Z użyciem primerów CBAMAVR (primer wiodący) i COREWK (primer odwrotny). Primer wiodący zaprojektowano na podstawie sekwencji HBV szczep ayw4 od pozycji 2120 do 2151. Primer ten wprowadza zmiany w sekwencji takie same, jak CXHOBAM oraz dodatkowo w pozycji 2143 zmienia tyminę na cytozynę. Wprowadzone zmiany przy użyciu primera CXHOBAM umożliwiają trawienie fragmentu DNA, na odcinku do którego jest komplementarny, nukleazami restrykcyjnymi XhoI, BamHIi Avrll.
Produkty każdej z wyżej opisanych reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym.
W pierwszej reakcji PCR powielono fragment DNA o długości 251 pz, w drugiej reakcji PCR powielono fragment DNA o długości 249 pz. Oba fragmenty wyeluowano z żelu poliakryloamidowego. Mieszaninę obu fragmentów użyto jako matrycę do reakcji PCR zużyciem primerów COREWP i COREWK. Mieszaninę produktów po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA o długości 477 pz wyizolowano z żelu poliakryloamidowego przez elucję, a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi Ndel i HindIII i odbiałczono. Otrzymany frag10
PL 196 114 B1 ment DNA ligowano z wektorem pIGCmT7 trawionym tymi samymi nukleazami restrykcyjnymi. Produkt ligacji użyto do transformowania komórek E. coli szczepu NM522.
Etap IV: Przygotowanie „mostka glicynowego - fragmentu DNA wklonowanego w miejsca po trawieniu enzymami restrykcyjnymi BamHl i Avrll w konstrukcji otrzymanej w Etapie III.
Fosforylowanie oligonukleotydu SCORE2 z użyciem polinukleotydowej kinazy Bakteriofaga T4.
Fosforylowanie oligonukleotydu SCORE3 SCORE2 z użyciem polinukleotydowej kinazy Bakteriofaga T4.
Łączenie ufosforylowanego oligonukleotydu SCORE2 z oligonukleotydem SCORE4 komplementarnymi częściami sekwencji.
Łączenie ufosforylowanego oligonukleotydu SCORE3 z oligonukleotydem SCORE1 komplementarnymi częściami sekwencji.
Ligacja produktów otrzymanych w punktach 3 i 4.
Mieszaninę ligacyjną rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Fragment DNA o długości 73 pz wyizolowano z żelu poliakryloamidowego przez elucję. Wyeluowany fragment DNA fosforylowano, a następnie ligowano z wektorem otrzymanym w Etapie III. Wektor przed użyciem do ligacji trawiono nukleazami restrykcyjnymi Avrll i BamHI, i odbiałczono. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z kolonii E. coli transformowanych wektorem, potwierdzono obecność wklonowanej wstawki w wyniku analizy restrykcyjnej.
Etap V: Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej powielono w reakcji PCR fragment kodujący część katalityczną tej proteazy od pozycji 325 do 982. W reakcji PCR wykorzystano primery MOTEPW (primer wiodący) i MOTEKWIN (primer odwrotny). Primery zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującego część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Primer MOTEPW wydłuża 5' koniec cząsteczki DNA wprowadzając miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną BglI oraz zmianę w sekwencji nukleotydowej. Zmieniono cytozynę w pozycji 327 na tyminę. Wprowadzona zmiana zachowuje sekwencję aminokwasową. Primer MOTEKWIN wydłuża koniec 3' cząsteczki DNA, wprowadzając miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne ClaI i BglI. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA o długości 700 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono nukleazą restrykcyjną BglI i odbiałczono. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem otrzymanym w Etapie IV, trawionym nukleazą restrykcyjną Sfil i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z kolonii transformowanych E. coli potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wstawki CWekGlyKatwPIG. Poprawność sekwencji fragmentu CWekGlyKatwPIG wklonowanego w plazmidzie pIGCmT7 zweryfikowano przez sekwencjonowanie z użyciem primerów PIGMSEK i T7SEK komplementarnych do sekwencji polilinkera plazmidu pIGCmT7. W sekwencjonowaniu konstrukcji wykorzystano również primery MOTSEK1, MOTSEK4, MOTSEK3, komplementarne do sekwencji katalitycznej części proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej i oligonukleotyd SCORE4.
Plazmidem zawierającym sprawdzoną wstawkę transformowano komórki E. coli szczep BL21(DE3).
Schemat otrzymywania Moty_cat_Ckrd_w_PIG włączonego do wektora pIGCmT7
Etap I: Z plazmidu HBV321 zawierającego cały genom HBV ayw4 powielono w reakcji PCR primerami COREWP i COREWK fragment genu kodującego część rdzeniową HBV ayw4 (od pozycji 1903 do 2349). Użyte primery zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującej fragment części rdzeniowej HBV ayw4. Primer wiodący COREWP wydłuża cząsteczkę DNA na końcu 5', wprowadzając miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne EcoRl i Ndel oraz wprowadza zmiany w sekwencji nukleotydowej, zmieniając cytozynę na tyminę w pozycjach 1908 i 1914 wprowadzając miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną ClaI, przy zachowaniu sekwencji aminokwasowej. Primer odwrotny COREWK wprowadza miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne SacI i HindlII oraz miejsce stop transkrypcji. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi Clal i Hindlll, i odbiałczono. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pBluescript SK(-), trawionym tymi samymi nukleazami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep NM522. Po izolacji DNA plazmidowego potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wstawki, a poprawność sekwencji zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Otrzymanym plazmidem pBluescript SK(-) zawierającym wklonowany fragment genu kodującego część rdzeniową HBV ayw4 transformowano komórki
PL 196 114 B1
E. coli szczep BZ37. Po izolacji plazmidów z kolonii transformowanych E. coli szczep BZ37 trawiono je nukleazami restrykcyjnymi Clal i Hindlll. Mieszaninę po cięciu rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym, z którego wycięto, a następnie wyeluowano fragment o długości 450 pz.
