KR20010013312A - 신부류의 핵산 양이온 형질감염제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형질감염제가 양이온 친수성 영역과 결합된 적어도 하나의 친유성 영역을 포함하고, 양이온 친수성 영역이 아미노 그룹에 의해 치환된 5개 또는 6개의 원자를 갖는 헤테로사이클로 이루어짐을 특징으로 하는, 신부류의 핵산 양이온성 형질감염제에 관한 것이다.

Description

신부류의 핵산 양이온 형질감염제{NOVEL CLASS OF NUCLEIC ACID CATIONIC TRANSFECTING AGENTS}
생물공학의 발달로, 핵산을 세포 중으로 전달하는 것이 가능해졌다. 이러한 전달의 효율은 다수의 유전병에 연루된 핵산의 발현 결함 및/또는 비정상적 발현의 교정에 필수적인 것으로 보인다. 그러나, 핵산 전달의 중요성은 유전자 요법에 국한되지는 않는다. 또한, 핵산의 전달은 유전자 발현 조절의 연구, 유전자의 클로닝, 또는 핵산을 수반하는 시험관내 조작에 있어 기타 목적, 및 재조합 단백질의 생산에 유용할 수 있다. 예를 들면, 트랜스제닉 동물의 생산, 백신 생산 또는 분자의 표지에 대한 연구를 위해, 생체내 핵산의 전달이 수행될 수 있다. 또한, 골수 이식, 면역요법 또는 나중에 재투여시킬 유기체로부터 수집된 세포 중으로의 유전자 전달을 수반하는 기타 방법을 포함한 연구에서, 핵산은 생체외에서 세포 중으로 전달될 수 있다.
근래에 들어서, 이러한 유형의 유전 정보의 세포내 전달을 위한 몇몇 방법이 제안되었다. 이러한 방법 중 하나는 화학적 또는 생화학적 벡터의 사용에 기초하고 있다. 이러한 합성 벡터는 두 가지 주기능을 보유하고 있다: 형질감염시킬 DNA와 복합체 형성 및 이의 세포 부착과 원형질막 및, 경우에 따라 두 핵막을 가로지르는 이의 통과 촉진. 개발된 합성 벡터 중에서, 폴리라이신 및 DEAE-덱스트란형의 양이온 중합체 또는 리포펙턴트가 더욱 유리하다.
리포펙턴트형 양이온 형질감염제, 좀더 정확히 말하면 양이온 지질의 사용에 기초한 공학의 발달로 이러한 양식의 형질감염에 있어 주된 진보가 이루어졌다. 따라서, 양으로 하전된 양이온 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)가 리포솜 또는 소형 소포 형태로, 음으로 하전되는 DNA를 자발적으로 간섭하여, 세포막과 융합될 수 있는 지질-DNA 복합체를 형성하고, 따라서 DNA의 세포내 전달을 허용함이 증명되었다.
DOTMA 이래로, 다른 양이온 지질, 즉 "스페이서"로도 불리는 아암을 통해 아미노 그룹에 커플링된 친유성 그룹이 이러한 동일 구조 모델에서 개발되었다. 이들 가운데서, 좀더 구체적으로는, 친유성 그룹으로서 지방산 또는 콜레스테롤 유도체를 포함하고, 아울러, 경우에 따라, 아미노 그룹으로서 4급 암모늄 그룹을 함유하는 것들을 들 수 있다. DOTAP, DOBT 또는 ChOTB가 특히 양이온 지질의 이러한 카테고리의 대표로 언급될 수 있다. DOSC 및 ChOSC와 같은 기타 화합물은 4급 암모늄 그룹 대신에 콜린 그룹의 존재를 특징으로 한다.
리포펙턴트의 다른 카테고리인 리포폴리아민도 기술된다. 일반적으로, 이는 "스페이서"를 통해 친유성 영역에 커플링된 폴리아민으로 이루어지는 적어도 하나의 친수성 영역을 포함하는 양쪽성 분자이다. 폴리아민 영역은 양으로 하전되며, 음으로 하전되는 핵산과 가역적으로 결합할 수 있다. 이러한 상호작용은 핵산을 상당히 조밀하게 만든다. 친유성 영역의 경우, 이는 형성된 복합체를 지질막으로 코팅함으로써 이러한 음이온 상호작용을 외부 매질에 비민감성으로 만든다. 이러한 유형의 화합물에서, 양이온 그룹은 2개는 1급이고 2개는 2급인 4개의 암모늄 그룹을 함유하는 L-5-카복시스퍼민 라디칼로 대표될 수 있다. 특히 DOG 및 DPPES가 이러한 카테고리에 속한다. 이러한 리포폴리아민은 1차 내분비 세포의 형질감염에 특히 가장 효과적이다. 이러한 후자 계통의 화합물의 대표적인 예로는, 예를 들면, 특허출원 WO 96/17823 및 WO 97/18185에 기술된 리포폴리아민을 들 수 있다.
그러나, 이러한 합성 벡터의 효율은 특히 형질감염 분자의 전하밀도 및 강성면에서 개선의 여지가 남아있다.
사실, 이들 산물의 활성은 이들이 활동하는 전하밀도에 좌우되는 것으로 일반적으로 받아들여지고 있다. 그러나, 지방족 쇄 상의 전하 증가는 독성 출현의 원인이 된다. 따라서, 지방족 쇄상의 전하밀도의 안정화는 독성인자의 출현을 방지할 수 있다. 또한, 형질감염 효율은 지방족 쇄가 아닌 영역에서의 전하밀도 증가에 의해 증진될 수 있다.
더욱이, 핵산 전달에 사용된 분자의 가요성은 핵산과 형질감염제 간의 충분히 근접한 상호작용에 장애물이 될 수 있어, 여타 형질감염에 필수적인 선행조건인 핵산 분자의 최적 조밀화의 달성을 막게된다. 형질감염제 분자의 증가된 강성은 핵산과의 더욱 효과적인 상호작용을 보장하는 것으로 생각되며, 따라서 형질감염이 향상된다.
본 발명은 신부류의 양이온 형질감염제, 이를 함유하는 약학 조성물, 핵산의 생체내, 생체외 및/또는 시험관내 형질감염을 위한 이의 적용 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
도1/5: 화합물 (1) 내지 (5)의 합성 개요.
도 2/5: 화합물 (5) 내지 (8a) 및 (8b)의 합성 개요.
도 3/5: 화합물 (9) 내지 (16)의 합성 개요.
도 4/5: 혈청 부재하, 헬라 세포내 루시퍼라제 활성의 측정에 의한 화합물 (8a) 및 (8b)의 시험관내 형질감염 효율의 측정. 측정은 벡터/㎍ DNA 비의 상이한 나노몰에서 수행되며, 막대로 나타내었다. 조성물 각각에 대한 단백질 분석도 수행되며 실선 형태의 곡선으로 동일 그래프상에 나타내었다.
도 5/5: 혈청 부재하, NIH 3T3 세포내 루시퍼라제 활성의 측정에 의한 화합물 (8a) 및 (8b)의 시험관내 형질감염 효율의 측정. 측정은 벡터/㎍ DNA 비의 상이한 나노몰에서 수행되며, 막대로 나타내었다.
재료 및 방법
- 수중 아세토니트릴 구배로 용출된 Vydac C4 칼럼상에서, Waters LC 4000 장치를 사용하여 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 정제를 수행한다.
- 각각 260 nm 및 590 nm의 여기 및 방출파장을 이용하여, Perkin Elmer LS50B 상에서 형광측정을 수행한다. 여기 및 방출에 대한 슬릿의 폭은 5 nm로 세팅된다. 최종농도로 에티듐 브로마이드 5 ㎍/ml을 가하여 형광치를 기록한다.
- 중수소처리 클로로포름 중 Bruker MSL 300 장치 상에서, 양성자에 대해 300.13 MHz에서 및 탄소에 대해 75.47 MHz에서 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼을 기록한다.
따라서, 독성이 감소되거나 독성이 전혀 없으면서, 증가된 형질감염능을 지닌 형질감염제를 구축하는 것이 특히 유리할 것이다. 이러한 점이 본 발명이 성취하고자 하는 제안 목적이다.
본 발명의 목적은 사실 정확하게 말하면, 전달제 상에 전술한 특이적 성질을 부여하는 새로운 양이온 친수성 영역을 지닌 신부류의 형질감염제를 제공하는 것이다.
좀더 정확히 말해서, 본 발명은 친유성 영역에 커플링된 적어도 하나의 양이온 친수성 영역을 포함하는 형질감염제에 관한 것이며, 양이온 친수성 영역은 아미노 그룹으로 치환된, 5개 또는 6개의 원자를 함유하는 적어도 하나의 헤테로사이클로 이루어진다.
양으로 하전된 친수성 영역은 음으로 하전된 핵산과 가역적으로 결합할 수 있으며 이에 따라 고도로 조밀하게 된다. 또한, 양이온 부분의 신구조는 분자에 증가된 강성을 부여한다.
