JP2006503860A - 肝炎に対するバクテリオファージを介する免疫 - Google Patents
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Abstract
Description
好ましくは、単位用量当たりの薬剤は1010個あるいは1011個以上のような1010個以上のバクテリオファージ粒子を含む。
図1は本発明に従って設計されたラムダファージを作成するために用いたpRc/CMV−HBs(S)ベクターの概要図を示す;
図2はマウスに投与した様々な肝炎コンストラクトのELISA反応の時間経過の図表を示す;
図3は図2に示したデータのグループ平均を描いている図表を示す;
図4は国際標準品との比較によってマウス血清中の抗HBs濃度測定の図表を示す;及び
図5はELISAで測定した時の、λ−HBsAg(A〜D)及び組換えHBsAg(E+F)で予防接種したウサギにおけるHBsAg(白丸、左側目盛り)及び全バクテリオファージ(黒四角、右側目盛り)に対する抗体反応を示す。ウサギA〜Dは0、9、15及び27週にλ−HBsAgで予防接種した(矢印で示した)。ウサギEとFは0及び27週に組替えHBsAgで予防接種した。HBsAgプレートに対しモノクローナル抗体(クローンNF5、Aldevron)を1:50,000の希釈で用い、一方マウスのポリクローナル抗血清(1:500)をファージ−被覆プレートに対して用いた。各血清サンプルからのシグナルは種々のプレート間で相対シグナルを比較できるようにこの標準のシグナルに対して標準化した。
HepBsバクテリオファージベクターの作成−λHepBs
ラムダファージへのHepB発現カセットのクローニング。
プラスミドpRc/CMV−HBs(S)(pCMV−S)(Aldeveron)(図1を参照)をλ−gt11(Stratagene)のEcoRIサイトにクローニングした。pCMV−SベクターにはEcoRIサイトはないが、矛盾の無い(compatible)粘着末端を与えるMfeIサイトがある。MfeIサイトはプラスミド上160番目の塩基に存在し、一方サイトメガロウイルス真核生物プロモーターは206番目の塩基にあるので、この酵素による1ヶ所の切断は発現カセットを妨げない。
消化したプラスミドDNAは次にフェノール/クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。消化物は蒸留水で200μlの最終容積にした。等容積のフェノール:クロロフォルム:イソアミルアルコール(35:34:1)(Fisher Biosciences UN2821)を加え、混合しフェーズロックチューブ(Eppendorf 0032 007.953)中マイクロフュージを用い13000rpmで回転させた。それから上部の水層を除き、同チューブ中当容積のクロロフォルムで抽出した。
この精製DNAとStratagene由来のEcoRIで消化した子牛腸管アルカリホスファターゼ処理λ−gt11(カタログ番号234211)を用いてライゲーションを行った。2μlのラムダDNA(0.5μg/μl)を既に90ng/μlに希釈された1.5μlの消化プラスミドに加えた。gt11はおよそ43kbで挿入断片はおよそ5.6kbなので、1μlのgt11及び135ngの挿入断片の使用は1:1のモル比となる。3UのDNAリガーゼ(Promega M1801)と適切なバッファーを加え容積を蒸留水で10μlとした。対照ライゲーションも用い、それは挿入DNAの替わりに1.5μlの水を加えた他には上述したようにセットアップした。ライゲーションは4℃で終夜インキュベートして行った。
ライゲーションしたDNAをPromega lambda packagene system(cat. K3154)を用いてインビトロでパッケージした。上述したようにライゲーション反応物と対照反応物の5μlを25μlのpackagene抽出物に加えた。packagene kitより供給されたポジティブコントロールDNAを用いて3番目の反応をセットアップした。いずれの反応も室温で3時間インキュベートするために放置した。インキュベーション後反応を停止させるために225μlのファージバッファー(packageneの使用説明書を参照)を加え12.5μlのクロロフォルムを加えた。チューブを良く混ぜ白色沈殿物を沈殿させた。澄んだ上澄み液はパッケージされたファージを含む。
それぞれ10匹のマウスを含む8群について検討した。
マウス群は以下の通り:
(1)ネガティブコントロール。非発現バクテリオファージ(λcI857)を筋肉内投与により免疫した。
(2)ポジティブコントロール。組換えB型肝炎表面抗原(HBsAg)で免疫した。
(3)‘裸‘のDNAによる予防接種のポジティブコントロール。サイトメガロウイルスプロモーター(pRC/CMV−HBs[S])のコントロール下HepB表面抗原を発現するプラスミドで免疫した。
(4)サイトメガロウイルスプロモーター(λHepBs)のコントロール下HepB表面抗原を発現するバクテリオファージλ。経口/鼻腔内投与、バクテリオファージは粘膜アジュバントキトサンとの複合体として与えた。
(5)λHepBs、リポソームと組み合わせて筋肉注射した。
(6)λHepBs、オイルを主体としたアジュバント(モンタニド206)で筋肉注射した。
(7)λHepBs、アジュバント無しSMバッファーのみで筋肉注射した。
(8)λHepBs、真空乾燥したバクテリオファージ粒子を皮膚に投与するためBio-Rad Helios圧縮窒素ガス‘遺伝子銃‘を用いて皮内/皮下免疫を行った。