Etap II: Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej powielono w reakcji PCR gen kodujący część katalityczną tej proteazy od pozycji 324 do 982. W reakcji PCR wykorzystano primery MOT1 (primer wiodący) i MOT3 (primer odwrotny). Primery zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującego część katalityczną proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Primer MOT1 wydłuża 5' koniec cząsteczki DNA, wprowadzając miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne BamHl i Ndel, oraz zmianę w sekwencji nukleotydowej. Zmieniono cytozynę w pozycji 327 na tyminę. Wprowadzona zmiana zachowuje sekwencję aminokwasową. Primer MOT3 wydłuża 3' koniec cząsteczki DNA, wprowadzając miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Hindlll i Clal, oraz kodon terminacyjny TAA. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment o długości 688 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi BamHl i Hindlll i odbiałczono. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pBluescript SK(-) trawionym tymi samymi nukleazami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Po izolacji DNA plazmidowego z transformowanych E. coli potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wklonowanej wstawki MOT_DO_C_POP_MOT1_MOT3_W_BLUESCRIPCIE. Z wektora pBluescript SK(-) zawierającego wklonowaną wstawkę wytrawiono enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll fragment DNA. Mieszaninę po reakcji trawienia rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym, z którego wycięto, a następnie wyeluowano fragment o długości 679 pz. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pIGCmT7 trawionym tymi samymi nukleazami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z kolonii transformowanych E. coli potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność w wektorze pIGCmT7 wklonowanej wstawki MOT_DO_C_POP_MOT1_MOT3_W_BLUESCRIPCIE. Następnie trawiono otrzymany wektor nukleazami restrykcyjnymi Clal i Hindlll. Mieszaninę po trawieniu rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym, z którego wycięto, a następnie wyeluowano fragment odpowiadający wektorowi pIGCmT7 z 678 pz fragmentem.
Etap III: Ligowano fragmenty DNA będące produktami końcowymi procedur opisanych w Etapach I i II. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep NM522. Po izolacji plazmidów z kolonii transformowanych komórek E. coli potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wklonowanej wstawki MOTY_cat_Ckrd_w_PIG w wektorze pIGCmT7.
Plazmidem zawierającym sprawdzoną wstawkę transformowano komórki E. coli szczep BL21(DE3).
Schemat otrzymywania fragmentu Cala_Mot_N włączonego do wektora ekspresyjnego pIGCmT7.
Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej powielono w reakcji PCR fragment kodujący prekursor tej proteazy (część katalityczna i liderowa) od pozycji 52 do 982. W reakcji PCR wykorzystano primery MOTPRO1 (primer wiodący) i MOT3 (primer odwrotny). Primery zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującej prekursor proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej. Primer MOTPRO1 wydłuża koniec 5' cząsteczki DNA, wprowadzając miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne BamHi i Ndel. Primer MOT3 wydłuża koniec 3' cząsteczki DNA, wprowadzając miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Hindlll i Clal, oraz kodon terminacyjny TAA. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment o długości 960 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono nukleazą restrykcyjną BamHI i Hindlll i odbiałczono. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pBluescript SK(-) trawionym tymi samymi nukleazami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep DH5a. Po izolacji DNA plazmidowego z transformowanych bakterii potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wstawki Cala_Mot_N w wektorze pBluescript SK(-).
Z wektora pBluescript SK(-) zawierającego włączoną wstawkę wytrawiono enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll fragment DNA. Mieszaninę po reakcji trawienia rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym, z którego wycięto, a następnie wyeluowano fragment o długości odpowiadającej wstawce Cala_Mot_N. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pIGCmT7 trawionym tymi samymi nukleazami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep DH5a. Po izolacji DNA plazmidowego z kolonii transformowanych
PL 196 114 B1
E. coli potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wstawki Cala_Mot_N w wektorze pIGCmT7. Poprawność sekwencji fragmentu Cala_Mot_N włączonego do wektora pIGCmT7 zweryfikowano przez sekwencjonowanie.
Transformacja komórek E. coli
Wykorzystywana była metoda transformacji kompetentnych komórek bakteryjnych E. coli opisana przez J. Sambrook i wsp. (supra).
Preparatyka ciałek inkluzyjnych i antygenów szczepionkowych
Ekspresja i izolacja ciałek inkluzyjnych
Bakterie E. coli szczep BL21(DE3) niosące odpowiedni zrekombinowny plazmid hodowano na pożywce LB zawierającej chloramfenikol (20mg/ml) w 37°C przez 3 godziny, po czym rozcieńczono świeżym podłożem LB (1:100) i po trzech godzinach wytrząsania w 37°C indukowano ekspresję przez dodanie isopropyl-thio-b-D-galactoside (IPTG, do końcowego stężenia 0,1 mg/ml). Po 3 godzinach bakterie zwirowano. Osad komórek zawieszono w buforze do lizy (0,5 M NaCl, 0,05 M Tris HCl, 0,01 M EDTA, 0,005 M 2-Mercaptoethanol, 0,35 mg/ml) i inkubowano 30 minut w 20°C. Dodano Triton X-100 do uzyskania stężenia 1%. Zawiesinę sonifikowano i zwirowano. Osad ciałek inkluzyjnych dwukrotnie zawieszano w buforze PBS zawierającym 1% Triton X-100, sonifikowano i wirowano. Wyizolowane ciałka inkluzyjne dwukrotnie przemywano buforem PBS. Końcowo ciałka inkluzyjne zawieszono w buforze PBS.