본 발명에 따른 핵산 전달제의 합성시 중간체인 양이온 친수성 영역은 특히 화학식 1로 표시된다.
상기식에서,
- y는 0 또는 1인 정수이고, 상이한 y′는 상호 독립적이며,
- X는 산소, 질소, 황 또는 셀레늄 원자를 나타내며,
- Z는 상호 독립적으로,
·수소원자,
·OR 그룹[여기에서, R은 수소원자, 메틸 그룹 또는 그룹 (CH2)n-NR1R2(여기에서, n은 1 내지 6의 정수이고 R1및 R2는 상호 독립적으로 수소원자 또는 그룹 (CH2)q-NH2를 나타내며, q는 1 내지 6으로 다양할 수 있으며, 상이한 q′은 상호 독립적이다)이다],
·그룹 (CH2)m-NR1R2(여기에서, m은 0 내지 6의 정수이고 R1및 R2는 전술한 바와 같다), 또는
·양이온 친수성 영역과 지질 영역의 결합을 허용하는 "스페이서" 그룹을 나타내며,
Z 치환체 중 적어도 하나는 아미노 그룹을 운반하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 전달제는 화학식 1의 적어도 하나의 양이온 친수성 영역을 함유한다. 본 발명의 일 별법에 따르면, 전달제는 Z 그룹 중 하나의 수준에서 상호 결합되는 2개 이상의 양이온 친수성 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, Z 치환체가 OR을 나타내고 R이 그룹 (CH2)n-NR1R2를 나타낼 때, n은 바람직하게는 2, 3 또는 4에서 선택된다.
본 발명의 유리한 별법에 따르면, 형질감염제는 X가 산소원자를 나타내는 화학식 1의 양이온 친수성 영역을 포함한다. 이어서, 양이온 친수성 부분은 피라노스 또는 퓨라노스 형태의 글리코사이드로 이루어진다. 피라노스 형태가 특히 유리하며 실시예에서 비-제한 방식으로 기술된다.
본 발명의 제 2 유리한 별법에 따르면, 형질감염제는 환에 존재하는 y가 1이고 X가 산소원자이며 Z 치환체 중 적어도 하나가 아미노 그룹을 포함하는 6-원 아미노 글리코사이드로 이루어진 화학식 1의 양이온 친수성 영역을 포함한다. 좀더 바람직하게는, Z 치환체 중 적어도 2개가 아미노 그룹을 포함한다.
본 발명의 다른 별법에 따르면, 양이온 친수성 영역은 화학식 1의 아미노 글리코사이드로 이루어지며, 여기에서 두 y′은 1이고, X는 산소원자이며, Z 그룹 중 2개는 수소원자를 나타내고, 나머지 2개의 Z는 질소-함유 그룹, 바람직하게는 아미노 그룹이며, 마지막 Z 그룹은 OR 그룹을 나타내며, R은 전술한 바와 같다. 바람직하게는, OR 그룹은 본 발명에 따른 형질감염제의 양이온 친수성 영역을 구성하는 헤테로사이클 상의 2 위치에 자리잡는다.
본 발명의 다른 유리한 양태에 따르면, 양이온 친수성 영역은 화학식 1의 아미노 글리코사이드로 이루어지며, 여기에서 환에 존재하는 y는 1이며, X는 산소원자이며, Z 그룹 중 적어도 2개는 그룹 O-(CH2)q-NH2에 상응하며, q는 전술한 바와 같고, Z 그룹 중 적어도 하나는 OR 그룹을 나타내며, R은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 전달제의 합성에 유용한 중간체인 화학식 1의 양이온 영역의 대표적인 예로는 특히 하기 화합물을 들 수 있다:
일반적으로, 본 발명의 목적을 위한 형질감염제는 친유성 영역과 결합된 전술한 적어도 하나의 양이온 친수성 영역을 포함한다.
본 발명의 목적을 위한 친유성 영역을 구성하는 분자는 당업자에 공지된 친유성 분자에서 선택된다. 유리하게는, 친유성 영역은 하나 이상의 임의로 할로겐화된 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 지방족 쇄로 이루어진다. 친유성 영역은 스테로이드 유도체에서 유리하게 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 별법에 따르면, 친유성 부분은 10 내지 22개의 탄소원자, 좀더 바람직하게는 12 내지 22개의 탄소원자를 함유하는 하나 이상의 지방족 쇄로 이루어진다. 예를 들면, 14, 16, 17, 18 또는 19개의 탄소원자를 함유하는 지방족 쇄, 특히 (CH2)13CH3, (CH2)15CH3, (CH2)16CH3, (CH2)17CH3및 (CH2)18CH3를 들 수 있다.
본 발명에 따른 전달제의 친유성 부분은 유리하게는, 예를 들면, 콜레스테롤, 콜레스탄올, 3-α-5-사이클로-5-α-콜레스탄-6-β-올, 콜산, 콜레스테릴 포메이트, 콜레스타닐 포메이트, 3α,5-사이클로-5α-콜레스탄-6β-일 포메이트, 콜레스테릴아민, 6-(1,5-디메틸헥실)-3a,5a-디메틸헥사데카하이드로사이클로펜타[a]사이클로프로파[2,3]사이클로펜타[1,2-f]나프탈렌-10-일아민, 또는 콜레스타닐아민과 같은 스테로이드 유도체 중에서 선택될 수 있다.
바람직한 양태에 따라, 양이온 친수성 영역은 "스페이서" 중간체 분자에 의해 친유성 영역에 커플링된다. "스페이서" 그룹은 본 발명의 목적상, 당업자에 공지된, 아미드, 카바메이트, 에스테르 또는 에테르 유형의 결합을 수득가능케 하거나 양이온 친수성 부분과 친유성 영역 간의 방향족 환을 통한 가수분해성 작용그룹을 포함하는 산성 또는 아미노 치환체를 의미하는 것으로 이해된다. 친수성 부분과 친유성 부분 간의 커플링은 바람직하게는, 화학식 1의 양이온 친수성 중간체 상에 존재하고 본 발명에 따른 전달제의 합성에 유용한 Z 그룹 중 하나의 수준에서 수행된다. 유리하게는, 친수성 영역과 친유성 영역 간의 커플링은 "스페이서" 그룹을 통해 화학식 1의 양이온 친수성 부분의 환 상 2 위치 또는 5 또는 6 위치(환에 존재하는 y가 0이냐 1이냐에 따라)에서 수행된다.
바람직하게는, "스페이서" 영역은 지방족 또는 방향족 쇄를 포함한다. 실행시, "스페이서"는 유리하게는, 아미드, 카바메이트, 에스테르 또는 에테르 그룹 또는 방향족 환 중에서 선택된 하나 이상의 그룹을 포함한다. 바람직한 "스페이서"는 특히 화학식 -O-CO-(CH2)x-COOH, -O-(CH2)x-COOH, -O-CO-(CH2)x-NH2, -O-(CH2)x-NH2, -NH-(CH2)x-NH2의 것들이며, x는 1 내지 6에서 선택된 정수를 나타낸다.
본 발명에 따른 형질감염제의 예로는, 화학식 (16),(17),(8a) 및 (8b)의 화합물을 들 수 있다:
본 발명은 또한, 전술한 바와 같은 신부류의 핵산 형질감염제의 제조방법에 관한 것이다. 좀더 정확하게 말하면, 지질 영역이 "스페이서"에 의해 커플링되는 일치환 또는 다치환 헤테로사이클로부터 형질감염제의 제조방법에 관한 것이다.
화학식 1의 양이온 친수성 영역은 환상의 아미노 작용그룹의 상대적인 위치와 이들의 수에 따라 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
Z 치환체 중 적어도 하나가 친유성 부분과의 결합을 허용하는 "스페이서"이고 Z 그룹 중 적어도 하나가 OR 그룹(여기에서, R은 그룹 (CH2)n-NR1R2를 나타낸다)인 화학식 1의 양이온 친수성 영역을 수득하고자 할 경우, 절차는 모든 치환체 O-(CH2)n-NR1R2가 하이드록실 작용성 그룹인 상응하는 유도체로 개시하여 실행한다.
제 1 단계에서, 하이드록실 작용그룹을 운반하는 유도체는 당업자에 공지된 통상적인 방법에 따라 O-알킬화를 겪게된다. 특히, 절차는 크라운 에테르의 존재하에 10 내지 60℃의 온도에서, 통상적인 알킬화 용매 중의 염기성 매질에서 알킬화제를 사용하여 수행된다.
특히 알킬화제는 알킬아민, 예를 들면, 알킬 할로아세테이트와 같은 에스테르의 할로겐화 유도체, 또는 알콜의 할로겐화 유도체가 사용된다. 바람직하게는 알킬 브로모아세테이트가 사용된다. 알킬 작용그룹은 n을 부여하고자 하는 값에 따라 선택된다. 예를 들면, n이 2를 갖기 위해서는, 에틸 브로모아세테이트가 바람직하게 사용된다.
