JP2001500162A - 少なくとも１種の治療上有効な物質、特にポリヌクレオチド、を標的細胞に導入するための新規脂質複合体および遺伝子治療における使用 - Google Patents

少なくとも１種の治療上有効な物質、特にポリヌクレオチド、を標的細胞に導入するための新規脂質複合体および遺伝子治療における使用

Info

Publication number
JP2001500162A
JP2001500162A JP11501792A JP50179299A JP2001500162A JP 2001500162 A JP2001500162 A JP 2001500162A JP 11501792 A JP11501792 A JP 11501792A JP 50179299 A JP50179299 A JP 50179299A JP 2001500162 A JP2001500162 A JP 2001500162A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
lipid
group
different
same
complex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP11501792A
Other languages
English (en)
Inventor
ライナー、ビショフ
ドゥニ、エスレール
アブデスラム、ナジー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Transgene SA
Original Assignee
Transgene SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transgene SA filed Critical Transgene SA
Publication of JP2001500162A publication Critical patent/JP2001500162A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/12—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly or doubly bound nitrogen atoms
    • C07D295/125—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly or doubly bound nitrogen atoms with the ring nitrogen atoms and the substituent nitrogen atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/13—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly or doubly bound nitrogen atoms with the ring nitrogen atoms and the substituent nitrogen atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/14—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D295/145—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/15—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、標的細胞に物質を導入するのに有用な、少なくとも１種の脂質と少なくとも１種の治療上有効な物質とを含んでなる複合体であって、脂質が式(I)： ｛式中n1およびn2は同一であっても異なっていてもよく、総数が0および1であり；R1およびR2は同一であっても異なっていてもよく；a)水素原子および、所望により互いに独立してヒドロキシル基で置換されていてもよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択されるか；またはb)特定の場合では、n1=n2=1であるとき、R1およびR2が一緒になって2〜3個の炭素原子を有する(C2-C3)二価のアルキレン鎖を形成することができ；R3およびR4は同一であっても異なっていてもよく、1〜6個の炭素原子を有するアルキル基であるか、または一緒になって2〜3個の炭素原子(C2-C3)を有する二価のアルキレン鎖を形成することができ；m、pは同一であっても異なっていてもよく、総数が1〜10の間であり；R5、R6は同一であっても異なっていてもよく、式1)R7C(=O)-X-（式中：X=NH、OまたはS；R7は直鎖または分枝した、6〜23個の炭素原子(C6-C23)を有するアルキルまたはアルキレン基である）；2)R8R9NC(=O)一（式中：R8、R9は同一であっても異なっていてもよく、水素原子、もしくは直鎖または分枝した、6〜23個の炭素原子を有するアルキルまたはアルキレン基からなる群より選択される（ただし、R8、R9は同時に水素原子であることはない）；かつ、3)基R5およびR6のうち１個がさらに水素原子であることも可能である、からなる群より選択される｝で示されることを特徴とする複合体に関する。本発明はまた遺伝子治療における該複合体の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 少なくとも１種の治療上有効な物質、特にポリヌクレオチド、を標的細胞に 導入するための新規脂質複合体および遺伝子治療における使用 本発明は、下記に定義された少なくとも１種の脂質複合体と少なくとも１種の 治療上有効な物質とを含んでなる新規複合体に関する。さらに詳しくは、本発明 は、負電荷を含有する少なくとも１種の治療上有効な物質、特にポリヌクレオチ ドを標的細胞、特に脊椎動物細胞、さらに特には哺乳動物細胞に導入するための 該複合体の使用に関する。 所与の細胞への遺伝子導入は、まさに遺伝子治療の基礎である。この技術の適 用分野は広大であり、この技術はそれに対する標準的に選択される治療法に効果 がない場合、あるいは存在さえしない重篤な疾病の治療を構想することを可能に し、また同様に遺伝子起源の疾病（血友病、膵臓繊維症、筋疾患など）や後天性 疾病（癌、エイズなど）に関与している。 最近30年のうちに、種々の異種遺伝子を細胞、特に哺乳類細胞へ導入するため に多くの手段が開発されてきた。これら種々の技術は２つのカテゴリーに分類で きる。第一のカテゴリーはマイクロインジェクション、エレクトロポレーション またはパーティクル・ボンバードメントなどの物理的技術に関連し、これらは効 果的ではあるが、in vitroでの適用が大きく制限され、煩雑かつ実施が困難であ る。第二のカテゴリーは分子生物学および細胞生物学に関連する技術を含み、そ のために導入されるべき遺伝子が該材料の導入を誘導する生物学的または総合的 特性を有するベクターに連結されている。 現在のところ最も効果的なベクターはウイルスベクター、特にアデノウイルス またはレトロウイルスベクターである。開発された技術は、細胞膜を通過し、そ れらの遺伝物質の分解を回避し、かつそれらのゲノムを核内への透過を可能にす るためにこれらのウイルスが有している天然の特性に基づくものである。これら のウイルスはすでに多くの研究の対象とされており、すでにそれらのいくつかは 例えば、予防接種、免疫療法または遺伝子欠損の補償を目的とした治療の目的の ためにヒトにおける遺伝子ベクターとして実験的に使用されている。しかしなが ら、このウイルスのアプローチは、特に、ウイルスゲノムにおけるクローン化能 の制限、宿主の体内および環境中で生じた感染性ウイルス粒子の伝播の危険性、 レトロウイルスベクターの場合に宿主細胞への挿入による人工産物の突然変異の 危険性、および治療処置中のin vivoにおける免疫および炎症応答の強力な誘導 のために多くの制限を有し、これらは考えられ得る投与回数を著しく制限するも のである(Mc Coy et al.，1995，Human Gene Therepy，6，1553-1560;Yang et a l.，1996，Immunity，1，433-442)。これらの多くの欠点は、特にヒトにおける 使用に関して、いくつかのチームをポリヌクレオチドの導入のための代替系の開 発へと導いた。 現時点では、いくつかの非ウイルス法が使用可能である。例えば、リン酸カル シウムを用いた共沈降、ウイルス系を模した受容体の使用（総論としてはCotten and Wagner，1993，Current Opinion in Biotechno1ogy，4，705-710を参照） 、またはポリアミドアミンなどのポリマーの使用(Haensler and Szoka，1993，B ioconjugate Chem.，4，372-379)、または樹木ポリマーの使用を記載しているWO 95/24221、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミンの使用を記載して いるWO 96/02655明細書、およびポリリジン複合体の使用を記載している米国特 許第5,595,897号およびフランス特許第2,719,316号明細書で示されたものなどの ポリマーの使用の記載がある。他の非ウイルス技術はリポソームの使用に基づい ており、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質など医薬上有効な物質を細胞内 へ導入するための試薬としてのその価値が文献で広く記載されている。この目的 の ために、すでにいくつかのチームが細胞膜および／または核酸に対して強い親和 性を有する陽イオン脂質の使用を提案している。この理由は示されていないが、 核酸の場合では、この種の高分子がin vivoにおいて特定細胞の原形質膜を通過 することができることであり(WO 90/11092)、観察されたトランスフェクション の能力が、特にそれ自身が実質が負の見かけの電荷を有している、それらの細胞 膜の通過を妨げる核酸の多陰イオン性のために、依然として極めて制限されたも のであるという事実がやはり残る。1989年以来(Felgner et al.，Nature，337， 387-388)、核酸のような大きな陰イオン分子の特定細胞への導入の促進に関して 有利な分子として陽イオン脂質が提案されてきた。これらの陽イオン脂質は陰イ オン分子と複合体を形成することができ、かくして該分子における負電荷を無効 にし、さらに細胞壁へのそれらの接近を誘導することにつながる。すでに多くの チームが種々の陽イオン脂質を開発している。例としては、DOTMA(Felger et al ．，1987，PNAS，84，7413-7417)、DOGSまたはTransfectam（商標）(Behr et al .，1989，PNAS，86，6982-6986)、DMRIEおよびDORIE(Felgner et al.，1993，Me thods 5，67-75)、DC-CHOL(Gao and Huang，1991，BBRC，179，280-285)、DOTAP （商標）(McLachlan et al.，1995，Gene Therepy，2，674-622)またはLipofect amine（商標）ならびに特許出願WO 91/16024またはWO 95/14651またはWO-A-94/0 5624に記載されたものが記載され得る。 さらに特に、特許出願WO-A-95/14651は式： （式中、Rは直鎖、5〜29個の炭素原子を有する脂肪族アルキル基であり、Yは-CH 2 -またはCOであり、R'は低級アルキル基であり、mは0〜7の整数であり、nは0〜1 であり、Rおよび(CH2)m中の炭素原子の総数が少なくとも10に等しい） の陽イオン脂質について記載している。 しかしながら、いくつかの研究（例としては、Mahato et al.，J．Pharm．Sci ．，1995，84，1267-1271，Thierry et al.，1995，P.N.A.S，92，9742-9746)で は、陰イオン性高分子の細胞への導入の効力が、特に複合体と細胞膜との間の相 互作用、考慮される細胞、陽イオン化合物の脂質組成、陰イオン分子とともに形 成される複合体の大きさ、わらに特には該複合体の異なる成分における正および 負電荷の割合の機能として様々であり得ることが実証された。特に、複合体と細 胞膜との相互作用および細胞への複合体の導入を可能にするメカニズムはまだ大 部分が知られておらず、研究者らは高度な経験的アプローチをもって研究を進行 中である。例えば、複合体の形成、安定性、in vivoでの挙動、または場合によ ってはそれらの毒性などの他の因子も、原則として明白でない脂質を選択させる 。結局、所望によりすでに記載されているもとより良好な、あるいはすでにきさ いされているものとは異なる特性を有する新規な非ウイルスベクターまたは脂質 複合体のデザインを可能とする他の陽イオン脂質を提案することが望ましい。 本発明は第一に、標的細胞に物質を導入するために使用できる、少なくとも１ 種の脂質と、特に負電荷を含有する少なくとも１種の治療上有効な物質とを含ん でなる複合体であって、脂質が式I： ｛式中： n1およびn2は同一であっても異なっていてもよく、0および1から選択される整 数であり、 R1およびR2は同一であっても異なっていてもよく： a)水素原子および、所望により互いに独立してヒドロキシル基で置換されてい てもよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択されるか、ま たは b)特定の場合では、n1=n2=1であるとき、R1およびR2が一緒になって2〜3個の 炭素原子を有する(C2-C3)二価のアルキレン鎖を形成することができ、 R3およびR4は同一であっても異なっていてもよく、1〜6個の炭素原子を有する アルキル基であるか、または一緒になって2〜3個の炭素原子(C2-C3)を有する二 価のアルキレン鎖を形成することができ、 mおよびpは同一であっても異なっていてもよく、1〜10の整数であり、 R5およびR6は同一であっても異なっていてもよく、式： 1)R7C(=O)-X- （式中、 X=NH、OまたはS、 R7は直鎖または分枝した、6〜23個の炭素原子(C6-C23)を有するアルキルまた はアルキレン基である） 2)R8R9NC(=O)- （式中、R8およびR9は同一であっても異なっていてもよく、水素原子、もしくは 直鎖または分枝した、6〜23個の炭素原子を有するアルキルまたはアルキレン基 からなる群より選択される（ただし、R8およびR9は同時に水素原子であることは ない）、および 3)基R5およびR6のうち１個が水素原子であることも可能である で示される基ならなる群より選択される｝ で示されることを特徴とする複合体に関する。 