CN1259134A - 新型的核酸阳离子转染剂 - Google Patents

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D·谢尔曼
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Abstract

本发明涉及一类新的阳离子核酸转染剂,其特征在于,该转染剂含有至少一个与阳离子亲水区相连的亲脂区,所述阳离子亲水区由一个被氨基取代的5原子或6原子杂环组成。

Description

新型的核酸阳离子转染剂
本发明涉及一类新型阳离子转染剂、涉及含有该转染剂的药物组合物、涉及其在体内、离体和/或体外的核酸转染方面的应用及其制备方法。
随着生物技术的发展，今后可能将核酸转移到细胞中。这些转移的效力对于矫正在许多遗传病中涉及的核酸表达的缺乏和/或异常的表达看来是必要的。但是，核酸转移的意义并不限于基因治疗。另外，核酸转移可以用于研究基因表达的调控、基因的克隆，或者用于所有其它的牵涉核酸的体外实验操作，以及用于制造重组蛋白质。这还涉及在体内的核酸转移，比如用来得到转基因动物、实现疫苗接种、研究分子标记。另外，在骨髓移植、免疫治疗或其他有关在从器官抽取的细胞中转移基因的其他方法中，也可能涉及离体细胞中的核酸转移。
如今，提出了许多方法来进行此类遗传信息的细胞内释放。其中一种方法特别提出使用化学的或生化的载体。这些合成的载体具有两个主要功能：与要转染的DNA复合和促进其细胞固定作用以及促进它穿过原生质膜，而且必要时穿过双层核膜。在开发的合成载体中，聚赖氨酸类的阳离子聚合物和DEAE葡聚糖或脂转染剂都是最有利的。
随着使用脂转染剂类阳离子转染剂，更准确说是阳离子脂类的技术的发展，此转染模式取得了重大的进展。已证实，带正电荷的阳离子脂类，如呈脂质体或小泡囊状的N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)自发地干扰带负电荷的DNA，形成能够与细胞膜融合的脂-DNA复合物，因此能够进行DNA的细胞内释放。
从DOTMA以后，在此同样的结构模型上，也就是说在亲脂基团通过也称作“间隔基团”的一个臂与氨基接合的模型上，开发了其它的阳离子脂类。其中特别可以举出含有脂肪酸或胆固醇衍生物作为亲脂基团，以及如有必要还含有季铵基团作为氨基的化合物。可以特别举出DOTAP、DOBT或ChOTP作为这类阳离子脂质的代表。其它的化合物如DOSC和ChOSC的特征是具有胆碱基团而不是季铵基团。
还报道了另一类脂类转染剂，即脂多胺。一般说来，这涉及含有至少一个由通过“间隔基团”与亲脂区相连的亲水区的两亲分子。带正电荷的多胺区能够以可逆的方式与带负电荷的核酸相连。这种相互作用强烈地使核酸密集化。至于亲脂区，通过覆盖由脂质层形成的复合物，它使这种离子相互作用对外界环境不敏感。在这类化合物中，阳离子基团可以用含有4个铵基的L-5-羧基精胺作为代表，其中两个是伯胺，两个是仲胺。DOGS和DPPES特别由它们构成一部分。这些脂多胺对于初级内分泌细胞的转染都是有效的。作为这类化合物的代表，可以特别举出在比如专利申请WO 96/17823和WO97/18185中叙述的脂多胺。
尽管如此，这类合成载体的有效性仍须改进，特别是在电荷密度和转染剂分子的刚性方面。
实际上，一般认为这些化合物的活性取决于它们达到的电荷密度。但是，电荷在脂肪链上的增多是显现毒性的根源。因此，将脂肪链上电荷密度的稳定化将有可能防止出现毒性因素。再者，在脂肪链以外的区域增大电荷密度，将会增加转染的效果。
此外，用于核酸转移的分子的柔软性可能是在所述核酸和转染剂之间足够密切的相互作用的障碍，这阻碍着实现核酸分子的最佳紧密化，而这种紧密化是所有转染所必须的先决条件。转染剂分子的刚性增加将保证与核酸的更有效的相互作用，这样就改善了转染。
因此，特别有意义的是提供一种转染能力提高，同时又具有较低、或者零毒性的转染剂。这就是本发明提出要达到的目的。
实际上，本发明的确切的目的是提供一种新型的转染剂，该转染剂具有新颖的阳离子亲水区赋予所述的转移剂上述的特定性能。
更确切地说，本发明涉及一种转染剂，它含有至少一个与亲脂区相连的阳离子亲水区，所述阳离子亲水区包括至少一个被氨基取代的5原子或6原子杂环。
带正电荷的亲脂区能够以可逆的方式与带负电荷的核酸相结合，这样核酸就强烈地被紧密化。另外，阳离子部分的新颖结构使分子的刚性增加。
阳离子亲水区是合成本发明的核酸转移剂的中间体，更具体它用通式(I)来代表：
Figure A9880579900091
其中：
—y是0或1的整数，不同的y彼此是独立的，
—X表示氧、氮、硫或硒原子，
—Z基团彼此独立地表示
  ·氢原子
  ·基团OR，其中R表示氢原子、甲基或基团(CH2)n-NR1R2，这
其中n是选自1-6(含)的整数，R1和R2彼此独立地表示氢原子
或基团(CH2)q-NH2，q可以在1-6(含)中变化，不同的q是彼此
独立的，
  ·基团(CH2)m-NR1R2，其中m是选自0-6(含)的整数，R1和R2
如前面所定义，或
  ·连接阳离子亲水区和亲脂区的“间隔基团”，
条件是，至少一个取代基Z带有氨基。
本发明的转移剂含有至少一个通式(I)的阳离子亲水区。按照本发明的一个实施方案，该转移剂含有两个或更多的阳离子亲水区，它们在基团Z上彼此相连。
按照本发明的一个优选实施方案，当取代基Z中有一个表示OR，而R表示基团(CH2)n-NR1R2时，n优选选自2、3或4。
按照本发明的一个优选实施方案，该转染剂含有一个通式(I)的阳离子亲水区，其中X表示氧原子。这时的阳离子亲水部分为一个吡喃糖或呋喃糖形式的糖苷。吡喃糖的形式是特别有意义的，在实施例中进行了非限定性的叙述。
按照本发明的第二个优选的实施方案，该转染剂含有一个通式(I)的阳离子亲水区，它为含有6个链节的含氨基糖苷(在环上的y等于1)，X是氧原子，至少一个取代基Z带有氨基。更优选的是，至少两个取代基Z中带有氨基。
按照本发明的另一个实施方案，该亲水区为一个通式(I)的含氨基糖苷，其中两个y都等于1，X是氧原子，两个基团Z表示氢原子，另外两个Z是含氮的基团，优选是氨基，最后的基团Z表示一个基团OR，R如前面所定义。按照优选的方式，基团OR位于构成本发明转染剂阳离子亲水区的杂环的2-位上。