사용되는 용매는 통상적인 O-알킬화 용매, 예를 들면, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 디메틸 설폭사이드, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란(THF) 등이다. 유리하게는, THF가 사용된다.
반응은 염기, 예를 들면, 수산화칼륨 또는 수소화나트륨의 존재하에 수행된다.
제 2 단계에서, 수득되는 유도체의 카복실 작용성 그룹은 당업자에 공지된 통상적인 방법에 따라 알콜로 환원된다. 절차는 특히 상용성의 통상적인 용매 중에서 환원제의 작용에 의해 수행된다.
환원제로는, 예를 들면, 보란-디메틸 설파이드(BMS), 리튬 알루미늄 하이드라이드 또는 나트륨 보로하이드라이드를 들 수 있다.
상용성 용매는 예를 들면, 에테르 또는 알콜이다. 바람직하게는, 테트라하이드로퓨란(THF)이 사용된다.
제 3 단계에서, 수득된 하이드록실 작용그룹은 당업자에 공지된 통상의 방법에 의해 아지드화된다.
절차는 반응과 상용성인 용매 중 트리페닐포스핀 및 디에틸아조디카복실레이트의 존재하에 하이드라조산의 작용에 의해 수행된다.
사용될 수 있는 용매는 예를 들면, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 클로로포름, 디클로로메탄 등, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란(THF)과 같은 통상적인 아지드화 용매이다.
최종적으로, 아지드 작용그룹은 당업자에 공지된 통상의 방법에 의해 아미노 작용그룹으로 전환된다.
절차는 특히 산 매질 중에서의 환원에 의해, 예를 들면, 탄소상 팔라듐의 존재하에 산 매질 중에서의 수소화에 의해, 또는 스타우딩거 반응을 이용하여, 또는 환원제, 예를 들면, 리튬 알루미늄 하이드라이드, 나트륨 보로하이드라이드, 주석(II) 클로라이드 등의 작용에 의해 수행된다.
따라서, Z 치환체 중 적어도 하나가 친유성 부분과의 결합을 허용하는 "스페이서"이고 Z 그룹 중 적어도 하나는 R이 그룹 -(CH2)n-NR1R2를 나타내는 OR 그룹인 화학식 1의 양이온 친수성 화합물이 수득된다.
이어서 친유성 부분과의 커플링을 당업자에 공지된 통상의 방법에 의해, 특히 펩타이드 커플링[참조문헌:Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag]에 의해 수행된다. 커플링은 "스페이서"를 나타내는 Z 그룹의 수준에서 일어난다.
Z 그룹 중 하나가 "스페이서" 그룹일 때, 후자는 경우에 따라 사전에 보호된다. 바람직하게는 펩타이드 커플링에 앞서 보호되는 양이온 친수성 부분에 의해 운반된 아미노 작용그룹에도 동일하게 적용된다. 보호 라디칼의 보호와 제거는 통상의 방법에 따라 수행된다.
보호는 사용 및 제거시 분자의 나머지에 악영향을 미치지 않는 상용성 그룹에 의해 달성될 수 있다. 특히, 절차는 문헌[참조:T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Syntheses, A. Wiley-Interscience Publication (1981)]에 의해, 또는 문헌[참조:Mc OMIE, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press (1973)]에 의해 기술된 방법에 따라 수행된다.
예를 들면, 보호그룹은 트리메틸실릴, 벤즈하이드릴, 테트라하이드로피라닐, 포밀, 아세틸, 클로로아세틸, 트리클로로아세틸, 트리플루오로아세틸, 에톡시카보닐, tert-부톡시카보닐 또는 트리클로로에톡시카보닐 등에서 선택될 수 있다.
다른 합성경로는 양이온 친수성 화합물의 제 2 계열에 접근할 수 있게 한다. 이러한 제 2 양태는 카보하이드레이트 백본이 전환된다는 점에서 첫 번째와 상이하다.
사실, 사용된 출발물질은 화학식 2의 글리칼이다.
상기식에서,
Z′치환체는 아세톡시 작용그룹이다.
사용되는 글리칼은 시판되고 있거나 시판 카보하이드레이트로부터 당업자에 공지된 임의 기술로, 특히 상응하는 아세토브로모슈가를 아연/구리쌍과 반응시킴으로써 수득된다.
제 1 단계에서, 아세틸화된 글리칼은 당업자에 공지된 통상의 방법에 따라 알킬화된다.
특히, 루이스산의 존재하에, 아미노 알콜, 알콕시카보닐알콜, 카복시알콜, 또는 친유성 영역과의 커플링을 허용하는 그룹에 의해 작용화된 기타 알콜의 작용에 의해 페리어 반응이 사용된다.
바람직하게는, 반응은 상용성 용매, 예를 들면, 에틸 에테르와 같은 에테르 중 붕소 트리플루오라이드의 존재하에 수행된다.
제 2 단계에서, 수득된 불포화 글리코사이드는 당업자에 공지된 통상의 방법에 따라 환원된다.
특히, 환원은 산 매질에서, 예를 들면, 탄소상 팔라듐의 존재하에 산 매질 중에서의 수소화에 의해 수행된다.
제 3 단계에서, 이어서 환에 존재하는 아세톡시 작용그룹은 당업자에 공지된 방법에 의해 하이드록실 작용그룹으로 전환된다.
특히, 절차는 알콕사이드, 예를 들면, 나트륨 메톡사이드를 사용하여 트랜스에스테르화에 의해 수행된다.
제 4 단계에서, 환에 존재하는 하이드록실 작용그룹은 당업자에 공지된 방법에 의해 아지드 작용그룹으로 전환된다.
특히, 절차는 트리페닐포스핀의 존재하에 하이드라조산 및 반응과 상용성인 용매 중 디에틸아조디카복실레이트의 작용에 의해 수행된다.
사용될 수 있는 용매는 통상의 아지드화 용매, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란(THF)이다.
따라서, 화학식 3의 양이온 친수성 영역이 수득된다.
상기식에서,
Z″는 수소원자 또는 아지드 그룹이고, Z″중 적어도 하나는 수소와는 상이하다.
친유성 영역은 당업자에 공지된 방법, 특히 펩타이드 커플링[참조문헌:Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag]에 의해, 또는 축합에 의해 아미노 작용그룹 -NR1R2로 전환될 수 있다.
제 1 단계 중에 사용된 알콜이 아미노 또는 에스테르 작용그룹 또는 친유성 영역과의 커플링을 허용하는 기타 작용그룹을 포함하므로, 사전에 보호하는 것이 바람직할 수 있다. 친유성 영역과의 커플링에 앞서 보호 라디칼의 보호 및 제거는 통상의 방법에 따라 수행된다.
보호는 사용 및 제거시 분자의 나머지에 악영향을 미치지 않는 상용성 그룹에 의해 달성될 수 있다. 특히, 절차는 문헌[참조:T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Syntheses, A. Wiley-Interscience Publication (1981)]에 의해, 또는 문헌[참조:Mc OMIE, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press (1973)]에 의해 기술된 방법에 따라 수행된다.
예를 들면, 보호그룹은 트리메틸실릴, 벤즈하이드릴, 테트라하이드로피라닐, 포밀, 아세틸, 클로로아세틸, 트리클로로아세틸, 트리플루오로아세틸, 에톡시카보닐, tert-부톡시카보닐 또는 트리클로로에톡시카보닐 또는 프탈이미도 라디칼 등에서 선택될 수 있다.
마지막으로, 최종단계에서, 5- 또는 6-원 환에 의해 운반된 아지드 작용그룹은 분자의 나머지에 악영향을 미치지 않는 당업자에 공지된 통상의 방법에 의해 아미노 작용그룹으로 전환된다. 바람직하게는, 절차는 물의 존재하에 트리페닐포스핀의 작용에 의해 수행된다.
본 발명에 따른 핵산 전달제로 인도하는 당업자에 공지된 기타 방법도 본 발명의 범위에 들어온다.
비-제한적인 예로, 본 명세서의 "실시예" 부분에서 명시되는 바와 같이, 본 발명의 제 1 양태는 화학식 (8a) 및 (8b)의 전달제를 유도하는 반면에, 제 2 양태는 화학식 (16) 및 (17)의 전달제를 유도한다.
양이온 친수성 영역의 이러한 제 2 합성방법의 중요성은 주로, 합성에 필수적인 소수의 단계 및 수득된 아미노 신톤(synthon)의 융통성에 있다. 동일한 양이온 헤드는 따라서 다양한 소수성 치환체와 축합될 수 있다.
본 발명의 다른 주제는 전술한 핵산 전달제 및 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 조성물은 핵산 ㎍당 벡터 0.1 내지 50 나노몰의 비를 포함한다. 유리하게는, 이러한 비는 핵산 ㎍당 벡터 2 내지 20 나노몰이고, 더욱 바람직하게는 핵산 ㎍당 벡터 4 내지 12 나노몰이다. 좀더 구체적으로 말하면, 전환제 및 핵산은 핵산 ㎍당 8 내지 12 나노몰의 비로 존재한다.