極めて特殊な場合では、各々n1またはn2が0に等しく、かつn2またはn1が1に等 しいとき、R1およびR2とともに、2個の窒素の間に１個だけ炭素原子を含有する アルキレン鎖を形成することができる。かかる鎖はまた、R3またはR4とともに、 2個の窒素の間に含まれてもよい。 「アルキレン」とは、問題の炭素鎖が該鎖に沿って１個以上の二重結合を含ん でなることを示すことを意図したものである。 変法によれば、本発明の複合体内に含まれる脂質は式II： ｛式中： n1およびn2は同一であっても異なっていてもよく、0および1の整数から選択さ れ、 R1およびR2は同一であっても異なっていてもよく、水素原子および、所望によ り互いに独立してヒドロキシル基で置換されていてもよい1〜6個の炭素原子を有 するアルキル基からなる群より選択され、特定の場合では、n1=n2=1であるとき 、R1およびR2が一緒になって2〜3個の炭素原子を有する二価のアルキレン鎖を形 成することができ、 mおよびpは同一であっても異なっていてもよく、1〜10の整数であり、 R7は同一であっても異なっていてもよく、直鎖または分枝した6〜23個の炭素 原子を有するアルキルまたはアルキレン基である｝ で示される脂質である。 基R7C(=O)は同一であっても異なっていてもよく、13〜18個の炭素原子を有す る基、特にオレオイル、ステロイル、パルミトイルおよびミリストイル基である ことが好ましい。 本発明の有利な場合によれば、該脂質は陽イオン形態であり、すなわち、１個 以上の窒素原子に１個の陽子を結合させることにより陽子を付加した形態である 。この場合、該陽イオン脂質は、例えばトリフルオロアセテート、ハロゲン、モ ノメチルスルフェート、酢酸塩またはリン酸塩、ヨウ化物、塩化物、臭化物など の生物学上許容される陰イオンの１種以上と会合している。言うまでもないが、 一般に、n1+n2の和が1または2のとき、該脂質は、生物学上許容されるn1+n2に等 しい負電荷を有する１個の陰イオン、またはn1+n2に等しい全電荷を有する2個の 陰イオンと会合する。「生物学上許容される陰イオン」という表現は、その陽イ オン脂質が細胞中に導入され得る、または細胞膜に存在し得るような陰イオンで あることを意味する。 好ましくは、本発明の複合体中に含まれる脂質は、所望によっては陽イオン型 である下記式： の化合物からなる群より選択される。 本発明に従い使用される式IIの陽イオン脂質は、式： で示されるテトラミンを式R7COOH （R7、mおよびpは式IIの化合物におけるものと同義を有する）と反応させること により製造され、これに対応するジアミンが得られる。 この後者の化合物は所望により、ハロゲン化アルキルとの反応によって、環の 窒素原子においてアルキル化されていてもよい。また、酸を用いた処理により同 窒素原子において陽子が付加されてもよい。 アルキル化反応は、有機媒質中でハロゲン化アルキルまたはニハロゲン化アル キレンを用いて行う。 実施については、この記載中に示された製造例が参照されよう。 記載の方法は一般に、所望により当業者の裁量の範囲内で適合させた後に、本 発明に従って使用される脂質の合成に適用できる。 もう１つの変法によれば、本発明の複合体に含まれる脂質は式VII： ｛式中： n1およびn2は同一であっても異なっていてもよく、0および1から選択される整 数であり、 R1およびR2は同一であっても異なっていてもよく： a)水素原子および、所望により互いに独立してヒドロキシル基で置換されてい てもよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択されるか、ま たは b)特定の場合では、n1=n2=1であるとき、R1およびR2が一緒になって2〜3個の 炭素原子を有する(C2-C3)二価のアルキレン鎖を形成することができ、 R3およびR4は同一であっても異なっていてもよく、1〜6個の炭素原子を有する アルキル基であるか、または一緒になって2〜3個の炭素原子(C2-C3)を有する二 価のアルキレン鎖を形成することができ、 mおよびpは同一であっても異なっていてもよく、1〜10の整数であり、 R8およびR9は同一であっても異なっていてもよく、水素原子、もしくは直鎖ま たは分枝した、6〜23個の炭素原子を有するアルキルまたはアルキレン基からな る群より選択され（ただし、R8およびR9は同時に水素原子であることはない）、 かつ、 分子の各末端の基NR8R9は異なっていてもよい｝ に相当する。 好ましくは、R8およびR9は6〜23個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケ ニル基から選択される。 好ましくは、該複合体中の脂質は下記式で示される化合物からなる群より選択 される。 もう１つの変法によれば、用いられる脂質は式 ｛式中： n1およびn2は同一であっても異なっていてもよく、0および1から選択される整 数であり、 R1およびR2は同一であっても異なっていてもよく： a)水素原子および、所望により互いに独立してヒドロキシル基で置換されてい てもよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択されるか、ま たは b)特定の場合では、n1=n2=1であるとき、R1およびR2が一緒になって2〜3個の 炭素原子を有する(C2-C3)二価のアルキレン鎖を形成することができ、 mおよびpは同一であっても異なっていてもよく、1〜10の整数であり、 R8およびR9は同一であっても異なっていてもよく、水素原子、もしくは直鎖ま たは分枝した、6〜23個の炭素原子を有するアルキルまたはアルキレン基からな る群より選択される（ただし、R8およびR9は同時に水素原子であることはない） ｝に相当する。 好ましくは、かかる脂質は下記式で示される化合物からなる群より選択される 。 かかる陽イオン脂質は式： のジアミンを式： （R1、R2、R3、R4、m、R8およびR9は式VIIにおけるものと同意義であり、Xはハ ロゲン化物XXの原子である） で示されるω-ハロアミドと反応させることにより製造できる。 ハロゲンとして使用される臭化物の１つ(m=1、p=1、R8=R9=オクチル)は、Li， T.；Diederich，F．J．Org．Chem．1992，57，3449-3454にすでに記載されてお り、N(CH2-CH2)3N（＝ジアザニ環式[2,2,2]オクトン）のジアルキル化でのその 使用もそうである。 しかしながら、本発明の複合体に含まれる脂質は、前記の製造方法により得ら れるものに限定されなくともよい。 さらに本発明の製造変法に従い、該複合体に含まれ、かつ前記された脂質は、 互いに組み合わせを考慮してもよいし、しなくともよい下記バリエーション： 好ましくは、R1および／またはR2、もしくはR3および／またはR4はメチル基で あり； 好ましくは、R1およびR2、もしくはR3およびR4は一緒になってエチレン鎖を形 成し； 好ましくは、R1およびR2、もしくはR3およびR4は一緒になってプロピレン鎖を 形成し； 好ましくは、mおよび／またはpは1〜6の整数であり； 好ましくは、式Xの場合、mは1〜6の整数であり、かつp=1 を有してよい。 本発明の特定の場合によれば、注目する１以上のリガンドが、少なくとも１個 の窒素原子を介して、あるいは基Rの１つを介してさえも脂質と結合することが できる。かかるリガンドは特に標識分子（米国特許第4,711,955号における標識 分子を参照）、細胞標的分子（例えば、GRPペプチド、ガストリン放出ペプチド ）またはアンカー分子からなってよい。かかる要素はある特定の細胞種を標的と することを可能にし、かつ、その細胞への浸透、エンドソームの溶解、または選 択的な細胞内輸送を促進し、文献で広く記載されている。それらは、例えば総て または数種の糖、ペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、 抗原、抗体、特異的膜-受容体リガンド、抗リガンドと反応可能なリガンド、フ ゾジェニックペプチド、各局在ペプチド、またはかかる化合物の組み合わせであ ってよい。さらに特に、肝細胞の表面のアシアログリコプロテイン受容体、イン フルエンザウイルスヘマグルチニンのサブユニットHA-2由来のフゾジェニックペ プチドINF-7(Plank et al.，1994，J．Biol．Chem．269，12918-12924)、もしく はSV40ウイルスのT抗原由来の(Lanford and Butel，1984，Cell 37，801-813)ま たはエプスタイン・バーウイルスのタンパク質EBNA-1由来の(Ambinder et al.， 1991，J．Virol．65，1466-1478)核局在化シグナルを標的化するためのガラクト シル残基に関して記載することができる。かかる複合体は広く文献で記載されて いる技術に従い、容易に得ることができる。 さらに、本発明はまたかかる複合体に含まれる脂質に対応するジアステレオマ ー（シスおよび／またはトランス）の一方、または他方、または混合物を含んで なる複合体に関するものであることが指摘されるべきである。これは、出願者が さらに、これらの異性体（シス／トランス）のあるもの、または他方のものがト ランスフェクション能力の点でその反対の異性体（それぞれトランスまたはシス ）よりもより良い特性を有し得ることを示したことによるものである。異性体の 同定は、当業者に十分公知な技術に従って、特に分析する脂質を含有する組成物 のNMRスペクトル測定および／または結晶化により、容易に行うことができる。 ジアステレオマーの例としては、特に下記式を有する脂質について記載するこ とができる。 もう１つの態様によれば、本発明はまた、前記の脂質／治療上有効な物質の複 合体であって、該脂質と該治療上有効な物質の間における複合体の形成を改良す るか、または細胞に対するこれら複合体の作用を改良することが可能な、少なく とも１種のアジュバンドを含んでなることを特徴とする複合体に関する。 好ましくは、かかるアジュバントは、例えばトリグリセリド、ジグリセリド、 コレステロール（例えば米国特許第5,438,044号を参照）などの中性または両性 イオン脂質、特に、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルコリ ン、ホスホコリン、スフィンゴミエリン、セラミドまたはセレブロシドであるか 、またはこれらに由来する中性または両性脂質であろう。ジオレオイルホスファ チジルエタノールアミン(DOPE)またはホスファチジルエタノールアミン(PE)を選 択することが有利である。 一般に、脂質とアジュバントとの間の重量比は0.1〜10の間であり、この割合 は考慮される化合物の性質により様々であってよいと理解される。当業者ならば 、これら一般性の低い適合を可能にするための十分な知識を有している。中性お よび／または両性脂質の混合物、あるいはまた陽イオン脂質の混合物、および中 性および／または両性脂質の混合物を使用することも可能である。 もう１つの態様によれば、本発明はまた、標的細胞に治療上有効な物質を導入 することを意図した組成物であって、複合体に関して前記されたものなど少なく とも１種の脂質と少なくとも１種の前記アジュバントとを含んでなる組成物に関 する。 ある特定の具体例によれば、本発明の治療上有効な物質は、核酸およびタンパ ク質から選択される。好ましくは、本発明の複合体の有効物質はポリヌクレオチ ドであり、次いで該脂質は細胞におけるポリヌクレオチドのトランスフェクショ ン力を改良することを可能とする。 「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの正確な配列を表す、二本鎖または 一本鎖、直鎖または環状、天然、単離または合成の、大きさの制限なく核酸のｐ 断片または領域定義することを可能にする、修飾されているかそうでない（例え ば米国特許第5,525,711号を参照）、また標識されているかまたはそうではない （例えば米国特許第4,711,955号または欧州特許第302,175号を参照）ＤＮＡおよ び／またはＲＮＡ断片を表すことを意図したものである。「ポリヌクレオチド」 とは、特にｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャ−ＲＮＡ、アンチセンスＲＮ Ａ、リボザイム、トランスファーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡまたはかかるＲＮＡ に対するＤＮＡコーディングを表すことを意図したものである。「ポリヌクレオ チド」および「核酸」は本特許出願に関しては同義語である。「アンチセンス」 とは、標的細胞に相補的な配列、例えば、その発現が標的配列に対するハイブリ ダイゼーションによるブロックのために所望されるｍＲＮＡ配列を有する核酸を 表すことを意図しており；「センス」とは、標的配列と相同または同一の配列、 例えば、タンパク質転写因子と結合する配列を有し、かつ、所与の遺伝子の発現 に関与する核酸を表すことを意図している。 本発明の特定の具体例によれば、該ポリヌクレオチドは注目する遺伝子と、注 目する遺伝子の発現を可能にする構成要素とを含んでなる。この具体例では、該 ポリヌクレオチドはプラスミドの形態であることが有利である。発現を可能にす る構成要素とは、該ＤＮＡ断片のＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ） への転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能にする総ての構成要素で ある。それらは特に、該細胞で効果的なプロモーター配列および／または調節配 列、および所望によっては標的細胞の表面で該ポリペプチドの排出または発現を 可能にするために必要とされる配列である。