按照本发明的另一个优选实施方案，该阳离子亲水区为一个通式(I)的含氨基糖苷，其中环上的y等于1，X是氧原子，至少两个基团Z相当于基团O-(CH2)q-NH2，q如前面所定义，至少一个基团Z表示OR，R如前面所定义。
作为通式(I)的阳离子亲水区的代表，也是用于合成本发明转移剂的中间体，更具体可以举出下面的化合物：
一般说来，本发明的转染剂含有与亲脂区相连的至少一个如上所定义的阳离子亲水区。
构成本发明的亲脂区的分子选自本领域技术人员已知的亲脂分子。该亲脂区优选包括一个或几个直链的或分链的、饱和的或不饱和的、任选卤代的脂族链。该亲脂区还可以优选自类固醇衍生物。
按照本发明的一个优选实施方案，亲脂部分由一个或几个含有10-22个碳原子，更优选含有12-22个碳原子的脂族链组成。作为例子，可以举出含有14、16、17、18或19个碳原子的脂族链，特别是-(CH2)13-CH3、-(CH2)15-CH3、-(CH2)16-CH3、-(CH2)17-CH3和-(CH2)18-CH3。
本发明转移剂的亲脂部分也可以优选自类固醇衍生物，比如胆固醇、胆甾烷醇、3-α-5-环-5-α-胆甾烷-6-β-醇、胆酸、胆固醇甲酸酯、胆甾烷醇甲酸酯、3α，5-环-5α-胆甾烷-6β-醇甲酸酯、胆甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基十六氢环戊二烯并[a]环丙[2，3]环戊二烯并[1，2-f]萘-10-基胺，或者胆甾烷基胺。
按照一个优选的实施方案，阳离子亲水区通过一个所谓的“间隔基团”中间分子与亲脂区相连。按照本发明的意思，“间隔基团”指的是所有本领域技术人员已知的含有可获得阳离子亲水部分和亲脂区之间的酰胺键、氨基甲酸酯键、酯键、醚键或芳香环连接的功能团的酸或胺取代基。亲水部分和亲脂部分之间的连接优选在存在于通式(I)的阳离子亲水中间体上的基团Z之一上进行，该中间体可用来合成本发明的转移剂。两个亲水区和亲脂区之间的连接优选在通式(I)的阳离子亲水部分的环上，在-2位，或在-5位或-6位(如果环上有y，它等于0或1)，通过“间隔基团”来实现。
按照优选的方式，“间隔基团”具有脂族链或芳香链。另外，“间隔基团”优选含有一个或几个选自酰胺、氨基甲酸酯、酯、醚或芳香环的基团。“间隔基团”特别优选是如下通式的基团：-O-CO-(CH2)x-COOH、-O-(CH2)x-COOH、-O-CO-(CH2)x-NH2、-O-(CH2)x-NH2、-NH-(CH2)x-NH2，这里x表示选自1-6(含)的整数。
作为本发明的转染剂的代表，更具体可以举出如下通式的化合物(16)、(17)、(8a)和(8b)：
Figure A9880579900121
本发明还涉及制备如上所定义的新一类核酸转染剂的方法。更确切说，本发明涉及由通过一个“间隔基团”与脂区连接的单取代的或多取代的杂环制备所述转染剂的方法。
根据氨基官能团相对于环的位置及其数量的不同，通式(I)的阳离子亲水区可以用不同的方法制备。
当希望得到式中至少一个取代基Z是能够与亲脂部分连接的“间隔基团”，而至少一个基团Z是OR基，这里R表示基团-(CH2)n-NR1R2的通式(I)阳离子亲水区时，由式中所有的取代基-O-(CH2)n-NR1R2都是羟基的相应衍生物进行操作。
第一步，所述带有羟基的衍生物按照本领域技术人员已知的传统方法进行-O-烷基化。特别是在传统的烷基化溶剂中，在冠醚存在下，在10-60℃的温度下，借助于碱性介质中的烷基化试剂进行。
作为烷基化试剂特别使用烷基胺、酯的卤代衍生物，比如卤代乙酸烷基酯、或者醇的卤代衍生物。优选使用溴代乙酸烷基酯。烷基官能团根据所希望给出的n值进行选择。比如对于n等于2，优选使用溴代乙酸乙酯。
使用的溶剂是O-烷基化的传统溶剂，比如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、四氢呋喃(THF)等，优选使用THF。
反应在碱存在下进行，比如在氢氧化钾或氢化钠存在下。
第二步，按照本领域技术人员已知的传统方法，在醇中将得到的衍生物的羧基官能团还原。特别是在相容的传统溶剂中，通过还原剂的作用进行。
作为还原剂，可举出比如硼烷甲硫醚(BMS)、氢化锂铝或硼氢化钠。
相容的溶剂是比如醚类或醇类。优选使用四氢呋喃(THF)。
第三步，用本领域技术人员已知的传统方法将得到的羟基官能团叠氮化。
特别是在与反应相容的溶剂中，在三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯存在下借助于叠氮酸进行反应。
可以使用的溶剂是叠氮化的传统溶剂，比如四氢呋喃、苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷等，优选四氢呋喃(THF)。
最后，通过本领域技术人员已知的传统方法，将叠氮官能团转化为氨基官能团。
特别是在碳载钯存在下，在酸性介质中还原，比如通过在酸性介质中加氢来进行反应，或者使用Staudinger反应，或通过还原剂的作用，如氢化锂铝、硼氢化钠、氯化亚锡等。
如此得到了通式(I)的阳离子亲水化合物，其中至少一个Z是能够连接在亲脂部分上的“间隔基团”，至少一个基团Z是基团OR，这里的R表示基团-(CH2)n-NR1R2。
然后通过本领域技术人员已知的传统方法进行与亲脂部分的连接，特别是通过肽偶联的方法，见Bodanski M.的《肽合成的原理和实践》(Principles and Practices of Peptides Synthesis)，Springe-Verlag出版社。偶联发生在表示“间隔基团”的Z上。
当Z中有一个是“间隔基团”时，如有必要要预先将其保护起来。阳离子亲水部分所具有的氨基官能团也一样，它优选在进行肽偶联时预先保护起来。按照常规方法进行保护基团的保护和消去。
可以通过各种相容的基团进行保护，其使用和消去都不会改变分子的其余部分。特别是按照T.W.Greene在《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Syntheses)A，Wiley-Interscience出版社(1981)，或Mc OMIE在《有机化学中的保护基团》(Protective Groups in Organic Chemistry)，Plenum出版社(1973)中叙述的方法进行。