본 발명의 목적상, "핵산"이란 데옥시리보핵산 및 리보핵산 모두를 의미한다. 이들은 천연 또는 인공 서열일 수 있고, 특히 게놈 DNA(gDNA), 상보성 DNA(cDNA), 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열, 변형되거나 변형되지 않은 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 핵산은 인간, 동물, 식물, 세균 또는 바이러스 기원 등일 수 있다. 이들은 당업자에 공지된 기술에 의해, 특히 라이브러리의 스크리닝에 의해, 화학적 합성에 의해 또는 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득된 서열의 화학적 또는 효소학적 변형을 포함한 혼합 방법에 의해 수득될 수 있다. 이들은 화학적으로 변형될 수 있다.
좀더 구체적으로 데옥시리보핵산의 경우, 이들은 일본쇄 또는 이본쇄, 및 짧은 올리고뉴클레오타이드 또는 좀더 긴 서열일 수 있다. 특히, 핵산은 유리하게는 플라스미드, 벡터, 에피솜, 발현 카세트 등으로 이루어진다. 이러한 데옥시리보핵산은 표적 세포에서 기능성이거나 기능성이 아닌 복제기원, 하나 이상의 마커 유전자, 전사 또는 복제 조절 서열, 해당 치료 유전자, 변형되거나 변형되지 않는 안티센스 서열, 다른 세포 성분과의 결합영역 등을 운반할 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 하나 이상의 프로모터의 조절하에 있는 하나 이상의 해당 유전자 및 표적 세포에서 활성을 띠는 전사 종결자로 이루어진 발현 카세트를 포함한다.
본 발명의 목적상, 해당 치료 유전자는 특히 치료효과가 있는 단백질 산물을 암호화하는 유전자를 의미한다. 이렇게 암호화된 단백질 산물은 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질 산물은 표적 세포에 대해 외생성, 상동성 또는 내생성일 수 있으며, 즉 어떠한 병리학적 증세도 지니지 않는 표적 세포에서 정상적으로 발현되는 산물일 수 있다. 이러한 경우에, 단백질의 발현은 예를 들면, 세포내 불충분한 발현 또는 변형으로 인해 불활성이거나 약하게 활성을 띠는 단백질의 발현을 완화시키거나, 또는 단백질을 과발현시킬 수 있게 만든다. 해당 치료 유전자는 또한, 안정성, 변형된 활성 등을 갖는 세포 단백질의 돌연변이체도 암호화할 수 있다. 단백질 산물은 또한 표적세포에 대해 이종일 수 있다. 이러한 경우에, 발현된 단백질은 예를 들면, 세포에 결핍되어 있는 활성을 보충하거나 제공하여 병리학적 증상에 대항할 수 있거나 면역반응을 자극할 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 치료산물로는, 특히 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인:인터루킨, 인터페론, TNF 등(FR 92/03120), 생장인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양인자(BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀 등), 아포리포단백질(ApoAI, ApoAIV, ApoE 등, FR 93/05125), 디스트로빈 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947), 낭포성 섬유증과 관련된 CFTR 단백질, 종양 억제 유전자(p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(FR 93/04745), 응고 관련 인자를 암호화하는 유전자(인자 VII, VIII, IX), DNA 수선 관련 유전자, 자살 유전자(티미딘 키나제, 사이토신 데아미나제), 헤모글로빈 또는 기타 단백질 캐리어, 대사 효소, 이화작용 효소에 대한 유전자 등을 들 수 있다.
해당 치료 핵산은 표적 세포에서의 발현이 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절할 수 있게 하는 유전자 또는 안티센스 서열일 수 있다. 특허 EP 140 308에 기재된 기술에 따라, 이러한 서열은 예를 들면, 표적 세포에서, 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사되고 따라서 이들의 단백질로의 해독을 차단할 수 있다. 치료 유전자는 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴시킬 수 있는 리보자임을 암호화하는 서열을 포함한다(EP 321 201).
전술한 바와 같이, 핵산은 또한, 인간 또는 동물에서 면역반응을 생성할 수 있는 항원 펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수도 있다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명은 따라서 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대항하여, 백신 생산 또는 인간 또는 동물에 적용된 면역요법 치료의 수행을 허용한다. 이들은 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185 573), 위-광견병 바이러스, 합포체 형성 바이러스, 기타 바이러스 특이성 항원 펩타이드, 또는 종양 특이성 항원 펩타이드일 수 있다(EP 259 212).
바람직하게는, 핵산은 또한 목적하는 세포나 기관에서 해당 치료 유전자 및/또는 항원 펩타이드를 암호화하는 유전자의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 이들은 서열이 감염세포에서 기능을 발휘할 수 있을 때 고려되는 유전자의 발현을 담당하는 서열일 수 있다. 이들은 또한, 상이한 기원의 서열일 수 있다(기타 단백질의 발현을 담당하거나, 또는 심지어 합성). 특히, 이들은 진핵생물 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 감염시키고자 하는 세포의 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이와 마찬가지로, 이들은 바이러스 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들면, E1A, MLP, CMV 및 RSV 유전자 등의 프로모터가 언급될 수 있다. 또한, 이들 발현 서열은 활성화 또는 조절 서열의 첨가 등에 의해 변형시킬 수 있다. 프로모터는 또한 유도성이거나 억제성일 수 있다.
더욱이, 핵산은 또한, 특히 치료 유전자의 상류에, 표적 세포의 분비경로에서 합성된 치료산물을 지시하는 시그널 서열을 포함할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 치료산물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 여타 기능적인 시그널 서열, 또는 인공 시그널 서열일 수 있다. 핵산은 또한, 합성된 치료산물을 세포의 특정 구획쪽으로 지시하는 시그널 서열을 포함할 수 있다.
조성물은 또한, 전달제/핵산 복합체와 결합할 수 있고, 이의 형질감염력을 향상시킬 수 있는 보조제를 포함할 수 있다. 다른 양태로, 본 발명은 따라서, 핵산, 전술한 전달제 및 핵지질 복합체와 결합할 수 있고 형질감염력을 향상시킬 수 있는 하나 이상의 보조제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명에 따른 조성물은 보조제로서, 하나 이상의 중성 지질을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 특히 전달제/핵산 전하비가 낮을 때 특히 유리하다. 출원인은 사실, 중성 지질의 첨가가 핵지질 입자의 형성을 향상시키고 막의 탈안정화에 의한 세포 중으로의 입자 침투를 촉진시킬 수 있음을 밝혀내었다.
좀더 바람직하게는, 본 발명에 사용된 중성 지질은 두 개의 지방쇄를 함유하는 지질이다. 특히 유리한 방법으로, 쯔비터이온이거나 생리 조건에서 이온 전하가 결핍되는 천연 또는 합성 지질이 사용된다. 이들은 특히 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일포스파티딜에탄올아민 및 1 내지 3회 N-메틸화되는 이들의 유도체, 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로사이드(예를 들면, 특히 갈락토세레브로사이드), 스핑고지질(예를 들면, 특히 스핑고마이엘린), 또는 아시알로강글리오사이드(예를 들면, 특히 아시알로GM1 및 GM2) 중에서 선택될 수 있다.
이들 상이한 지질은 합성에 의해 또는 기관(예를 들면, 뇌) 또는 난으로부터 추출에 의해, 당업자에 익히 공지된 통상의 기술에 의해 수득될 수 있다. 특히, 천연지질의 추출은 유기 용매에 의해 수행될 수 있다(Lehninger, Biochemistry 참조).
좀더 최근에는, 출원인은 보조제로서, 핵산의 응축에 직접 관련되거나 관련되지 않은 화합물을 사용하는 것이 특히 유리함을 입증하였다(WO 96/25508). 본 발명에 따른 조성물내 이러한 화합물의 존재는 형질감염 활성에 대한 손상효과 없이 독물학적인 면에서 유익한 결과를 불러오면서 형질감염제의 양을 감소시킬 수 있게한다. 핵산의 응축에 관련된 화합물은 핵산을 직접 또는 간접적으로 조밀하게 하는 화합물로 정의된다. 좀더 정확하게 말하면, 이러한 화합물은 형질감염시킬 핵산의 수준에서 직접 작용할 수 있거나, 이러한 핵산의 응축에 직접 관련된 부가 화합물의 수준에서 포함될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 수준에서 직접 작용한다. 예를 들면, 예비조밀화제는 폴리양이온, 예를 들면, 폴리라이신일 수 있다. 바람직한 양태에 따라, 이러한 제제는 프로타민, 히스톤, 또는 뉴클레올린으로부터 및/또는 이들의 유도체 중 하나로부터 부분적으로 또는 완전히 유도된 핵산의 응축에 수반된다. 이러한 제제는 또한, 전부 또는 부분적으로, 펩타이드 단위(KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)로 이루어질 수 있으며, 단위의 수는 2 내지 10일 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 구조에서, 이러한 단위는 연속적으로 반복되거나 반복되지 않을 수 있다. 이들은 따라서 생화학적 종, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산, 또는 화학 종의 결합에 의해 분리될 수 있다.