例示すれば、ウイルスRSV、MPSV、S V40、CMVまたは7.5kのワクシニアウイルスのプロモーター、筋クレアチンキナー ゼ、アクチンまたは肺界面活性物質に対する遺伝子コーディングのプロモーター などのプロモーターが記載されよう。また、与えられた細胞種に特異的であるか 、 または定義された条件の下で活性化され得るプロモーター配列を選択することも できる。文献はかかるプロモーター配列に関する大量の情報を提供している。さ らに、該ポリヌクレオチドは、同一であっても異なっていてもよく、転写プロモ ーター活性を示す少なくとも２つの配列、および／または同一であっても異なっ ていてもよく、転写プロモーター機能または該配列の転写が影響を受けないとい う条件で、互いに関連して、隣接して、離れて、同一方向で、または反対方向で 配置された少なくとも２つのコーディングＤＮＡ配列を含んでなってよい。同様 に、この種の核酸構築体へと、転写に影響を及ぼさず、かつ、転写段階の前にス プライシングを受ける「中性の」核酸配列、すなわちイントロンを導入すること が可能である。かかる配列およびそれらの使用は文献に記載されている。該ポリ ヌクレオチドはまた、細胞内輸送に、複製に、および／または組み込みに必要な 配列を含む。かかる配列は当業者には十分に公知である。さらに、本発明のポリ ヌクレオチドはまた、それらが標的細胞のゲノム中に組み込まれないように修飾 したポリヌクレオチドであってもよいし、または例えばスペルミンなどの試薬の 助けで安定化させたポリヌクレオチドであってもよい。 本発明に関して、ポリヌクレオチドは標的細胞と同種であってもよいし、異種 であってもよい。ポリペプチド、特に治療または予防活性、さらに特には細胞型 または体液型の免疫活性を有するポリペプチドの総てまたは一部に関してコード しているポリヌクレオチドを使用することが有利であると考えられる。ポリペプ チドとは、限定されるものではないが、その大きさまたはその修飾（例えばグリ コシル化）の程度に対するものと理解される。例えば酵素、ホルモン、サイトカ イン、膜受容体、構造ポリペプチド、膜チャンネルを形成するポリペプチド、輸 送ポリペプチド、接着性分子、リガンド、転写の、翻訳の、複製のまたは転写の 安定化の調節に関する因子、または抗体に関する遺伝子コーディング、例えば、 CFTRタンパク質、ジストロフィン、因子VIIIまたはIX、HPVのE6/E7、MUC1、BRAC 1、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、インターロイキン(IL)2、IL-4 、IL-6、IL-7、IL-12、腫瘍壊死因子(TNF)α型、GM-CSF（顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor)）、１ 型単純ヘルペスウイルス(HSV-1)tk遺伝子、網膜芽腫またはp53、もしくは断片F( ab)2、Fab'、Fab、または抗イディオタイプなどの免疫グロブリンの総てまたは 一部と関連した遺伝子に対する遺伝子コーディングなどが記載されてよい（米国 特許第4,699,880号）。言うまでもないが、このリストは限定されるものではな く、他の遺伝子を使用してもよい。 好ましい具体例によれば、本発明の複合体はサイズにおいて小さい（500nm未 満、有利には200nm未満、特には100nm未満）。 さらに、実施したトランスフェクション試験では、該ポリヌクレオチドに対す る脂質の重量比が0.01〜100であることが有利であることを示している。至適比 は0.05〜10である。 本発明はまた陽イオン脂質／治療上有効な陰イオン物質複合体を製造するため の方法に関し、この方法は本発明に従って記載された陽イオン形態の１以上の脂 質を、１以上の有効物質と接触させて置き、そこで該複合体を回収するを特徴と するものである。本発明はまた、１以上の脂質、または１以上の本発明の組成物 を含んでなるかかる複合体を製造するためのキットに関する。 第１の変法によれば、第１の段階において、例えば、特許出願WO-A-96/03977 に記載された公知の方法に従って、１以上の陽イオン脂質を適量の水和性溶媒ま たは溶媒混合物、特にエタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、または、好ま しくは、1:1(v:v)エタノール／DMSO混合液に溶解させて脂質集塊を形成させるか 、もしくは、第２の変法によれば、適量の洗剤、例えば、n-オクチル-β-D-グル コピラノシドまたは6-O-(N-ヘプチルカルボモイル)-メチル-α-D-グルコピラノ シドなどのオクチルグルコシドに懸濁させる。 次いで、その懸濁液を緩衝培地に置き、負電荷を含有する治療上有効な物質の 溶液と混合させればよい。 最終複合体中に中性または両性イオン脂質が存在することが望ましい場合は、 水和性溶媒、または洗剤溶液への溶解に先立ち、公知の方法で、該陽イオン脂質 および該中性脂質または、例えばDOPEなどの両性イオン脂質を含有する混合液を 用いて被膜を形成させる。 本方法の重要な特徴の１つは、陽イオン脂質の正電荷と有効物質の負電荷間の 比率の選択にある。 特定の比率により限定されるものではないが、種々の電荷量は、陽イオン脂質 の正電荷数と治療上有効な物質の負電荷数の比率が、0.05〜20の間、特に0.1〜1 5の間、好ましくは5〜10の間となるよう選択される。 かかる比率に至るための算出は、有効物質が帯びる負電荷を考慮に入れ、前記 で示した比率を満たすのに必要な陽イオン脂質の量を調節する。他の構成要素に 対する量および濃度は、それらそれぞれのモル質量、およびそれらの正電荷およ び／または負電荷数によって調節する。 第２の変法では、さらに所望により洗剤を減じ、かつ、複合体を回収するため に、続いて透析を行えばよい。かかる方法の原理は、例えばHofland et al.(199 6,PNAS 93，p7305-7309)により、およびPhilippot et al.の文書(G.Gregoriedis ，81-89，CRC Press 1993)II章に記載されている。 それは得られた複合体のサイズの点から、第１の変法が優れた結果をもたらす ことを示している。 第３の変法によれば、１以上の陽イオン脂質を緩衝液に懸濁し、次いでその懸 濁液を、視覚的に均質性が得られるまで超音波処理を施す。次いでその脂質懸濁 液を、適切な圧力下で、2つの微細多孔性膜を通して押し出す。次いで、その脂 質懸濁液を、負電荷を有してなる治療上有効な物質の溶液と混合する。このいわ ゆる超音波押出法は当該技術分野で十分に公知である。 サイズの小さい（200nm未満、好ましくは100nm未満）複合体の製造には、中性 脂質または、DOPEなどの両性イオン脂質を使用することが有利であることが証明 できる。 形成された複合体の特徴は、測定を可能にするいくつかの手段、例えば： 特に物質が核酸であるときの、ゲル電気泳動による遊離核酸の同定による、有 効物質との複合化の状態、 準弾性光散乱による粒子サイズ、 長期にわたって沈降が存在しないこと により評価できる。 本発明の主題はまた、前記で挙げた方法を用いて得られる複合体にある。 本発明はまた、少なくとも１種の治療上有効な物質、さらに特には核酸を、in vitroで、ex vivoで、またはin vivoで、さらに特にはin vivoで、標的細胞へ 導入するための本発明の複合体の使用に関する。 本発明によれば、「標的細胞」とは、原核細胞、酵母細胞、および真核細胞、 植物細胞、ヒトまたは動物細胞、特に哺乳類細胞を意味する。さらに癌細胞も記 載すべきである。In vivoにおいて本発明は、肺、気管、皮膚、筋肉、脳、肝臓 、心臓、脾臓、骨髄、胸腺、膀胱、リンパ液、血液、膵臓、胃、腎臓、卵巣、睾 丸、直腸、末梢または中枢神経系、眼、リンパ系器官、軟骨および内皮などの組 織の間質または管腔空間のレベルで適用することができる。本発明の有利な選択 によれば、標的細胞は筋細胞、造血幹細胞またはそうでなければ気道の細胞、さ らに特には気管細胞または肺胞細胞、および有利には、呼吸器上皮の細胞であろ う。 本発明の複合体は、治療、予防、またはワクチン目的の医薬製剤として使用す ることができる。従って、発明の主題はまた、治療、予防、またはワクチン目的 にの医薬製剤としての本発明の複合体にある。かかる複合体は少なくとも１種の 治療上有効な物質、特にポリヌクレオチドを標的細胞、特に哺乳類細胞、さらに 明確には、筋細胞、造血幹細胞、気道細胞、さらに特には気管細胞または肺胞細 胞、呼吸器上皮細胞に導入することからなる治療処置に使用することができる。 さらに広義には、本発明はまた、負電荷を有してなる治療上有効な物質を細胞 に導入する方法であって、適切な培地で培養した細胞を、陽イオン脂質／負電荷 を含有する治療上有効な物質の複合体の懸濁液に接触させて置くことを特徴とす る方法に関する。一定のインキュベーション時間の後、その細胞を洗浄し、回収 する。いずれの適切な手段によっても、治療上有効な物質の導入を確認する（所 望により細胞溶解した後）ことができる。 導入方法はそれ自体は十分に公知である。「導入」とは、負電荷を含有する治 療上有効な物質を細胞に導入し、次いで本方法の終了時には、該細胞内に、また は膜中に置くことを意味するものと理解される。治療上有効な物質が核酸である とき、特に「トランスフェクション」という表記がなされよう。この場合、核酸 のトランスフェクションは、いずれの適切な方法、例えば問題の遺伝子の発現ま たは発現したタンパク質の濃度を測定することにより確認することができる。 本発明はより詳しくは、特に遺伝子治療により、ヒトまたは動物の身体を治療 することを意図した治療、予防、またはワクチン目的の医薬製剤の製造のための 発明の複合体または組成物の使用に関する。 第１の可能性に従って、該医薬製剤をin vivoで直接（例えばエアゾル剤など によって筋肉へ、肺へ）投与することができる。また、患者から細胞（骨髄幹細 胞、末梢血液リンパ球、筋細胞など）を採取し、本発明に従ってそれらをin vit roでトランスフェクトし、次いでそれらを患者に再び投与することからなるex v ivoのアプローチを採用することもできる。 発明の複合体は、注射器により、もしくは吸入、点滴注入またはエアゾル化な どの、気道または粘膜処置に適切な他のいずれの同等手段、系によっても、筋肉 内、気管内、鼻腔内、脳内、胸膜内、腫瘍内、心臓内、胃内、腹膜内、表皮、静 脈内または動脈内経路を介して投与することができる。クリーム剤を塗布するこ とによる、経口投与または、専ら当業者に公知であり、しかも、本発明に適用可 能な他のいずれかの手段による投与による投与様式を記載してもよい。 また、複合体の見かけの電荷である、複合体における化合物または組成物／治 療上有効な物質の比率を調整するために調製した本発明の複合体を、特に静脈内 経路を介して投与することにより、特定の器官または組織を標的とすることも本 発明の範囲内にある（特にLiu et al.，1997，Gene Therapy，4，517-523;Thier ry et al.，1995，P.N.A.S.，92，9742-9746を参照）。 本発明はまた、適切量の本発明の複合体を患者に投与することからなる遺伝子 治療法に関する。本発明によれば、またin vivo遺伝子治療に関しては、与えら れた患者で、投与された化合物の１つに対していずれの主要な免疫反応も誘引せ ずに、本法を提唱される数回繰り返すことができる。投与は単回の投与で、また は一定期間の後、１回または数回繰り返して行うことができる。反復投与は、与 えられた用量に対して投与すべき治療上有効な物質、さらに特にはＤＮＡの量を 減じることを可能にすると考えられる。適切な投与経路および用量は種々のパラ メーター、例えば、治療すべき個体または疾病、または導入されるポリヌクレオ チドにより異なる。 さらに特に本発明は、少なくとも１種の前記複合体を含んでなり、また所望に より、例えばそれを保存する、および／または該複合体のトランスフェクション 力を向上させる目的で該医薬製剤を安定化させることができる少なくとも１種の アジュバントを含有してもよい医薬製剤に関する。かかるアジュバントは、例え ば、クロロキン、特にプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセ ロール、エタノール、1-メチル-L-2-ピロリドンから選択される極性プロトン性 化合物、またはその誘導体、もしくは特にジメチルスルホキシド(DMSO)、ジエチ ルスルホキシド、ジ-n-プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン 、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチルウレアおよびア セトニトリルから選択される極性非プロトン性化合物、またはその誘導体からな る群より選択することができた。同様に、該製剤はヒトまたは動物への投与を可 能にする医薬上許容される担体を含有してもよい。 本発明のin vivo治療法の使用に関して、前記医薬製剤を投与する前に、トラ ンスフェクションのレベルを増強することを可能にするマクロファージの一時的 涸渇が見られるように計画された患者に対する処置を行うこともできる。かかる 技術は文献に記載されている；特にVan Rooijen et al.，1997，TibTech，15，1 78-184を参照。 最後に本発明は、前記定義に同じ複合体でトランスフェクトされた細胞、特に 原核細胞、酵母細胞、または真核細胞、特には動物細胞、特に哺乳類細胞、さら に特には癌細胞に関する。本発明の好ましい場合によれば、該細胞は気道の細胞 、さらに特には気管または肺細胞、有利には呼吸器上皮細胞である。 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明を限定するものではない。 図面の説明： 図1〜14： 本発明の種々のＤＮＡ／陽イオン脂質複合体でのA549細胞のin vitroトランスフ ェクション。 