Analiza oczyszczonych ciałek inkluzyjnych
Obecność frakcji ciałek inkluzyjnych potwierdzono poddając próby rozdziałowi elektroforetycznemu w 15% żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE). Białka wizualizowano barwnikiem Coomassie blue.
Obrazy rozdziałów elektroforetycznych prób izolowanych ciałek inkluzyjnych przedstawiono na figurach: 3,4, 5, 6.
Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia białek
Stężenie białek oznaczano mierząc pochłanianie światła (absorbancję) przy długości fali l 595 nm z użyciem odczynnika Bradforda.
Startery i oligonukleotydy reakcji PCR
Startery zastosowane do powielenia użytych fragmentów DNA zostały zamówione i wykonane w firmie Perkin Elmer.
Nazwa: COREWP
5' -GGG GAA TTC ATA TGG ATA TCG ATC CTT ATA AAG AAT TTG GANazwa: COREWK
5' -TCT CGA GCT CAA GCT TTT AAA CAA CAG TAG TCT CCG GNazwa: M0T1 .
5' -GGG GAT CCA TAT GGC TGT ACC CGA CAA AAT TGA CNazwa: MOT2
PL 196 114 B1
5' -AAA AGC TTA ATC GAT ATC ACT ACC GCT ACC CGG AAA TCG TGC CAC
CAT CNazwa: M0T3
5' -AAA AGC TTA ATC GAT GCC GGA AAT CGT GCCNazwa: SEQBLT3
5' -AAA TTA ACC CTC ACT AAA GGNazwa: MOTPRO1
5' -GGG GAT CCA TAT GTC GAA TGA TGA TTT GTG GNazwa: CXBAD
5' -GTA CGA GAT CTT CTG GAT ACNazwa: CXHOBAM
5' -TGC TGG ATC CTC GAG ATT AAC ACC CACNazwa: CBAMAVR
5' -GTG TTA ATC TCG AGG ATC CAG CAC CTA GGG ACNazwa: SCORE1
5' -GAT CAA GGT GGT GGA GGT TCT GGT GGA GGA GGC CAA GGNazwa: SCORE2
5' -AGG CCA AGG AGG AGG TGG TTC AGG CGG TGG TGG ATNazwa: SCORE4
5' -CTA GAT CCA CCA CCG CCT GAA CCA CCT CCT CCT TGG CCT CCTNazwa: MOTEPW
5' -AAA GGC CAA GGA GGC GCT GTA CCC GAC AAA ATT GACNazwa: MOTEKWIN
5' -AAA GGC CTC CTT GGC CAT CGA TGC CGG AAA TCG TGC CNazwa: SCORE3T
5' -TGG CCT CCT CCA CCA GAA CCT CCA CCA CCT TNazwa; MOTSEK1
5' -CCC GAC AAA ATT GAC TGG CGNazwa: MOTSEK2
PL 196 114 B1
5' -GGC AAC TCC TAA CTG CTT ATT GNazwa: M0TSEK3
5' -GGA TTG TGA AAA ATA GTT GGG GNazwa: MOTSEK4
5' -CCC CAA CTA TTT TTC ACA ATC CNazwa: T7SEK
5' -CCA CAA CGG TTT CCC TCT AGA AANazwa: PIGMSEK
5’ -CGG TGG CAG CAG CCA ACT CAAparatura i inne materiały:
Enzymy użyte do klonowań: Taq DNA polimeraza i bufor (Roche, zestaw Expand Long Template PCR System, Cat. No. 1 681 834; Ligaza DNA faga T4 i bufor (USB); T4 polinukleotydowa kinaza i bufor (USB)
Wykorzystano komercyjnie dostępne nukleazy restrykcyjne.
PCR: Maszyna do PCR PTC-100™ Programmable Thermal Controller MJ Research, Inc.
Sekwencjonowanie: maszyna do sekwencjonowania Visible Genetics, Inc.; zestaw do sekwencjonowania firmy Amersham Cat. No. US79840 (zgodnie z zaleceniami producenta); zestaw do oczyszczania DNA plazmidowego firmy Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne.
Pomiar stężenia białka: spektrofotometr Philips PU 8730.
Dokumentacja: zestaw do dokumentacji żeli Sony Digital Graphics Printer UP 0890 oraz oprogramowanie Grab it.
Szczepy bakteryjne: szczepy E. coli użyte w pracy:
NM522 supE thi D (lac-proAB) hsd5 F' [proAB+ lac1q lacZD M15]
DH5a supE44 DlacU169 (j 80 lacZDM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
BL21(DE3) hsdS gal (lclts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1)
BZ37 dam- dcm-
Sekwencje wstawek włączonych do wektorów zostały zaprezentowane na figurach 7-15.
W sekwencjach podkreślono miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne po trawieniu którymi włączono daną wstawkę do wektora. Kodon startu i terminacji oznaczono pogrubioną czcionką.