특히 유리한 양태에서, 본 발명의 조성물은 추가로, 핵산의 전달을 배향시킬 수 있게 하는 표적화 요소를 포함한다. 이러한 표적화 요소는 DNA의 전달을 특정 세포 유형 또는 특정 세포 조직(종양 세포, 간 세포, 조혈 세포 등)쪽으로 배향시킬 수 있는 세포외 표적화 요소일 수 있다. 이는 핵산의 전달을 특정의 바람직한 세포 구획(미토콘드리아, 핵 등)쪽으로 배향시킬 수 있는 세포내 표적화 요소일 수도 있다. 표적화 요소는 본 발명에 따른 핵산 전달제에 또는 전술한 핵산에 결합될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 표적화 요소로는, 당, 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 지질, 뉴로미디에이터(neuromediator), 호르몬, 비타민 또는 이들의 유도체를 들 수 있다. 바람직하게는, 이들은 당, 펩타이드 또는 단백질, 예를 들면, 항체 또는 항체 단편, 세포 수용체의 리간드 또는 이의 단편, 수용체 또는 수용체 단편 등이다. 특히, 이들은 생장 인자 수용체, 사이토킨 수용체, 세포 렉틴형 수용체의 리간드, 또는 인테그린과 같은 접착 단백질에 대한 수용체에 친화성을 갖는 RGD 서열-함유 리간드일 수 있다. 트랜스페린, HDL 및 LDL에 대한 수용체, 또는 폴레이트 트랜스포터를 들 수 있다. 표적화 요소는 또한 아시알로글리코단백질에 대한 또는 시알라이드 루이스 X와 같은 시알라이드에 대한 수용체와 같은 렉틴, 또는 항체의 Fab 단편, 또는 일본쇄 항체(ScFv)를 표적화할 수 있는 당일 수 있다. 최근에 와서, 특정 세포에 대한 이들의 선택성에 특히 유리하고 이러한 세포에서 내부화를 효율적으로 촉진할 수 있는 천연 또한 합성 리간드 펩타이드도 기술되었다[참조문헌:Bary et al. Nature Medicine, 2, 1996, 299-305].
핵지질 복합체와 표적화 요소의 조합이 당업자에 공지된 기술에 의해, 예를 들면, 소수성 부분 또는 본 발명에 따른 전달제의 핵산과 상용작용하는 부분에, 또는 본 발명에 따른 전달제와 상호작용하는 그룹에 또는 핵산과 커플링시킴으로써 행해질 수 있다. 문제의 상호작용은 바람직한 양식에 따라, 이온성 또는 공유결합성일 수 있다.
다른 별법에 따르면, 본 발명의 조성물은 또한, 핵지질 복합체의 입자 크기를 안정화시킬 충분한 양의 적어도 하나의 비이온성 계면활성제를 임의로 혼입할 수 있다. 비이온성 계면활성제의 도입은 응집체의 형성을 방지하여, 조성물이 생체내 투여에 더욱 적합해지게 된다. 이러한 계면활성제를 혼입하는 본 발명에 따른 조성물은 안전성이라는 면에서 장점이 있다. 이들은 또한, 핵지질 복합체의 조성물의 전체 전하의 감소를 가정하면, 다른 단백질과의 상호작용 위험을 감소시킨 다는 점에서 또다른 장점이 있다.
계면활성제는 유리하게는, 적어도 하나의 소수성 단편, 및 적어도 하나의 친수성 단편으로 이루어진다. 바람직하게는, 소수성 단편은 지방족 쇄, 소수성 폴리옥시알킬렌, 알킬리덴 폴리에스테르, 벤질 폴리에테르 헤드를 지닌 폴리에틸렌 글리콜 및 콜레스테롤 중에서 선택되고, 친수성 단편은 유리하게는 친수성 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 또는 사카라이드 중에서 선택된다. 이러한 비이온성 계면활성제는 특허출원 PCT/FR98/00222에 기재되어 있다.
본 발명의 주제는 또한, 핵산(및 좀더 일반적으로는 폴리음이온)을 세포 중으로 전달하기 위한 전술한 전달제의 사용이다. 이러한 사용은 이들 형질감염제가 전혀 없거나 매우 감소된 세포 독성을 지니면서 형질감염을 효율적으로 증가시키기 때문에 특히 유리하다.
생체내 사용을 위해, 예를 들면, 유전자의 조절 연구를 위해, 병리학적 증상의 동물 모델의 제작, 또는 치료시 본 발명에 따른 조성물은 국소, 피부, 경구, 직장, 질, 비경우, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피, 기관지내 또는 복막내 경로 등에 의한 투여용으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 주사제형, 특히 목적하는 기관으로의 직접 주사, 또는 국소 경로에 의한 투여(피부 및/또는 점막상)용으로 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히, 등장성 멸균액, 또는 사례에 따라, 멸균수 또는 생리식염수의 첨가시 주사액의 구성을 허용하는 건조, 특히 동결건조 조성물일 수 있다. 주사에 사용된 핵산 용량 및 투여 횟수는 다양한 파라미터, 특히 사용된 투여방식, 해당 병리상태, 발현시킬 유전자, 또는 목적하는 치료 지속기간에 따라 맞출 수 있다. 좀더 구체적으로 투여 방식의 경우, 조직, 예를 들면, 종양 수준에서, 또는 순환계 중으로의 직접 주사, 또는 주사 또는 이식에 의한 생체내 재이식이 뒤따르는 배양 세포 처리일 수 있다. 본 발명에서의 해당조직은 예를 들면, 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 방광, 위, 장, 고환, 난소, 직장, 신경계, 눈, 선(腺), 결합조직 등이다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, 핵산의 세포 중으로의 전달방법에 관한 것이다:
(1)핵산을 전술한 전달제와 접촉시켜 핵지질 복합체를 형성시키는 단계.
(2)단계(1)에서 형성된 복합체와 세포를 접촉시키는 단계.
세포를 핵지질 복합체와 배양하거나(시험관내 또는 생체 사용을 위해), 또는 복합체를 유기체 중으로 주사함으로써(생체내 사용을 위해) 세포를 복합체와 접촉시킬 수 있다. 배양은 바람직하게는 예를 들면, 0.01 내지 1000 ㎍의 핵산/106세포의 존재하에 수행된다. 생체내 투여의 경우, 예를 들면, 0.01 내지 10 mg의 핵산 용량이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 추가로 전술한 하나 이상의 보조제를 함유하는 경우, 보조제는 본 발명에 따른 지질과 또는 핵산과 사전에 혼합된다.
따라서, 본 발명은 특히 질환 치료를 위한 핵산 전달의 특히 유리한 방법을 제공하며, 방법은 단백질을 암호화하거나 질환을 교정할 수 있는 핵산으로 전사될 수 있는 핵산의 생체내, 생체외 또는 시험관내 투여를 포함하며, 핵산은 전술한 조건하에서 화학식 1의 화합물과 배합된다. 좀더 구체적으로는, 이러한 방법은 단백질 또는 핵산 산물의 결핍으로 생기는 질환에 적용될 수 있으며, 투여된 핵산은 단백질 산물을 암호화하거나 핵산 산물로 전사되거나 핵산 산물을 구성한다.
본 발명은 세포의 형질감염을 위한 본 발명에 따른 핵산 전달제의 용도에까지 확장된다.
본 발명의 핵산 전달제는 특히 핵산을 1차 세포 또는 설정된 라인 중으로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 분화되거나 다분화능 형태(전구체)의, 섬유아세포, 근세포, 신경세포(뉴런, 성상세포, 신경교세포), 간세포, 조혈세포주(림프구, CD34, 수지상 세포 등), 상피세포 등일 수 있다.
전술한 것들 외에도, 본 발명은 또한 하기 실시예와 도면으로부터 출현하게 될 기타 특징과 장점도 포함하며, 본 발명의 범위를 제한함이 없이 본 발명을 설명하는 것으로 생각되어야 한다.
실시예 1: 6-메틸벤질옥시갈락토피라노스로부터 전달제 8(a)의 합성
상이한 반응 단계를 도 1/5 및 2/5에 다이어그램으로 나타내었다.
a)6-메틸벤질옥시-2,3,4-트리-O-(2′-카복시에틸)-β-D-갈락토피라노사이드(2)의 합성
6-메틸벤질옥시-β-D-갈락토피라노사이드(1) 28.4 g(0.1 몰)을 교반하에, THF 400 ml에 용해시키고 0℃에 둔다. 미세한 갈색의 수산화칼륨 32 g(5.7 당량), 18-Cr-6 크라운 에테르 0.5 g(2%) 및 에틸브로모아세테이트 32.5 ml(1.5 당량)를 가한다. 두 시간 후에, 혼합물을 증발건고시키고, 물에 용해시킨 다음 수득 용액을 2N 염산으로 중화시킨다. 산물(2) 32 g이 수득되며(수율:70%), 이 산물은 디클로로메탄으로 추출된다.