作为例子，保护基团可以选自三甲基甲硅基、二苯甲基、四氢吡喃基、甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、乙氧基羰基、叔丁氧羰基、三氯乙氧基羰基等。
另一种合成途径能够导致第二系列阳离子亲水化合物。此第二种实施方案与第一种之不同在于糖的骨架发生改形。
实际上，使用的原料是通式(II)的烯糖：
其中，取代基Z’是乙酰氧基。使用的烯糖是商品，或者由本领域技术人员已知的各种方法从商品糖得到，特别是通过相应的乙酰溴代糖与锌/铜偶的反应得到。
第一步，按照本领域技术人员已知的传统方法将乙酰基烯糖烷基化。
特别是使用Ferrier反应，在Lewis酸存在下与氨基醇、烷氧基羰基醇、羧基醇或者其它各种带有可以与脂区偶联的基团的醇进行反应。
反应优选在三氟化硼存在下，在相容的溶剂如乙醚之类的醚类中进行。
第二步，按照本领域技术人员已知的传统方法，还原得到的不饱和糖苷。
特别是在碳载钯存在下，在酸性介质中进行还原，比如在酸性介质中加氢。
然后，第三步，通过各种本领域技术人员已知的方法，将环上的乙酰氧基转化为羟基。
特别是借助于醇盐如甲醇钠进行酯交换。
第四步，用本领域技术人员已知的方法，将环上的羟基官能团转化为叠氮官能团。
特别是在与反应相容的溶剂中，在三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯存在下，通过叠氮酸的作用进行此反应。
可以使用的溶剂是叠氮化的传统溶剂，优选四氢呋喃(THF)。
如此得到通式(III)的阳离子亲水区
Figure A9880579900161
其中，Z是氢原子或者是叠氮基，Z”中至少一个不是氢。
可以按照本领域技术人员已知的方法将亲脂部分偶联到氨基官能团-NR1R2上，特别是使用肽偶联(见Bodanski的《肽合成的原理和实践》)，或者通过缩合。
在第一步过程中使用的醇含有氨基、酯或各种其它的能够与亲脂区偶联的官能团，这些官能团优选预先保护起来。在与亲脂区偶联以前保护基团的保护和消去都按照常规方法进行。
可以用各种相容的基团进行保护，其使用和消去都不会改变分子的其余部分。特别是按照T.W.Greene在《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Syntheses)A，Wiley-Interscience出版社(1981)或Mc OMIE在《有机化学中的保护基团》(Protective Groups in Organic Chemistry)，Plenum出版社(1973)中叙述的方法进行。
作为例子保护基团可以选自三甲基甲硅基、二苯甲基、四氢吡喃基、甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、乙氧基羰基、叔丁氧羰基、三氯乙氧基羰基、苯二甲酰亚胺基等。
最后，最后一步，通过本领域技术人员已知的传统方法，将在5链节或6链节的环上的叠氮基转化为氨基，分子的其余部分不发生改变。优选通过在水存在下用三苯基膦的作用进行此反应。
本领域技术人员已知的其它制备本发明核酸转移剂的方法也在本发明的范围之内。
作为非限定性的例子，如同在本说明书“实施例”部分中详细说明的，本发明的第一个实施方案导致通式(8a)和(8b)的转移剂，而第二种实施方案导致通式(16)和(17)的转移剂。
合成阳离子亲水区的此第二条途径的意义在于此合成只有很少的必需步骤，还在于得到的胺合成物的多样性。一个阳离子头可以与不同的疏水取代基缩合。
本发明的另一个目的涉及含有如前面所定义的核酸转移剂和核酸的组合物。该组合物优选每μg核酸含有0.1-50nmol的载体。此比值优选为每μg核酸2-20nmol载体，更优选为每μg核酸4-12nmol的载体。更特别的核酸转移剂与核酸的比为每μg核酸8-12nmol的载体。
在本发明中，“核酸”应当理解是脱氧核糖核酸和核糖核酸。可能涉及天然或人工序列，具体地如基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)的序列，杂合序列或合成或半合成的序列，修饰或未修饰的寡核苷酸。这些核酸可以来自人、动物、植物、细菌、病毒等。它们可以采用本领域技术人员已知的任何技术得到，具体地采用筛选文库、化学合成得到，或采用包括化学或酶修饰由筛选文库所得到序列的混合方法得到。它们可以采用化学方法修饰。
特别地，脱氧核糖核酸可以是短的寡核苷酸或较长的序列，可以是单链或双链。具体地，这些核酸有利地由质粒、载体、附加体、表达盒等构成。这些脱氧核糖核酸可以带有在其靶细胞中有功能或否的复制起点、一个或多个标记基因、转录或复制的调节序列、有治疗意义的目的基因、修饰或未修饰的反义序列、其他细胞组分连接区等。
优选地，该核酸包括一个表达盒，它由靶细胞中有活性的一个或多个启动子和转录终止子控制下的一个或多个具有治疗意义的目的基因构成。
在本发明的意义上，具有治疗意义的目的基因应当特别地理解是编码具有治疗作用的蛋白质产品的任何基因。如此编码的蛋白质产品具体地可以是蛋白质或肽。这种蛋白质产品对靶细胞可以是同源性外源的或内源的，即当靶细胞没有任何疾病时在该细胞中正常被表达的产物。在这种情况下，蛋白质表达例如可缓解该细胞中表达不充分，或由于修饰而失活的或低活性蛋白的表达，或能够过表达所述的蛋白质。具有治疗意义的目的基因还可编码稳定性提高的、活性改变的细胞蛋白突变体。蛋白产品对靶细胞还可以是异源的。在这种情况下，表达的蛋白例如可以补充或提供细胞中的缺失活性，使它能够抵御疾病，或刺激免疫反应。
在本发明意义上的治疗产品中，更具体地可以列举酶、血液衍生物、激素、淋巴因子：白介素、干扰素、TNF等(FR 92/03120)、生长因子、神经递质或它们的前体或合成酶、营养因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP/多效营养因子等)、原脂蛋白(ApoAI、ApoAIV、ApoE等，FR93/05125)、肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白(FR 91/11947)、与先天性粘液稠厚症相关的CFTR蛋白质、肿瘤抑制基因(p53，Rb，RaplA，DCC，k-rev等，FR93/04745)、编码凝血相关因子的基因(因子VII、VIII、IX)、参与DNA修复的基因、自杀基因(胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶)、血红蛋白或其他蛋白载体的基因、代谢酶、分解代谢酶等。