P r z y k ł a d 2. Badanie przydatności proteazy cysteinowej F. hepatica eksprymowanej w postaci ciałek inkluzyjnych do uodporniania żywicieli przeciwko inwazjom tego pasożyta
Badania przeprowadzono na szczurach, gdyż odpowiedź immunologiczna i obronna tych zwierząt na inwazje motylicy ma podobny przebieg jak odpowiedź bydła, najczęstszego żywiciela F. hepatica.
Szczury rasy Sprague Dawley (szczep wsobny) zostały zakupione w Zakładzie Zwierząt Laboratoryjnych Instytutu Centrum Zdrowia Matki-Polki, ul. Rzgowska 281/289, Łódź.
Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z zezwoleniem III Lokalnej Komisji Etycznej w Warszawie. Szczury były zgrupowane po 4 osobniki tej samej płci w standardowych plastikowych klatkach umieszczonych w klimatyzowanej szafie zaopatrywanej w filtrowane (HEPA) powietrze, w warunkach naturalnego fotoperiodu. Szczury były pojone wodą z 750 ml butelek (Tecniplast) i karmione ad libitum karmą LSM.
Przed rozpoczęciem doświadczeń szczury aklimatyzowały się przez 1 do 2 tygodni. Wtedy przeprowadzano też badania parazytologiczne kału, by określić obecność innych inwazji, które mogłyby wpływać na przebieg doświadczeń. W badanym kale nie stwierdzono postaci rozwojowych pasożytów.
PL 196 114 B1
Żaden ze szczurów nie padł w czasie doświadczenia, a szczury z grup kontroli fizjologicznej wykazywały stabilność wskaźników hematologicznych przez cały okres trwania doświadczeń, co świadczy o tym, że nie przechodziły poważniejszych infekcji.
Przyżyciowe pobieranie niewielkich objętości (każdorazowo 150 mikrolitrów) krwi w trakcie trwania doświadczenia odbywało się poprzez nacięcie koniuszka ogona
W dniu sekcji od szczurów pobierano 5 ml krwi z serca w głębokiej narkozie. Po pobraniu krwi zwiększano dawkę anastetyku i doprowadzając do śmierci. Po wyjęciu wątrób, z przewodów żółciowych i miąższu wątroby izolowano przywry.
Hodowla metacerkarii Fasciola hepatica
W Instytucie Parazytologii im. W. Stefańskiego PAN utrzymywany jest pełny cykl rozwojowy Fasciola hepatica. W związku z tym dysponujemy hodowlą żywicieli pośrednich pasożyta - ślimaków Galba truncatula oraz stanowiących ich pożywienie glonów z rodzaju Oscillatoria.
Z żywych przywr pochodzących z wątrób bydlęcych izolowano jaja i przechowywano je w wodzie oligoceńskiej w 4°C. W dniu planowanego zarażania ślimaków jaja przywry w wodzie umieszczano pod silnym źródłem światła na kilkanaście minut, co powodowało kłucie się miracidiów. Ślimaki Galba truncatula zarażano umieszczając je w niewielkich dołkach plastikowych płytek w towarzystwie 3 miracidiów na tak długo, aż miracydia wniknęły do organizmu żywiciela. Po około 90 dniach hodowli z powierzchni wody i dolnej strony wieczka szalek hodowlanych zbierano metacerkarie.
W dniu zarażania szczurów metacerkarie z różnych ślimaków były zbierane do jednej probówki, z której następnie odliczano liczbę metacerkarii potrzebną do zarażenia pojedynczych osobników i przenoszono do kolejnych probówek.
Otrzymywanie i przechowywanie surowic
Pobraną krew pozostawiano na dwie godziny w 37°C. Po tym czasie krew wstawiano do 4°C. Następnego dnia krew odwirowywano w podręcznej wirówce i zbierano czystą surowicę do probówek Eppendorfa. Surowice przechowywano w -70°C do czasu wykonywania testów serologicznych.
Doustne szczepienie szczurów rasy Sprague-Dawley obojga płci proteazą cysteinową przywry w ciałkach inkluzyjnych
Eksperyment I
Poszczególne grupy zwierząt immunizowano białkami, które ekspresjonowano w bakteriach E.coliw postaci ciałek inkluzyjnych
Grupa 1 - immunizowana oralnie białkiem części katalitycznej proteazy cysteinowej (PC) Fasciola hepatica kodowanym przez sekwencję KAT_Nasza_MOT1_MOT2
Grupa 2 - immunizowana oralnie białkiem prekursora (część liderowa i część katalityczna) proteazy cysteinowej (PC) Fasciola hepatica kodowanym przez sekwencję Cala_Mot_N
Grupa 3 - kontrola zarażenia; traktowana oralnie białkiem z lizatu nie transformowanych bakterii
Grupa 4 - kontrola fizjologiczna
W pierwszym dniu doświadczenia szczurom podano doustnie następujące preparaty:
Grupa 1-300 mikrogramów białka części katalitycznej proteazy cysteinowej (PC) Fasciola hepatica (kodowanego przez sekwencję KAT_Nasza_MOT1_MOT2) w 0.9% NaCl;
Grupa 2 -300 mikrogramów białka prekursora (część liderowa i część katalityczna) PC F. hepatica (kodowanego przez sekwencję Cala_Mot_N) w 0.9% NaCl;
Grupa 3 -300 mikrogramów białek lizatu bakterii (E. coli) nie transformowanych w 0.9% NaCl
Grupa 4 -250 mikrolitrów 0.9% NaCl
Objętość zawiesiny podawanej jednemu zwierzęciu wynosiła 250 ml. W 28 dni później szczurom poszczególnych grup podano powtórnie doustnie identyczne preparaty ale zawierające 100 mikrogramów białka. W 28 dni po drugiej immunizacji poszczególne szczury zarażono doustnie 30 metacerkariami Fasciola hepatica.