図1：DOPEの不在下におけるpcTG51 図2：等モル量のDOPEの存在下におけるpcTG51 図3：DOPEの不在下におけるpcTG52 図4：等モル量のDOPEの存在下におけるpcTG52 図5：DOPEの不在下におけるpcTG53 図6：等モル量のDOPEの存在下におけるpcTG53 図7：DOPEの不在下におけるpcTG54 図8：等モル量のDOPEの存在下におけるpcTG54 図9：DOPEを含むまたは含まないpcTG57 図10：DOPEを含むまたは含まないpcTG58 図11：DOPEの不在下におけるpcTG59 図12：等モル量のDOPEの存在下におけるpcTG59 図13：DOPEの不在下におけるpcTG60 図14：等モル量のDOPEの存在下におけるpcTG60。 各々の図面について、ウシ胎児DOPEの存在または不在はそれぞれ(+)および(6) で示されており；ウェル当たりのプラスミドＤＮＡの量はx軸で示し(0.5、1また は0.05μｇ/ウェル）；電荷比は記号表に示し(0.8、1.25、2.5、5または10)；測 定したルシフェラーゼ活性はルシフェラーゼfg/全タンパク質mgで表し、y軸で示 している。 実施例1 式I（式中、n1=n2=0、R3、R4はエチレン鎖、m=p=3、R5=R6=NHCO C13H27）で示 される陽イオン脂質pcTG23の合成 無水クロロホルム(5ml)中のジシルコヘキシルカルボジイミド(2.06g;9.98mmol )溶液を、無水クロロホルム(15ml)中の1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン( 1.00g;5.00mmol)、ミリスチン酸(2.28g;9.98mmol)および1-ヒドロキシベンゾト リアゾール(1.42g;10.5mmol)に添加する。反応混合液を室温にて4時間攪拌し、 次いで濾過してジクロロヘキシルウレアを除去する。濾液を減圧下で濃縮し、シ リカゲルのカラム上でクロマトグラフィーに付して（溶離液：9/1ジクロロメタ ン／メタノール）、117-118℃の融点を有するジアミドpcTG23(2.7g;87％)を得る 。 マススペクトロメトリー：計算質量=621.1 Da；測定質量=620.6 Da。 実施例2 式I（式中、R1=R2=メチル；R3およびR4は一緒になってエチレン残基を形成；m =3；p=3；R5およびR6はNH C(=O)C13H27基（n-トリデシル残基C13H27））で示さ れる陽イオン脂質pcTG24の合成 0.5mlのヨードメタン(8.0mmol)および4mlのアセトニトリル中のジアミンpcTG2 3(100mg;0.16mmol)の懸濁液を40時間還流し、室温まで冷却し、次いで20mlのエ ーテルで希釈する。このようにして得られた懸濁液を濾過して、淡黄色の粉末を 得、これをエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させる。クロロホルム／メタノール 混合液からの再結晶の後、式Iの陽イオン脂質pcGT24(135mg;93%)が得られ、融点 は198℃である。 質量分析：計算値=651.2 Da；実測値=650.6 Da；C40H82I2N4O2についての分析 計算値：C，53.09%;H，9.13%;N，6.19%。実測値：C，53.1%;H，9.1%;N，6.2%。実施例3 式I（式中、R3、R4=エチレン鎖；R1、R2=メチル；m=p=1；R5=R6=(C8H17)2NC(= 0) ）で示される陽イオン脂質pcTG40の合成 2-ブロモ-N,N-ジオクチルアセトアミドの合成（Li，T.；Diederich，F．J．Or g．Chem．1992，57，3449-3454を参照）。 テトラヒドロフラン(2ml)中のブロモアセチルブロミド(0.69ml;7.94mmol)溶液 を、0℃で、テトラヒドロフラン(13ml)中のジオクチルアミン(2.00ml;6.62mmol) とジイソプロピルエチルアミン(1.73ml;9.93mmol)の混合液に添加する。混合液 を室温にて1時間攪拌し、次いでエーテル(25ml)で希釈し、10％塩酸水溶液(10ml )で洗浄する。 有機相を水洗し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、次いでシリ カゲルカラム上でのクロマトグラフィー（溶離液：85/15ヘキサン／エーテル） により精製して、褐色油状の2-ブロモ-N,N-ジオクチルアセトアミド(2.23g;93%) を得る。 陽イオン脂質pcTG40 アセトニトリル(2ml)中のN,N-ジメチル-1,4-ピペラジン(30mg;0.26mmol)およ び2-ブロモ-N,N-ジオクチルアセトアミド(200mg;0.55mmol)溶液を、16時間還流 する。この溶液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラム上でのクロマトグラ フィー（溶離液：95/5次いで90/10ジクロロメタン／メタノール）により精製し て、196-170℃の融点を有する陽イオン脂質pcTG40(166mg;76%)を得る。 質量分析：計算質量=672.2 Da；測定質量=678.8 Da。 実施例4 式I（式中、R1=R2=R3=R4=メチル；m=p=1；R5=R6=C(=O)-N(C8H17)2，(C8H17)-n -オクチル）で示される陽イオン脂質pcTG42の合成 陽イオン脂質pcTG40に関するものと同様の手法で、N,N,N',N'-テトラメチルエ チレンジアミン(75mg;0.64mmol)および2-ブロモ-N,N-ジオクチルアセトアミド(7 00mg;1.93mmol)を用いて開始し、ワックス状の陽イオン脂質pcTG42(498mg;92%) の製造が可能である。 質量分析：計算質量=681.2 Da；測定質量=681.0 Da。 実施例5 式I（式中、n1=n2=0、R3、R4はエチレン鎖、m=p=3、R5=R6=NH-(O=)C-C17H33） で示される陽イオン脂質pcTG30の合成 ジアミドpcTG23に関するものと同様の手法で、1-ヒドロキシベンゾトリアゾー ル(0.502g;3.72mmol)およびジシクロヘキシルカルボジイミド(1.10g;5.31mmol) の存在下で、1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン(0.355g;1.77mmol)および オレイン酸(1.00g;3.54mmol)を用いて開始し、79℃の融点を有するジアミドpcTG 30(1.09g;84%)の製造が可能である。 質量分析：計算質量=729.2 Da；測定質量=728.7 Da。 実施例6 式I（式中、R1=R2=メチル；R3，R4，エチレン鎖；m=p=3；R5=R6=HN-(O=)C-C17 H33）で示される陽イオン脂質pcTG38の合成 陽イオン脂質pcTG24に関するものと同様の手法で、アセトニトリル(4ml)中に 懸濁させたジアミドpcTG30(100mg;0.137mmol)およびヨウ化メチル(0.5ml;8.0mmo l)を用いて開始し、175-180℃の融点（分解）を有する陽イオン脂質pcTG38(135m g;97%)の製造が可能である。 質量分析：計算質量=759.3 Da；測定質量=759.0 Da。 実施例7 式I（式中、R1=R2=メチル；R3，R4，エチレン鎖；m=p=1；R5=(C14H29)2NC(O) ；R6=H）で示される陽イオン脂質pcTG51 a)アセトニトリル中のN,N'-ジメチル-1,4-ピペラジン溶液(0.13g;1.13mmol)を 、アセトニトリル(5ml)中の2-ブロモ-N,N-ジテトラデシルアセトアミド(0.30g;0 .56mmol)に徐々に加える。次いで、この反応混合液を室温で0.5時間、さらに40 ℃にて1時間攪拌する。アセトニトリルおよび過剰のN,N'-ジメチル-1,4-ピペラ ジンを減圧下で蒸発させる。 b)ヨードメタン(1ml)を、前記で得られた残りの液体のアセトニトリル(5ml)溶 液に加える。この混合液を4時間還流し、次いで冷却後、エーテル(2ml)を加える 。その後形成する白色沈殿を濾紙上で濾去し、次いでシリカゲルカラム上でのク ロマトグラフィー（溶離液：15/85メタノール／ジクロロメタン）により精製し て、白色個体状の陽イオン脂質pcTG51(0.41g;92%)を得る。 融点：168-170℃（分解）。 実施例8 式I（式中、R1=R2=R3=R4=メチル；m=p=1；R5=(C14H29)2NC(O)；R6=H）で示さ れる陽イオン脂質pcTG52 陽イオン脂質pcTG51に関するものと同様の手法で、N,N,N',N'-テトラメチルエ チレンジアミン(0.13g;1.13mmol)、2-ブロモ-N,N-ジテトラデシルアセトアミド( 0.30g;0.57mmol)およびヨードメタン(1ml)を用いて開始し、白色個体状の陽イオ ン脂質pcTG52(0.42g;94%)の製造が可能である。 融点：125-126℃（分解）。 実施例9 式I（式中、R1=R2=2-ヒドロキシエチルR3=R4=エチレン鎖；m=p=1；R5=(C14H29 )2NC(O)；R6=H）で示される陽イオン脂質pcTG53 アセトニトリル中の1,4-ビス(2-ヒドロキシエチル）ピペラジン(0.33g;1.88mm ol)および2-ブロモ-N,N-ジテトラデシルアセトアミド(0.50g;0.94mmol)溶液を室 温で1時間攪拌する。次いで、この混合液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル カラムのクロマトグラフィー（溶離液：10/90次いで15/85メタノール／ジクロロ メタン）にかけて一アルキル化生成物(0.67g)を得、これをアセトニトリル(5ml) 中に取り、ヨードメタン(1ml)の存在下で4時間還流する。このようにして得られ た懸濁液を、次いで放冷し、エーテルで希釈して濾過し、エーテルで洗浄し、真 空下で乾燥させて白色粉末を得る。シリカゲルカラム上でクロマトグラフィー（ 溶離液：15/85メタノール／ジクロロメタン）に付した後、白色個体状の陽イオ ン脂質pcTG53(0.59g;74%)を得る。 融点：156-158℃。 実施例10 式I（式中、R1=R2=メチル；R3=R4=エチレン鎖；m=p=1；R5=(C18H35)2NC(O);R6 =H ）で示される陽イオン脂質pcTG54 陽イオン脂質pcTG51に関するものと同様の手法で、N,N'-ジメチル-1,4-ピペラ ジン(66mg;0.58mmol)、2-ヨード-N,N-ジオレイルアセトアミド(200mg;0.29mmol) およびヨードメタン(0.5ml)を用いて開始し、黄色みを帯びた個体状の陽イオン 脂質pcTG54(254mg;93%)の製造が可能である。 融点：155-160℃（分解）。 実施例11 式I（式中、R1=R2=R4=メチル；m=p=1；R5=(C18H35)2NC(O)；R6=H）で示される 陽イオン脂質pcTG55 陽イオン脂質pcTG51に関するものと同様の手法で、N,N,N',N'-テトラメチルエ チレンジアミン(67mg;0.58mmol)、2-ヨード-N,N-ジオレイルアセトアミド(200mg ;0.29mmol)およびヨードメタン(0.5ml)を用いて開始し、黄色みを帯びたペース ト状の陽イオン脂質pcTG55(248mg;91%)の製造が可能である。 融点：125-126℃（分解）。 実施例12 R1=R2=2 メチル；R3=R4=エチレン鎖；m=p=1；R5=(C8H17)2NC(O)；R6=Hである陽 イオン脂質pcTG50 陽イオン脂質pcTG51に関するものと同様の手法で、N,N'ジメチル-1,4-ピペラ ジン(0.16g;1.38mmol)、2-ブロモ-N,N-ジオクチルアセトアミド(0.25g;0.69mmol )およびヨードメタン(0.5ml)を用いて開始し、白色個体状の陽イオン脂質pcTG50 (0.36g;85%)の製造が可能である。 融点=175℃（分解）。 pcTG50〜pcTG55の合成のための開始化合物は以下のように製造する： N,N- ジテトラデシル-p-トルエンスルホンアミド 炭酸カリウム(20.18g;146.00mmol)を、ジメチルホルムアミド(75ml)中のp-ト ルエンスルホンアミド(5.00g;29.20mmol)および1-ブロモ-テトラデカン(21.70ml ;73.00mmol)溶液に加える。この懸濁液を還流下で20時間攪拌し；次いで、反応 液を室温まで冷却し、エーテル(100ml)で希釈し、濾過する。濾過物を水(50ml) で洗浄し、水相をエーテル(100ml)で抽出する。合わせた有機相を硫 酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、白色固体を得、これを シリカゲルカラム上でのクロマトグラフィー（溶離液：40/60ジクロロメタン／ ヘキサン）により精製して、白色個体状のN,N-ジテトラデシル-p-トルエンスル ホンアミド(15.86g;96%)を得る。 融点=54℃。 ジテトラデシルアミン テトラヒドロフラン(2ml)中のN,N-ジテトラデシル-p-トルエンスルホンアミド 溶液(4.16g;7.38mmol)溶液を、0℃にてリチウムナフタレニド溶液[テトラヒドロ フラン(40ml)中のナフタレン(4.73g;36.88mmol)および金属リチウム(0.38g;55.3 5mmol)から室温で1時間にて調製]に加え、この反応混合液を室温で1時間攪拌す る。メタノール(2ml)を加え、続いて水(25ml)を加え、混合液をエーテル(2×25m l)で抽出する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し て白色固体を得、これをシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィー（溶離液： エーテル）により精製して、ジテトラデシルアミン(2.68g;89%)を得る。 2- ブロモ-N,N-ジテトラデシルアセトアミド 2-ブロモ-N,N-ジオクチルアセトアミドに関するものと同様の手法で、ブロモ アセチルブロミド(0.29ml;3.34mmol)およびジテトラデシルアミン(1.10g;2.78mm ol)を用いて開始し、黄色みを帯びた液体状の2-ブロモ-N,N-ジテトラデシルアセ トアミド(1.28g;87%)の製造が可能である。 オレイルブロミド 0℃にて激しく攪拌したアセトニトリル(15ml)中のオレイルアルコール(1.00g; 3.72mmol;Fluka，99%)およびテトラブロモメタン(1.61ml;4.84mmol)に、トリフ ェニルホスフィン(2.52g;9.62mmol)を少量ずつ加える。