13C NMR: δ, 172.94; 136.87; 127.93; 127.41; 98.89; 97.22; 78.74; 76.17; 72.97; 69.52; 67.93; 63.59; 54.75.
b)6-메틸벤질옥시-2,3,4-트리-O-(2′-하이드록시에틸)-β,D-갈락토피라노사이드(3)의 합성
선행 트리산(2) 30 g(0.065 몰)을 THF 400 ml에 용해시키고 질소하에 0℃에 둔다. 보란-디메틸 설파이드 40 ml를 교반하에 적가한다. 혼합물을 실온에서 추가로 2 시간 교반한 다음 메탄올을 과량으로 신중하게 가한다. 이어서, 용액을 증발 건고시키고 수득 고체를 메탄올에 수차례 재용해시킨다. 최종 산물(3) 24.5 g이 수득되며(수율:90%), 이 산물을 에틸 아세테이트를 용출제로 사용하여 실리카 칼럼 상에서 정제한다.
c)6-메틸벤질옥시-2,3,4-트리-O-(2′-아지도에틸)-β-D-갈락토피라노사이드(4)의 합성
선행 단계에서 수득한 트리올(3) 20 g(0.048 몰)을 THF 500 ml에 용해시킨다. 트리페닐포스핀 40 g(3.2 당량), 톨루엔 중의 1.1 M 하이드라조산 용액 160 ml(3.7 당량), 및 디에틸아조디카복실레이트 24.2 ml(3.2 당량)을 가한다. 1 시간 후, 용액을 증발시키고 헥산/에틸 아세테이트(6:4) 혼합물을 용출제로 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에서 정제한다. 산물(4) 17.6 g이 수득된다(수율 90%).
13C NMR: δ, 128.47; 127.80; 98.23; 79.05; 76.27; 73.55; 71.92; 70.15; 69.95; 68.77; 68.14; 55.37; 51.41; 51.11; 50.87
d)메틸-2,3,4-트리-O-(2′-아미노에틸)-β-D-갈락토피라노사이드, 트리스하이드로클로라이드(5)의 합성
트리아지드(4) 15 g(0.03 몰)을 에탄올 200 ml에 용해시키고, 12 N 염산 7.5 ml를 가한 다음 혼합물을 탄소상 팔라듐의 존재하에 3 시간 수소로 처리한다. 여과 후, 용매를 증발시키고 수득된 잔사(5)(12.6 g, 수율:95%)를 후속 단계에서 직접 사용한다.
e)메틸-2,3,4-트리-O-(2′-tert-부틸카바미도에틸)-β-D-갈락토피라노사이드(6)의 합성
하이드로클로라이드(5) 12 g(0.028 몰)을 디옥산 100 ml 및 1N 수산화나트륨 85 ml의 혼합물에 용시킨다. 디-tert-부틸 디카보네이트 18.7 g(3.3 당량)을 가하고 혼합물을 실온에서 2 시간 교반한다. 반응 혼합물을 증발시키고 이어서 디클로로메탄(3회 50 ml)으로 추출한다. 유기상을 합하여 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시킨다. 이에 따라 잔사(6) 15.56 g(수율:90%)이 수득되며, 이 잔사를 에틸 아세테이트를 용출제로 사용하여 실리카 겔 칼럼상에서 정제한다.
f)6-메틸디옥타데실아미도석시닐-2,3,4-트리-O-(2′-tert-부틸카바미도에틸)-β-D-갈락토피라노사이드(7a)의 합성
선행 산물(6) 10 g(0.016 몰)을 디클로로메탄 300 ml에 용시킨다. 디옥타데실아미도석신산 14.6 g(1.5 당량), 디메틸아미노피리딘 1.95 g(1 당량) 및 디사이클로헥실카보디이미드 6.5 g(2 당량)을 연속적으로 가한다. 디옥타데실아민을 석신산 무수물과 반응시켜 디옥타데실아미도석신산을 수득한다. 하룻밤 후, 메탄올 중의 옥살산 용액 10 ml를 주의를 기울여 가하고 혼합물을 1 시간 교반한다(일산화탄소 방출). 용액을 여과하고 증발 건고시킨 다음, 수득 산물을 헵탄/에틸 아세테이트(7:3) 용액을 용출제로 사용하여 실리카 겔 상에서 정제한다. 산물(7a) 12.8 g이 수득된다(수율:65%).
g)6-메틸-디옥타데실아미도석시닐-2,3,4-트리-O-(2′-아미노에틸)-β-D-갈락토피라노사이드, 트리스트리플루오로아세테이트(8a)의 합성
산물(7a) 10 g(0.016 몰)을 트리플루오로아세트산 20 ml에 용해시킨다. 30분 후, 용액을 증발시키고 잔사를 톨루엔 20 ml에 3회 취한다. 수득된 잔사(8a)를 HPLC(RP4;물/아세토니트릴; 0 - ＞ 100%; 20분)로 정제한다. 이에 따라 산물(8a) 9.7 g이 수득된다(수율 95%).
MH+=1304.
실시예 2: 6-메틸벤질옥시갈락토피라노스로부터 화합물 8(b)의 합성
상이한 반응단계를 도 1/5와 2/5에 다이어그램으로 나타내었다.
합성의 제 1 단계는 실시예 1에 기술된 합성단계 a) 내지 e)와 동일하다. 이어서, 절차를 하기의 방법으로 계속한다:
f)6-메틸디옥타데실아미도프탈릴-2,3,4-트리-O-(2′-tert-부틸카바미도에틸)-β-D-갈락토피라노사이드(7b)의 합성
이 산물은 디옥타데실아미도석신산 대신에 디옥틸데실아미도프탈산을 사용하는 것을 제외하고는 산물(7a)에서와 동일한 방법으로 수득된다.
g)6-메틸디옥타데실아미도프탈릴-2,3,4-트리-O-(2′-아미노에틸)-β-D-갈락토피라노사이드, 트리스트리플루오로아세테이트(8b)의 합성
화합물(8b)을 산물(8a)에서와 동일한 방법으로, 선행 단계에서 수득된 산물(7b)로부터 수득한다.
MH+=1317
실시예 3:트리아세틸 글루칼로부터 전달제(16)의 합성
a)프탈이미도프로필-4,6-디-O-아세틸-2,3-비스데옥시-β-D-에리스로-2-헥세노피라노사이드(10)의 합성
상이한 반응 단계를 도 3/5에 나타내었다.
트리아세틸-D-글루칼(9) 13.17 g(0.048 몰)을 디클로로메탄 250 ml에 용해시킨다. 프탈이미도프로판올 11 g(1.1 당량) 및 붕소 트리플루오라이드 에테레이트 1.56 ml(0.26 당량)를 가한다. 실온에서 1 시간 후, 혼합물을 중탄산나트륨의 포화용액으로 중화시키고, 용액을 경사하여 건조시킨 다음 증발시킨다. 이에 따라 산물(10) 16 g이 수득되며(수율:80%), 이 산물을 헵탄/에틸 아세테이트(5:5) 용액을 용출제로 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에서 크로마토그래피로 정제한다.
b)프탈이미도프로필-4,6-디-O-아세틸-2,3-비스데옥시-β-D-글루코피라노사이드(11)의 합성
글리코사이드(10) 16 g(0.038 몰)을 에탄올 200 ml에 용해시킨다. 탄소상 10% 팔라듐 0.16 g을 가하고, 혼합물을 2 시간 수소 처리한다. 여과 후, 용액을 증발시킨다. 산물(11) 15.7 g이 수득된다(수율:99%).
c)프탈이미도프로필-2,3-비스데옥시-β-D-글루코피라노사이드(12)의 합성
선행산물(11) 15 g(0.036 몰)을 메탄올 250 ml에 용해시킨 다음, 1N 나트륨 메톡사이드 3.5 ml(0.1 당량)을 가한다. 두 시간 후, 혼합물을 IR120 앰벌라이트 수지로 중화시킨다. 산물(12) 11.5 g이 여과 및 증발 후에 수득된다(수율:96%).
d)프탈이미도프로필-4,6-디아지도-2,3,4,6-테트라데옥시-β-D-글루코피라노사이드(13)의 합성
탈아세틸화 산물(12) 11 g(0.033 몰)을 THF 250 ml에 용해시킨다. 트리페닐포스핀 21.5 g(2.5 당량) 및 톨루엔 중의 1.1 M 염산 110.5 ml(3.7 당량)을 교반하에 연속적으로 가한다. 디에틸아조디카복실레이트 12.88 mm(2.5 당량)을 혼합물의 온도가 30℃를 초과하지 않도록 하는 비율로 가한다. 1 시간 후, 용액을 증발 건고시키고 수득 산물을 헵탄/에틸 아세테이트(8:2) 혼합물을 용출제로 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에서 정제한다. 산물(13) 7.2 g이 수득된다(수율:57%).