W 35 DPZ od szczurów pobrano dużą objętość krwi na surowicę, szczury uśpiono, przeprowadzono sekcję i przeanalizowano wątroby pod kątem obecności przywr.
Eksperyment Ila i IIb wykonano w celu sprawdzenia czy możliwe jest podwyższenie protekcyjności szczepionki poprzez modyfikację antygenu
W doświadczeniu Ila poszczególne grupy zwierząt immunizowano białkami, które ekspresjonowano w bakteriach E. coliw postaci ciałek inkluzyjnych.
Grupa 1 - immunizowana oralnie konstruktem: rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej, kodowanym przez sekwencję Moty_Cat_Ckrd
Grupa 2 - kontrola fizjologiczna
PL 196 114 B1
W doświadczeniu IIb poszczególne grupy zwierząt immunizowano białkami, które ekspresjonowano w bakteriach E. coli w postaci ciałek inkluzyjnych.
Grupa 1 - immunizowana oralnie konstruktem: rdzeniowa część HBV::katalityczna część proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej, połączone mostkiem glicynowym, kodowanym przez sekwencję CWekGlyKatwPIG
Grupa 2 - kontrola fizjologiczna
Przebieg eksperymentów był identyczny jak opisano powyżej.
Obliczanie poziomu protekcji
Poziom protekcji u grup szczepionych obliczano porównując średnią liczbę przywr obecnych w wątrobie osobnika szczepionego ze średnią liczbą przywr u osobnika z grupy kontrolnej, któremu podano doustnie lizat z nie zrekombinowanych E. coli.
Poziom protekcji obliczano według wzoru:
(1-d/k)* 100%, gdzie:
d - średnia liczba przywr występująca u osobnika z grupy zaszczepionej prekursorem (część liderowa i część katalityczna, sekwencja Cala_Mot_N) proteazy cysteinowej lub tylko częścią katalityczną tej proteazy (sekwencj a KAT_Nasza_MOT1_MOT2).
k - średnia liczba przywr występująca u osobnika z grupy kontrolnej, której podano nie zrekombinowane bakterie.
Metodyka badań hematologicznych mikrolitrów pobranej krwi mieszano z antykoagulantem i analizowano automatycznie w aparacie AutoCounter AC920 (Swelab). Uzyskiwano dane o hematokrycie (HCT), liczbie erytrocytów (RBC), średniej objętości erytrocytu (MCV), zawartości hemoglobiny (HGB), średniej zawartości hemoglobiny w erytrocycie (MCH), liczbie płytek krwi (PLT) oraz liczbie leukocytów (WBC).
Subpopulacje leukocytów określano poprzez zliczanie komórek na preparatach mikroskopowych rozmazów krwi barwionych metodą Pappenheima.
Test immunoenzymatyczny (ELISA).
Surowice szczurów zebrane w trakcie doświadczenia były poddawane testowi immunoenzymatycznemu pojedynczo lub jako równoobjętościowe mieszaniny surowic pobranych od wszystkich osobników z danej grupy.
Mikropłytki do ELISA o płaskim dnie były opłaszczane przez noc w 4°C białkami ekskrecyjnosekrecyjnymi (ES) Fasciola hepatica o stężeniu 15 mikrogramów/ml w buforze węglanowym ( pH 9.6). Na dołek stosowano 100 mikrolitrów mieszaniny opłaszczającej. Następnie dołki były trzykrotnie przepłukiwane buforem TBS (10 mM Tris, 0.15 M NaCl), z 0.05% Tween 40 w pH 7.4. Niespecyficzne wiązanie blokowano wprowadzając do dołków na dwie godziny w temperaturze pokojowej po 100 mikrolitrów 4% roztworu odtłuszczonego mleka w TBS. Następnie przeprowadzano dwukrotne płukanie: TBS i TBS + Tween i wprowadzano do dołków surowice badane rozcieńczone 100 razy w 2% roztworze mleka w proszku w TBS. Każdą próbę powtarzano dwa lub trzy razy. Inkubacja trwała 30 min. w 37°C, następnie przeprowadzano 4 płukania w TBS + Tween. Następnie dodawano surowicę rozpoznającą określony izotyp przeciwciał szczura. W przypadku IgG, IgM i IgE były to surowice znakowane peroksydazą chrzanową (HRP), pochodzące z owcy (IgG, IgM) lub z myszy (IgE). W przypadku anty-IgA dysponowaliśmy tylko surowicą nie znakowaną pochodzącą z myszy, trzeba więc było dodawać po odpłukaniu kolejną - owczą przeciw mysim IgG, znakowaną HRP. Wszystkie surowice pochodziły z firmy Serotec i były rozcieńczane w różnych testach, stosownie do wskazówek producenta.
Reakcję enzymatyczną przeprowadzano po trzykrotnym przepłukaniu płytek TBS + Tween, stosując 3,3',5,5' - tetrametylobenzydynę (TMB) jako substrat. Reakcję enzymatyczną zatrzymywano po 30 minutach dodając 50 mikrolitrów 2M kwasu siarkowego i badano gęstość optyczną przy pomocy automatycznego czytnika ELISA (Dynatech Laboratories) przy fali o długości 405 nm.