この不均一媒質を室温で 1時間攪拌する。次いで上清を丸底フラスコに移し、残りのペーストをエーテル( 10ml)でトリチュレートし、次いで濾過する。合わせた有機溶液を減圧下で濃縮 して無色の油状物質を得、これをシリカゲルカラムのクロマトグラフィー（溶離 液：ヘキサン）により精製して、無色の油状のオレイルブロミド(1.21g;98%)を 得る。 N,N- ジオレイル-p-トルエンスルホンアミド N,N-ジテトラデシル-p-トルエンスルホンアミドに関するものと同様の手法で 、オレイルブロミド(1.20g;3.62mmol)、p-トルエンスルホンアミド(0.28g;1.65m mol)および炭酸カリウム(1.14g;8.25mmol)を用いて開始し、N,N-ジオレ イル-p-トルエンスルホンアミド(0.83g;87%)の製造が可能である。 ジオレイルアミン ジテトラデシルアミンに関するものと同様の手法で、N,N-ジオレイル-p-トル エンスルホンアミド(1.00g;1.49mmol)、ナフタレン(0.95g;7.44mmol)および金属 リチウム(0.08g;11.18mmol)を用いて開始し、黄色みを帯びた油状のジオレイル アミン(0.55g;71%)の製造が可能である。 2- ブロモ-N,N-ジオレイルアセトアミド 2-ブロモ-N,N-ジオクチルアセトアミドに関するものと同様の手法で、ブロモ アセチルブロミド(0.17ml;1.89mmol)およびジオレイルアミン(0.82g;1.58mmol) を用いて開始し、黄色みを帯びた液体状の2-ブロモ-N,N-ジオレイルアセトアミ ド(0.83g;82%)の製造が可能である。 2- ヨード-N,N-ジオレイルアセトアミド アセトン中の2-ブロモ-N,N-ジオレイルアセトアミド(0.81g;1.27mmol)および ヨウ化ナトリウム(0.76g;5.08mmol)溶液を一晩還流する。ヘキサン(10ml)を加え 、沈殿物を濾去し、濾液を減圧下で蒸発させた後、黄色みを帯びた液体状の2-ヨ ード-N,N-ジオレイルアセトアミド(0.87g;100%)を得る。 エタノール中の懸濁液による脂質-ＤＮＡ複合体の調製 1.+/- 電荷比=10の所望によりDOPEを含む脂質pcTG24-ＤＮＡ複合体の調製 脂質の量は、最終ＤＮＡ濃度(in vitro試験に関しては0.1mg/ml)、所望の電荷 比、脂質のモル質量、選択された陽イオン脂質の正電荷数および所望の最終容量 を基にして計算する。例としては、陽イオン脂質により与えられる正電荷と最終 ＤＮＡ濃度0.1mg/mlのＤＮＡにより与えられる負電荷の電荷比が10であるpcTG24 ／DOPEおよびプラスミドＤＮＡの複合体0.5mlを得るために、以下の計算式に従 って種々の成分を混合する： ＤＮＡ0.1mg/ml、すなわち1ml当たり(0.1/330)mmolの負電荷(330 Daはヌクレオ チドの平均分子量)は、0.30μｍｏｌ/mlの負電荷または0.5ml当たり0.15μｍｏ ｌの負電荷に相当する。10倍の正電荷を得るためには、陽イオン脂質により与え られる3.0μｍｏｌ/mlの正電荷密度(0.5ml当たり1.5μｍｏｌ)が必要である。ヨ ウ化物塩の形態のpcTG24のモル質量は905g/molであり、この分子は2個の正電荷 を含んでいる。 かくして、0.75μｍｏｌ/mlのpcTG24が必要であり、これは0.68mg/mlに相当す る。少し余分を得るために、1.0μｍｏｌ(0.9mg)のpcTG24を用いて懸濁液を調製 する。 等モル濃度のL-α-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE，744g/m ol，Sigma;PO510)を得るために、脂質調製物中0.74mg/mlのこの物質が必要であ る。その他の化合物の量および濃度は、それぞれのモル質量および正電荷数によ り調整する。 脂質は、クロロホルム／メタノール(v:v)溶液を用いて混合する。2mM濃度の陽 イオン脂質（脂質総量4mM）を得るために、陽イオン脂質を計量し、アルコール およびUVにて滅菌したガラス試験管中で10または20mg/mlクロロホルム溶液を用 いてこのDOPE量を加える。1分間あたり40回転する攪拌器(Labconco，Rapidvap， Uniequip，Martinsried，Germany)を用いて45℃にて真空下(0.2×105Pa(200バー ル))で45分間、溶媒を蒸発させる。陽イオン脂質濃度が50mg/mlとなるように、 この脂質被膜を18μｌのエタノール中に取る。 最終5mg/mlの陽イオン脂質を含有する溶液を調製するために、最後にこの溶液 を162μｌの20mM HEPES pH7.5（Na0Hで調整）を加える。 プラスミドＤＮＡは、1mg/mlを含有する保存液(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5) を用いて調製する。 最終的に0.5mlの溶液を得るために、50μｌの保存液(50μｇＤＮＡ)を取り、 これに315μｌの20mM HEPES pH7.5を加える。 ＤＮＡを脂質調製物と複合化するために、脂質をこのＤＮＡに加える。この懸 濁液を10回の吸引／排出により混合する。この複合体を+4℃にて保存する。 0.1mg/mlのＤＮＡを含有し、かつ、電荷比が10の複合体0.5mlを得るためには 、137μｌのpcTG24/DOPEを363μｌのDNA溶液に加える。 この複合体は層流通風室(laminar-flow fume cupboard)下で調製する。その他 の工程の間も、いかなる汚染も避けるべきである。 2.+/- 電荷比=10の所望によりDOPEを含む脂質pcTG42-ＤＮＡ複合体の調製 脂質の量は、最終ＤＮＡ濃度(in vitro試験に関しては0.1mg/ml)、所望の電荷 比、脂質のモル質量、選択された陽イオン脂質の正電荷数および所望の最終容量 (0.5ml)を基にして計算した。例としては、陽イオン脂質により与えられる正電 荷と最終ＤＮＡ濃度0.1mg/mlのＤＮＡにより与えられる負電荷の電荷比が10であ るpcTG42／DOPEおよびプラスミドＤＮＡの複合体0.5mlを得るための計算は以下 の通りである： ＤＮＡ0.1mg/ml、すなわち1mlあたり(0.1/330)mmolの負電荷(330 Daはヌクレオ チドの平均分子量)は0.30μｍｏｌ/mlの負電荷または0.5ml当たり0.15μｍｏｌ の負電荷に相当する。10倍の正電荷を得るためには、陽イオン脂質により与えら れる3.0μｍｏｌ/mlの正電荷密度(0.5ml当たり1.5μｍｏｌ)が必要である。臭化 物塩の形態のpcTG42のモル質量は841g/molであり、この分子は2個の正電荷を含 んでいる。かくして、0.75μｍｏｌ/mlのpcTG42が必要であり、これは0.63mg/ml に相当する。少し余分を得るために、1.0μｍｏｌ(0.84mg)のpcTG42を用いて懸 濁液を調製する。 等モル濃度のDOPE(744g/mol，Sigma;PO510)は、脂質調製物中0.74mgに相当す る。 脂質は、上記のように混合する。陽イオン脂質濃度を50mg/mlに調整するため に、この脂質被膜を17μｌのエタノール中に取る。 最終5mg/mlの陽イオン脂質を含有する溶液を調製するために、最後にこの溶液 に153μｌの20mM HEPES pH7.5を加える。 1mg/mlを含有する保存液(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5)50μｌに相当する50μ ｇのプラスミドＤＮＡを322μｌの20mM HEPES pH7.5に希釈する。 0.1mg/mlのＤＮＡを含有し、かつ、電荷比が10である複合体0.5mlを得るため には、128μｌのpcTG42／DOPEを372μｌのＤＮＡ溶液に加える。この懸濁液をピ ペットを用いて吸引／排出(10回)を行い混合する。この複合体は+4℃にて保存す る。洗剤溶液に懸濁させることによる脂質-ＤＮＡ複合体の調製 最終0.5mlについての脂質量は、前記したように最終ＤＮＡ濃度(in vitro試験 に関しては0.1mg/ml)、所望の電荷比、陽イオン脂質のモル質量、選択された陽 イオン脂質の正電荷数を基にして計算する。陽イオン脂質の2mM溶液を得るため に、アルコールおよびUVを用いて滅菌したガラス製試験管中で脂質を混合する（ 前記を参照）。溶媒を蒸発させ、脂質被膜を陽イオン脂質／洗剤比が1/5(mol:mo l)でn-オクチル-β-D-グルコピラノシド(オクチルグルコシド，Sigma，0 9882) 溶液中に取る。 例えば、pcTG24またはpcTG42／DOPE１μｍｏｌにつき、20mM HEPES pH7.5中の オクチルグルコシド20mM溶液から250μｌを取りり、これに脂質混合物の被膜を 取る。1mg/mlを含有する保存液(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5)の50μlに相当す る50μgのプラスミドＤＮＡを取り、212.5μｌの20mM HEPES pH7.5に加える。0. 1mg/mlのＤＮＡを含有し、かつ、+/-電荷比10の最終懸濁液を得るためには、187 .5μｌの脂質懸濁液を、ピペットを用いて10回吸引および排出を行うことにより ＤＮＡに加える。洗剤を除去するために、透析マイクロバッグ(13.2kDのカット- オフ；Sartorius，Gottingen，Germany)中、室温にて20mM HEPES pH7.5に対して 4時間の透析を3回行う。透析されたＤＮＡ／脂質複合体は+4℃にて保存する。調 製は層流通風室中にて行う。 超音波処理-押出による脂質-ＤＮＡ複合体の調製 最終0.5mlについての脂質量は、前記したように最終ＤＮＡ濃度(in vitro試験 に関しては0.1mg/ml)、所望の電荷比、陽イオン脂質のモル質量、選択された陽 イオン脂質の正電荷数を基にして計算する。前記したように、2mMの陽イオン脂 質溶液を得るために、アルコールおよびUVを用いて滅菌したガラス製試験管中で 脂質を混合する。溶媒を蒸発させ、脂質被膜を4℃にて約16時間、600μｌの20mM HEPES pH7.5中に取る。この懸濁液を、視覚的に均質になるまで超音波処理槽 (Bransonic 221)中で超音波処理を施す。この脂質懸濁液を最大圧力50×105Pa(5 0バール)にて孔径0.2μｍの2枚の膜(Nucleopore，Costar，Cambridge，MA，USA) を通して押し出し、20mM HEPES pH7.5にて洗浄する（Lipex Biomembranes，Vanc ouver，Canada製の押出器）。この脂質懸濁液を室温にて1時間放置する。450μ ｌの脂質懸濁液を50μｌのプラスミドＤＮＡ保存液(1mg/ml)に加え、ピペットを 用いて吸引／排出を10回行うことにより混合する。この脂質／ＤＮＡ複合体は+4 ℃にて保存する。調製は層流通風室中にて行う。 脂質によるＤＮＡの複合体形成を評価するのためのプロトコール 1%(w:v)アガロースゲルをTAE緩衝液(TAE：Tris 4.86g/l+酢酸ナトリウム0.68g /l+EDTA 0.336g/l pH7.8）中で調製する。必要であれば、サンプルをTAEで希釈 し、次いでサンプル緩衝液（0.083%ブロモフェノールブルー、0.083%シアノール キシレンFF、10%グリセロール水溶液）を加えＤＮＡ50ng/μｌとする。便宜には このサンプルを攪拌し、室温にて30分間放置する。対照として、同濃度で調製し た非複合プラスミドを使用する。10μｌ(ＤＮＡ500ng)をゲル上に置き、60mVに て3時間、泳動を行う。このゲルを0.006%(v:v)の臭化エチジウムを10mg/ml含有 するTAE中で少なくとも30分間進展させる。次いで、ゲルをTAE中で洗浄し、UV下 で解析する。 準弾性光散乱による粒子サイズ測定のプロトコール 分析は20分のサンプルの平衡化の後、Coulter N4Plus(Coultronics France S. A.，Margency，France)で25℃にて行う。サンプルのアリコートはピペットで採 取する前に数回吸引・排出する。サンプルを計量タンク内で希釈し、ホモジナイ ズする。90℃にて分散した光の測定を、180秒待機の後、180秒間行う。使用レン ジは31個の瓶を用い3nm〜10000nmである。確実であるためには、サンプルは5000 0〜1000000数／秒の間で与えるべきである。物理化学的特性 3種類の処方「エタノールの注入」、「洗剤の透析」および「超音波処理／抽 出」を、約10または5の電荷比で等モル量のDOPEを伴い、または伴わずに本発明 の陽イオン脂質に適用する。ＤＮＡが完全に複合体を形成し（アガロースゲルで 移動しない）、かつ、その複合体が準弾性光散乱により測定された、in vivo投 与を可能とする粒子径を有している場合、その処方が再現性ある研究のための選 択に適しているとみなされる。 一般に、試験した総てのＤＮＡ／脂質複合体（pcTG24、pcTG42、pcTG52、pcTG 54またはpcTG55に基づく）がDOPEの存在または不在下でＤＮＡと完全に複合体を 形成する。 さらに、エタノール中に懸濁させることによる処方は、in vivo投与の目的に 特に適した小型の複合体（500nm未満）を製造するのに有利であることが判明し 、試験した総ての脂質でそうである。 例としては、約200nm以下の直径を有する複合体は下記の場合： 電荷比R=5のＤＮＡ／pcTG24／DOPE 電荷比R=10のＤＮＡ／pcTG42／DOPE 電荷比R=10または5のＤＮＡ／pcTG42／DOPE 電荷比R=5または10のＤＮＡ／pcTG52／DOPE 電荷比R=5または10のＤＮＡ／pcTG54／DOPE 電荷比R=10のＤＮＡ／pcTG55／DOPE で得られる。 種々の処方により調製されるpcTG42脂質に基づく複合体を評価した。200nm未 満または200nm付近のサイズの複合体は、n-オクチル-β-D-グルコピラノシドお よび超音波処理により得られた、電荷比R=10のＤＮＡ／pcTG42／DOPE溶液中に懸 濁させることにより調製された電荷比R=10のＤＮＡ／pcTG42組成物に関して得ら れる。 サテライト細胞のin vitroトランスフェクション リポータープラスミドpTG11033を用いて本発明の化合物のトランスフェクショ ン能力を評価する。