具有治疗意义的核酸还可能是一种反义基因或序列，其在靶细胞中的表达能够控制基因表达或细胞mRNA转录。根据在专利EP 140 308中描述的技术，这样一些序列例如能够在靶细胞中转录成细胞mRNA的互补RNA，并因此阻断其转译成蛋白。治疗基因还包括核酶的编码序列，它能够选择性地破坏靶RNA(EP 321 201)。
如上所述，核酸还可以包括一个或多个编码能够在人体或动物中产生免疫反应的抗原性肽的基因。在这种特定的实施方式下，本发明可用于制备疫苗，或者用于人或动物的免疫治疗，特别是抗微生物、病毒或癌的免疫治疗。特别涉及EB病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒(EP185 573)、假狂犬病病毒、“合胞体形成病毒”、其他病毒的特定抗原性肽，或特定的肿瘤抗原性肽(EP 259 212)。
优选地，核酸还含有支持具有治疗意义的目的基因和/或编码抗原性肽的基因在所希望的细胞或器官中表达的序列。当它们在被转染细胞中能够发生作用时，可能涉及天然地负责表达所考虑基因的序列。还可能涉及不同来源的序列(负责表达其他蛋白，或甚至合成的序列)。具体地，可能涉及真核生物或病毒基因的启动子序列。例如，可能涉及来自希望转染细胞的基因组的启动子序列。同样地，可能涉及来自病毒基因组的启动子序列。在这方面例如可以列举E1A、MLP、CMV、RSV等基因的启动子。另外，这些表达序列可以通过加入激活、调节等序列修饰。还可能涉及可诱导或可阻抑性启动子。
另外，核酸特别在具有治疗意义的目的基因上游还可能包括一种引导合成的治疗产品到靶细胞分泌道中的信号序列。这种信号序列可能是治疗产品的自然信号序列，但也可能涉及任何其他的功能信号序列，或人工的信号序列。该核酸还可能包括将合成的治疗产品引向特定胞腔的信号序列。
本发明的组合物另外还能够与转染剂/核酸复合物结合并能够改善转染能力的添加剂。在另外一种实施方式中，本发明还涉及含有核酸、如前面定义的转移剂和一种或多种添加剂的组合物，该添加剂能够与转染剂/核酸复合物结合，并能够改善转染能力。
从这点来看，本发明组合物可以含有一种或多种中性脂类作为添加剂。这样一些组合物是特别有利的，转移剂/核酸电荷比低时尤其如此。申请人事实上已表明加入中性脂类能够改善核酸脂类颗粒的生成，还有利于颗粒渗透到细胞中，其使细胞膜不稳定。
更优选地，在本发明范围内使用的中性脂类是具有2个脂肪链的脂类。特别有利地，使用在生理条件下两性离子的或没有离子电荷的天然或合成的脂类。更具体地，它可以选自二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、油酰基棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(POPE)、二-硬脂酰基、二-棕榈酰基、二-肉豆蔻酰基磷脂酰基乙醇胺以及它们的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂酰基甘油、二酰基甘油、糖基二酰基甘油、脑苷脂类(具体如半乳糖脑苷脂类)、鞘脂类(例如鞘磷脂)，或脱唾液酸神经节苷脂类(具体例如是脱唾液酸GM1与GM2)。
这些不同的脂类可以采用本领域技术人员熟知的方法，或者通过合成，或者通过从器官(例如脑)或卵提取得到。具体地，可以采用有机溶剂提取天然脂类(还可参见Lehninger，生物化学)。
最近，申请人证实使用一种直接或非直接地参与所述核酸凝集的化合物作为添加剂也是特别有利的(WO 96/25508)。在本发明组合物中，这种化合物的存在能够降低转染化合物的量，由此得到在毒理学方面有益的结果，而不会对转染活性带来任何损害。关于参与核酸凝集的化合物，应当定义为一种直接地或非直接地使核酸紧密化的化合物。更确切地，这种化合物或者可以在待转染核酸中直接地起作用，或者在一种直接参与核酸凝集的附加化合物中起作用。优选地，直接地在核酸中起作用。例如，预紧密化试剂可以是任何多阳离子物，例如聚赖氨酸。根据一种优选实施方式，这种参与核酸凝集的紧密化剂全部或部分地由鱼精蛋白、组蛋白或核仁素和/或一种它们的衍生物衍生得到。这种紧密化剂还可以全部或部分由肽结构单元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)构成，结构单元数可以是2-10。在本发明化合物的结构中，这些结构单元可以连续地或非连续地重复。也就是说它们可以通过生物化学性质的连接物，例如通过一种或多种氨基酸，或通过化学性质的连接物被分隔。
在特别有利的实施方式中，本发明组合物还含有能够使核酸转移定向的靶向元件。这种靶向元件可以是能够使DNA转移定向到某些细胞类型或某些所希望的组织(肿瘤细胞、肝细胞、生血细胞)的细胞外靶向元件。还可能涉及能够使核酸转移定向到某些特定的细胞区(线粒体、核等)的细胞内靶向元件。靶向元件可以与本发明的核酸转移剂连接，或还可以与如前面所提到的核酸连接。
在本发明范围内可使用的靶向元件中，可以列举糖、肽、蛋白、寡核苷酸、脂类、神经介质、激素、维生素或它们的衍生物。优选地，涉及糖、肽或蛋白质，如抗体或抗体片段、细胞受体配体或它们的片段、受体或受体片段等。具体地，可能涉及生长因子受体的配体、细胞因子受体的配件、细胞凝集素类受体的配体，或具有RGD序列且对如整联蛋白之类的粘合蛋白受体有亲合性的配体。还可以列举转铁蛋白、HDL和LDL的受体，或叶酸转运载体。靶向元件还可以是能够靶向于凝集素如脱唾液酸糖蛋白受体或syalydes受体的糖，像sialyde Lewis X，或为抗体的片段Fab、或单链抗体(ScFv)。最近报道了特别关系到对特定细胞的选择性并能够有效促进这些细胞中的内在化的天然或合成肽配体(Bary等，自然医学(NatureMedicine)，2，1996，299-305)。
可以采用本领域技术人员已知的任何技术，例如采用与憎水部分偶合，或与本发明转移剂与核酸相互作用的部分偶合，或者与本发明转移剂或与核酸相互作用的基团偶合，使靶向元件与核酸脂类复合物结合。根据优选方式，上述相互作用可以是离子性的或共价性的。