PL 196 114 B1
Wyniki i omówienie Eksperyment I
T ab e l a 1 Poziom protekcji
| Grupa | L. szczurów | % protekcji | Istotność* statystyczna | Indeks uszkodzeń wątroby |
| 1 | 8 | 79 | P<0.001 | 1,1 |
| 2 | 8 | 73 | P<0.05 | 1,3 |
| 3 | 8 | 0 | 3,56 |
Wyniki badań parazytologicznych wskazują, że dwukrotne podanie drogą pokarmową białka zrekombinowanej proteazy cysteinowej Fasciola hepatica wywołuje bardzo wysoki poziom odporności na zarażenie tą przywrą. Z analizy uszkodzeń wątroby wynika, że w przypadku szczurów szczepionych PC jedynie pojedyncze przywry podjęły wędrówkę przez miąższ tego narządu.
Dotychczas w literaturze specjalistycznej nie było doniesień o uodpornieniu na inwazję F. hepatica poprzez doustne podawanie antygenów przywry w postaci ciałek inkluzyjnych.
Parametry hematologiczne.
Nie stwierdzono istotnych różnic w liczbie płytek krwi. Liczba erytrocytów nieznacznie spadła w dwa tygodnie po zarażeniu, choć hematokryt się nie zmienia. Całkowita liczba leukocytów ulegała nieznacznym wahaniom, zmieniała się natomiast liczba komórek należących do poszczególnych subpopulacji.
Największe zmiany dotyczyły liczby eozynofilów w grupie 3. Niewielki wzrost liczby tych komórek występuje już w 14 DPZ, natomiast w 28 DPZ rozwija się poważna eozynofilia, która na zbliżonym poziomie utrzymuje się w 42 DPZ. Wzrost liczby eozynofilów w grupach 1 i 2 był nieznaczny co może potwierdzać, że inwazja u szczepionych szczurów była bardzo słaba.
Wyniki badań serologicznych.
Wyniki uzyskane metodą ELISA.
Wyniki badania poziomu przeciwciał klas: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgE oraz IgA reagujących z PC lub ES motylicy przedstawiają figury 15-20.
Analiza wyników testów ELISA wskazuje, że szczury szczepione doustnie zareagowały na inwazję odpowiedzią przeciwciał zależnych od limfocytów Th2. Uważa się, że odpowiedź immunologiczna wyrażana przez Th2 zależne przeciwciała ma u szczurów charakter obronny w przypadku inwazji helmintów.
Eksperyment IIa
Tabel a 2 Poziom protekcji
| Grupa | L. szczurów | % protekcji | Istotność* statystyczna | Indeks uszkodzeń wątroby |
| 1 | 8 | 61.6 | P<0.05 | 1,4 |
| 2 | 8 | 0 | 4,1 |
Eksperyment Ilb
T ab e l a 3 Poziom protekcji
| Grupa | L. szczurów | % protekcji | Istotność* statystyczna | Indeks uszkodzeń wątroby |
| 1 | 8 | 65.5 | P<0.05 | 1,3 |
| 2 | 8 | 0 | 4,4 |
*średnia liczba przywr w grupie szczepionej vs średnia liczba przywr w grupie nie szczepionej (kontrola „challenge)
PL 196 114 B1
Podsumowując uzyskane w niniejszych doświadczeniach wyniki należy mocno podkreślić fakt, że wykazały one w sposób nie budzący wątpliwości, że szczepionka doustna oparta na białku proteazy cysteinowej Fasciola hepatica w postaci ciałek inkluzyjnych może być skuteczna w zapobieganiu inwazjom tej przywry.
Olbrzymią zaletą i novum takiej szczepionki byłaby możliwość jej podawania w formie zawiesiny wraz z wodą pitną.
Claims (34)
- Zastrzeżenia patentowe1. Polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, korzystnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV.
- 2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci ciałek inkluzyjnych.
- 3. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,- sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV oraz resztami glicynowymi, tworzącymi strukturę mostka glicynowego,- sekwencję domeny katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,- sekwencję białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą domenę katalityczną i liderową.
- 4. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera jedną z sekwencji kodowanych przez sekwencje przedstawione na figurach od 7 do 15.
- 5. Sekwencja kodująca polipeptyd, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, ewentualnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV.
- 6. Sekwencja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV oraz reszty glicynowe,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą część katalityczną i liderową.
- 7. Sekwencja według zastrz. 5, znamienna tym, że została wybrana spośród sekwencji przedstawionych na fig. 7- fig. 15.
- 8. Konstrukt zawierający sekwencję kodującą polipeptyd, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, ewentualnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV.
- 9. Konstrukt według zastrz. 8, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,PL 196 114 B1- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV oraz reszty glicynowe,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą część katalityczną i liderową.
- 10. Konstrukt według zastrz. 8, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera sekwencję wybraną spośród sekwencji przedstawionych na fig. 7 - fig. 15.
- 11. Konstrukt według zastrz. 8, znamienny tym, że jest plazmidem powstałym poprzez włączenie sekwencji kodującej polipeptyd do plazmidu pIGDM1, korzystnie plazmidu pIGCmT7.
- 12. Komórka bakteryjna transformowana konstruktem ekspresyjnym zawierającym sekwencję kodującą polipeptyd, znamienna tym, że konstrukt jako sekwencję kodującą polipeptyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, ewentualnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV.
- 13. Komórka bakteryjna według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV oraz reszty glicynowe,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą część katalityczną i liderową.