それにはルシフェラーゼ遺伝子の発現を指示するCMVプロモ ーターが含まれている。 イヌ筋肉およびヒト筋肉の培養は、10%ウシ胎児血清(FCS，Hyclone，Logan，U T)、10μｇ/mlのインスリン(Sigma)、10ng/mlのEGF(Sigma)および塩基性FGF(Pep ro Tech Inc.，Rocky Hill，NJ)、2mMのグルタミン(bioMerieux)および40μｇ/m lのゲンタマイシン(Schering Plough)を補足したHamF 14培地(Life Tedmo1ogies )にて行う。 細胞は、トランスフェクション24〜48時間前、約30%密度、ウェル当たり5ｘ103 〜104細胞の割合で、96ウェル細胞ディッシュ中へ接種し、5%CO2および95%空気 を含有する大気下で37℃に維持する。 イオン電荷比およびウェル当たりの至適ＤＮＡ濃度を決定するため、種々の濃 度の脂質およびプラスミドＤＮＡの混合物でトランスフェクションを行う。 使用する複合体はトランスフェクションの24〜48時間前に調製し、10%FCSの存 在または不在下、40μｇ/mlのゲンタマイシンおよび2mMのグルタミンを含有する HamF 14培地に希釈する。 培養培地の除去後、100μｌのトランスフェクション混合物を各々のウェルに 移す。 37℃にて4時間後、総てのトランスフェクション培地を10% FCSまたは(FCS+血 清)、10μｇ/mlのインスリン(Sigma)、10ng/mlずつのEGF(Sigma)および塩基性FG F(Pepro Tech Inc.，Rocky Hil1，NJ)、2mMのグルタミン(BioMerieux)および40 μｇ/mlのゲンタマイシン(Schering Plough)、最終容量250μｌに調整する。こ の培養物を48時間インキュベーションし、次いで回復させ、それらのルシフェラ ーゼ 遺伝子発現能について試験する。 A549 細胞のトランスフェクション トランスフェクション開始の24時間前、A549細胞（ヒト肺癌由来の上皮細胞） を、37℃、5%CO2/95%空気の加湿大気下、96ウェルプレートで(ウェル当たり2ｘ1 04細胞)、10%ウシ胎児血清(Gibco BRL)を含有するダルベッコの改変イーグル培 地(Dulbecco's modified Fagle's medium)(DMEM)中で培養する。血清不在下にお けるトランスフェクションに関しては、培地を除去して血清フリー培地に置換す る。別のマイクロプレートで、下記の脂質／ＤＮＡ複合体の懸濁液を調製する(0 .1mg/mlのＤＮＡおよび示された電荷比の脂質／ＤＮＡ複合体）：第一の3つのウ ェルに44μｌ(4.4μｇＤＮＡ)、22μｌ(2.2μｇＤＮＡ)、5.5μｌ(0.55μｇＤＮ Ａ)の保存液、さらに次のウェルに11μｌ(0.11μｇＤＮＡ)の10倍希釈保存液。D MEMで容量を110μｌに調整し、100μｌをA549細胞上へ移す。ウェル当たり4、2 、0.5および0.1μｌのＤＮＡとともに4時間インキュベーションを行う。トラン スフェクション開始の4時間後、50μｌのDMEMおよび30%ウシ胎児血清を加える。 最後に、トランスフェクション開始の24時間後、100μｌのDMEMおよび10% FCSを 加える。10%ウシ胎児血清の存在下でのトランスフェクションは、血清を含む培 地でトランスフェクションが起こることを除いては、同じ方法で行う。 トランスフェクションの分析 トランスフェクションの48時間後、培地を除去し、細胞を100μｌのPBSリン酸 溶液で洗浄し、50μｌの溶解緩衝液(Promega)で溶解させる。この溶解物はルシ フェラーゼ活性が測定されるまで-80℃で凍結させる。ルシフェラーゼ活性の測 定は、「ルシフェラーゼ」測定システム(Promega)(LB96P Berthold luminometer )を用い、96ウェルプレート中、運動モードにて、1分につき20μｌ混合液にて行 う。トランスフェクション試験の結果 DOPEの存在または不在下で、pcTG24およびpvTG42に基づく製剤を、A549細胞お よびイヌ肺サテライト細胞を用いるin vitroトランスフェクションにて評価する 。ウェル当たりの相対光単位(relative light units)(RLU)を、ウェル当たりの ＤＮＡ量(4、2、0.5および0.1μｇ)および実験条件を（血清の存在または不在下 でのトランスフェクション）変えることにより評価する。 A549肺細胞のpTG11033/pcTG24複合体でのトランスフェクションは、特に低濃 度のＤＮＡ(0.1μｇ)で、また血清の不在下で、ルシフェラーゼ遺伝子の高レベ ルの発現を可能にする。製剤中のDOPEの存在はトランスフェクション活性を増強 し、複合体中のＤＮＡ量を増し(0.1〜0.5μｇ)、かつ、トランスフェクション中 に取り込まれる血清の量を増す。 同様に、pTG11033/pcTG42複合体はA549細胞をトランスフェクトすることがで きる。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は低濃度のＤＮＡ(0.1μｇ)で最も高い。ト ランスフェクションの実験条件（血清の有無）による有意な差はほとんど、もし くは全く認められない。トランスフェクション能力は、その製剤がDOPEを含む場 合に増強される。この効果は、トランスフェクションが血清の存在下で行われる 場合に、よりいっそう有益である。 さらに特にＤＮＡ/pcTG42/DOPE複合体は筋肉細胞をトランスフェクトするのに 適している。高レベルのルシフェラーゼ発現は、低ＤＮＡ濃度(0.1μｇ)で得ら れる。 実施例13：ピペラジンまたはホモピペラジン単位の中心にある陽イオン脂質シ スおよびトランス異性体の製造 ジアミドANI 181 THFとアセトニトリルの混合液(1/1;v/v;5ml)中の2-ブロモ-N,N-ジオクチル アセトアミド(1.05g;2.90mmol)溶液を、アセトニトリル(20ml)中のピペラジン(0 .125g;1.45mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(0.187g;2.90mmol)溶液に徐 々に加える。この黄色みを帯びた不均一な混合液を0℃にて4時間攪拌し、次いで エーテルで希釈し、飽和炭酸ナトリウム水溶液で洗浄する。有機相を硫酸ナトリ ウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、シリカゲルカラム上でのクロマトグラフィ ー（溶離液：5/95メタノール／ジクロロメタン）により精製して、無色油状のジ アミンANI 181(0.852g;91%)を得る。 ジアミドANII 21 ジアミドANI 181に関するものと同様の手法で、ジイソプロピルエチルアミン( 232mg;1.79mmol)の存在下、2-ブロモ-N,N-ジオクチルアセトアミド(650mg;1.79m mol)およびホモピペラジン(90mg;0.89mmol)を用いて開始し、無色油状のジアミ ドANII 21(545mg;92％%の製造が可能である。 オレイル2-ブロモアセテート テトラヒドロフラン(12ml)中のブロモアセチルブロミド(0.49ml;5.65mmol) を、0℃にてテトラヒドロフラン(38ml)中のオレイルアルコール(1.00ml;3.77mmo l)およびジイソプロピルエチルアミン(0.88g;5.65mmol)の混合液に加える。この 混合液を0℃にて2時間、次いで室温にて1時間攪拌し；その後、これを1N塩酸溶 液(20ml)で洗浄し、エーテル(50ml)で抽出する。合わせた有機相を飽和炭酸ナト リウム溶液(20ml)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、次 いでシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィー（溶離液:99/1ヘキサン／エー テル）により精製して、無色油状のオレイル2-ブロモアセテート(1.31g;89％)を 得る。 異性体陽イオン脂質ANII 16 F1およびANII 16 F2 アセトニトリル(5ml)中のジアミドANI 181(316ml;0.49mmol)溶液にヨードメタ ン(1ml)を加え、混合液を4時間還流する。冷却後、この溶液を減圧下で濃縮し、 黄色みを帯びた粗反応生成物をシリカカラムのクロマトグラフィー（溶離液：60 /35/5エーテル／ジクロロメタン／メタノール）により精製して、２種の異性体 陽イオン脂質ANII 16 F1(142mg;31%)およびANII 16 F2(245mg;54%)を得る。 ANII 16 F1:融点=148℃。 ANII 16 F2:融点=143℃。 異性体陽イオン脂質ANII 22 F1およびANII 22 F2 陽イオン脂質ANII 16に関するものと同様の手法で、ジアミドANII 21(400mg;0 .603mmol)およびヨードメタン(1ml)を用いて開始し、陽イオン脂質ANII 22 F1(1 68mg;29%)およびANII 22 F2(255mg;45%)の製造が可能である。 ANII 22 F1:融点=144-145℃。 ANII 22 F2:融点=122-124℃。 異性体陽イオン脂質ANII 39 F1およびANII 39 F2 アセトニトリル(5ml)中のN,N'-ジメチル-1,4-ピペラジン(26mg;0.226mmol)お よびオレイル2-ブロモアセテート(220mg;0.565mmol)溶液を16時間還流する。こ の溶液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィー（ 溶離液：40/45/15、次いで40/.40/20エチルアセテート／ジクロロメタン／メ タノール）により精製して、2種の異性体陽イオン脂質ANII 39 F1(75mg;37%)お よびANII 39 F2(40mg;20%)を得る。 ANII 39 F1:融点=173-175℃。 ANII 39 F2:融点=163-165℃。 ジアミドANII 151 ジアミドANI1 81に関するものと同様の手法で、ジイソプロピルエチルアミン( 60mg;0.47mmol)の存在下、2-ブロモ-N,N-ジ(テトラデシル)アセトアミド(310mg; 0.584mmol)およびホモピペラジン(23mg;0.23mmol)を用いて開始し、無色油状の ジアミドANII 151(197mg;84%)の製造力何能である。 異性体陽イオン脂質ANII 152 F1およびANII 152 F2 陽イオン脂質ANII 16に関するものと同様の手法で、ジアミドANII 151(150mg; 0.150mmol)およびヨードメタン(1ml)を用いて開始し、陽イオン脂質ANII 152 F1 (58mg;30%)およびANII 152 F2(84mg;44%)の製造が可能である。 ANII 152 F1:融点=130℃。 ANII 152 F2:融点=118℃。 異性体陽イオン脂質ANII 150 F1およびANII 150 F2 陽イオン脂質ANII 39に関するものと同様の手法で、2-ブロモ-N,N-ジ(テトラ デシル)アセトアミド(220mg;0.415mmol)およびN,N'-ジメチル-1,4-ピペラジン(1 9mg;0.17mmol)を用いて開始し、陽イオン脂質ANII 150 F1(61mg;31%)およびANII 150 F2(37mg;19%)の製造が可能である。 ANII 150 F1:融点=111℃。 ANII 150 F2:融点=110-102℃。 異性体陽イオン脂質ANII 157 F1およびANII 157 F2 陽イオン脂質ANII 39に関するものと同様の手法で、2-ブロモ-N,N-ジオレイル アセトアミド(136mg;0.211mmol)およびN,N'-ジメチル-1,4-ピペラジン(16mg;0.1 4mmol)を用いて開始し、陽イオン脂質ANII 157 F1(65mg;33%)およびANII 157 F2 (22mg;11%)の製造力何能である。 ANII 157 F1: ANII 157 F2: 実施例14 新規な脂質複合体の分析 1. 溶媒との混合によるＤＮＡ／陽イオン脂質複合体の処方 各陽イオン脂質の必要量を測定し、CHCl3/MeOH混合物(v/v:1/1)に溶解させる 。必要であれば、等モル量のDOPE(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)をエバ ポレーション(Labconco Rapidvap Model 79000;UniEquip)を用い、真空下、45℃ 、40rpm、45分間で付加する。得られた脂質被膜をエタノール／DMSO混合物(v/v: 1/1)中に再溶解させ、50mg/mlの全脂質濃度を得る。次いで、この脂質懸濁液を 直ちに20mM HEPES，pH7.5と混合し、最終脂質濃度を5mg/mlとする。この複合体 組成物を、TE(10mM TRIS、1mM EDTA、pH7.5)中に1mg/mlで調製したものである精 製プラスミドＤＮＡとともに、20mM HEPES、pH7.5で希釈して所望の濃度とし、 前記の脂質懸濁液を添加して所望の電荷比を有する0.1mg/mlのＤＮＡ濃度にする 。さらに、小型の複合体を得、しかも沈殿の問題を回避するためには、ピペット を用いて吸引／排出することにより素速く化合物を混合することが重要である。 これら総ての製剤は使用まで4℃で保存する。 2. 洗剤および透析を用いた混合によるＤＮＡ／陽イオン脂質複合体の処方 脂質量を計算し、0.1mgのＤＮＡ/mlを含有し、所望の電荷比を有するＤＮＡ／ 脂質複合体を得る。この脂質溶液(2mM)を乾燥させた後、脂質被膜を5/1の洗剤／ 脂質重量比で、20mM n-オクチル-β-D-グルコピラノシドを含有する20mM pH7.5 HEPES溶液中に取る。プラスミド溶液は1mg/mlの保存液を用いて調製する。素速 くピペット操作を繰り返すことによりこのＤＮＡに脂質懸濁液を加え、0.1m/ml の核酸濃度と電荷比10を得る。洗剤は、20mM HEPES[sic]、pH7.5に対する3〜4時 間の透析によって除去する（カット-オフ：13kD；Sartorius）。 3. ＤＮＡ／脂質複合体でのin vitroトランスフェクション 標準条件に従い、マイクロ滴定プレートで24時間、A549細胞を培養する。複合 体は前記の方法の１つに従って調製する。