按照另一个实施方案，本发明的组合物还可以任选地含有至少一种非离子型表面活性剂，其加入量足以使核酸脂复合物颗粒的大小稳定化。加入非离子型表面活性剂可防止形成聚集体，这使该组合物更适合于在体内使用。加入这些表面活性剂的本发明组合物具有无毒的优点。它们还具有另外的优点，考虑到核酸脂复合物组合物总电荷的降低，减小了干扰其它蛋白质的危险。
表面活性剂优选由至少一个疏水链段和至少一个亲水链段组成。疏水链段优选选自脂族链、疏水的聚氧亚烷基、亚烷基的聚酯、带有苄基聚醚头的聚乙二醇和胆固醇，而亲水的链段优选选自亲水的聚氧亚烷基、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮或糖类。这些非离子型表面活性剂在专利申请PCT/FR 98/00222中曾描述过。
本发明的另一个目的是上述的转移剂在转移核酸(更一般是聚阴离子)到细胞中的用途。这样的应用是特别有利的，因为这些转染剂在保持零或很小的细胞毒性的同时，提高了转染效果。
对于体内应用，例如研究基因调节、建立动物疾病模型或在治疗中，本发明的组合物可以根据局部、皮肤、口服、直肠、阴道、胃肠外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、眼内、经皮的、气管内、腹膜内等用药途径而配制。优选地，本发明组合物含有在注射剂中、具体地直接注射到所要求器官中时、或采用局部方法(在皮肤和/或粘膜上)用药时在药学上可接受的赋形剂。具体地可能涉及灭菌的等渗溶液，或干组合物，特别是冻干组合物，根据情况通过添加无菌水或生理血清，上述组合物能够制成可注射溶液。注射时所使用核酸的剂量以及用药次数可以根据不同的参数进行调整，特别是根据所使用的用药方式、涉及的疾病、待表达基因、或寻求的治疗时间。更具体地关于用药方式，可能是直接注入组织中，例如注入肿瘤中或血液循环途径中，或者处理培养细胞接着采用注射或移植术再植入体内。在本发明范围内有关组织与血液循环途径例如是肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、软骨、胰、肾、膀胱、胃、肠、睾丸、卵巢、直肠、神经系统、眼、腺、结缔组织等。
本发明还涉及向细胞中转移核酸的方法，该方法包括下述步骤：
(1)让核酸与如前面定义的转移剂接触形成核酸脂复合物，和
(2)让细胞与(1)中生成的复合物接触。
可以通过与所述的核酸脂复合物一起培养细胞(对于体外或离体的应用)或通过在器官中注射复合物(对于体内的应用)使细胞与复合物进行接触。优选地，在例如每106细胞为0.01-1000微克的核酸存在下进行培养。对于体内用药，例如可以使用的核酸剂量是0.01-10毫克。
在本发明的组合物还含有一种或多种如前面定义的添加剂的情况下，这一种或多种添加剂预先与本发明的脂混合或与核酸混合。
本发明因此提供一种核酸转移、特别是治疗疾病的特别有利的方法，该方法包括在体外、体内或离体下在上述定义的条件下施用与通式(I)化合物结合的能减轻所述疾病的核酸。更具体地，这种方法可用于因缺少蛋白质或核酸产品而造成的疾病，使用的核酸编码所述的蛋白质产品，或转录成核酸产品，或构成所述的核酸产品。
本发明还涉及本发明核酸转移剂转染细胞方面的任何应用。
本发明的核酸转移剂特别地可用于核酸向初级细胞中或向稳定细胞系中的转移。可能涉及成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞(神经元、星形细胞、神经胶质细胞)、肝细胞、造血细胞系(淋巴细胞、CD34、树状细胞等)、上皮细胞等，它们呈分化或多能(前体)形式。
除了前面说明的方案外，本发明还包括由下面实施例与附图得出的其他特征与优点，而这些实施例应认为是说明本发明而不限制其保护范围。
附图
图1/5：合成化合物(1)-(5)的示意图。
图2/5：合成化合物(5)-(8a)以及(8b)的示意图。
图3/5：合成化合物(9)-(16)的示意图。
图4/5：在没有血清存在下，通过测定HeLa细胞中的荧光素酶活性测量化合物(8a)和(8b)的体内转染效果。在不同的载体nmol/DNAμg比值下进行测定，用直方图表示。对每种组合物也进行了蛋白质量的测试，在同一个图上用实曲线表示。
图5/5：在没有血清存在下，通过测量NIH 3T3细胞中的荧光素酶活性来测定化合物(8a)和(8b)的体内转染效果。在不同的载体nmol/DNAμg比值下进行测定，用直方图表示。
材料和方法
—高效液相色谱纯化是用Waters LC 4000型设备在Vydac C4柱子上用乙腈在水中的梯度溶液洗脱进行的。
—激发波长和发射波长分别为260nm和590nm，在Perkin ElmerLS50B上进行荧光测定。激发和发射的狭缝宽度调节到5nm。在加入最终浓度5μg/mL的溴化乙锭后记录荧光值。
在Bruker MSL 300设备上，在氘化氯仿中记录核磁共振波谱，对质子是在330.13MHz，对碳是在75.47MHz。
实施例
实施例1：由6-苄氧基-吡喃半乳糖甲甙合成转移剂(8a)
在图1/5和2/5上显示出反应的不同步骤。
a)合成6-苄氧基-2，3，4-三-O-(2’-羧基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(2)
将28.4g(0.1mol)6-苄氧基-β-D-吡喃半乳糖甲甙(1)溶解在400mL四氢呋喃中，并且在搅拌下在0℃放置。加入32g(5.7当量)研细的氢氧化钾、0.5g(2％)的18-Cr-6冠醚和32.5mL(1.5当量)溴代乙酸乙酯。两小时以后，蒸发至干，重新溶解在水中，用2N盐酸中和得到的溶液。用二氯甲烷萃取，得到32g产物(2)(收率：70％)。
13 C NMR：δ，172.94；136.87；127.93；127.41；98.89；97.22；78.74；76.17；72.97；69.52；67.93；65.39；54.75。
b)合成6-苄氧基-2，3，4-三-O-(2’-羟基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(3)
将30g(0.065mol)前面的三酸(2)溶解于400mL四氢呋喃中，在氮气下于0℃放置。在搅拌下滴加40mL硼烷-甲硫醚。在环境温度下再搅拌2小时，然后仔细加入过量甲醇。然后蒸发溶液至干，再多次将得到的固体溶解于甲醇中。在硅胶柱上用乙酸乙酯洗脱进行提纯，如此得到24.5g最终产物(3)(收率：90％)。