ワクチンの製造と免疫のプロトコール:2週毎にマウスから採血した。0及び3週にマウスに予防接種した。予防接種に先立ち、ハロタンを吸入させマウスを麻酔した(グループ8を除いて)。
グループ1〜3及びグループ5〜7(筋肉内投与免疫)。前けい骨筋への到達を容易にするため後肢を剃った。皮膚にサンプルを注射するため27G×3/4インチの針を用いた。針の先は前けい骨粗面の約3mm外側。針先は3mm挿入し、サンプル(プラスミドDNA、ファージあるいは組替えHepB表面抗原[HBsAg])を約10秒かけてゆっくりと注射した。針は約5〜10秒そのままにし、その後ゆっくりと引き抜いた。
グループ3:プラスミドDNAは0.5mg/mlの濃度でエンドトキシンを含まないホスフェートバッファー食塩水(PBS)に含まれ、1匹当たり50μl(25μgDNA/マウス)を用いた。
1群10匹のマウス、
マウス1〜2は0、2、4及び6週に採血、
マウス3〜4は0、2、4、6及び7週に採血、
マウス5〜6は0、2、4、6及び8週に採血、
マウス7〜8は0、2、4、6、8及び9週に採血、
マウス8〜9は0、2、4、6、8及び10週に採血。
各時点ですべてのマウスから採血していないので、このことから図2におけるマウス採血のギャップが説明される。
ELISAにより測定したHBsAgに対する抗体反応。
各群で個々のマウスについて抗体反応の時間経過を測定した。種々のプレート間の標準化を行うために個々のELISAプレートには抗HBsAgモノクローナル抗体の1:50,000の希釈液を含む(結果は各図表の関連部分に‘コントロール’値として示す)。図3は図2で示したデータの群平均を示す。
リポソーム中λHepBsで免疫したマウス(グループ5、マウス4)の血清の1:10希釈液は17.5mIU/mlに等価の反応を示し、一方コントロールのpRC/CMV−HBs[S]で免疫したマウスは2.5mIU/mlに等価の反応を示した。保護のための認められた国際濃度は血清の10mIU/mlで、λHepBsによる免疫は保護に対して認められた国際濃度よりも大きな抗体価(1:10希釈で)をもたらしたことを示している。さらなる例は;グループ6(λHepBsプラスモンタニド)マウス5、16mIU/ml@1:10希釈、及びグループ7(λHepBsのみ)マウス8、14mIU/ml@1:10希釈。抗体濃度は無希釈マウス血清を用いて試験した時よりも高いと予想される。試験サンプルにおいて1次マウス血清に対して抗ヒト2次抗体が用いられているので(むしろ特異的抗マウスHRP複合体よりも)、これらの結果はおそらく実際の抗体価よりも表示不足していることが認められる。
ウサギの免疫
食塩水バッファー中2×1011個ファージ/ml(4×1010個ファージ、2μgDNA/ウサギ)の濃度で筋肉内投与した200μlのλ−HBsAgでウサギに予防摂取した。ファージワクチンを0、9、15及び27週に投与した。組換えB型肝炎表面抗原(HBsAg−Aldevron)を投与したウサギには0及び27週に25μg/ml(5μgタンパク質/ウサギ)の濃度で200μlの食塩水バッファー中タンパク質を筋肉内投与した。ウサギから定期的に採血し、抗体反応をELISAにより定量した。
組換えHBsAgまたはバクテリオファージλコートタンパク質に対する抗体反応を間接ELISAにより測定した。ELISAプレートを100ngの精製HBsAg(Aldevron)あるいは109個のバクテリオファージ(50ng)/ウェルのいずれかで0.05Mの炭酸ナトリウムバッファー中pH9.2で終夜被覆した。その後コーティングバッファーを除き、200μl/ウェルのブロッキングバッファー(PBS−Tween中5%のMarvel乾燥スキムミルク)を37℃で30分間加えた。その後ブロッキングバッファーを除き、ブロッキングバッファー中1:50の希釈で100μl/ウェルの1次抗体を加え、プレートを4℃で終夜インキュベートした。それからプレートをPBS−Tween中で5回洗浄し、抗ウサギセイヨウワサビペロキシダーゼ標識2次抗体(DAKO)をメーカーの推奨希釈で37℃で1時間で加えた。その後プレートをPBS−Teen中で5回洗浄し、200μl/ウェルの基質(SIGMA Fast-OPD錠)を加え、プレートを暗所で5分間(ファージプレート)及び30分間(HBsAgプレート)展開した。50μl/ウェルの3M硫酸を加えて反応を停止させ、492nmで光学濃度を測定した。ELISAプレートの最初のウェルにブロッキングバッファー中100μlの希釈1次抗体(推定力価に依存して1:10〜1:50)を加え、プレートの12カラムすべてを1:1に連続希釈することにより反応を停止させた。各血清サンプルに対するエンドポイントの力価を計算するためにOD492NM=0.2のカットオフ値を用いた。