- 14. Komórka bakteryjna według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający sekwencję wybraną spośród sekwencji przedstawionych na fig. 7-fig. 15.
- 15. Komórka bakteryjna według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera plazmid powstały poprzez włączenie sekwencji kodującej polipeptyd do plazmidu pIGDM1, korzystnie plazmidu pIGCmT7.
- 16. Komórka bakteryjna według zastrz. 12, znamienna tym, że jest szczepem E.coli.
- 17. Ciałka inkluzyjne zawierające polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, ewentualnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV.
- 18. Ciałka inkluzyjne według zastrz. 17, znamienne tym, że są produkowane w E.coli.
- 19. Ciałka inkluzyjne według zastrz. 17, znamienne tym, że wspomniany polipeptyd zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję części katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,- sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV oraz resztami glicynowymi, tworzącymi strukturę mostka glicynowego,- sekwencję części katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,- sekwencję białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą część katalityczną i liderową.
- 20. Ciałka inkluzyjne według zastrz. 17, znamienne tym, że wspomniany polipeptyd zawiera jedną z sekwencji kodowanych przez sekwencje przedstawione na figurach od 7 do 15.
- 21. Sposób otrzymywania szczepionki doustnej przeciwko motylicy wątrobowej, znamienny tym, że obejmuje transformację komórek E. coli wektorem ekspresyjnym, ekspresję polipeptydu kodowanego przez ten wektor, izolowanie ciałek inkluzyjnych zawierających produkowany polipeptyd służących do przygotowania szczepionki, przy czym wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodują20PL 196 114 B1 cą sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, ewentualnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV.
- 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że wspomniana sekwencja nukleotydowa zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją kodującą białko rdzeniowe HBV oraz reszty glicynowe,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową części katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,- sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą część katalityczną i liderową.
- 23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że wspomniana sekwencja nukleotydowa została wybrana spośród sekwencji przedstawionych na fig. 7 - fig. 15.
- 24. Zastosowanie polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, ewentualnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV, do otrzymywania szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej.
- 25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że polipeptyd jest produkowany w genetycznie zmodyfikowanym mikroorganizmie.
- 26. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że polipeptyd jest w postaci ciałek inkluzyjnych.
- 27. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że polipeptyd zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję części katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,- sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV oraz resztami glicynowymi, tworzącymi strukturę mostka glicynowego,- sekwencję części katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,- sekwencję białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą część katalityczną i liderową.
- 28. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że polipeptyd zawiera jedną z sekwencji kodowanych przez sekwencje przedstawione na figurach od 7 do 15.
- 29. Szczepionka doustna przeciwko motylicy wątrobowej zawierająca antygen i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub adiuwant, znamienna tym, że jako antygen zawiera polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej, ewentualnie połączoną z sekwencją aminokwasową białka rdzeniowego HBV.
- 30. Szczepionka według zastrz. 29, znamienna tym, że polipeptyd jest produkowany w genetycznie zmodyfikowanym mikroorganizmie.
- 31. Szczepionka według zastrz. 29, znamienna tym, że polipeptyd jest w postaci ciałek inkluzyjnych.
- 32. Szczepionka według zastrz. 29, znamienna tym, że polipeptyd zawiera jedną z następujących sekwencji:- sekwencję części katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,- sekwencję domeny liderowej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV,- sekwencję domeny katalitycznej proteinazy cysteinowej z motylicy wątrobowej połączoną z sekwencją białka rdzeniowego HBV oraz resztami glicynowymi, tworzącymi strukturę mostka glicynowego,- sekwencję części katalitycznej proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej,PL 196 114 B1- sekwencję białka prekursora proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej obejmującą część katalityczną i liderową.
- 33. Szczepionka według zastrz. 29, znamienna tym, że polipeptyd zawiera jedną z sekwencji kodowanych przez sekwencje przedstawione na figurach od 7 do 15.