c)合成6-苄氧基-2，3，4-三-O-(2’-叠氮基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(4)
将在前面步骤中得到的20g(0.048mol)三醇溶解于500mL四氢呋喃中。加入40g(3.2当量)三苯基膦、160mL(3.7当量)1.1M的叠氮酸甲苯溶液，然后加入24.2mL(3.2当量)偶氮二羧酸二乙酯。1小时以后，蒸发溶液，在硅胶柱上用庚烷/乙酸乙酯(6∶4)洗脱进行提纯，如此得到17.6g产物(4)(收率：90％)。
13 C NMR：δ，128.47；127.80；98.23；79.05；76.27；73.55；71.92；70.15；69.95；68.77；68.14；55.37；51.41；51.11；50.87。
d)合成2，3，4-三-O-(2’-氨基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙三盐酸盐(5)
将15g(0.03mol)叠氮化合物(4)溶解于200mL乙醇中。加入7.5mL12N的盐酸，然后在碳载钯存在下用氢处理3小时。过滤后，蒸发溶剂，将得到的残渣(12.6g，收率：95％)直接用在下一步。
e)合成2，3，4-三-O-(2’-叔丁氧羰基氨基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(6)
将12g(0.028mol)盐酸盐(5)溶解于100mL二氧六环和85mL1N氢氧化钠的混合物中。加入18.7g(3.3当量)二碳酸二叔丁基酯，在环境温度下搅拌2小时。将反应混合物蒸发，然后用二氯甲烷萃取(3次50mL)。合并有机相，然后在硫酸钠上干燥并蒸发。如此得到15.56g(收率：90％)残渣(6)，用乙酸乙酯在硅胶柱上提纯。
f)合成6-二(十八烷基)氨基琥珀酰-2，3，4-三-O-(2’-叔丁氧羰基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(7a)
将10g(0.016mol)前面的产物(6)溶解于300mL二氯甲烷中。相继加入14.6g(1.5当量)二(十八烷基)氨基琥珀酸、1.95g(1当量)二甲氨基吡啶和6.5g(2当量)二环己基碳化二亚胺。通过二(十八烷基)胺和琥珀酸酐反应得到二(十八烷基)氨基琥珀酸。在一夜以后，仔细加入10mL(1.7g)草酸的甲醇溶液，将其搅拌1小时(放出一氧化碳)。过滤溶液，蒸发至干，在硅胶柱上用庚烷/乙酸乙酯(7∶3)溶液洗脱提纯所得产物。如此得到12.8g产物(7a)(收率：65％)。
g)合成6-二(十八烷基)氨基琥珀酰-2，3，4-三-O-(2’-氨基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙三(三氟醋酸)盐(8a)
将10g(0.008mol)产物(7a)溶解于20mL的90％三氟醋酸中。半小时以后，蒸发溶液，再每次用20mL甲苯处理3次。用高效液相色谱(RP4；水/乙腈；0→100％；20min)提纯所得残渣(8a)。如此得到9.7g产物(8a)(收率：95％)。
MH +＝1304。
实施例2：由6-苄氧基-吡喃半乳糖甲甙合成化合物(8b)
反应的不同步骤如图1/5和2/5所示。
合成的第一段与实施例1中的步骤a)-e)相同。然后按照下面的方式继续：
f)合成6-二(十八烷基)氨基邻苯二甲酰-2，3，4-三-O-(2’-叔丁氧羰基-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙(7b)
按与产物(7a)相同的方式得到此产物，但是用二(十八烷基)氨基邻苯二甲酸代替二(十八烷基)氨基琥珀酸。
g)合成6-二(十八烷基)氨基邻苯二甲酰-2，3，4-三-O-(氨基-2’-乙基)-β-D-吡喃半乳糖甲甙三(三氟醋酸)盐(8b)
按照与产物(8a)相同的方式，由上一步得到的产物(7b)得到化合物(8b)。
MH +＝1317
实施例3：由三乙酰基烯糖合成转移剂(16)
a)合成邻苯二甲酰亚胺基丙基-4，6-二-O-乙酰基-2，3-二脱氧-β-D-赤己-2-烯吡喃糖苷(10)
不同的反应步骤显示在图3/5上。
将13.17g(0.048mol)的三乙酰基-D-己烯糖(9)溶解于250mL二氯甲烷中。加入11g(1.1当量)邻苯二甲酰胺基丙醇和1.56mL(0.26当量)三氟化硼醚溶液。在环境温度下1小时以后，用饱和碳酸氢钠溶液中和该混合物，倾析、干燥和蒸发溶液。如此得到16g产物(10)(收率：80％)，在硅胶柱上用庚烷/乙酸乙酯(5∶5)洗脱提纯。
b)合成邻苯二甲酰亚胺基丙基-4，6-二-O-乙酰基-2，3-二脱氧-β-D-赤己-2-烯吡喃葡糖苷(11)
将16g糖苷(10)溶解于200mL乙醇中。加入0.16g的10％碳载钯，用氢处理2小时。过滤以后，蒸发溶液。如此得到15.78g产物(11)(收率：99％)。
c)合成邻苯二甲酰亚胺基丙基-2，3-二脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(12)
将15g(0.036mol)前面的产物(11)溶解于250mL甲醇中，然后加入3.5mL(0.1当量)1N的甲醇钠。2小时以后，用amberliteIR120树脂中和。过滤和蒸发以后，得到11.5g产物(12)(收率：96％)。
d)合成邻苯二甲酰亚胺基丙基-4，6-二叠氮基-2，3，4，6-四脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(13)
将11g(0.033mol)脱乙酰基的产物(12)溶解于250mL四氢呋喃中。在搅拌下相继加入21.5g(2.5当量)三苯基膦和110.5mL(3.7当量)1.1M的叠氮酸的甲苯溶液。以保持混合物的温度不超过30℃的速度加入12.88g(2.5当量)偶氮二羧酸二乙酯。1小时以后，蒸发溶液至于，在硅胶柱上用庚烷/乙酸乙酯(8∶2)洗脱提纯所得产物。如此得到7.2g产物(13)(收率：57％)。
e)合成氨基丙基-4，6-二叠氮基-2，3，4，6-四脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(14)