一連の複合体希釈カスケード（複合体 プラスミド2〜0.01μｇ）を調製する。これらの希釈物を培養細胞に加える(225 μｌ)。所望により、インキュベーション開始から4時間後に25μｌのウシ胎児血 清を加える。 48時間後にトランスフェクションを終了させる。培養培地を100μｌのPBSを用 いて除去し、次いで50%l[sic]の溶解緩衝液(Promega)で溶解させる。ルシフェラ ーゼ活性の測定時まで、この溶解細胞を-80℃で保存する。ルシフェラーゼ活性 は、Berthold LB96Pルミノメーターを用い、20μｌアリコートについて測定する 。RLUにおいて、測定された活性を発現したルシフェラーゼをfgで表した量と相 関させるために、平衡して較正標準レンジを準備する。タンパク質の測定は、供 給者(Pierce)により提供されるBCA標準法に従い行う。 4. 結果 図1〜14は、脂質(pcTG51〜pcTG54、pcTG57〜pcTG60)を含有する複合体を用い てのin vitroトランスフェクション後に観察された結果を示す。DOPEの存在また は不在下、0.8〜10の範囲の電荷比に対して、ＤＮＡ量はウェル当たり0.5〜0.01 μｇの範囲にわたる（図を参照）。 pcTG51は、その疎水部分が2xC14であり、かつ二重結合を持たない、2個の正電 荷を含有するジアミノ環式脂質であり； pcTG52は、その疎水部分が2xC14であり、かつ二重結合を持たない、2個の正電 荷を含有するジアミノ環式脂質であり； pcTG53は、その疎水部分が2xC14であり、かつ二重結合を持たない、2個の正電 荷を含有するジアミノ環式脂質であり；この化合物はそれをより親水性にするヒ ドロキシル基を含み； pcTG54は、その疎水部分が2xC16であり、かつ二重結合を持たない、2個の正電 荷を含有するジアミノ環式脂質であり； pcTG51〜pcTG54の合成については前記実施例を参照； pcTG57は、その疎水部分が4xC8であり、かつ二重結合を持たない、2個の正電 荷を含有するジアミノ環式脂質であり； pcTG58は、その疎水部分が4xC8であり、かつ二重結合を持たない、2個の正電 荷を含有するジアミノ環式脂質であり； pcTG57とpcTg58は互いに異性体であり（記載を参照）； pcTG59は、その疎水部分が4xC8であり、かつ二重結合を持たない、2個の正電 荷を含有するジアミノ環式脂質であり； pcTG60は、その疎水部分が4xC8であり、かつ二重結合を持たない、2個の正電 荷を含有するジアミノ環式脂質であり； pcTG59とpcTg60は互いに異性体である（記載を参照）。 1または2に記載の方法に従い調製した脂質を用いて得られた結果は同様である 。 図1〜14に提供された結果からの結論は以下の通り： −pcTG51を含有する複合体（図1および2）：DOPEの存在は、特に血清の存在下 で、トランスフェクション能力を著しく向上させる。1.25未満の電荷比はトラン スフェクションに好ましくない。 −pcTG52を含有する複合体（図3および4）：DOPEの存在に関しては同様の記載 ができる。ここではやはり、DOPEの存在下、電荷比0.8に対して、適切なトラン スフェクション能力が観察される。 −pcTG53を含有する複合体（図5および6）：この脂質については、得られるト ランスフェクション能力の点で電荷比の選択がより決定的に重要であることが明 らかである。DOPEの添加は血清の阻害効果の中和を可能にする。 −pcTG54を含有する複合体（図7および8）：対応する複合体の処方へのDOPEの 添加は、得られた結果を比較した場合、決定的な役割を果たしているとは考えら れない。 −pcTG57を含有する複合体（図9）：DOPEの存在はトランスフェクション能力 を向上させ；血清はこの能力に全く影響を及ぼさない。 −pcTG58を含有する複合体（図10）：DOPEはトランスフェクションにおける血 清の阻害効果の中和を可能にする。 −pcTG59を含有する複合体（図11および12）：またはpcTG60を含有する複合体 （図13および14）：血清の存在または不在下で、DOPEの存在はかかる脂質を含有 する複合体のトランスフェクション能力を著しく向上させる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 標的細胞に物質を導入するために使用できる、少なくとも１種の脂質と 、少なくとも１種の治療上有効な物質とを含んでなる複合体であって、脂質が式 I： ｛式中： n1およびn2は同一であっても異なっていてもよく、0および1から選択される整 数であり、 R1およびR2は同一であっても異なっていてもよく： a)水素原子および、所望により互いに独立してヒドロキシル基で置換されてい てもよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択されるか、ま たは b)特定の場合では、n1=n2=1であるとき、R1およびR2が一緒になって2〜3個の 炭素原子を有する(C2-C3)二価のアルキレン鎖を形成することができ、 R3およびR4は同一であっても異なっていてもよく、1〜6個の炭素原子を有する アルキル基であるか、または一緒になって2〜3個の炭素原子(C2-C3)を有する二 価のアルキレン鎖を形成することができ、 mおよびpは同一であっても異なっていてもよく、1〜10の整数であり、 R5およびR6は同一であっても異なっていてもよく、式： 1)R7C(=O)-X- （式中、 X=NH、OまたはS R7は直鎖または分枝した、6〜23個の炭素原子(C6-C23)を有するアルキルまた はアルキレン基である） 2)R8R9NC(=O)- （式中、R8およびR9は同一であっても異なっていてもよく、水素原子、もしくは 直鎖または分枝した、6〜23個の炭素原子を有するアルキルまたはアルキレン基 からなる群より選択される（ただし、R8およびR9は同時に水素原子であることは ない）、および 3)基R5およびR6のうち１個が水素原子であることも可能である で示される基からなる群より選択される｝ で示されることを特徴とする複合体。 ２． 脂質が式VII： ｛式中： n1およびn2は同一であっても異なっていてもよく、0および1から選択される整 数であり、 R1およびR2は同一であっても異なっていてもよく； a)水素原子および、所望により互いに独立してヒドロキシル基で置換されてい てもよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択され、 b)特定の場合では、n1=n2=1であるとき、R1およびR2が一緒になって2〜3個の 炭素原子(C2-C3)を有する二価のアルキレン鎖を形成することができ、 R3およびR4は同一であっても異なっていてもよく、1〜6個の炭素原子を有する アルキル基であるか、または一緒になって2〜3個の炭素原子(C2-C3)を有する二 価のアルキレン鎖を形成することができ、 mおよびpは同一であっても異なっていてもよく、1〜10の整数であり、 R8およびR9は同一であっても異なっていてもよく、水素原子、もしくは直鎖ま たは分枝した、6〜23個の炭素原子を有するアルキルまたはアルキレン基からな る群より選択される（R8およびR9が同時に水素原子であることはない）、かつ 分子の各末端の基NR8R9が異なっていてもよい｝ で示される脂質である、請求項１記載の複合体。 ３． 脂質が式II： ｛式中： n1およびn2は同一であっても異なっていてもよく、0および1の整数から選択さ れ、 R1およびR2は同一であっても異なっていてもよく、水素原子および、所望によ り互いに独立してヒドロキシル基で置換されていてもよい1〜6個の炭素原子を有 するアルキル基からなる群より選択され、特定の場合では、n1=n2=1であるとき 、R1およびR2が一緒になって2〜3個の炭素原子を有する二価のアルキレン鎖を形 成することができ、 mおよびpは同一であっても異なっていてもよく、1〜10の整数であり、 R7は同一であっても異なっていてもよく、直鎖または分枝した6〜23個の炭素 原子を有するアルキルまたはアルキレン基である｝ で示される脂質である、請求項１記載の化合物。 ４． ・R1および／またはR2、もしくは ・R3および／またはR4 がメチル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。 ５． ・R1およびR2、および／または ・R3およびR4 が一緒になってエチレン鎖を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複 合体。 ６．・R1およびR2、および／または ・R3およびR4 が一緒になってプロピレン鎖を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の 複合体。 ７． mおよび／またはpが1〜6の間の整数である、請求項１〜６のいずれか１ 項に記載の複合体。 ８． 基R7C(=O)が同一であっても異なっていてもよく、13〜18個の炭素原子 を有する基、特に、オレオイル、ステロイル、パルミトイルまたはミリストイル 基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。 ９． 脂質が下記式の化合物からなる群より選択される、請求項３〜８のいず れか１項に記載の複合体。 １０． R8およびR9が6〜23個の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニル 基から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。 １１． 下記式で示される化合物からなる群より選択される、請求項１、３ま たは１０のいずれか１項に記載の複合体。 １２． 脂質が式X：｛式中： n1およびn2は同一であっても異なっていてもよく、0および1から選択される整 数であり、 R1およびR2は同一であっても異なっていてもよく： a)水素原子および、所望により互いに独立してヒドロキシル基で置換されてい てもよい1〜6個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より選択されるか、ま たは b)特定の場合では、n1=n2=1であるとき、R1およびR2が-緒になって2〜3個の炭 素原子を有する(C2-C3)二価のアルキレン鎖を形成することができ、 mおよびpは同一であっても異なっていてもよく、1〜10の整数であり、 R8およびR9は同一であっても異なっていてもよく、水素原子、もしくは直鎖ま たは分枝した、6〜23個の炭素原子を有するアルキルまたはアルキレン基からな る群より選択され（ただし、R8およびR9は同時に水素原子であることはない）｝ で示される、請求項１記載の複合体。 １３． ・R1、R2または ・R3、R4 がメチルまたはヒドロキシエチル基である、請求項１２記載の複合体。 １４． ・R1およびR2、または ・R1およびR4 が一緒になってエチレン鎖を形成する、請求項１２記載の複合体。 １５． ・R1およびR2、または ・R3およびR4 が一緒になってプロピレン鎖を形成する、請求項１２記載の複合体。 １６． mが1〜6の間の整数であり、かつ、p=1である、請求項１２〜１５のい ずれか１項に記載の複合体。 １７． R8およびR9が6〜23個の炭素を有するアルキルまたはアルケニル基か ら選択される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の複合体。 １８． 脂質が下記式で示される化合物からなる群より選択される、請求項１ ２〜１７のいずれか１項に記載の複合体。 １９． 脂質がその脂質に対応する２種のジアステレオマー（シスおよび／ま たはトランス）の一方、他方または混合物である、請求項１〜１８のいずれか１ 項に記載の複合体。 ２０． またそれが脂質と治療上有効な物質との間の複合体の形成を改良する ことができるか、または細胞に対するこれら複合体の作用を改良することができ る少なくとも１種のアジュバントを含んでなる、請求項１〜１９のいずれか１項 に記載の複合体。 ２１． アジュバントが、例えば、トリグリセリド、ジグリセリド、コレステ ロールなど、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルコリン、ホ スホコリン、スフィンゴミエリン、セラミドまたはセレブロシド、好ましくはジ オレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)またはホスファチジルエタノ ールアミン(PE)に由来する中性または両性イオン脂質である、請求項２０記載の 複合体。 ２２． 脂質とアジュバントの重量比が0.1〜10の間である、請求項２１記載 の複合体。 ２３． 治療上有効な物質が核酸およびタンパク質から選択され、好ましくは 複合体中の有効物質がポリヌクレオチドである、請求項１〜２２のいずれか１項 に記載の複合体。 ２４． 陽イオンの脂質の正電荷数と治療上有効な物質の負電荷の比率が0.05 〜20の間、特には0.1〜15の間、好ましくは5〜10の間である、請求項１〜２３の いずれか１項に記載の複合体。 ２５． 脂質が： −R1=R2=メチル；R3およびR4が一緒になってエチレン鎖を形成し、m=3、P=3、 R5=R6=NHC(=O)C13H27である請求項１の脂質(pcTG24)； −R1=R2=R3=R4=メチル、R5=R6=C(=O)-N(C8H17)2である請求項１の脂質(pcTG4 2) からなる群より選択される、請求項１記載の複合体。 ２６． 特に遺伝子治療によりヒトまた動物の身体を治療することを意図した 、治療、予防またはワクチン用医薬製剤の製造のための、請求項１〜２５のいず れか１項に記載の複合体の使用。 ２７． in vitroにおいて標的細胞に少なくとも１種の治療上有効な物質、さ らに特には核酸を導入するための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の複合 体の使用。 ２８． 医薬製剤を筋肉内、気管内、鼻腔内、脳内、胸膜内、腫瘍内、心臓内 、胃内、腹膜内、表皮、静脈内または動脈内経路を介して投与することを意図し た、請求項２６記載の使用。 ２９． 細胞に負電荷を含有する治療上有効な物質を導入する方法であって、 適切な培地で培養した細胞を、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の複合体の 懸濁液と接触させ、一定期間のインキュベーションの後に細胞を洗浄、回収する ことを特徴とする方法。 ３０． 少なくとも１種の請求項１〜２５のいずれか１項に記載の複合体を含 んでなり、さらに所望により、例えばそれを保存する、および／または該複合体 のトランスフェクション力を増強する目的で、医薬製剤を安定化させることが可 能な少なくとも１種のアジュバントを含有する医薬製剤。 ３１． アジュバントがクロロキン、特にプロピレングリコール、ポリエチレ ングリコール、グリセロール、エタノール、1-メチル-L-2-ピロリドンから選択 される極性プロトン性化合物、またはその誘導体、もしくは特にジメチルスルホ キシド(DMSO)、ジエチルスルホキシド、ジ-n-プロピルスルホキシド、ジメチル スルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラ メチルウレアおよびアセトニトリルから選択される極性非プロトン性化合物、ま たはその誘導体からなる群より選択される、請求項３０記載の医薬製剤。