e)아미노프로필-4,6-디아지도-2,3,4,6-테트라데옥시-β-D-글루코피라노사이드(14)의 합성
산물(13) 7 g(0.018 몰)을 에탄올 500 ml에 용해시킨 다음 하이드라진 하이드레이트 2.6 ml를 가한 다음, 혼합물을 40℃에서 2 시간 교반한다. 증발 후, 잔사를 디클로로메탄 중에 재용해시키고 형성되는 프탈릴하이드라지드를 결정화시킨다. 용액을 여과하고 증발시킨다. 이에 따라 산물(14) 4.17 g이 수득된다(수율:90%).
f)콜레스테릴-O-포름아미도프로필-4,6-디아지도-2,3,4,6-테트라데옥시-β-D-글루코피라노사이드(15)의 합성
콜레스테릴 클로로포메이트 6.34 g(0.9 당량) 및 산물(14) 4 g(0.016 몰)을 에틸 에테르 200 ml에 용해시킨다. 침전물이 즉시 형성되며, 1N 수산화나트륨 50 ml를 가한다. 수 분 후에, 용액은 다시 투명해진다. 이를 추가로 30분간 교반상태로 유지시킨 다음 경사하고, 물 50 ml로 2회 세척하며, 용액을 증발 건고시킨다. 이에 따라 산물(15) 9.4 g이 수득되며, 이 산물을 헵탄/에틸 아세테이트(6.4) 용액을 용출제로 사용하여 칼럼 상에서 정제한다(수율:90%).
g)(콜레스테릴-O-포름아미도프로필)-4,6-디아미노-2,3,4,6-테트라데옥시-β-D-글루코피라노사이드(16)의 합성
다아지드(15) 9 g(0.013 몰)을 80% THF 150 ml에 용해시킨 다음, 트리페닐포스핀 14.2 g(4 당량)을 가하고 혼합물을 1 시간 동안 50℃에서 가열한다. 냉각 후, 혼합물을 IRC-50 COOH 음이온 수지의 칼럼 상에 로딩하고, 80% THF로 세척한다. 이어서, 산물을 THF/물/아세트산(64/16/10) 혼합물을 사용하여 아세테이트 형태로 용출시킨다. 이에 따라 산물(16) 8.9 g이 수득된다(수율:90%).
13C NMR: δ, 176.55; 156.65; 139.84; 132.02; 128.46; 125.46; 122.44; 97.11; 74.28; 56.66; 56.12; 50.02; 43.70; 42.30; 39.51; 38.57; 36.98; 36.55; 36.16; 35.76; 31.87; 30.30; 29.89; 28.18; 23.82; 22.78; 22.53; 21.03; 19.31; 18.70; 11.84.
실시예 4: 화합물(17)의 합성
a)벤질(5-O-아세틸-6-아세톡시메틸-5,6-디하이드로-2H-피란-2-일옥시)아세테이트의 합성
트리아세틸 D-글루칼(0.01 몰) 2.8 g 및 벤질 글리콜레이트 1.6 ml(1.1 당량)을 클로로포름 80 ml에 용해시킨다. 혼합물을 빙욕에서 냉각시키고 붕소 트리플루오라이드 에테레이트 0.651 ml(0.5 당량)을 가한다. 45분 후에, 혼합물을 중탄산나트륨 포화 수용액으로 중화시키고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과 및 농축시킨다. 혼합물을 헵탄/에틸 아세테이트(6:4) 혼합물을 용출제로 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 정제한다. 수율은 96%이다.
b)(5-O-아세틸-6-아세톡시메틸테트라하이드로피란-2-일옥시)아세트산의 합성
선행 산물 3.5 g(0.0093 몰)을 탄소상 10% 팔라듐 0.35 g의 존재하, 대기압 및 실온에서 수소화시킨다. 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 농축시킨 다음 에틸 아세테이트를 용출제로 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 정제한다. 수율은 90%이다.
c)N,N-디옥타데실(5-O-아세틸-6-아세톡시메틸테트라하이드로피란-2-일옥시)아세트아미드의 합성
선행 산물 0.675 g(0.0017 몰)을 클로로포름 8.6 ml에 용해시키고, 디옥타데실아민 0.899 g(1 당량) 및 디사이클로헥실카보디이미드 0.426 g(1.2 당량)을 가한다. 실온에서 하룻밤 후, 혼합물을 농축시키고 산물을 헵탄으로 추출한다. 혼합물을 헵탄/에틸 아세테이트(8:2) 혼합물을 용출제로 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에서 크로마토그래피로 정제한다. 수율은 70%이다.
d)N,N-디옥타데실(5-하이드록시-6-하이드록시메틸테트라하이드로피란-2-일옥시)아세트아미드의 합성
선행 산물 1.57 g(0.00198 몰)을 메탄올 10 ml에 용해시킨다. 나트륨 메톡사이드 0.197 ml(0.2 당량; 메탄올 2M)를 가한다. 실온에서 2 시간 후, 혼합물을 중화시키고 농축시킨다. 혼합물을 헵탄/에틸 아세테이트(8:2) 혼합물을 용출제로 사용하여, 실리카 겔 칼럼 상에서 크로마토그래피로 정제한다. 수율은 92%이다.
e)N,N-디옥타데실(5-아지도-6-아지도메틸테트라하이드로피란-2-일옥시)아세트아미드(17)의 합성
선행 산물 0.6 g(0.00087 몰)을 THF 15 ml에 용해시킨다. 트리페닐포스핀 0.48 g(2.1 당량)을 가한 다음 DEAD 0.288 ml(2.1 당량)을 가한다. 발열반응이 완료되면, 톨루엔 중의 1.38 M 하이드라조산 용액 1.588 ml(2.5 당량)을 가한다. 반응 말미에, 매질을 농축시키고, 헵탄에 취하여, 여과한 다음 농축한다. 이어서, 혼합물을 헵탄/에틸 아세테이트(8:2) 혼합물을 용출제로 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에서 크로마토그래피로 정제한다. 수율은 72%이다.
13C NMR: δ, 173.21; 172.07; 162.22; 161.77; 118.34; 114.49; 110.65; 108.34; 96.88; 65.18; 64.50; 48.27; 46.54; 40.69; 35.86; 31.78; 30.94; 28.63; 27.56; 26.92; 22.54; 21.84; 13.94.
실시예 5: 본 발명의 형질감염제 (8a) 및 (8b)와 DNA의 결합
본 실시예는 본 발명의 형질감염제와 DNA 간의 결합 성질, 및 복합체의 형성을 설명한다.
본 발명에 따른 형질감염제를 물에 10 mM로 용해시킨다. 이렇게 하여 수득된 용액은 투명하고 양이온 지질 미셀 형태의 구조에 상응한다.
형질감염제/DNA 복합체를 DNA ㎍당 형질감염제 6 나노몰의 비로 제조한다.
형질감염제(8b)와 DNA의 결합은 크기가 92 nm ± 27 nm이고, 300 mM에서 수중 형광성이 7% 및 염화나트륨 중 형광성이 60%인 복합체를 생성한다.
DNA와 결합된 본 발명의 형질감염제(8b)는 크기가 98 nm ± 20 nm에 근접하고, 300 mM에서 수중 형광성이 7% 및 염화나트륨 중 형광성이 55%인 복합체의 형성을 허용한다.
이러한 결과는 본 발명에 따른 형질감염제가 DNA와 결합할 수 있고, 세포막 횡단에 특히 적당한 크기를 구성하는 평균 직경 약 100 nm의 입자를 형성할 수 있음을 보여준다. 이러한 결합은 배지의 강도가 증가될 때 상대적으로 안정하게 남는다. 사실, 300 mM에서, DNA의 50% 이상이 본 발명의 형질감염제와 결합된 채로 남는다.
실시예 6: 본 발명의 형질감염제(8a) 및 (8b)를 사용한 시험관내에서 DNA의 형질감염
형질감염 효율은 DNA ㎍당 다양한 용량의 벡터에서 시험관내 평가된다.
이러한 실험에 사용되는 유전물질은 "루시퍼라제" 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 작제물 pCMV-Luc이며, 이 작제물은 플라스미드 pcDNA3[Invitrogen]으로부터 추출된 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 함유하는 MluI-HindIII 단편을 삽입시킴으로써 플라스미드 pGL2-기본 벡터[Promega]로부터 유도된다.
생리식염수(0.15 M 염화나트륨) 중 40 ㎍/ml의 희석 핵산 용액이 또한 사용된다.
본 발명에서 기술된 산물을 물에 80 내지 800 μM의 농도로 물에 용해시키고, DNA 용액과 용적/용적으로 혼합한다. 최종 식염수 농도는 사이토펙턴트 용액을 새로 제조하기 위해 75 mM이다.
형질감염을 위해, 세포를 적절한 조건하에 24-웰 마이크로플레이트에 배양하고(2 cm2/웰) 대수 증식기에 있는 동안 50-70% 융합율로 형질감염시킨다.