将7g(0.018mol)产物(13)溶解于500mL乙醇中，然后加入2.6mL水合肼，在40℃搅拌2小时。蒸发以后，再溶解于二氯甲烷中，让形成的邻苯二甲酰肼结晶。过滤和蒸发溶液。如此得到4.17g产物(14)(收率：90％)。
f)合成(胆甾烯基-O-甲酰氨基丙基)-4，6-二叠氮基-2，3，4，6-四脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(15)
将6.34g(0.9当量)氯甲酸胆固醇酯和4g(0.016mol)产物(14)溶解于200mL乙醚中。立即形成沉淀，这时加入50mL1N的氢氧化钠。几分钟后，溶液重新变得清澈透明。再搅拌30min，然后倾析，用50mL水洗涤两次，将溶液蒸发至干。如此得到9.4g产物(15)，在硅胶柱上用庚烷/乙酸乙酯(6∶4)洗脱提纯(收率：90％)。
g)合成(胆甾烯基-O-甲酰氨基丙基)-4，6-二氨基-2，3，4，6-四脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(16)
将9g(0.013mol)二叠氮化合物(15)溶解于150mL的80％四氢呋喃中，然后加入14.2g(4当量)三苯基膦，并在50℃下加热1小时。在冷却以后，放到阴离子树脂IRC-50 COOH柱上，用80％的四氢呋喃洗涤。然后用四氢呋喃/水/醋酸(64∶16∶10)的混合物洗脱呈醋酸盐形式的产物。如此得到8.9g产物(16)(收率：90％)。
13 C NMR：δ，176.55；156.65；139.84；132.02；128.46；125.46；122.44；97.11；74.28；56.66；56.12；50.02；43.70；42.30；39.51；38.57；36.98；36.55；36.16；35.76；31.87；30.30；29.89；28.18；23.82；22.78；22.53；21.03；19.31；18.70；11.84。
实施例4：合成化合物(17)
a)合成(5-O-乙酰基-6-乙酰氧基甲基-5，6-二氢-2H-吡喃-2-基氧)乙酸苄基酯
将2.8g(0.01mol)的三乙酰基-D-己烯糖和1.6mL(1.1eq.)乙醇酸苄酯(1.1当量)溶解于80mL氯仿中。在冰浴中冷却并加入0.651mL(0.5当量)三氟化硼醚溶液。45分钟以后，用饱和碳酸氢钠水溶液中和，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。在硅胶柱上用庚烷/乙酸乙酯(6∶4)混合物洗脱进行层析纯化。收率96％。
b)合成(5-O-乙酰基-6-乙酰氧基甲基-四氢吡喃-2-基氧)乙酸
在大气压和环境温度下，在0.35g的10％碳载钯存在下，将3.5g(0.0093mol)前面的产物加氢10小时。在硅藻土上过滤，浓缩并在硅胶柱上用乙酸乙酯洗脱进行层析提纯。收率90％。
c)合成N，N-二(十八烷基)-(5-O-乙酰基-6-乙酰氧基甲基-四氢吡喃-2-基氧)乙酰胺：
将0.675g(0.0017mol)前面的产物溶解于8.6mL氯仿中。加入0.9mL二异丙基乙基胺、0.899g(1当量)二(十八烷基)胺和0.426g(1.2当量)二环己基碳化二亚胺。在环境温度下过夜后，浓缩并用庚烷萃取产物。在硅胶柱上用庚烷/乙酸乙酯(8∶2)混合物洗脱进行层析纯化。收率70％。
d)合成N，N-二(十八烷基)-(5-羟基-6-羟基甲基-四氢吡喃-2-基氧)乙酰胺：
将1.57g(0.00198mol)前面的产物溶解于10mL甲醇中。加入0.197mL(0.2当量，2M甲醇溶液)甲醇钠。在环境温度下2小时以后，中和并浓缩。在硅胶柱上用庚烷/乙酸乙酯(8∶2)洗脱进行层析纯化。收率92％。
e)合成N，N-二(十八烷基)-(5-叠氮基-6-叠氮基甲基-四氢吡喃-2-基氧)乙酰胺(17)：
将0.6g(0.00087mol)前面的产物溶解于15mL四氢呋喃中。加入0.48g(2.1当量)三苯基膦，然后再加入0.288mL(2.1当量)DEAD。当放热反应终止时，加入1.588mL(2.5当量)的1.38M叠氮酸甲苯溶液。在反应结束时，浓缩并再用庚烷处理，过滤并浓缩。然后在硅胶柱上用庚烷/乙酸乙酯(8∶2)混合物洗脱进行层析纯化。收率72％。
13 C NMR：δ，173.21；172.07；162.22；161.77；118.34；114.49；110.65；108.34；96.88；65.18；64.50；48.27；46.54；40.69；35.86；31.78；30.94；28.63；27.56；26.92；22.54；21.84；13.94。
实施例5：本发明的转染剂8(a)和8(b)与DNA的结合
此实施例说明在本发明转染剂和DNA之间结合的性质以及复合物的形成。
将本发明的转染剂溶解于水中成为10mM的浓度。如此得到的溶液是透明的，相当于阳离子脂类微团的结构。
按照6nmol转染剂/μgDNA的比值制备转染剂/DNA复合物。
转染剂8(b)与DNA结合得到的复合物尺寸等于92nm±27nm，在水中的荧光为7％，在300mM的氯化钠中的荧光为60％。
与DNA结合的本发明转染剂8(a)能够形成尺寸约98nm±20nm的复合物，在水中的荧光为6％，在300mM的氯化钠中的荧光为55％。
这些结果表明，本发明的转染剂能够与DNA相结合，形成平均直径大约100nm的颗粒，此尺寸特别适合于通过细胞膜。实际上，在300mM时，50％以上的DNA仍然与本发明的转染剂结合。
实施例6：用本发明的转染剂8(a)和8(b)进行DNA的体外转染
在不同的载体量/μgDNA下，在体外评价转染的效果。
为此实验使用的遗传材料是由质粒pGL2-基本载体[Promega]，通过插入含有从pcDNA3[Invitrogen]质粒提取的人巨细胞病毒启动子的Mlu I-Hind III片段，从而得到的包含“荧光素酶”报道基因的pCMV-Luc质粒结构。
还使用了在生理血清(0.15M的氯化钠溶液)中稀释到40μg/mL的核酸溶液。
将本发明中描述的产品溶解于水中，浓度为80μM-800μM，与DNA溶液等体积混合。最终的盐水浓度为75mM，以即时制备细胞转染剂溶液。
为了进行转染，在适当的条件下，在24孔(2cm2/孔)微板上培养细胞并进行转染，转染时细胞处于指数生长期，达到50-70％的汇合。