マウス以外の動物での免疫反応を調べ、追加の予防接種がより一貫した反応を与えるかどうかを明らかにするために、4羽のウサギをλ−HBsAgレポーターコンストラクトで免疫し、2羽を組換えHBsAgタンパク質で免疫した。注射間の間隔を大きく取り、初期の実験での2羽に比べて全部で4羽(λ−HBsAg)または2羽(組換えHBsAg)に投与し、1〜3週毎に採血した。組換えHBsAgに対しELISAによって抗体価を測定した(図5)。λ−HBsAgの2回の予防接種後、ファージをコードしたHBsAgワクチン抗原に対し矛盾する反応が再度見られた。λ−HBsAgを接種した4羽のウサギの内1羽がHBsAgに対して有意な反応を示し(図5D)、一方残る3羽は低レベルのゆるやかな増加を示した。これらの割合はλ−EGFPによる2回の予防接種後観察された割合と類似していた(即ち、レポーターファージワクチンによる2回の予防接種後動物の25%がEGFPに対し反応を示す)。しかし3回の予防接種後、いずれのウサギも組替えHBsAgタンパク質による1回の予防接種により誘導される反応に匹敵するかあるいは有意に増加した過剰な抗HBsAg反応を示した(図5)。λ−HBsAgによる4回の予防接種は1羽で抗HBsAg力価の顕著な増加(図5C)を、他の3羽に低強度のよりゆるやかな増加をもたらした。組換えHBsAgを投与したグループでは、2回目の予防接種は2羽でHBsAg抗体価の上昇をもたらしたが、この強度は特にこのグループの他のウサギ(ウサギF)で観察された力価に比較して、またはλ−HBsAgを予防接種したグループに比べた時非常に弱いHBsAg抗体価を示すウサギ5Eで低かった。この反応の矛盾は以前にHBsAgについて報告されている(Alper, C. A., Kruskall, M. S., Marcus-Bagley, D., Craven, D. E., Katz, A. J., Brink, S. J., Dienstag, J. L., Awdeh, Z., and Yunis, E. J. B型肝炎ワクチンに対する無反応の遺伝的予測N. Engl. J. Med. 1989; 321: 708-712)。
Claims (21)
- 表面が修飾されていないバクテリオファージ粒子及び薬学的に許容される担体を含み、バクテリオファージ粒子が、生物体の抗原提示細胞の表面で発現及び提示され得る肝炎ウイルスポリペプチドをコードする外来の核酸分子を含み、その生物体において前記ポリペプチドに対する免疫応答を引き起こす肝炎ワクチン製剤。
- A型、B型、C型、D型、及び/またはE型肝炎に対する予防接種において使用する請求項1に記載の肝炎ワクチン。
- 抗原提示細胞の表面に発現及び提示された抗原が肝炎表面抗原である請求項1または2に記載の肝炎ワクチン。
- バクテリオファージが1個以上の肝炎抗原を発現するように設計された先行するいずれかの請求項に記載の肝炎ワクチン。
- 各粒子の表面が修飾されていない109個以上のバクテリオファージ粒子及び薬学的に許容される担体を含み、バクテリオファージ粒子が、生物体の抗原提示細胞の表面で発現及び提示され得る肝炎ウイルスポリペプチドをコードする外来の核酸分子を含み、その生物体において前記ポリペプチドに対する免疫応答を引き起こすワクチン製剤。
- 体液性及び/または細胞性免疫応答を誘導することができる先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- ウイルス、バクテリア、真菌類、酵母、原生動物、寄生虫、昆虫または伝染性海綿状脳症に対する予防接種において使用する請求項5に記載のワクチン製剤。
- 癌細胞特異的抗原の発現によって癌細胞に対する免疫応答を誘導すべく使用する請求項5に記載のワクチン製剤。
- バクテリオファージが、ポリペプチドの発現を促進するための転写レギュレーター及び/または翻訳レギュレーターを含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- CMV、SV40、チミジンキナーゼ、またはRSVプロモーターのような真核生物プロモーターを含む請求項9に記載のワクチン製剤。
- コンスティテューティブプロモーター及び制御可能なプロモーターの制御下外来核酸を含む請求項9に記載のワクチン製剤。
- バクテリオファージが、ラムダ(λ)、p1ファージ、Tファージ、Mu、fd、M13、または繊維状ファージである先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- バクテリオファージが、1個のポリペプチドの単一コピーもしくは多重コピーまたは複数のポリペプチドを発現し得るものである先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- バクテリオファージが、選択された哺乳類宿主の自然な細菌叢において溶解成長しない先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- リソソーム/エンドソームの酵素的異化阻害剤及び/または核移行シグナルをさらに含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- バクテリオファージによって発現されるポリペプチドをさらに含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- ファージ粒子表面のポリペプチドを発現するようにバクテリオファージが修飾されている先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- 外来核酸が免疫応答を増強させ得るポリペプチドをもコードする先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- さらにアジュバントを含む先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- バクテリオファージが媒体と結合している先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
- ヒトまたは動物における疾病の予防及び/または治療において使用される先行するいずれかの請求項に記載のワクチン製剤。
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