세포를 혈청 단백질을 함유하지 않는 배지 500 ㎕로 2회 세척한다. 사이토펙턴트 혼합물 50 ㎕[DNA 1 ㎍/웰]를 이들 세포에 가한다[3 웰/조건 벡터-DNA]. 증식배지에 형질감염 2 시간 후 적당량의 혈청을 보충한다.
Promega 키트[Luciferase Assay System] 사용에 대해 주어진 권장에 따라 루시퍼라제의 발현을 측정함으로써 해독 48 시간 후 형질감염 효율을 평가한다. 사이토펙턴트 혼합물의 독성은 세포 용해물내 단백질 농도의 측정에 의해 평가된다.
헬라세포의 형질감염에 대해 수득된 결과는 도4/5에 모아 놓았으며, NIH3T3 세포에서 수득한 것들은 표 5/5에 나타내었다.
이들 두 도면 및 DNA ㎍당 20 nmol 이상의 벡터/DNA 비에 대해 수득된 결과로부터, 벡터/DNA 비가 DNA ㎍당 벡터 2 내지 20 나노몰일 때 형질감염이 특히 효율적임을 추론해낼 수 있다.
제시된 결과는 사용된 두 세포형의 경우, 형질감염 효율이 DNA ㎍당 벡터 4 내지 12 나노몰의 비, 더욱 정확하게는 DNA ㎍당 벡터 8 내지 12 나노몰의 비에 대한 최적임을 보여준다.
또한, 벡터의 용량 효과를 제시하는 히스토그램이 고려되는 세포형과 무관하게 산물(8a) 및 (8b)에 대해 중첩될 수 있음이 관찰된다.
본 발명의 두 산물은 NIH 3T3 세포에 대해 검토된 벡터 용량에서 유독하지 않다. 사실, 형질감염 세포의 샘플당 벡터 8 나노몰 이상의 용량에 대해서만 세포 단백질의 20% 최대 손실이 관찰될 뿐이다.

Claims (29)

  1. 양이온 친수성 영역이 아미노 그룹으로 치환된, 5개 또는 6개의 원자를 함유하는 적어도 하나의 헤테로사이클로 이루어짐을 특징으로 하는, 적어도 하나의 양이온 친수성 영역과 하나의 친유성 영역을 포함하는 형질감염제.
  2. 제 1 항에 있어서, 형질감염제 합성 중간체인 양이온 친수성 영역이 화학식 1로 표현됨을 특징으로 하는 형질감염제.
    화학식 1
    상기식에서,
    - y는 0 또는 1인 정수이고, 상이한 y′는 상호 독립적이며,
    - X는 산소, 질소, 황 또는 셀레늄 원자를 나타내며,
    - Z는 상호 독립적으로,
    ·수소원자,
    ·OR 그룹[여기에서, R은 수소원자, 메틸 그룹 또는 그룹 (CH2)n-NR1R2(여기에서, n은 1 내지 6의 정수이고 R1및 R2는 상호 독립적으로 수소원자 또는 그룹 (CH2)q-NH2를 나타내며, q는 1 내지 6으로 다양할 수 있으며, 상이한 q′은 상호 독립적이다)이다],
    ·그룹 (CH2)m-NR1R2(여기에서, m은 0 내지 6의 정수이고 R1및 R2는 전술한 바와 같다), 또는
    ·양이온 친수성 영역과 지질 영역의 결합을 허용하는 "스페이서" 그룹을 나타내며,
    Z 치환체 중 적어도 하나는 아미노 그룹을 운반한다.
  3. 제 2 항에 있어서, 화학식 1에서, n이 그룹 (CH2)n-NR1R2에서 2, 3 및 4 중에서 선택된 정수임을 특징으로 하는 형질감염제.
  4. 제 2 항에 있어서, 양이온 친수성 영역이 피라노스 또는 퓨라노스 형태의 글리코사이드로 이루어짐을 특징으로 하는 형질감염제.
  5. 제 2 항에 있어서, 화학식 1에서, 환에 존재하는 y가 1이고 X가 산소원자임을 특징으로 하는 형질감염제.
  6. 제 5 항에 있어서, 추가로, Z 그룹 중 적어도 하나가 아미노 작용그룹을 포함함을 특징으로 하는 형질감염제.
  7. 제 5 항에 있어서, 추가로, Z 그룹 중 적어도 2개가 아미노 작용그룹을 포함함을 특징으로 하는 형질감염제.
  8. 제 5 항에 있어서, 추가로, Z 그룹 중 2개가 수소원자이고, 2개의 다른 Z 그룹이 질소 함유 그룹, 특히 아미노 그룹이고 마지막 Z 그룹이 OR 그룹(R은 제 2 항에서 정의한 바와 같다)을 나타냄을 특징으로 하는 형질감염제.
  9. 제 8 항에 있어서, OR 그룹이 화학식 1의 헤테로사이클 상의 2 위치에 존재함을 특징으로 하는 형질감염제.
  10. 제 5 항에 있어서, 추가로, 적어도 2개의 Z 그룹이 O-(CH2)2-NH2그룹이고 Z 그룹 중 적어도 하나가 OR 그룹(R은 제 2 항에서 정의한 바와 같다)을 나타냄을 특징으로 하는 형질감염제.
  11. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 형질감염제 합성 중간체인 양이온 친수성 영역이
    중에서 선택됨을 특징으로 하는 형질감염제.
  12. 제 1 항에 있어서, 친유성 영역이 하나 이상의 임의로 할로겐화, 포화 또는 불포화된, 직쇄 또는 측쇄 지방족 쇄 및/또는 스테로이드 유도체로 이루어짐을 특징으로 하는 형질감염제.
  13. 제 12 항에 있어서, 지방족 쇄가 10 내지 22개의 탄소원자, 특히 14, 16, 17, 18 및/또는 19개의 탄소원자를 함유함을 특징으로 하는 형질감염제.
  14. 제 12 항 또는 13 항에 있어서, 지방족 쇄가 (CH2)13CH3, (CH2)15CH3, (CH2)16CH3, (CH2)17CH3및 (CH2)18CH3중에서 선택됨을 특징으로 하는 형질감염제.
  15. 제 12 항에 있어서, 스테로이드 유도체가 콜레스테롤, 콜레스탄올, 3-α-5-사이클로-5-α-콜레스탄-6-β-올, 콜산, 콜레스테릴 포메이트, 콜레스타닐 포메이트, 3α,5-사이클로-5α-콜레스탄-6β-일 포메이트, 콜레스테릴아민, 6-(1,5-디메틸헥실)-3a,5a-디메틸헥사데카하이드로사이클로펜타[a]사이클로프로파[2,3]사이클로펜타[1,2-f]나프탈렌-10-일아민, 또는 콜레스타닐아민 중에서 선택됨을 특징으로 하는 형질감염제.
  16. 제 1 항에 있어서, 친유성 영역이 가수분해성 작용그룹을 포함하는 산 또는 아미노 그룹으로 이루어진 "스페이서"에 의해 양이온 친수성 영역에 결합됨을 특징으로 하는 형질감염제.
  17. 제 16 항에 있어서, 스페이서"가 지방족 또는 방향족 쇄로 이루어지고, 아미드, 에스테르, 에테르, 카바메이트 및 방향족 환 중에서 선택된 하나 이상의 그룹을 포함함을 특징으로 하는 형질감염제.
  18. 제 16 항에 있어서, "스페이서"가 -O-CO-(CH2)x-COOH, -O-(CH2)x-COOH, -O-CO-(CH2)x-NH2, -O-(CH2)x-NH2, -NH-(CH2)x-NH2중에서 선택되고, x가 1 내지 6의 정수를 나타냄을 특징으로 하는 형질감염제.
  19. 제 1 항에 있어서, 화학식 16, 17, 8a 또는 8b의 화합물 중 하나로 표현됨을 특징으로 하는 형질감염제.
    화학식 16
    화학식 17
    화학식 8a
    화학식 8b
  20. 친유성 영역을 "스페이서"에 의해 화학식 1의 헤테로사이클에 커플링시킴을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 따른 형질감염제의 제조방법.
  21. 제 1 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 따른 형질감염제 및 적어도 하나의 핵산을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 형질감염제/핵산 비가 DNA ㎍당 형질감염제 0.1 내지 50 나노몰임을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 21 항에 있어서, 추가로 하나 이상의 보조제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 보조제가 중성 지질임을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 23 항에 있어서, 보조제가 핵산의 응축에 직접 또는 간접적으로 수반되는 화합물임을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 21 항 내지 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사제용의 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 21 항 내지 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 및/또는 점막에 적용하기 위한 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  28. 핵산을 세포 중으로 전달하기 위한 제 1 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 따른 형질감염제의 용도.
  29. (1)핵산을 제 1 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 따른 전달제, 및 경우에 따라 보조제와 접촉시켜 핵지질 복합체를 형성시킨 다음,
    (2)세포를 단계(1)에서 형성된 복합체와 접촉시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 핵산의 세포 중으로의 전달방법.
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