用500μL的不含有血清蛋白质的培养基洗涤细胞2次，细胞在无血清的培养基中生长。将50μL细胞转染剂混合物[1μgDNA/孔]加入到细胞中[3孔/对照载体DNA]。在转染2小时后，用适当数量的血清补充生长培养基。
在转染后48小时，通过按照Promega试剂盒[荧光素酶检测系统]所推荐的使用说明测定荧光素酶的表达来评价转染的效果。通过测定在细胞中溶解物中的蛋白质浓度来估计细胞转染剂混合物的毒性。
在图4/5中汇集了对于HeLa细胞转染所得到的结果，在图5/5中显示了在NIH3T3细胞中所得到的结果。
由这两个图以及对于载体/DNA比值大于20nmol/μgDNA所得到的结果(未显示)可以推断出，当载体/DNA比值为2-20nmol载体/μgDNA时转染特别有效。
现有的结果表明，对于使用的两种细胞，比值为4-12nmol载体/μgDNA，更优选比值8-12nmol/μgDNA下转染的效果最佳。
另外还证实，无论对于哪种细胞，产物8(a)和8(b)的显示载体剂量效果的直方图是可叠合的。
对于NIH 3T3细胞，在所研究的载体剂量下，本发明的两种产物都是无毒的。实际上，只有对于剂量超过8nmol载体/转染细胞样本时，才观察到最大20％的细胞蛋白质损失。

Claims (29)

1.含有至少一个阳离子亲水区和一个亲脂区的转染剂，其特征在于，所述阳离子亲水区由至少一个被氨基取代的5原子或6原子杂环组成。
2.按照权利要求1的转染剂，其特征在于，该阳离子亲水区，即所述转染剂的合成中间体具有(I)的通式：
其中：
—y是0或1的整数，不同的y彼此是独立的，
—X表示氧、氮、硫或硒原子，
—Z基团彼此独立地表示
  ·氢原子
  ·基团OR，其中R表示氢原子、甲基或基团(CH2)n-NR1R2，这
其中n是选自1-6(含)的整数，R1和R2彼此独立地表示氢原子或
基团(CH2)q-NH2，q可以在1-6(含)间变化，不同的q是彼此独
立的，
  ·基团(CH2)m-NR1R2，其中m是选自0-6(含)的整数，R1和R2
如前面所定义，以及
  ·可以连接阳离子亲水区和脂区的“间隔基团”，
条件是，至少一个取代基Z带有氨基。
3.按照权利要求2的转染剂，其特征在于，在通式(I)中的基团(CH2)n-NR1R2中，n是选自2、3和4的整数。
4.按照权利要求2的转染剂，其特征在于，阳离子亲水区由吡喃糖或呋喃糖形式的糖苷组成。
5.按照权利要求2的转染剂，其特征在于，在通式(I)中，在环上的y等于1，而X是氧原子。
6.按照权利要求5的转染剂，其特征还在于，至少一个基团Z带有氨基。
7.按照权利要求5的转染剂，其特征还在于，至少两个基团Z带有氨基。
8.按照权利要求5的转染剂，其特征还在于，有两个基团Z是氢原子，另外两个基团Z是含氮的基团，特别是氨基，最后一个基团Z表示基团OR，这里R如权利要求2中所定义。
9.按照权利要求8的转染剂，其特征在于，基团OR在通式(I)杂环的2-位上。
10.按照权利要求5的转染剂，其特征还在于，至少两个基团Z是O-(CH2)2-NH2，至少一个基团Z表示OR，R如权利要求2所定义。
11.按照权利要求1或2的转染剂，其特征在于，该阳离子亲水区，即转染剂合成的中间体选自：
12.按照权利要求1的转染剂，其特征在于，该亲脂区由一个或多个饱和或不饱和的、直链或支链的、任选卤代的脂族链和/或由类固醇衍生物组成。
13.按照权利要求12的转染剂，其特征在于，所述的脂族链含有10-22个碳原子，特别含有14、16、17、18和/或19个碳原子。
14.按照权利要求12或13的转染剂，其特征在于，所述脂族链选自-(CH2)13-CH3、-(CH2)15-CH3、-(CH2)16-CH3、-(CH2)17-CH3和-(CH2)18-CH3。
15.按照权利要求12的转染剂，其特征在于，类固醇衍生物选自胆固醇、胆甾烷醇、3-α-5-环-5-α-胆甾烷-6-β-醇、胆酸、甲酸胆固醇酯、甲酸胆甾烷醇酯、甲酸3α，5-环-5α-胆甾烷-6β-醇酯、胆甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基-十六氢环戊二烯并[a]环丙[2，3]环戊二烯并[1，2-f]萘-10-基胺，或者胆甾烷基胺。
16.按照权利要求1的转染剂，其特征在于，亲脂区通过一个由含有可水解官能团的酸基团或含氨基基团组成的“间隔基团”与亲水区相连。
17.按照权利要求16的转染剂，其特征在于，该“间隔基团”含有一个或多个脂族链或芳香链，还包括一个或多个选自酰胺、酯、醚、氨基甲酸酯和芳香环的基团。
18.按照权利要求16的转染剂，其特征在于，该“间隔基团”选自-O-CO-(CH2)x-COOH、-O-(CH2)x-COOH、-O-CO-(CH2)x-NH2、-O-(CH2)x-NH2、-NH-(CH2)x-NH2，这里x表示选自1-6(含)的整数。
19.按照权利要求1的转染剂，其特征在于，其代表是如下结构式的化合物(16)、(17)、(8a)或(8b)：
Figure A9880579900041
Figure A9880579900051
20.制备按照权利要求1-19之一的转染剂的方法，其特征在于，通过“间隔基团”将亲脂区与通式(I)的杂环偶合。
21.组合物，其特征在于，它含有如权利要求1-19之一所述的转染剂和至少一种核酸。
22.按照权利要求21的组合物，其特征在于，转染剂/核酸的比值为0.1-50nmol转染剂/μgDNA。
23.按照权利要求21的组合物，其特征在于，它还含有一种或多种添加剂。
24.按照权利要求23的组合物，其特征在于，所述添加剂是中性的脂类。
25.按照权利要求23的组合物，其特征在于，所述添加剂是直接或间接参与核酸聚集的化合物。
26.按照权利要求21-25之一的组合物，其特征在于，该组合物含有可以用于可注射制剂的可药用载体。
27.按照权利要求21-25之一的组合物，其特征在于，该组合物含有可用于皮肤和/或粘膜施用的可药用载体。
28.按照权利要求1-19之一的转染剂在将核酸转移到细胞中的应用。
29.转移核酸到细胞中的方法，其特征在于，该方法包括如下的步骤：
(1)将核酸与如权利要求1-19之一所定义的转染剂和必要时的一种或多种添加剂接触，形成核酸脂复合物，以及
(2)让细胞与在(1)中形成的复合物接触。
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