JP11501792A 1997-06-12 1998-06-11 少なくとも１種の治療上有効な物質、特にポリヌクレオチド、を標的細胞に導入するための新規脂質複合体および遺伝子治療における使用 Pending JP2001500162A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9707290 1997-06-12
FR97/07290 1997-06-12
PCT/FR1998/001220 WO1998056423A1 (fr) 1997-06-12 1998-06-11 Nouveaux complexes lipidiques pour le transfert d'au moins une substance therapeutiquement active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001500162A true JP2001500162A (ja) 2001-01-09

Family

ID=9507896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP11501792A Pending JP2001500162A (ja) 1997-06-12 1998-06-11 少なくとも１種の治療上有効な物質、特にポリヌクレオチド、を標的細胞に導入するための新規脂質複合体および遺伝子治療における使用

Country Status (6)

Country Link
US (2) US6291423B1 (ja)
EP (1) EP0956050A1 (ja)
JP (1) JP2001500162A (ja)
AU (1) AU739998B2 (ja)
CA (1) CA2263367A1 (ja)
WO (1) WO1998056423A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006503860A (ja) * 2002-10-02 2006-02-02 モアダン・リサーチ・インスティテュート 肝炎に対するバクテリオファージを介する免疫
JP2012196220A (ja) * 2006-05-05 2012-10-18 Molecular Transfer Inc 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬
JP2013095692A (ja) * 2011-10-31 2013-05-20 Univ Of Miyazaki ピペラジンアルキル誘導体を含有する金属の選択的抽出剤
JP2018524330A (ja) * 2015-06-24 2018-08-30 日東電工株式会社 イオン性化合物及び組成物並びにその使用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1013772A1 (en) * 1998-12-21 2000-06-28 Transgene S.A. Method for preparing suspension of stable posiplexes
FR2796397B1 (fr) * 1999-07-16 2006-09-01 Merial Sas Genes de calicivirus felin et vaccins notamment vaccins recombines
US6372250B1 (en) * 2000-04-25 2002-04-16 The Regents Of The University Of California Non-invasive gene targeting to the brain
US20040137064A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-15 Lewis David L. Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
US20040019008A1 (en) * 2002-05-28 2004-01-29 Lewis David L. Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
US7601367B2 (en) * 2002-05-28 2009-10-13 Mirus Bio Llc Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
US7771660B2 (en) 2004-05-04 2010-08-10 University Of North Carolina At Chapel Hill Electrophoretic interactive spectral methods and devices for the detection and/or characterization of biological particles
ES2373561T3 (es) 2004-11-10 2012-02-06 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Uso de derivados de 1,4-bis(3-aminoalquil)piperazina en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
DE202007015863U1 (de) * 2007-11-12 2009-03-26 Melitta Haushaltsprodukte Gmbh & Co. Kommanditgesellschaft Filterpapiereinsatz
AU2017200272A1 (en) * 2009-05-05 2017-02-02 Arbutus Biopharma Corporation Lipid compositions
SG10201402054UA (en) * 2009-05-05 2014-09-26 Muthiah Manoharan Lipid compositions
CN103380113B (zh) 2010-11-15 2018-03-30 生命科技公司 含胺的转染试剂及其制备和使用方法
DK2938597T3 (en) * 2012-12-27 2017-01-09 Alzprotect N- (3- (4- (3- (diisobutylamino) propyl) piperazine-1-yl) -propyl) -1H-benzo [d] imidazol-2-amine sulfate salts, PREPARATION THEREOF AND USE OF SAME

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09505593A (ja) * 1993-11-24 1997-06-03 メガバイオス・コーポレイション ピペラジンの両親媒性誘導体
US5635487A (en) * 1994-12-29 1997-06-03 Wolff; Jon A. Amphipathic, micellar delivery systems for biologically active polyions
US5744335A (en) * 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006503860A (ja) * 2002-10-02 2006-02-02 モアダン・リサーチ・インスティテュート 肝炎に対するバクテリオファージを介する免疫
JP2012196220A (ja) * 2006-05-05 2012-10-18 Molecular Transfer Inc 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬
JP2013095692A (ja) * 2011-10-31 2013-05-20 Univ Of Miyazaki ピペラジンアルキル誘導体を含有する金属の選択的抽出剤
JP2018524330A (ja) * 2015-06-24 2018-08-30 日東電工株式会社 イオン性化合物及び組成物並びにその使用
US10167253B2 (en) 2015-06-24 2019-01-01 Nitto Denko Corporation Ionizable compounds and compositions and uses thereof
US11384051B2 (en) 2015-06-24 2022-07-12 Nitto Denko Corporation Ionizable compounds and compositions and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU739998B2 (en) 2001-10-25
EP0956050A1 (fr) 1999-11-17
US6291423B1 (en) 2001-09-18
US20020025920A1 (en) 2002-02-28
WO1998056423A1 (fr) 1998-12-17
CA2263367A1 (fr) 1998-12-17
AU8113398A (en) 1998-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU727204B2 (en) Glycerolipid compounds useful for the transfer of an active substance into a target cell
US6335199B1 (en) Lipid compounds and compositions containing same used for the transfer of at least an active substance, in particular a polynucleotide, in a target cell and therapeutic use
JP4854853B2 (ja) トランスフェクション薬剤
JP2001500162A (ja) 少なくとも１種の治療上有効な物質、特にポリヌクレオチド、を標的細胞に導入するための新規脂質複合体および遺伝子治療における使用
JP4467084B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための化合物、その製法及びその使用
KR19990067552A (ko) 형질감염제로서의 리포폴리아민 및 이의 약학적 용도
AU740392B2 (en) Cationic polymers, complexes associating said cationic polymers with therapeutically active substances comprising at least a negative charge, in particular nucleic acids, and their use in gene therapy
Ahmed et al. N 4, N 9-Dioleoyl spermine is a novel nonviral lipopolyamine vector for plasmid DNA formulation
CZ295225B6 (cs) Amidiniový derivát a farmaceutický prostředek tento derivát obsahující
KR20010013312A (ko) 신부류의 핵산 양이온 형질감염제
KR20010081924A (ko) 환원 조건에 민감한 형질감염 조성물, 이를 함유한 약학조성물, 및 이들의 용도
Soltan et al. Design and Synthesis of N 4, N 9-Disubstituted Spermines for Non-viral siRNA Delivery–Structure-Activity Relationship Studies of siFection Efficiency Versus Toxicity
AU750696B2 (en) Use of a cationic polymer for the preparation of a complex with nucleic acid and related compositions
US20030109699A1 (en) Amphiphilic quinolylpolyamines as transfer agents for biologically active macromolecules
EP1300161A1 (en) Cationic lipids suitable for gene transfer
US6613351B1 (en) Compound capable of introducing at least one molecule into a cell
CA2213257A1 (en) Oligopeptide derivatives