- 34. Zastosowanie ciałek inkluzyjnych według zastrz. 17-20 do wytwarzania szczepionki doustnej przeciwko motylicy wątrobowej.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL358081A PL196114B1 (pl) | 2002-12-31 | 2002-12-31 | Ciałka inkluzyjne jako antygeny do doustnej immunizacji zwierząt |
| EP03789657A EP1578791B1 (en) | 2002-12-31 | 2003-12-31 | Inclusion bodies for the oral vaccination of animals |
| NZ541291A NZ541291A (en) | 2002-12-31 | 2003-12-31 | Inclusion bodies for the oral vaccination of animals |
| AT03789657T ATE388962T1 (de) | 2002-12-31 | 2003-12-31 | Einschlusskörper für die mündliche impfung von tieren |
| DE60319741T DE60319741T2 (de) | 2002-12-31 | 2003-12-31 | Einschlusskörper für die mündliche impfung von tieren |
| AU2003294191A AU2003294191B2 (en) | 2002-12-31 | 2003-12-31 | Inclusion bodies for the oral vaccination of animals |
| PCT/PL2003/000151 WO2004058816A2 (en) | 2002-12-31 | 2003-12-31 | Inclusion bodies for the oral vaccination of animals |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL358081A PL196114B1 (pl) | 2002-12-31 | 2002-12-31 | Ciałka inkluzyjne jako antygeny do doustnej immunizacji zwierząt |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL358081A1 PL358081A1 (pl) | 2004-07-12 |
| PL196114B1 true PL196114B1 (pl) | 2007-12-31 |
Family
ID=32678127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL358081A PL196114B1 (pl) | 2002-12-31 | 2002-12-31 | Ciałka inkluzyjne jako antygeny do doustnej immunizacji zwierząt |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1578791B1 (pl) |
| AT (1) | ATE388962T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003294191B2 (pl) |
| DE (1) | DE60319741T2 (pl) |
| NZ (1) | NZ541291A (pl) |
| PL (1) | PL196114B1 (pl) |
| WO (1) | WO2004058816A2 (pl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2616231T3 (es) | 2008-08-21 | 2017-06-12 | Immunogenics Llc | Formulación para administración oral de proteínas |
| EP2251025A1 (en) | 2009-05-12 | 2010-11-17 | Universitat Autònoma De Barcelona | Use of inclusion bodies as therapeutic agents |
| NL2023863B1 (en) * | 2019-09-20 | 2021-05-25 | Univ Griffith | Protein particles and uses thereof |
| CN116514993B (zh) * | 2023-03-29 | 2023-09-29 | 中山大学附属第三医院 | 一种肝吸虫口服芽孢疫苗及其制备方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5996294A (en) * | 1993-02-05 | 1994-08-29 | Daratech Pty Ltd | Polypeptides obtainable from species of fasciola, and vaccines, methods of treatment and DNA sequences of the same |
| PL201419B1 (pl) * | 2002-12-04 | 2009-04-30 | Inst Biotechnologii I Antybiot | Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina |
-
2002
- 2002-12-31 PL PL358081A patent/PL196114B1/pl unknown
-
2003
- 2003-12-31 AT AT03789657T patent/ATE388962T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-12-31 WO PCT/PL2003/000151 patent/WO2004058816A2/en not_active Ceased
- 2003-12-31 AU AU2003294191A patent/AU2003294191B2/en not_active Ceased
- 2003-12-31 DE DE60319741T patent/DE60319741T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-31 EP EP03789657A patent/EP1578791B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-31 NZ NZ541291A patent/NZ541291A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60319741T2 (de) | 2009-04-02 |
| NZ541291A (en) | 2008-06-30 |
| WO2004058816A3 (en) | 2004-10-14 |
| AU2003294191A1 (en) | 2004-07-22 |
| EP1578791B1 (en) | 2008-03-12 |
| ATE388962T1 (de) | 2008-03-15 |
| AU2003294191A8 (en) | 2004-07-22 |
| WO2004058816A2 (en) | 2004-07-15 |
| DE60319741D1 (de) | 2008-04-24 |
| AU2003294191B2 (en) | 2010-11-25 |
| EP1578791A2 (en) | 2005-09-28 |
| PL358081A1 (pl) | 2004-07-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lu et al. | Passive protection of shrimp against white spot syndrome virus (WSSV) using specific antibody from egg yolk of chickens immunized with inactivated virus or a WSSV-DNA vaccine | |
| Dertzbaugh | Genetically engineered vaccines: an overview | |
| Niikura et al. | Chimeric recombinant hepatitis E virus-like particles as an oral vaccine vehicle presenting foreign epitopes | |
| HU230364B1 (hu) | Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására | |
| JP2010059164A (ja) | 新しい免疫防御性インフルエンザ抗原及びそのワクチン接種への使用 | |
| CA2035039C (en) | Recombinant poxvirus and streptococcal m protein vaccine | |
| JP2013513548A (ja) | コクシジウム症ワクチンの使用のための方法および組成物 | |
| MXPA03009632A (es) | Proteinas de la envoltura de vhc glucosiladas en la estructura central. | |
| US7993652B2 (en) | Immunoprotective influenza antigen and its use in vaccination | |
| Fahey et al. | A recombinant subunit vaccine that protects progeny chickens from infectious bursal disease | |
| PL196114B1 (pl) | Ciałka inkluzyjne jako antygeny do doustnej immunizacji zwierząt | |
| JP6877788B2 (ja) | ブタのＦｃ断片と融合した抗原およびこれを含むワクチン組成物 | |
| Ogrina et al. | Bacterial expression systems based on Tymovirus-like particles for the presentation of vaccine antigens | |
| US20150190486A1 (en) | Vaccination by means of recombinant yeast by producing a protective humoral immune response against defined antigens | |
| EP1334197B1 (en) | Yeast derived vaccine against ipnv | |
| CN114196639B (zh) | 表达3型鸭甲型肝炎病毒p1和3c基因的重组鸭瘟病毒及其构建方法和用途 | |
| EP0471457A2 (en) | Herpesvirus-based viral vector which expresses a foot & mouth disease virus epitope | |
| PL199190B1 (pl) | Ciałka inkluzyjne jako antygeny do pokarmowej immunizacji zwierząt | |
| CN105385698A (zh) | 重组聚核苷酸与带有相同重组聚核苷酸的转基因金针菇 | |
| WO2004050883A2 (en) | Chimaeric protein containing cysteine protease of liver fluke fused to hepatitis b core protein or ubiquitin, plants expressing said protein, and uses thereof as vaccine | |
| TW201018480A (en) | Duck hepatitis vaccine and the manufacture method thereof | |
| WO2017165420A1 (en) | Engineered human hookworms as a novel biodelivery system for vaccines and biologicals | |
| JP2006503860A (ja) | 肝炎に対するバクテリオファージを介する免疫 | |
| PL199189B1 (pl) | Szczepionka doustna i nowe zastosowanie drożdży zdolnych do ekspresji antygenu | |
| Bachrach | Molecular approaches to vaccines |